WO2004108634A2 - Reagenzien zur modifikation von biopharmazeutika, deren herstellung und anwendung - Google Patents

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WO2004108634A2
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Definitions

  • the present invention relates to compounds which are suitable for coupling to pharmaceuticals, in particular biopharmaceuticals, and to conjugates from the compounds with biomolecules or pharmaceutical active substances.
  • the compounds of the invention can be easily formed by multi-component reactions.
  • Another object of the invention is the use of the conjugates as an improved formulation of pharmaceuticals and their preparation.
  • the invention also provides a laboratory kit for the in vitro production of conjugates from the compounds and pharmaceuticals according to the invention and biotechnological substances, in particular biopharmaceuticals, pharmaceutical active ingredients, synthetic molecules or surfaces.
  • the effectiveness and the duration of action of an active ingredient are determined by its pharmacological profile. Particularly in the case of biopharmaceuticals, a rapid loss of activity is very often observed in vivo, which is generally referred to as "clearance”. The clearance takes place through processes such as metabolism or metabolism, renal excretion and through the response of the immune system to the foreign connection. Proteinogenic substances in particular, an important group of biopharmaceuticals, produce a strong immune response when used therapeutically: this can lead to an allergic shock. In many cases, such adverse effects prevent the commercial or therapeutic use of this otherwise very advantageous class of active ingredient.
  • branched modification reagents that contain several PEG chains in one molecule.
  • PEG chains There are few commercial examples of this class of substance.
  • a well-known example of this is an activated lysine provided with two m-PEG chains. Due to the fact that the bindings can also be freely rotated here, the shielding effect is only moderate (Veronese, FM Bioconjugate Chem. 1995, 6, 62-69).
  • R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 C atoms with each occurrence, R 3 OH or Is NR 4 R 5 ,
  • R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n each time an occurrence independently an integer from 1 is to 1000 and x is an integer from 1 to 10 every occurrence and y is an integer from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 each occurrence.
  • the compounds according to the invention contain at least one binding group Y, which enables the compound according to the invention to be covalently bound to further molecules, in particular to biotechnological, pharmaceutical or synthetic active substances, and to surfaces or to biocatalysts.
  • Non-covalent bonds for example chelates, complexes with metals, for example on surfaces or with radioisotopes, as well as bonds to silicon-containing surfaces are also possible.
  • Suitable binding groups are, for example, a carboxylic acid or an activated carboxylic acid group.
  • the compounds of the formula (I) according to the invention have a molecular weight of 200 to 50,000 Da, in particular 1,000 to 20,000 Da. It has furthermore been found that compounds of the formula (I) according to the invention which contain more than one chain of the formula (II) provide good shielding even at lower molecular weights of the entire compound. In the case of compounds which have two to three groupings of the formula (II), a molecular weight of the total compounds of 500 to 25,000 Da, in particular from 500 to 10,000 Da, is sufficient.
  • Compounds which have four or five groupings of the formula (II) preferably have a molecular weight of 200 to 12,500 Da, in particular 500 to 7,500 Da.
  • the molecular weight is particularly preferably ⁇ 7,500 Da and more preferably ⁇ 5000 Da.
  • the residues or placeholders P, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , n, x, y and q in a molecule or a residue can in each case be the same or else different from one another ,
  • the rest of formula (II) can be a polyalkylene oxide consisting of polyethylene oxide and polypropylene oxide groups.
  • R 4 and R 5 can be hydrogen or a hydrocarbon radical having 1 to 30 C atoms, in particular 1 to 10 C atoms, more preferably 1 is 6 C atoms, which may contain heteroatoms, in particular one or more heteroatoms, selected from O, N, P and S.
  • the radicals R 4 and R 5 together can also form a ring, for example a morpholine ring.
  • the radical R 1 is hydrogen, hydroxyl or a hydrocarbon radical with 1 to 50 carbon atoms, more preferably 1 to 30 carbon atoms and most preferably 1 to 10 carbon atoms, which optionally contains heteroatoms, in particular O, N, S, P or / and Si.
  • the radical R 1 can be saturated or mono- or polyunsaturated as well as linear, branched or cyclic. HO, CH 3 -O, CH 3 - (CH 2 ) a -O, (CH 3 ) 2 CH-O is particularly preferred, where a is an integer between 1 and 20.
  • n is between 0 and 1000.
  • n (as used herein, for example in Formula II or Formula Ila) is independently an integer from 0 to 1000, more preferably from 1 to 500, even more preferably from 2 to 250, especially at least 3 and most preferably at least every occurrence 4 to 50.
  • n is independently an integer from 0 to 1000, more preferably from 1 to 500, even more preferably from 2 to 250, especially at least 3 and most preferably at least every occurrence 4 to 50.
  • compounds which contain 2 or 3 groups of the formula (II) are often particularly preferred.
  • x is independently an integer from 1 to 10, in particular 1 to 6, more preferably from 2 to 3, and y is an integer from 0 to 50, more preferably from 1 to 10, even more preferably from 2 to 6 .
  • q is 0 or 1 at each occurrence independently.
  • residues V, W, X and Z originate from the reactants reacted in the multicomponent reaction or become, in the event that one of the reactants has two or more functional groups (amine, ketone or aldehyde, isonitrile or acid grouping) exhibits, in the course of
  • Multi-component reaction established. Preference is given to compounds which are obtained in a multicomponent reaction or a multistage multicomponent reaction, in particular a four-component reaction and most preferably in a Ugi reaction, in which at least one starting material which is branched, ie at least two, more preferably at least three, is used Multi-component reaction reactive groups (eg amine, carbonyl, isonitrile or / and acid grouping).
  • the radical V comes from the acid component
  • the radical Z from the isonitrile component
  • the radical X from the amino component
  • the radical W from the carbonyl component.
  • hydrocarbon radicals are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, cycloalkenyl, alkynyl, cycloalkynyl, aroyl and heteroaroyl.
  • a hydrocarbon radical, as used herein, can also contain functional groups and in particular a targeting agent and for example an aminocarboxylic acid ester, for example a saturated or unsaturated omega-aminocarboxylic acid ester, a dye, a fluorescent label, an antibiotic, a minor or major groove binder Biotinyl residue, a streptavidin residue, an intercalating residue, an alkylating residue, a steroid, a lipid, a polyamine, folic acid, a receptor agonist or antagonist, an enzyme inhibitor, a peptide, an antibody or an antibody fragment, an amino sugar, a saccharide or oligosaccharide, eg Galactose, glucose or mannose, an antisense polymer, a modified surface, a sur
  • At least one of the residues V, W, X or / and Z comprises a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer.
  • a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer.
  • a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer.
  • the invention it is also possible to provide molecules which contain two or more targeting groups. This enables an increased targeting effect to be achieved and / or the compound or a conjugate formed therewith to be directed to a number of desired locations.
  • the compounds according to the invention can also contain reporter groups, for example fluorescent dyes or fluorescent markers, which enables use for diagnostic purposes.
  • radical X contains a targeting grouping, as indicated above.
  • the shielding function by the formula (II) and the targeting function are present in a radical X.
  • Such a radical X preferably has the formula (IIb)
  • the radicals W which originate from the carbonyl compound in the preparation of the compounds according to the invention by a Ugi reaction, are each preferably independently hydrogen or a CC 6 hydrocarbon radical, in particular a C r C 4 alkyl radical and most preferably hydrogen, methyl or ethyl.
  • the use of symmetrical ketones prevents the formation of a center of symmetry on the carbon atom to which the radicals W are bound are prevented. As a result, there are no problems associated with chiral compounds in the formation of conjugates with active substances.
  • W is particularly preferably hydrogen on each occurrence.
  • the radical W is introduced by using an aldehyde as the starting material in the Ugi reaction.
  • one of the radicals W is hydrogen
  • the other radical W is preferably a C r C 6 hydrocarbon and in particular a C 1 -C 4 alkyl radical.
  • one of the radicals W can contain a group of the formula (II), a linker and / or a targeting group.
  • polyfunctional starting materials are used.
  • at least one of the starting materials of the Ugi reaction is used in polyfunctional form, that is to say in difunctional, trifunctional or higher functional form.
  • at least one bifunctional starting material that is to say a dicarboxylic acid, a diamine, a diisonitrile or / and a dialdehyde or diketone, and preferably at least one dicarboxylic acid or / and a diamine.
  • the acid component in formula (purple) here is a 1, 1, 2-ethanetricarboxylic acid which additionally bears a linker group at the 1 position.
  • the carbonyl component used to prepare compounds of formula (purple) is preferably formaldehyde or a symmetrical carbonyl compound, e.g. Acetone or cyclohexanone. This prevents the formation of mixtures of diastereoisomers.
  • asymmetrical aldehydes e.g. Isobutyraldehyde, or ketones can be used.
  • n is an integer from 1 to 10, but preferably an integer from 1 to 5.
  • the present invention helps to reduce the disadvantages or limitations described in the prior art. It encompasses the synthesis of bifunctional compounds which can be used to modify natural products, technical products, biotechnological and synthetic products or pharmaceutical active ingredients.
  • the compounds according to the invention contain an activated linker group which forms a covalent bond with one or more amino functionalities or other functional groups of a biotechnological or synthetic product as part of a chemical reaction under mild reaction conditions and at least one polymer function which influence the biochemical and pharmacological properties of the conjugate.
  • the connections contain further functions, such as e.g. Targeting functions.
  • the present invention preferably provides an unbranched or branched polymer compound that carries only a single activated linker group, thereby avoiding cross-linking reactions.
  • This polymer compound is hydrophilic and biologically compatible. It is easy to manufacture and opens up a wide range of applications for the modification of active pharmaceutical ingredients and technically used products. Conjugates of the polymer compound according to the invention with active pharmaceutical ingredients enable an improvement in the therapeutic use. Furthermore, these conjugates make it possible to reduce the amount of active ingredient to be administered, for example for the treatment of cancer and infectious diseases, when the duration of action is prolonged.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the compounds according to the invention, the individual components of the formulas being used in a multicomponent reaction
  • V, W ⁇ X 'and Z' each independently represent a hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms or / and V, W or / and X 'represent hydrogen, at least one of the radicals V, W, X' and Z 'carries a binding group Y and the radicals V, W, X' and Z ' together at least one, in particular at least two, groups of the formula (II)
  • P independently represents H, OH, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence
  • R. H or a hydrocarbon radical having 1 to 50 carbon atoms, which can contain heteroatoms, in particular O, N, S, P or / and Si,
  • R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 carbon atoms with each occurrence
  • R 3 is OH or NR 4 R 5 ,
  • radicals X ', W, Z and V no longer have any further functionality which is reactive for the multicomponent reaction (ie NH 2 , CO, NC or COOH)
  • educts are 1, 1, 2-ethanetricarboxylic acid with three carboxylic acid residues, ie two carboxylic acid groups in residue V, or residues which contain at least two different functional groups, such as lysine (contains an acid group and an amine group at the same time) or ⁇ - aminobutyric acid.
  • the corresponding groupings V, W, X and Z in the product, starting from the functional group in the remainder V, W, X 'and Z' are only built up during the multicomponent reaction. In this way it is possible to build up highly branched and highly functional compounds in a one-pot reaction, in particular compounds which contain a large number of groupings of the formula (II).
  • h, i are independently 0 or 1 with each occurrence, g and f are independently with each occurrence an integer between 0 and 10, preferably between 0 and 5,
  • A stands for H or - (CO) -NX 2 at each occurrence and
  • XX 2 , X 3 and X 4 and X each independently have the meanings given for X above.
  • achiral molecules can be prepared according to the invention which contain up to 6 (in the case of dicarboxylic acids) or up to 9 (in the case of tricarboxylic acids) groups of the formula ( II) have. Since the coupling of amines to di- or tricarboxylic acids, which are not amino acids, takes place according to the invention, the coupling can be carried out in a simple manner, without the need for a complex synthesis process using protective groups.
  • the invention further relates to conjugates comprising compounds of the formula (I) in covalent linkage to medical devices or auxiliaries Presentation of active ingredients.
  • tissues for heterografts such as heart valves, for example, can be made more tolerable for the recipient.
  • auxiliary agents for the administration of active substances for example liposomes or nanocapsules, can be modified in order to impart desired properties, in particular a longer half-life in the body.
  • Compositions can be used, for example, for the prevention or treatment of cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases, neuronal or cerebral diseases or inflammatory processes such as infections, immune diseases or autoimmune diseases (e.g. rheumatoid arthritis).
  • the compounds or conjugates according to the invention are also outstandingly suitable as diagnostic agents.
  • kits which comprises all the reagents and instructions as well as the compounds according to the invention which make it possible to obtain a Modification of proteins, nucleic acids or other active substances or even surfaces with polymers can be carried out in vitro in a simple manner.
  • the reaction of a substance with the compounds according to the invention takes place, for example, in such a way that, to a solution or a suspension of the substance to be modified, for example a protein, in aqueous buffer the polymer compound according to the invention is at least in molar amount based on the number of modifiable reactive groups, for example amino groups (Lysine residues, histidine, N-terminus), carboxyl groups (aspartic acid, glutamic acid, C-terminus), thiol groups (cysteine), hydroxyl groups (serine, threonine, tyrosine) or carbonyl groups (aldehydes).
  • the polymer compounds according to the invention are preferably used in a molar excess of 1 to 1000, more preferably in a molar excess of 1 to 100 and particularly preferably in a molar excess of 1 to 20, based on the modifiable groups.
  • Suitable reaction solutions are aqueous buffers such as 0.001 to 1.0 molar solutions of sodium or potassium dihydrogen phosphate with disodium or dipotassium hydrogen phosphate or sodium, potassium or ammonium hydrogen carbonate with disodium, disodium or diammonium carbonate or Tris ( hydroxymethyl) aminoethane with hydrochloric acid, buffer solutions are preferably suitable for the pH range between pH 4 and pH 10, particularly preferably between pH 5 and pH 9.
  • the cosolvents methanol, ethanol, propanol, i-propanol, butanol, ethyl acetate, methyl acetate, dimethylformamide, acetonitrile, dimethyl sulfoxide or sulfolane can be added to the buffer in amounts of 0.1 to 50% by volume, more preferably 0.1 to 20 vol% are added, depending on the solubility of the reactants.
  • the reaction temperature is between 0 ° C and 90 ° C, preferably 4 ° C to 40 ° C.
  • stabilizers or detergents can be added to the buffers, for example sodium azide, glycerol, ethylene glycols or ionic or non-ionic detergents.
  • the conjugate crude products obtainable by the process according to the invention can furthermore be purified by dialysis, chromatographic processes or ultrafiltration (including those for centrifuges) with aqueous buffer solutions or pure water and by processes familiar to the person skilled in the art and then used for further use.
  • the structural evidence of the products (conjugates), i.e. the analytical number of covalently bound polymer compounds according to the invention is carried out by direct measurement of the molecular weight, e.g. by means of MALDI-TOF mass spectrometry, by selective determination of one or more covalently bound components or by indirect detection of the unmodified groups.
  • a dye molecule introduced via the compound according to the invention can be determined in a simple manner by measuring the absorbance (UV ⁇ IS).
  • the number of unmodified amino groups for example, can be determined fluorometrically by reaction with fluorescamine.
  • the stability of the conjugate towards proteases can be investigated, for example, as direct evidence of the improvement in the properties of the conjugate from a polymer compound according to the invention.
  • Figure 1 Analysis of conjugates from L-asparaginase and substance 16 using SDS-PAGE.
  • the samples are: lanes 1) and 9) protein standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) L-asparaginase (control, 2 ⁇ g), lane 3) modified L-asparaginase (0.5eq. Substance 16), Lane 4) modified L-asparaginase (1eq. Substance 16), lane 5) modified L-asparaginase (2eq. Substance 16), lane 6) modified L-asparaginase (5eq. Substance 16), lane 7) modified L-asparaginase ( 10eq. Substance 16) and lane 8) modified L-asparaginase (20eq. Substance 16).
  • Figure 2 Protease stability of a conjugate of L-asparaginase and substance 16: Influence of the modification of L-asparaginase with substance 16 on the Stability of L-asparaginase against trypsin derived from residual activity. Modification with substance 16 significantly increases the stability towards trypsin.
  • Figure 3 Influence of the modification of L-asparaginase with substance 16 on the stability of L-asparaginase against chymotrypsin derived from the residual activity. Modification with substance 16 significantly increases the stability towards chymotrypsin.
  • Figure 4 Analysis of conjugates from streptokinase and substance 16 using SDS-PAGE.
  • the samples are: lanes 1) and 8) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) streptokinase (control, 2 ⁇ g), lane 3) modified streptokinase (0.5eq. Substance 16), lane 4) Streptokinase (1eq. Substance 16), lane 5) modified streptokinase (2eq. Substance 16), lane 6) modified streptokinase (5eq. Substance 16) and lane 7) modified streptokinase (10eq. Substance 16).
  • Figure 5 Analysis of conjugates from trypsin and substance 16 using SDS-PAGE.
  • the samples are: lanes 1), 2) and 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) trypsin (control, 2 ⁇ g), lane 3) modified trypsin (0.5eq. Substance 16), lane 4) modified trypsin (1eq. Substance 16), lane 5) modified trypsin (2eq. Substance 16), lane 6) modified trypsin (5eq. Substance 16) and lane 7) modified trypsin (10eq. Substance 16).
  • an amino component, an oxo or carbonyl component, an isocyanine component and an acid component are reacted to the compound according to the invention.
  • the primary amines used are commercially available or, starting from the monomethoxypolyethylene glycols, can be prepared by a Gabriel synthesis or from the corresponding azido compound by catalytic hydrogenation.
  • Secondary amines, symmetrical or asymmetrical, are obtainable from a primary amine by reductive amination with a corresponding aldehyde, which is obtained, for example, by Swern oxidation from monomethoxypolyethylene glycol, or can be obtained by simple substitution reactions.
  • Isonitriles are commercially available on a large scale. A large number of synthetic methods are also available for their production. A very reliable method is the preparation of isonitriles from primary amines via the conversion to formamide with subsequent dehydration using phosgene or POCI 3 (I. Ugi; R. Meyr, Angew. Chem. 1958, 70, 702). Alternatively, isonitriles can be obtained in a simple manner by reacting a primary or secondary amine with a methyl or ethyl ⁇ -isocyanocarboxylic acid ester.
  • aldehydes or ketones can be used as the oxo or carbonyl component.
  • symmetrical ketones such as acetone, and the simple formaldehyde are preferably used.
  • the acid component also serves as a linker for later coupling to the active substance, so that carboxylic acids are preferably used, which can be converted into an activated form of the compound according to the invention by a few synthetic steps after a successful multi-component reaction.
  • carboxylic acids are preferably used, which can be converted into an activated form of the compound according to the invention by a few synthetic steps after a successful multi-component reaction.
  • These can be monoesters of dicarboxylic acids (e.g. succinic acid mono-tert-butyl ester) or unsaturated monocarboxylic acids (e.g. 4-pentenecarboxylic acid).
  • N-substituted amino acids e.g. N-Boc-L-glutamic acid, N-Boc-L-aspartic acid
  • more highly branched carboxylic acids e.g. tricarboxylic acid 7
  • azomethine it is advantageous to use one equivalent each of the individual components in the implementation. It may also be advantageous to form the azomethine by precondensation.
  • Aprotic, polar and non-polar, and protic, polar can be used as solvents.
  • Alcohols such as methanol, ethanol, water or water / alcohol mixtures and DMF or are particularly suitable as protic solvents for this Acetonitrile.
  • aprotic solvents dichloromethane, tetrahydrofuran or chloroform are often used.
  • Lewis acids such as boron trifluoride etherate or zinc chloride, have a beneficial effect on the Ugi reaction. The reactions are usually carried out at from -20 ° C. to 100 ° C., but reaction temperatures between 0 ° C. and 50 ° C. are preferred.
  • acid components which simultaneously serve as a protective group for the amino functionality.
  • Such protective groups can then be removed so that the secondary amine formed can also be coupled to carboxylic acids later using generally known methods from peptide chemistry.
  • examples for such acids are trifluoroacetic acid or 4-pentenecarboxylic acid.
  • Bovine serum albumin (short: BSA, Sigma), L-asparaginase (short: ASNase, ProThera), streptokinase (Sigma), trypsin (Sigma) and chymotrypsin (Sigma) were used for the experiments.
  • the conjugates comprising a compound according to the invention covalently coupled to one biopharmaceutical, pharmaceutical or synthetic active ingredient were incubated in the presence of trypsin or chymotrypsin for at least 90min at 37 ° C. Aliquots were taken at various times and the residual activity of the conjugate to be examined was determined from these. Trypsin cleaves peptides and proteins preferably at the C-terminal of basic amino acids (lysine and arginine residues), chymotrypsin preferably at the C-terminal of aromatic amino acids (tryptophan, phenylalanine and tyrosine residues).
  • Substance 16 (0.5eq. / 0.7 ⁇ L, 1eq./1, 4 ⁇ L, 2eq.) was added to 75 ⁇ L of an L-asparaginase solution (0.5 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) ./2.7 ⁇ L, 5eq./6.8 ⁇ L, 10eq./13.7 ⁇ L or 20eq./27.3 ⁇ L) dissolved in dimethyl sulfoxide (10mg / mL) and with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9, 5) filled up to a total volume of 150 ⁇ L.
  • the reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
  • the modification reduces the activity of the L-asparaginase only slightly. With a degree of PEGylation from 41% to 75% residual activity, with a degree of PEGylation from 43% to 60% residual activity (see Table 1)
  • Streptokinase is modified to 100% of the lysine residues when 10 equivalents of substance 16 are used (see Table 2)
  • Substance 16 (0.5eq. / 1, 5 ⁇ L, 1eq./2.7 ⁇ L, 2eq./ to 120 ⁇ L of a tr ⁇ psin solution (1.0 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5)) 5.4 ⁇ L, 5eq. I3.8 ⁇ L or 10eq./27.3 ⁇ L) dissolved in dimethyl sulfoxide (10mg / mL) and filled with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) to a total volume of 150 ⁇ L.
  • the reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
  • Trypsin is modified with 10 equivalents of substance 16 to 44% of the lysine residues.
  • the residual activity increases to 137%.
  • the increase in activity by modification with reagents containing polyethylene glycol is explained in the literature by a change in the microenvironment of the active center (Zhang, Z., He, Z. & Guan, G. (1999) in Biotechnology Techniques 13: 781-786).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, weiche zur Kopplung an Pharmazeutika, insbesondere Biopharmazeutika geeignet sind, sowie Konjugate aus den Verbindungen mit Biomolekülen oder pharmazeutischen Wirkstoffen. Die erfindungsgemässen Verbindungen können auf einfache Weise durch Mehrkomponentenreaktionen gebildet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Konjugate als verbesserte Formulierung von Pharmazeutika sowie deren Herstellung. Ferner stellt die Erfindung einen Labor Kit zur in vitro Herstellung von Konjugaten aus den erfindungsgemässen Verbindungen und Pharmazeutika sowie biotechnologischen Substanzen, insbesondere Biopharmazeutika, pharmazeutischen Wirkstoffen, synthetischen Molekülen oder Oberflächen zur Verfügung.

Description

Reagenzien zur Modifikation von Biopharmazeutika, deren Herstellung und Anwendung
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, welche zur Kopplung an Pharmazeutika, insbesondere Biopharmazeutika geeignet sind, sowie Konjugate aus den Verbindungen mit Biomolekülen oder pharmazeutischen Wirkstoffen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf einfache Weise durch Mehrkomponentenreaktionen gebildet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Konjugate als verbesserte Formulierung von Pharmazeutika sowie deren Herstellung. Ferner stellt die Erfindung einen Labor Kit zur in vitro Herstellung von Konjugaten aus den erfindungsgemäßen Verbindungen und Pharmazeutika sowie biotechnologischen Substanzen, insbesondere Biopharmazeutika, pharmazeutischen Wirkstoffen, synthetischen Molekülen oder Oberflächen zur Verfügung.
Die Entwicklung von Biopharmazeutika als Arzneistoffe oder für potentielle Arzneistoffe sowie biotechnologischer Produkte für die Anwendung im Bereich Proteomics oder technischen Bereich machte in den vergangenen Jahrzehnten sprunghafte Fortschritte, die durch mehrere Faktoren entscheidend beeinflusst wurden: a) verbesserte Isolierungs- und Reinigungstechniken, b) die revolutionären Entwicklungen in der Gentechnologie und damit verbunden die Möglichkeit zur Herstellung rekombinanter Proteine, c) das bessere Verständnis der Biochemie sowie der
Wirkmechanismen von Biophamazeutika und d) die Erschließung neuer Anwendungsgebiete und Methoden für biotechnologische Produkte.
Die Effektivität und die Dauer der Wirkung eines Wirkstoffs werden durch sein pharmakologisches Profil bestimmt. Besonders bei Biopharmazeutika wird sehr oft in vivo ein schneller Wirkungsverlust beobachtet, was allgemein als „clearance" bezeichnet wird. Die clearance erfolgt durch Prozesse wie Verstoffwechselung bzw. Metabolisierung, renale Ausscheidung und durch die Reaktion des Immunsystems auf die körperfremde Verbindung. Gerade proteinogene Wirkstoffe, eine wichtige Gruppe von Biopharmazeutika, rufen bei deren therapeutischem Einsatz eine starke Immunantwort: hervor, die bis zum allergischen Schock führen kann. Solche nachteiligen Effekte verhindern in vielen Fällen den kommerziellen bzw. therapeutischen Einsatz dieser sonst sehr vorteilhaften Wirkstoffklasse.
Wissenschaftler beschäftigen sich seit vielen Jahren damit, Strategien zu entwickeln, den therapeutischen Einsatz von Biopharmazeutika dennoch zu ermöglichen. Eine der ersten Methoden war die Änderung der Oberflächenladung durch Umsetzung von Proteinen mit Bernsteinsäureanhydrid. Diese Modifikation wird als Succinylierung bezeichnet (Habeeb, A.F.S.A. Arch. Biochem. Biophys. 1968, 121, 652). Eine kovalente Bindung einer biologisch aktiven Verbindung an verschiedenste Polymere stellt eine der erfolgreichsten Strategien der letzten Jahre dar und wurde zu einer der wichtigsten Methoden zur Verbesserung der pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften von biopharmazeutischen Wirkstoffen. Eines der am häufigsten verwendeten Polymere ist hierbei das Polyalkylenoxid Polyethylenglykol, kurz PEG genannt.
Abuchowski, einer der Pioniere auf dem Gebiet der polymervermittelten Darreichung von Biopharmazeutika, konnte zeigen, dass eine kovalente Kopplung von Polyethylenglykolketten an ein Polypeptidmolekül einen positiven pharmakologischen Effekt bei diesem Wirkstoff erzeugt. Ein solches Konjugat zeichnet sich durch eine verminderte Immunogenität und eine verlängerte Halbwertszeit im Blut aus (US-Patent Nr. 4 179 337, Davis et al.; Abuchowski & Davis „Enzymes as Drugs", Holcenberg & Roberts, Hrsg. John Wiley & Sons, N.Y. 1981 , 367-383). Ferner hat die Modifikation biotechnologischer Produkte, wie z.B. Enzyme, häufig Einfluss auf weitere biochemische Parameter, z.B. auf deren pH- und Thermostabilität. Eine Modifikation kann deshalb z.B. für technische Enzyme zum Einsatz in Waschmitteln aufgrund einer erhöhten Thermostabilität oder für Biopharmazeutika im Hinblick auf eine orale Verabreichung aufgrund einer erhöhten pH-Stabilität vorteilhaft sein.
Die oben beschriebenen Arbeiten beschleunigten massiv die Forschung auf dem Gebiet der Konjugation von Wirkstoffen mit dem Polymer Polyethylenglykol. Die Modifikation mit Polyethylenglykol bietet auch bei herkömmlichen kleinen Wirkstoffen einige Vorteile. Die kovalente Bindung eines kleinen Wirkstoffs an das hydrophile Molekül Polyethylenglykol erhöht die Löslichkeit des Konjugates und kann außerdem die Toxizität verringern (Kratz, F. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7, 2517-2524). Die wichtigsten Übersichtsartikel zur Konjugation mit Polyethylenglykol sind im Folgenden benannt: Greenwald, R.B., J. of Controlled Release 2001 , 74, 159-171 ; Zaiipsky, S. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, 16, 157-182; Zaiipsky, S. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 150-165; N. K. Jain, N.K.; et al. Pharmazie 2002, 57, 5 - 29.
Die chemische Reaktion zur Kopplung eines Polyethylenglykolmoleküls an ein Biopharmazeutikum erfordert die Aktivierung einer der beiden Komponenten, die zur Reaktion gebracht werden. Im Regelfall wird hierzu das PEG-Molekül mit einem Verbindungsmolekül, dem so genannten aktivierten Linker versehen. Zur Aktivierung steht die gesamte Breite der lange etablierten Peptidchemie zur Verfügung. Zur Modifikation von Aminofunktionalitäten, meist von Lysinresten als Baustein einer biologisch aktiven Verbindung, wird der Linker häufig in Form eines N- Hydroxysuccinimid Aktivesters aktiviert. Harris, J.M. et al. (US-Patent Nr. 5,672,662) entwickelte diese Methode für Propion- und Buttersäurelinker, während bei Zaiipsky, S. et al. (US-Patent Nr. 5,122,614) ein aktivierter Kohlensäureester zum Einsatz kommt. Die Reaktion eines Lysinrestes mit einem solchen aktivierten Linker führt zur Bildung einer Amid- bzw. Urethanbindung. Die Verknüpfung eines PEGs mit einem Biopharmazeutikum, PEGylierung genannt, führt in manchen Fällen zum Verlust der biologischen Aktivität. Ein Grund dafür kann der Verlust der positiven Ladung durch die Bildung einer Amidbindung am Lysinrest sein.
Die reduktive Aminierung unter Verwendung von PEG-Aldehyden stellt eine gute Alternative zu der Verwendung von Aktivestern dar (Harris, J.M. US- Patent Nr. 5,252,714), weil diese Kopplungsmethode zur Bildung eines sekundären Amins unter Erhalt der positiven Ladung führt. Weitere Kopplungsmöglichkeiten bestehen in der Verwendung der Maleinimidmethode (Cysteinreste) und der direkten Verbindung ohne eine Linkergruppe beim Einsatz von Tresyl- oder Halogenverbindungen. Bei den am häufigsten verwendeten PEGs handelt es sich um lineare Monomethoxypolyethylenglykol-Ketten (m-PEGs). Diese linearen Ketten sind konformativ nicht eingeschränkt und können sich' je nach Umgebung frei drehen. Folglich ist die von den Ketten abgeschirmte Oberfläche des Biopharmazeutikums relativ gering. Um die Oberflächenabschirmung zu verbessern, werden verzweigte Modifizierungsreagenzien entwickelt, die mehrere PEG-Ketten in einem Molekül enthalten. Von dieser Substanzklasse gibt es nur wenig kommerzielle Beispiele. Ein bekanntes Beispiel dafür ist ein mit zwei m-PEG-Ketten versehnes, aktiviertes Lysin. Aufgrund der auch hier vorhanden freien Drehbarkeit der Bindungen, ist der Abschirmeffekt jedoch nur mäßig (Veronese, F.M. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 62-69).
Obwohl die PEGylierung schon sehr weit entwickelt ist, bleiben noch einige entscheidende Nachteile bestehen: a) die Modifikation von Biopharmazeutika führt in vielen Fällen zu einem dramatischen Abfall der biologischen Aktivität, b) Polymere, wie Polyethylenglykol, liegen aus Prozessgründen als komplexes Gemisch verschiedener Molekulargewichte vor, was als Polydispersität bezeichnet wird und häufig zu Problemen bei der Reproduzierbarkeit bzw. Qualität führt, c) in Abhängigkeit von der Qualität des m-PEGs und der Art der Aktivierung kommt es in einigen Fällen zu unerwünschten Quervernetzungsreaktionen, d) die Optimierung der Reaktionsbedingungen, die Abschätzung des pharmakologischen Effekts und die Wahl des richtigen Modifizierungsreagenzes sind schwierig und zeitaufwendig und e) die Modifizierung von Biopharmazeutika mit Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, ist bis heute Speziallabors vorbehalten.
Aufgrund der beschriebenen Defizite beim Stand der Technik gibt es einen großen Bedarf an Modifizierungsreagenzien mit neuen, variablen Eigenschaften, deren Anwendung zu entscheidenden Verbesserungen bei biotechnologischen sowie auch bei herkömmlichen, synthetischen Produkten führt. Ferner wäre es wünschenswert, diese Technologie auch Anwendern zugänglich zu machen, die nicht über eigene, spezielle Laborausstattungen verfügen bzw. keinen Zugriff auf Speziallabors haben.
Eine Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, Verbindungen bereitzustellen, welche an Biopharmazeutika gebunden werden können und mit denen die Nachteile von Biopharmazeutika-Konjugaten des Standes der Technik zumindest teilweise überwunden werden können. Eine weitere Aufgabe bestand darin, einen Labor Kit zur Verfügung zu stellen, der es jedem geneigten Wissenschaftler ermöglicht, eine Substanz mit Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, zu modifizieren.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung von Verbindungen der Formel (la/b)
H o w o
-N - -N - -V
W X Formel (la)
H O W o
-N- -o- -v
w Formel (Ib)
gelöst, wobei Verbindungen der Formel (la) mittels einer Ugi-Reaktion und der Formel (Ib) mittels einer Passerini-Reaktion hergestellt werden können und worin die Reste V, W, X und Z jeweils unabhängig voneinander einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher Heteroatome enthalten kann oder/und V, W, oder/und X Wasserstoff darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Reste V, W, X oder/und Z eine Bindegruppe Y trägt und dass die Reste V, W, X und Z zusammen mindestens eine Gruppe der Formel (II)
Figure imgf000007_0001
Formel (II)
aufweisen, worin
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, C C4-Alkyl, O-R2 oder CO-R3 darstellt,
R., H, OH oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt, R3 OH oder NR4R5 ist,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen ein Grundgerüst auf, welches durch eine Mehrkomponentenreaktion, beispielsweise eine Ugi- oder eine Passerini-Reaktion bzw. durch eine stufenweise durchgeführte Ugi-Reaktion erhältlich ist. Bei einer stufenweise durchgeführten Ugi-Reaktion werden zunächst drei Komponenten miteinander umgesetzt (Amin-, Isonitril- und Carbonylkomponente) und an das Reaktionsprodukt dann die vierte Komponente (Säurekomponente) gekoppelt. Durch Verwendung einer solchen Mehrkomponentenreaktion ist es möglich, bei Auswahl geeigneter Ausgangsverbindungen gezielt funktioneile Gruppen auf einfache Weise in einem Molekül bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten als funktioneile Gruppe wenigstens eine Bindegruppe Y, welche eine kovalente Bindung der erfindungsgemäßen Verbindung an weitere Moleküle, insbesondere an biotechnologische, pharmazeutische oder synthetische Wirkstoffe, sowie an Oberflächen oder an Biokatalysatoren ermöglicht. Bei der Bindegruppe Y handelt es sich bevorzugt um eine Verbindung, welche mit einer in dem zu koppelnden Wirkstoff vorliegenden funktionellen Gruppe kovalent binden kann, beispielsweise um eine Bindegruppe, die mit einer Aminogruppe, einer Thiolgruppe, einer Carboxylgruppe, einer Guanidingruppe, einer Carbonylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Heterozyklus, insbesondere mit N als Heteroatom (z.B. in Histidinresten), einer C-nukleophilen Gruppe, einer C-elektrophilen Gruppe, einem Phosphat, einem Sulfat oder ähnlichem bindefähig ist. Möglich sind auch nicht kovalente Bindungen, z.B. Chelate, Komplexe mit Metallen, z.B. an Oberflächen oder mit Radioisotopen sowie Bindungen an Silicium-haltige Oberflächen. Geeignete Bindegruppen sind beispielsweise eine Carbonsäure oder eine aktivierte Carbonsäuregruppe.
Zur späteren Kopplung der Verbindung an ein biotechnologisches oder synthetisches Produkt sowie an Naturstoffe und technische Produkte enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt eine aktivierte Funktionalität Y. In der aktivierten Form ist Y bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus (O-alkyl)2, -OSO2CH2CF3 (Tresyl), (O-aryl)-Azide, -CO- Q, Maleimidyl, -O-CO-Nitrophenyl oder Trichlorphenyl, -S-S-Alkyl, -S-S-Aryl, -SO2-Alkenyl (Vinylsulfon), -Halogen (Cl, Br, I) besteht, wobei Q unabhängig aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus H, O-Aryl, O-Benzyl, O-N- Succinimid, O-N-Sulfosuccinimid, O-N-Phthalimid, O-N-Glutarimid, O-N- Tetrahydrophthalimid, N-Norbomene-2,3-dicarboximid, Hydroxybenzotriazole und Hydroxy-7-azabenzotriazole besteht. Bevorzugt handelt es sich bei Y um eine Gruppe -CO-Q. Eine gute Übersicht über mögliche Aktivierungen bietet der Review von Zaiipsky, S. erschienen in Bioconjugate Chem. 1995, 6, 150-165.
Durch die Gruppe Y können die erfindungsgemäßen Verbindungen kovalent an Wirkstoffe gebunden werden und somit höchst wünschenswerte, stabile Konjugate bilden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen weiterhin mindestens eine Gruppe der Formel (II) auf. Bevorzugt weisen die Verbindungen mindestens zwei und noch mehr bevorzugt drei Gruppen der Formel (II) auf. Aufgrund der durch die Mehrkomponentenreaktion bereitgestellten Flexibilität ist es möglich, die Gruppen der Formel (II) an verschiedenen Positionen im Molekül einzufügen. So ist es möglich, Gruppen der Formel (II) in verschiedenen Resten V, W, X oder/und Z, insbesondere in X oder/und Z, einzuführen. Auf diese Weise ist es möglich, eine Verbindung bereitzustellen, welche mehrere und insbesondere eine große Anzahl an Gruppierungen der Formel (II) enthält, welche einem Konjugat aus Verbindung der Formel (I) und einem Wirkstoff insbesondere eine verminderte Immunogenität, eine verlängerte Halbwertszeit im Körper, eine höhere Proteolysestabilität, eine Erhöhung der Löslichkeit, eine Verringerung der Toxizität, eine verbesserte pH-Stabilität sowie eine erhöhte Thermostabilität verleihen.
Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, in einem der Reste V, W, X oder/und Z, insbesondere X oder/und Z, mehrere Gruppen der Formel (II), bevorzugt zwei Gruppen der Formel (II) einzufügen.
Insbesondere ist es erfindungsgemäß möglich, eine gute Abschirmung durch eine oder mehrere kurzkettige Gruppen der Formel (II) zu erreichen, wobei kurzkettige Gruppen der Formel (II) mit gleicher Kettenlänge mit guter Reproduzierbarkeit erhalten und eingeführt werden können. Alternativ ist es auch möglich, gleichzeitig Gruppen der Formel (II) mit unterschiedlichen Kettenlängen einzuführen. Ferner ist es auch möglich, polydisperse Gruppierungen der Formel (II) einzusetzen.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass eine gute Abschirmung von an erfindungsgemäße Verbindungen gekoppelten Wirkstoffen bereits erreicht werden kann, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) ein Molekulargewicht von 200 bis 50.000 Da, insbesondere 1.000 bis 20.000 Da aufweist. Ferner wurde festgestellt, dass erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I), die mehr als eine Kette der Formel (II) enthalten, bereits bei geringeren Molekulargewichten der gesamten Verbindung eine gute Abschirmung bewirken. Bei Verbindungen, welche zwei bis drei Gruppierungen der Formel (II) aufweisen, ist bereits ein Molekulargewicht der gesamten Verbindungen von 500 bis 25.000 Da, insbesondere von 500 bis 10.000 Da ausreichend. Verbindungen welche vier oder fünf Gruppierungen der Formel (II) aufweisen, weisen bevorzugt ein Molekulargewicht von 200 bis 12.500 Da, insbesondere von 500 bis 7.500 Da auf. Bei Verbindungen, welche sechs oder mehr Gruppierungen der Formel (II) enthalten, beträgt das Molekulargewicht besonders bevorzugt < 7.500 Da und noch mehr bevorzugt < 5000 Da.
Die Gruppen der Formel (II) stellen bevorzugt Polyalkylenoxide, wie beispielsweise Polyethylenglykol, Polyolefinalkohole, wie beispielsweise Polyvinylalkohol oder Polyacrylmorpholin dar.
In den Gruppen der Formeln (II) können die Reste bzw. Platzhalter P, R2, R3, R4, R5, n, x, y sowie q in einem Molekül bzw. einem Rest jeweils gleich oder auch unabhängig voneinander unterschiedlich sein. So kann der Rest der Formel (II) beispielsweise ein aus Polyethylenoxid- und Polypropylenoxidgruppen bestehendes Polyalkylenoxid sein.
Für P = CO-R3 handelt es sich um Polyacrylsäuregruppierungen (R3 = OH) bzw. Polyacrylamide (R3 = NR4R5). R4 und R5 können dabei Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 C-Atomen, insbesondere 1 bis 10 C-Atomen, mehr bevorzugt 1 ist 6 C-Atomen darstellen, welcher Heteroatome enthalten kann, insbesondere ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus O, N, P und S. Die Reste R4 und R5 können zusammen auch einen Ring bilden, beispielsweise einen Morpholinring.
Bei dem Rest R1 handelt es sich um Wasserstoff, Hydroxy oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt 1 bis 30 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, welcher gegebenenfalls Heteroatome, insbesondere O, N, S, P oder/und Si, enthalten kann. Der Rest R1 kann gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sowie linear, verzweigt oder zyklisch sein. Besonders bevorzugt ist , HO, CH3-O, CH3-(CH2)a-O, (CH3)2CH-O, wobei a eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist. R., kann weiterhin bevorzugt ausgewählt werden aus einem Acetal, z.B. (CH3O)2- und (CH3-CH2O)2-, einem Aldehyd, z.B. OHC-CH2-O-, einer Alkenylgruppe, z.B. CH2=CH-CH2- O-, einem Acrylat, z.B. CH2=CH-CO2-, oder einem Methacrylat, z.B. CH2=C(CH3)-CO2-, einem Acrylamid, z.B. CH2=CH-CONH-, einer Aminoalkylgruppe, z.B. H2N-CH2-CH2-, einer geschützten Aminoalkylgruppe, z.B. A--NH-CH2-CH2", wobei A eine Schutzgruppe darstellt, insbesondere N- Acyl, N-Sulfonyl, N-Silylschutzgruppen, wie z.B. tert. Boc-, Alloc-, Fmoc, Tr-, Z-, Moz-, einer Thioalkylgruppe HS-CH2-CH2-, oder einer geschützten Thioalkylgruppe. Bevorzugt weist die Gruppierung der Formel (II) die Formel (Ila)
Rr(CH2-CH2-0)n-CH2-CH2- Formel (Ila)
auf, wobei n zwischen 0 und 1000 ist.
n (wie hierin verwendet, z.B. in Formel II oder Formel Ila) ist bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1000, mehr bevorzugt von 1 bis 500, noch mehr bevorzugt von 2 bis 250, insbesondere mindestens 3 und am meisten bevorzugt mindestens 4 bis 50. Erfindungsgemäß ist es möglich, Verbindungen mit einer großen Anzahl an Gruppierungen der Formel (II) bereitzustellen, bevorzugt mit mindestens 2, insbesondere mindestens 3, bevorzugt mindestens 4, mehr bevorzugt mindestens 5 und am meisten bevorzugt mindestens 9 Gruppierungen der Formel (II). Oftmals sind jedoch bereits Verbindungen besonders bevorzugt, welche 2 oder 3 Gruppierungen der Formel (II) enthalten.
x ist bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere 1 bis 6, mehr bevorzugt von 2 bis 3 und y ist eine ganze Zahl von 0 bis 50, mehr bevorzugt von 1 bis 10, noch mehr bevorzugt von 2 bis 6. q ist bei jedem Auftreten unabhängig voneinander 0 oder 1.
Die Reste V, W, X und Z stammen aus den bei der Multikomponentenreaktion umgesetzten Edukten bzw. werden, für den Fall, dass eines der Edukte zwei oder mehr funktionelle Gruppen (Amin-, Keton- bzw. Aldehyd-, Isonitril- oder Säuregruppierung) aufweist, im Verlauf der
Multikomponentenreaktion aufgebaut. Bevorzugt sind Verbindungen, die bei einer Mehrkomponentenreaktion oder einer mehrstufigen Mehrkomponentenreaktion, insbesondere einer Vierkomponentenreaktion und am meisten bevorzugt bei einer Ugi-Reaktion erhalten werden, in der wenigstens ein Edukt eingesetzt wird, welches verzweigt ist, d.h. wenigstens zwei, mehr bevorzugt wenigstens drei in der Mehrkomponentenreaktion reaktive Gruppierungen (z.B. Amin-, Carbonyl-, Isonitril- oder/und Säuregruppierung) aufweist. Bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mittels einer Ugi- Reaktion stammt der Rest V aus der Säurekomponente, der Rest Z aus der Isonitrilkomponente, der Rest X aus der Aminokomponenten und der Rest W aus der Carbonylkomponente.
Die Reste V, W, X und Z stellen jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest dar, welcher gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann. Ein Kohlenwasserstoffrest bedeutet hierin, soweit nicht explizit anders angegeben, einen Rest mit 1 bis 100.000 C- Atomen, mehr bevorzugt einen Rest von 1 bis 10.000 C-Atomen, in einigen bevorzugten Fällen 1 bis 50 C-Atomen, welcher 0 bis 10.000, mehr bevorzugt 1 bis 1.000 Heteroatome enthalten kann, beispielsweise ausgewählt aus O, P, N oder S. Die Kohlenwasserstoffreste können linear oder verzweigt sein und gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sein. Ein Kohlenwasserstoffrest kann auch zyklische oder aromatische Abschnitte enthalten. Bevorzugte Kohlenwasserstoffreste sind Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Cycloalkenyl, Alkinyl, Cycloalkinyl, Aroyl sowie Heteroaroyl. Ein Kohlenwasserstoffrest, wie hierin verwendet, kann aber auch funktioneile Gruppen und insbesondere ein Targeting-Agens enthalten und beispielsweise einen Aminocarbonsäureester, beispielsweise einen gesättigten oder ungesättigten Omega-Aminocarbonsäureester, einen Farbstoff, einen Fluoreszenzmarker, ein Antibiotikum, einen Minor oder Major Groove Binder, einen Biotinylrest, einen Streptavidinrest, einen intercalierenden Rest, einen alkylierenden Rest, ein Steroid, ein Lipid, ein Polyamin, Folsäure, einen Rezeptoragonisten oder -antagonisten, einen Enzyminhibitor, ein Peptid, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, einen Aminozucker, ein Saccharid oder Oligosaccharid, z.B. Galactose, Glucose oder Mannose, ein Antisenspolymer, eine modifizierte Oberfläche, ein grenzflächenaktives Agens oder ein komplexierendes Agens umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst wenigstens einer der Reste V, W, X oder/und Z eine Targeting-Gruppierung, die das zielgerichtete Dirigieren der erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere von die erfindungsgemäßen Verbindungen enthaltenden Konjugaten an einen gewünschten Zielort, beispielsweise einen Ort einer Erkrankung, wie einen Entzündungsherd oder ein Krebsgeschwür ermöglicht. Als Targeting- Gruppierung können z.B. Folat, Biotin, Mannose, Maltose, Succinat, Aconitat, Dexamethason, Alkylglycoside, Glykoside und Peptide, z.B. mit Arg-Gly-Asp Motiv, dienen.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Moleküle bereitzustellen, welche zwei oder mehr Targeting-Gruppierungen enthalten. Dadurch kann eine erhöhte Targeting-Wirkung erzielt werden oder/und die Verbindung bzw. ein damit gebildetes Konjugat an mehrere gewünschte Stellen dirigiert werden.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch Reportergruppierungen enthalten, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluoreszenzmarker, welche eine Anwendung für diagnostische Zwecke ermöglicht.
Bei dem Rest X in den erfindungsgemäßen Verbindungen (der Rest, der in einer Ugi-Reaktion durch die Verwendung eines primären Amins X-NH2 eingeführt wird) handelt es sich bevorzugt um eine Targeting-Gruppierung, um einen Rest der Formel (II) oder eine Kombination aus beiden. Besonders bevorzugt ist dabei x = 2, 3 oder 4. Besonders bevorzugte Untereinheiten im Rest X sind Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglykol oder Kombinationen davon mit einer Kettenlänge von 3 bis 500, insbesondere von 4 bis 100 Einheiten. R1 im Rest X ist besonders bevorzugt Methoxy oder Ethoxy, insbesondere Methoxy. Am meisten bevorzugt ist X Methoxypolyethylenglykol mit 1 bis 1000, insbesondere 4 bis 50 Ethyleneinheiten. Kurzkettige Methoxypolyethylenglykol-Reste, beispielsweise mit 3 bis 10, insbesondere mit 3 bis 4 Ethyleneinheiten werden besonders bevorzugt monodispers eingesetzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Rest X eine Targeting- Gruppierung, wie oben angegeben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Abschirmfunktion durch die Formel (II) und die Targeting-Funktion in einem Rest X vorhanden. Ein solcher Rest X weist bevorzugt die Formel (llb)
Targeting-Gruppe oder "(CH)X- -to]q -(CH)y Zusatzfunktion
J n Formel (llb) auf, worin die Bedeutungen der Platzhalter hierin wie oben angegeben sind.
Der Rest Z, welcher bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mittels Ugi-Reaktion aus dem Isonitril (Z-NC) stammt, ist bevorzugt ein C,- Cg-Alkylrest oder ein Rest, welcher eine, zwei oder mehr Gruppierungen der Formel (II) enthält sowie gegebenenfalls eine Targeting-Funktion. Besonders bevorzugt ist Z eine Gruppierung der Formel (Xa), (Xb) oder (Xc)
Figure imgf000014_0001
Formel (Xa)
R1-4-(CH)c -o- -(CH2)b N- -CO- -(CH2)a
H
Formel (Xb)
Figure imgf000014_0002
Formel (Xc) und insbesondere
Figure imgf000015_0001
worin
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, C^C^Alkyl, O-R2 oder CO-R3 darstellt (wobei R2 und R3 wie oben definiert sind), R1 H, OH oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome enthalten kann und bevorzugt ein C^C^-Alkoxyrest ist, a bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 0 bis 50, insbesondere von 1 bis 3 darstellt, b bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 0 bis 50, insbesondere von 1 bis 3 darstellt, c bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere 2 bis 4 ist und d bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1.000, insbesondere von 5 bis 100 ist.
Die Reste W, welche bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine Ugi-Reaktion aus der Carbonylverbindung stammen, sind bei jedem Auftreten unabhängig bevorzugt Wasserstoff oder ein C C6- Kohlenwasserstoffrest, insbesondere ein CrC4-Alkylrest und am meisten bevorzugt Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. In einer besonders bevorzugte Ausführungsform sind die beiden Reste W in Verbindungen der Formel (I) identisch, stammen also von Formaldehyd (W = W = H) oder von symmetrischen Ketonen, wie beispielsweise Aceton oder 3-Pentanon. Durch die Verwendung von symmetrischen Ketonen wird das Entstehen eines Symmetriezentrums an dem Kohlenstoffatom, an das die Reste W gebunden sind, verhindert. Dadurch treten keine mit chiralen Verbindungen assoziierten Probleme bei Bildung von Konjugaten mit Wirkstoffen auf. Besonders bevorzugt ist W bei jedem Auftreten Wasserstoff.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Rest W durch Verwendung eines Aldehyds als Ausgangsstoff bei der Ugi-Reaktion eingeführt. In diesem Fall ist einer der Reste W Wasserstoff, während der andere Rest W bevorzugt ein CrC6-Kohlenwasserstoff und insbesondere ein C1-C4-Alkylrest ist. In diesem Fall kann einer der Reste W eine Gruppe der Formel (II), einen Linker oder/und eine Targeting-Gruppe enthalten.
Der Rest V schließlich stammt aus der Carbonsäureverbindung bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mittels Ugi-Reaktion. Bevorzugt enthält die Gruppierung V einen Linker bzw. eine Bindegruppe Y zur Kopplung der erfindungsgemäßen Verbindungen an weitere Moleküle, insbesondere an biotechnologische, pharmazeutische oder synthetische Wirkstoffe. Der Rest V kann neben der Bindegruppe eine Linkergruppe enthalten, bevorzugt eine C1-C8-Alkylengruppe oder eine Glykolgruppe, beispielsweise eine Tetraethylenglykolgruppe.
In der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform weisen die Verbindungen der Formel (I) bevorzugt eine bis drei, mehr bevorzugt zwei bis drei Gruppen der Formel (II) auf, nämlich eine Gruppe im Rest X und eine oder zwei Gruppen im Rest Z.
Eine besonders bevorzugte Struktur solcher Verbindungen ist im Folgenden als Formel (XI) dargestellt, wobei n = 0 bis 10.
Figure imgf000016_0001
Formel (XI)
Während oben eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, nämlich die Herstellung von Verbindungen unter Verwendung von monofunktionellen Ausgangsmaterialien mittels Ugi-Reaktion näher erläutert wurde, können in einer weiteren erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsform polyfunktionelle Ausgangsmaterialien eingesetzt werden. Dazu wird wenigstens eines der Ausgangsmaterialien der Ugi-Reaktion in polyfunktioneller Form, also in difunktioneller, trifunktioneller oder höherfunktioneller Form eingesetzt. Besonders bevorzugt wird wenigstens ein bifunktionelles Ausgangsmaterial, also eine Dicarbonsäure, ein Diamin, ein Diisonitril oder/und ein Dialdehyd bzw. Diketon und bevorzugt mindestens eine Dicarbonsäure oder/und ein Diamin eingesetzt. Durch Verwendung solcher polyfunktioneller Ausgangsmaterialien werden Verbindungen der Formel (I) erhalten, in welchen mehrere Gruppen V, X, W und Z und insbesondere mehrere Gruppierungen X und Z vorliegen und somit eine Vielzahl an Gruppierungen der Formel (II) vorgesehen sein können. Ein Beispiel für solche Verbindungen, in denen eine Tricarbonsäure als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, wird durch die folgende allgemeine Formel (III) repräsentiert:
Figure imgf000017_0001
Formel (III)
und insbesondere
Figure imgf000018_0001
Formel (lila; wobei p, q, r unabhängig voneinander eine ganze Zahl zwischen 0 und 50, mehr bevorzugt zwischen 0 und 10 sein kann. Bevorzugt ist r = 0.
Verbindungen der Formel (III) können mit einem Verfahren auf der Basis einer Ugi-4-Komponentenreaktion hergestellt werden, an der eine Carbonyl-, Amino-, Isonitril- und Säurekomponente beteiligt sind. Diese Komponenten können gegebenenfalls gleichzeitig miteinander umgesetzt werden und Schutzgruppen enthalten, die später entfernt werden oder im Molekül verbleiben.
Die Säurekomponente in Formel (lila) ist hier eine 1 ,1 ,2- Ethantricarbonsäure, die zusätzlich eine Linkergruppe an der 1 -Position trägt. Die zur Herstellung von Verbindungen der Formel (lila) verwendete Carbonylkomponente ist bevorzugt Formaldehyd oder eine symmetrische Carbonylverbindung, z.B. Aceton oder Cyclohexanon. Hierdurch wird die Entstehung von Diastereoisomerengemischen vermieden. Alternativ können auch unsymmetrische Aldehyde, z.B. Isobutyraldehyd, oder Ketone verwendet werden.
Der Linker T ist bevorzugt repräsentiert durch eine Alkylkette, die verzweigt oder unverzweigt, gesättigt oder ungesättigt ist, und Heteroatome, insbesondere N, S und O, z.B. zwischen der Verzweigung und T enthalten kann. Bevorzugt weist T ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom als Verknüpfung zur Verzweigungsstelle in den Verbindungen der Formel (III) bzw. (lila) auf. Mehr bevorzugt ist T eine Alkylkette der Struktur 1.
T = -(CH2)n
Struktur 1
wobei m eine ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt aber eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
Für den Fall,
(O-Alkyl)
/ dass Y ein Acetal darstellt, weist der Linker die Struktur T' \
(O-Alkyl) auf.
Weitere bevorzugte Verbindungen, in denen eine Dicarbonsäure als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, werden durch die allgemeine Formel (XII) repräsentiert:
Figure imgf000019_0001
Formel (XII)
worin p und q jeweils ganze Zahlen von 0 bis 5 darstellen. Bevorzugte Verbindungen, die durch Verwendung von Diaminen erhältlich sind, werden durch die allgemeine Formel (XIII) dargestellt:
Figure imgf000020_0001
Formel (XIII)
worin p und q jeweils ganze Zahlen von 0 bis 5 darstellen.
Die vorliegende Erfindung trägt dazu bei, die beschriebenen, im Stand der Technik auftretenden Nachteile oder Einschränkungen zu verringern. Sie umfasst die Synthese bifunktionaler Verbindungen, welche zur Modifikation von Naturstoffen, technischen Produkten, biotechnologischen und synthetischen Produkten oder von pharmazeutischen Wirkstoffen verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten eine aktivierte Linkergruppe, die mit einer oder mehreren Aminofunktionalitäten oder anderen funktionellen Gruppen eines biotechnologischen oder synthetischen Produktes im Rahmen einer chemischen Reaktion unter milden Reaktionsbedingungen eine kovalente Bindung eingeht und mindestens eine Polymerfunktion, die die biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften des Konjugats beeinflussen. In bevorzugten Ausführungen enthalten die Verbindungen weitere Funktionen, wie z.B. Targeting- Funktionen.
Die vorliegende Erfindung stellt bevorzugt eine mehrfach verzweigte Struktur bereit, sowie deren Synthese und Anwendung zur Modifikation von biotechnologischen Produkten. Die Struktur kann unter Verwendung einer Mehrkomponentenreaktion, z.B. der Ugi-Reaktion (Ugi, I. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 3168-3210; EP 1104677), hergestellt werden. Die Verwendung der Mehrkomponentenreaktion ermöglicht einen kombinatorischen Ansatz sowie die Automation der Herstellung.
Die vorliegende Erfindung stellt bevorzugt eine unverzweigte oder verzweigte Polymerverbindung bereit die nur eine einzige aktivierte Linkergruppe trägt, wodurch Quervernetzungsreaktionen vermieden werden. Diese Polymerverbindung ist hydrophil und biologische verträglich. Sie ist einfach herzustellen und eröffnet breite Anwendungsmöglichkeiten bei der Modifikation pharmazeutischer Wirkstoffe und technisch eingesetzter Produkte. Konjugate der erfindungsgemäßen Polymerverbindung mit pharmazeutischen Wirkstoffen ermöglichen eine Verbesserung des therapeutischen Einsatzes. Weiterhin ermöglichen diese Konjugate bei Verlängerung der Wirkdauer die Verringerung der zu verabreichenden Menge an Wirkstoff, so zum Beispiel für die Behandlung von Krebs- und Infektionskrankheiten.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei man in einer Mehrkomponentenreaktion die Einzelkomponenten der Formeln
X'-NH2 (IV)
(W)2C = O (V)
Z'-NC (VI)
und
V'-COOH (VII)
miteinander umsetzt, wobei V, W\ X' und Z' jeweils unabhängig voneinander einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann oder/und V, W oder/und X' Wasserstoff darstellen, wobei wenigstens einer der Reste V, W, X' und Z' eine Bindegruppe Y trägt und wobei die Reste V, W, X' und Z' zusammen mindestens eine, insbesondere mindestens zwei Gruppen der Formel (II)
Figure imgf000022_0001
Formel (II)
aufweisen, worin
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, O-R2 oder CO-R3 darstellt,
R., H oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome, insbesondere O, N, S, P oder/und Si, enthalten kann,
R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt,
R3 OH oder NR4R5 ist,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome, insbesondere O, N, S oder/und P, enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.
Als Mehrkomponentenreaktion wird insbesondere eine
Vierkomponentenreaktion, mehr bevorzugt eine Ugi- oder Passerini-Reaktion und am meisten bevorzugt eine Ugi-Reaktion eingesetzt. Für den Fall, dass die Reste X', W, Z und V keine weitere für die Mehrkomponentenreaktion reaktive Funktionalität (also NH2, CO, NC oder COOH) mehr aufweisen, entsprechen die in den Edukten vorhandenen Reste V, W, X' und Z' gerade den in den erfindungsgemäßen Verbindungen wieder zu findenden Resten V, W, X und Z. Bevorzugt ist es aber, wenigstens ein Edukt einzusetzen, welches eine weitere Funktionalität (NH2, CO, NC oder COOH) enthält. In diesem Fall wird ein verzweigtes Molekül erhalten. Beispiele für solche Edukte sind die 1 ,1 ,2-Ethantricarbonsäure mit drei Carbonsäureresten, also zwei Carbonsäuregruppierungen im Rest V, oder Reste, welche mindestens zwei verschiedene funktioneile Gruppen enthalten, wie beispielsweise Lysin (enthält gleichzeitig eine Säuregruppierung und eine Amingruppierung) oder γ-Aminobuttersäure. Bei Verwendung solcher mehrfunktioneller Edukte werden die entsprechenden Gruppierungen V, W, X bzw. Z im Produkt ausgehend von der funktioneilen Gruppe im Rest V, W, X' bzw. Z' erst bei der Mehrkomponentenreaktion aufgebaut. Auf diese Weise ist es möglich, in einer Eintopfreaktion hochverzweigte und hochfunktionelle Verbindungen aufzubauen, insbesondere Verbindungen, die eine Vielzahl an Gruppierungen der Formel (II) enthalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen bereitgestellt, welche wenigstens zwei Gruppierungen der Formel (II) aufweisen. Diese Verbindungen weisen die allgemeine Formel (XIV) auf
Figure imgf000023_0001
Formel (XIV)
worin h, i bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 sind, g und f bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, bevorzugt zwischen 0 und 5 sind,
A bei jedem Auftreten für H oder -(CO)-NX2 steht und
X X2, X3 und X4 sowie X jeweils unabhängig voneinander die oben für X angegebenen Bedeutungen aufweisen.
Bevorzugt steht T-Y für die Gruppierung -CH2-CH2-CH=CH2, wobei an der Doppelbindung beliebige Funktionalitäten zur Kopplung an Wirkstoffe eingefügt werden können.
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, in denen g = f, h = i, X., = X3, X2 = X4, wobei in solchen Verbindungen das Kohlenstoffatom in der markierten Position 1 kein Chiralitätszentrum ist. Durch die Verknüpfung einer Dicarbonsäure oder Tricarbonsäure mit einem eine Gruppe der Formel (II) enthaltenden Amin können erfindungsgemäß achirale Moleküle hergestellt werden, die bis zu 6 (im Fall von Dicarbonsäuren) bzw. bis zu 9 (im Fall von Tricarbonsäuren) Gruppen der Formel (II) aufweisen. Da erfindungsgemäß die Kopplung von Aminen an Di- bzw. Tricarbonsäuren erfolgt, welche keine Aminosäuren sind, kann die Kopplung auf einfache Weise durchgeführt werden, ohne dass ein aufwändiges Syntheseverfahren unter Verwendung von Schutzgruppen notwendig wäre.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Konjugate der bifunktionalen, verzweigten Polymerverbindung mit biologisch aktiven Substanzen, wie Proteinen (z.B. humane Wachstumsfaktoren), Enzymen, Co-Faktoren für Enzyme (z.B. NAD+/NADH), Liposomen, Antikörpern, synthetischen, kleinen Wirkstoffen, Phosphoiipiden, Lipiden, Nucleosiden, Oligonucleotiden, Mikroorganismen, humanen Zellen und Oberflächen bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft deshalb auch Konjugate, umfassend Verbindungen der Formel (I) in kovalenter Verknüpfung an weitere Moleküle, insbesondere an Wirkstoffe, wie etwa Biopharmazeutika oder synthetische Wirkstoffe, oder biotechnologische Substanzen, die im Bereich „Life Science" eingesetzt werden, z.B. im Bereich Proteomics oder Diagnostik. Solche Substanzen sind z.B. Enzyme, insbesondere Proteasen, wie z.B. Trypsin oder Chymotrypsin. Die in den Konjugaten an den erfindungsgemäßen Verbindungen verknüpften Verbindungen sind vorzugsweise Biopharmazeutika, peptidische Wirkstoffe oder andere biologisch aktive Substanzen. Weiterhin können auch Konjugate mit Oberflächen oder Biokatalysatoren gebildet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Konjugate, umfassend Verbindungen der Formel (I) in kovalenter Verknüpfung an Medizinprodukte oder Hilfsmittel zur Darreichung von Wirkstoffen. Durch die Anknüpfung der erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise Gewebe für Heterotransplantate, wie beispielsweise Herzklappen, für den Empfänger verträglicher gemacht werden. Weiterhin können Hilfsmittel zur Darreichung von Wirkstoffen, beispielsweise Liposomen oder Nanokapseln, modifiziert werden, um ihnen gewünschte Eigenschaften, insbesondere eine längere Halbwertszeit im Körper, zu verleihen.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere die erfindungsgemäßen Konjugate. . Solche pharmazeutischen
Zusammensetzungen können beispielsweise zur Prävention oder Behandlung von Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechsel- Erkrankungen, neuronalen bzw. cerebralen Erkrankungen oder entzündlichen Prozessen, wie Infektionen, Immunerkrankungen oder Autoimmunerkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis) eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. Konjugate eignen sich auch hervorragend als diagnostische Mittel.
Aufgrund der Mehrkomponentenreaktion ist es erfindungsgemäß ohne weiteres möglich, eine große Vielfalt von Verbindungen nach Anspruch 1 herzustellen. Durch Variation der Edukte können über weite Bereiche variierende und den jeweiligen Erfordernissen angepasste Verbindungen erhalten werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind somit kombinatorische Bibliotheken bzw. die Herstellung solcher Bibliotheken, welche wenigstens zwei, mehr bevorzugt wenigstens fünf, noch mehr bevorzugt wenigstens 10 und am meisten bevorzugt wenigstens 100 der erfindungsgemäßen Substanzen enthalten. Mit Hilfe solcher Bibliotheken kann auf einfache Weise nach gewünschten Eigenschaften, beispielsweise Bindeeigenschaften an Wirkstoffmoleküle oder Abschirmeigenschaften für bestimmte Wirkstoffe oder nach gewünschten Targetingeigenschaften gescreent werden.
Schließlich ist es erfindungsgemäß ohne weiteres möglich, einen Kit zur Verfügung zu stellen, der alle Reagenzien und Anleitungen sowie die erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst, die es ermöglichen, eine Modifizierung von Proteinen, Nukleinsäuren oder anderen Wirkstoffen bzw. auch Oberflächen mit Polymeren in vitro auf einfache Weise durchzuführen. Die Umsetzung einer Substanz mit den erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt z.B. derart, dass zu einer Lösung oder einer Suspension der zu modifzierenden Substanz, z.B. eines Proteins, in wässrigem Puffer die erfindungsgemäße Polymer Verbindung mindestens in molarer Menge bezogen auf die Anzahl der modifizierbaren reaktiven Gruppen, z.B. Aminogruppen (Lysinreste, Histidin, N-Terminus), Carboxylgruppen (Asparaginsäure, Glutaminsäure, C-Terminus), Thiolgruppen (Cystein), Hydroxylgruppen (Serin, Threonin, Tyrosin) oder Carbonylgruppen (Aldehyde) gegeben wird. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Polymer Verbindungen in einem molaren Überschuss von 1 bis 1000, mehr bevorzugt in einem molaren Überschuss von 1 bis 100 und besonders bevorzugt in einem molaren Überschuss von 1 bis 20 bezogen auf die modifizierbaren Gruppen eingesetzt.
Als Reaktionslösungen eignen sich wässrige Puffer wie beispielsweise 0,001 bis 1 ,0 molare Lösungen von Natrium- oder Kalium-dihydrogenphosphat mit Dinatrium- oder Dikalium-hydrogenphosphat oder Natrium-, Kalium- oder Ammonium-hydrogencarbonat mit Dinatrium-, Dinatrium- oder Diammoniumcarbonat oder Tris(hydroxymethyl)-aminoethan mit Salzsäure, bevorzugt geeignet sind Pufferlösungen für den pH-Bereich zwischen pH 4 und pH 10, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und pH 9.
Dem Puffer können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Cosolventien Methanol, Ethanol, Propanol, i-Propanol, Butanol, Essigsäureethylester, Essigsäuremethylester, Dimethylformamid, Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Sulfolan in Mengen von 0,1 bis 50 Vol-%, mehr bevorzugt 0,1 bis 20 Vol-% zugesetzt werden, je nach Löslichkeit der Reaktionspartner. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 0°C und 90°C, bevorzugt bei 4°C bis 40°C.
Des Weiteren können den Puffern Stabilisatoren oder Detergenzien zugesetzt sein, z.B. Natriumazid, Glycerin, Ethylenglykole bzw. ionische oder nicht-ionische Detergenzien.. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Konjugat- Rohprodukte können weiterhin durch Dialyse, chromatographische Verfahren oder Ultrafiltration (auch solche für Zentrifugen) mit wässrigen Pufferlösungen oder reinem Wasser sowie durch dem Fachmann geläufige Verfahren gereinigt und dann der weiteren Anwendung zugeführt werden.
Der Strukturnachweis der Produkte (Konjugate), d.h. die analytische Anzahl der kovalent gebundenen erfindungsgemäßen Polymer-Verbindungen erfolgt durch die direkte Messung des Molekulargewichts, z.B. mittels der MALDI- TOF-Massenspektrometrie, durch selektive Bestimmung einer oder mehrerer kovalent gebundener Komponenten oder durch indirekten Nachweis der nicht modifizierten Gruppen. So lässt sich beispielsweise ein über die erfindungsgemäße Verbindung eingeführtes Farbstoffmolekül in einfacher Weise über die Messung der Extinktion (UVΛ IS) bestimmen. Ferner lässt sich beispielsweise die Zahl nicht modifizierter Aminogruppen durch Umsetzung mit Fluorescamin fluorometrisch bestimmen.
Als direkter Nachweis der Verbesserung der Eigenschaften des Konjugats aus einer erfindungsgemäßen Polymer Verbindung kann beispielsweise die Stabilität des Konjugats gegenüber Proteasen untersucht werden.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Beispiele und Abbildungen weiter erläutert:
Abbildung 1 : Analyse von Konjugaten aus L-Asparaginase und Substanz 16 mittels SDS-PAGE. Die Proben sind: Spuren 1 ) und 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), Spur 2) L- Asparaginase (Kontrolle, 2μg), Spur 3) modifizierte L-Asparaginase (0,5eq. Substanz 16), Spur 4) modifizierte L-Asparaginase (1eq. Substanz 16), Spur 5) modifizierte L-Asparaginase (2eq. Substanz 16), Spur 6) modifizierte L- Asparaginase (5eq. Substanz 16), Spur 7) modifizierte L-Asparaginase (10eq. Substanz 16) und Spur 8) modifizierte L-Asparaginase (20eq. Substanz 16).
Abbildung 2: Proteasestabilität eines Konjugats aus L-Asparaginase und der Substanz 16: Einfluss der Modifikation von L-Asparaginase mit Substanz 16 auf die Stabilität von L-Asparaginase gegenüber Trypsin abgeleitet aus der Restaktivität. Durch Modifikation mit Substanz 16 wird die Stabilität gegenüber Trypsin deutlich erhöht.
Abbildung 3: Einfluss der Modifikation von L-Asparaginase mit Substanz 16 auf die Stabilität von L-Asparaginase gegenüber Chymotrypsin abgeleitet aus der Restaktivität. Durch Modifikation mit Substanz 16 wird die Stabilität gegenüber Chymotrypsin deutlich erhöht.
Abbildung 4: Analyse von Konjugaten aus Streptokinase und Substanz 16 mittels SDS-PAGE. Die Proben sind: Spuren 1 ) und 8) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), Spur 2) Streptokinase (Kontrolle, 2μg), Spur 3) modifizierte Streptokinase (0,5eq. Substanz 16), Spur 4) modifizierte Streptokinase (1eq. Substanz 16), Spur 5) modifizierte Streptokinase (2eq. Substanz 16), Spur 6) modifizierte Streptokinase (5eq. Substanz 16) und Spur 7) modifizierte Streptokinase (10eq. Substanz 16).
Abbildung 5: Analyse von Konjugaten aus Trypsin und Substanz 16 mittels SDS-PAGE. Die Proben sind: Spuren 1 ), 2) und 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), Spur 2) Trypsin (Kontrolle, 2μg), Spur 3) modifiziertes Trypsin (0,5eq. Substanz 16), Spur 4) modifiziertes Trypsin (1eq. Substanz 16), Spur 5) modifiziertes Trypsin (2eq. Substanz 16), Spur 6) modifiziertes Trypsin (5eq. Substanz 16) und Spur 7) modifiziertes Trypsin (10eq. Substanz 16).
A. Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen gemäß Ansprüchen 1 bis 6
Im Rahmen der Mehrkomponentenreaktion werden eine Aminokomponente, eine Oxo- bzw. Carbonylkomponente, eine Isocyankomponente und eine Säurekomponente zur erfindungsgemäßen Verbindung umgesetzt. Die verwendeten primären Amine sind kommerziell erhältlich oder können, ausgehend von den Monomethoxypolyethylenglykolen, durch eine Gabriel- Synthese oder aus der entsprechenden Azidoverbindung durch katalytische Hydrierung hergestellt werden. Sekundäre Amine, symmetrisch oder unsymmetrisch, sind aus einem primären Amin durch reduktive Aminierung mit einem entsprechenden Aldehyd, der z.B. über eine Swern-Oxidation aus Monomethoxypolyethylenglykol erhalten wird, zugänglich oder können durch einfache Substitutionsreaktionen gewonnen werden.
Figure imgf000029_0001
1
MS (ES+): m/z: 398,2 [M+H]+, 420,2 [M+Na]+; C18H39O8.
Isonitrile sind im großen Umfang kommerziell erhältlich. Weiterhin steht eine große Anzahl von synthetischen Methoden zu deren Herstellung zur Verfügung. Ein sehr zuverlässiges Verfahren ist die Darstellung von Isonitrilen aus primären Aminen über die Umsetzung zum Formamid mit anschließender Dehydratisierung unter Verwendung von Phosgen oder POCI3 (I. Ugi; R. Meyr, Angew. Chem. 1958, 70, 702). Alternativ dazu können Isonitrile auf einfache Weise durch Umsetzung eines primären oder sekundären Amins mit einem Ω-Isocyanocarbonsäuremethyl- bzw. ethylester erhalten werden.
Schema: 1
Figure imgf000029_0002
Zu 2 (3,00 g; 18,4 mmol) wird unter Rühren Isocyanoessigsäuremethylester (1 ,82 g; 18,4 mmol) bei 20-25°C zugegeben. Die erhalten Reaktionsmischung wird anschließend 24 Stunden bei 20-25°C gerührt. Säulenchromatographische Reinigung ergibt 4 (3,64 g; 86 %) als hellgelbes
Öl.
MS (ES-): m/z: 229.2 [M-H]", MS (ES+): m/z: 231.1 [M+H]+; C10H18N2O4
Als Oxo- bzw. Carbonylkomponente kann eine große Anzahl an Aldehyden oder Ketonen verwendet werden. Um jedoch die Bildung von Chiralitätszentren und die sich daraus ergebenden Enatiomeren- bzw. Diastereomerengemischen (höherer Verzweigungsgrad) zu vermeiden, werden symmetrische Ketone, wie z.B. Aceton, und der einfache Formaldehyd bevorzugt verwendet. Zur Darstellung von Aldehyden des Polyethylenglykols bzw. Monomethoxyethylenglykols gibt es eine breite Auswahl an synthetischen Möglichkeiten. Sie können durch direkte Oxidation der terminalen Hydroxyfunktion (z.B. Swem-Oxidation) oder auch aus ungesättigten Ethern oder Estern (z.B. Allylethem) durch oxidative Spaltung der Doppelbindung (z.B. Ozonolyse, kat. OsO4/NalO4) erhalten werden.
Die Säurekomponente dient gleichzeitig als Linker für die spätere Kopplung an den Wirkstoff, sodass bevorzugt Carbonsäuren verwendet werden, die durch wenige synthetische Schritte nach erfolgreicher Mehrkomponentenreaktion in eine aktivierte Form der erfindungsgemäßen Verbindung umgewandelt werden können. Dies können Monoester von Dicarbonsäuren (z.B. Bernsteinsäure-mono-tert-butylester) oder ungesättigte Monocarbonsäuren (z.B. 4-Pentencarbonsäure) sein. Zur Erreichung eines höheren Verzweigungsgrades der erfindungsgemäßen Verbindung können N-substituierte Aminosäuren (z.B. N-Boc-L- Glutaminsäure, N-Boc-L- Asparaginsäure) oder höherverzweigte Carbonsäuren (z.B. Tricarbonsäure 7) verwendet werden.
7 ist einfach aus der CH-aziden Verbindung 5 in zwei Schritten zugänglich. Alternativ dazu kann diese Verbindung auch ausgehend von Malonsäure dargestellt werden (A.N. Blanchard, DJ. Burneil, Tetrahedron Lett. 2001, 42, 4779-4781 ). Solche Tricarbonsäuretriester können auch durch thermische Decarboxylierung in die Dicarbonsäurediester überführt werden, sodass sehr leicht eine Vielzahl von Dicarbonsäuren verfügbar wird. Schema 2:
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
Zu einer Suspension von NaH (34 mg; 60 % in Öl) in einer Mischung von THF (3 mL) und DMF (1mL) wird 5 (200 mg; 0,81 mmol) bei 20-25°C zugegeben. Nach ca. 10 min (Wasserstoffentwicklung) wird 5-Brom-1-penten (121 mg; 0,81 mmol) bei 20-25°C zugegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wird anschließend bei 50°C 48 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen auf 20-25°C wird die Reaktionsmischung mit einer Ammoniumchloridlösung (0,5 M; 2mL) verdünnt. Chromatographische Reinigung des Rohproduktes, das durch Extraktion mit Ethylacetat erhalten wird, ergibt 6 (214 mg; 84 %) als farbloses Öl. 1H-NMR (200 MHz, CDCI3): δ = 1 ,20-1 ,40 (11 H); 1 ,93-2,10 (4H); 2,97 (s, 2H); 4,15-4,25 (OCH2) 6H); 4,95-5,05 (2H); 5,70-5,85 (1 H) MS (ES+): m/z: 315,1 [M+H]+, 337,0 [M+Na]+; C16H26O6.
Zu einer Lösung von 6 (2,0 g; 6,4 mmol) in Ethanol (20mL) wurde NaOH (2M, 5mL) bei 20-25°C gegeben. Diese Mischung wurde auf 55°C erhitzt und anschließend 72 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend auf 20-25°C abgekühlt und das Ethanol wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser/Methanol (1 :1 , 20mL) gelöst und auf aktiviertes Dowex 50 (H+-Form 10 g) aufgegeben. Das Produkt wurde mit Wasser/MeOH (4:1 ,40 mL) eluiert. Azeotrope Destillation mit Toluol im Vakuum ergibt 7 (1 ,45 g, quantitativ) als weiß-grauen Feststoff.
1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1 ,15-1 ,29 (2H); 1 ,75-2,05 (4H); 2,72 (s, 2H); 4,87-5,05 (2H); 5,63-5,85 (1 H).
13H-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 23,39; 32,25; 33,41 ; 37,25; 54,43;
115,16; 138,33; 171 ,90; 172,31 ; 172,32.
MS (ES+): m/z: 231 ,0 [M+H]+, 253,0 [M+Na]+; C10H14O6.
Der Hauptschritt der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch eine Mehrkomponentenreaktion, wobei die Ugi-Reaktion mit drei (U- 3CR) oder vier (U-4CR) Komponenten in flüssiger Phase bevorzugt ist. Im Fall der U-4CR wird in flüssiger Phase die Aminkomponente mit der Oxokomponente, der Säurekomponente und einer Isocyanokomponente nach der folgenden allgemeinen Formel zur Reaktion gebracht:
Schema 3: Allgemeines Reaktionsschema U-4CR
w o
NH, + C=0 + -v + -NC
HO'
X w
H o w
-N- -N- -V
W X
Vorteilhaft ist es, je ein Äquivalent der Einzelkomponenten bei der Umsetzung zu verwenden. Weiterhin kann es auch von Vorteil sein, das Azomethin durch eine Vorkondensation zu bilden. Als Lösungsmittel können aprotische, polar sowie unpolar, und protische, polare verwendet werden. Besonders eigenen sich hierfür als protische Lösungsmittel Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Wasser bzw. Wasser/Alkoholgemische sowie DMF oder Acetonitril. Bei den aprotischen Lösungsmitteln werden häufig Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Chloroform verwendet. Lewis Säuren, wie Bortrifluoridetherat oder Zinkchlorid, wirken förderlich auf die Ugi- Reaktion. Üblicherweise werden die Reaktionen bei -20°C bis 100°C durchgeführt, jedoch sind Reaktionstemperaturen zwischen 0°C und 50°C bevorzugt.
Allgemeine Vorschrift:
Eine Lösung aus der Aminkomponente (3,4 mmol) und der Oxokomponente (3,4 mmol) in Methanol (30 mL) wird 10 - 15 min gerührt. Zu dieser Lösung wird anschließend das Isonitril (3,4 mmol) und die Säurekomponente (3,4 mmol) zugegeben. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt chromatographisch oder durch Kristallisation gereinigt.
Beispiel 1 :
Figure imgf000033_0001
1H-NMR (200 MHz, CDCI3): δ = 1 ,21 (t, 3H); 1 ,37 (s, 9H); 2,45-2,65 ( 4H); 3,32 (s, 3H) 3,45-3,65 (16H); 3,90-3,99 (2H); 4,05-4,16 (4H); 7,18 (t, NH) MS (ES+): m/z: 507,3 [M+H]+, 529,3 [M+Na]+; C23H42N2O10.
Beispiel 2:
Figure imgf000033_0002
MS (ES+): m/z: 624,4 [M+H]+, 646,4 [M+Na]+; C28H53O 12 Beispiel 3:
Figure imgf000034_0001
MS (ES+): m/z: 902,9 [M+H]+; (ES-): m/z: 879,1 [M-H]"; C40H73N5O16
Beispiel 4:
Figure imgf000034_0002
MS (ES+): m/z: 916,3 [M+H]+; 938,3 [M+Na]+; C49H78N4O12
Weiterhin kann es von Vorteil sein, Säurekomponenten zu verwenden, die gleichzeitig als Schutzgruppe der Aminofunktionalität dienen. Solche Schutzgruppen können anschließend entfernt werden, sodass das gebildete sekundäre Amin auch über allgemein bekannte Methoden aus der Peptidchemie später an Carbonsäuren gekoppelt werden kann. Beispiele für solche Säuren sind Trifluoressigsäure oder 4-Pentencarbonsäure.
Beispiel: 5
Figure imgf000035_0001
MS (ES+): m/z: 465,3 [M+H]+; 487,3 [M+Na]+; C25H40N2O6
Beispiel 6:
Figure imgf000035_0002
MS (ES+): m/z: 608,6 [M+H]+; 630,3 [M+Na]+; C24H44F3 30^
In manchen Fällen kann es von Vorteil sein, die Säurekomponente durch eine Säure zu ersetzen, die nicht im Sinne der Ugi-Reaktion reagiert. Als Säuren kommen z.B. Mineralsäuren, wie Salz- oder Schwefelsäure, Sulfonsäuren und Lewissäuren, wie Bortrifluoridetherat oder lnCI3 zum Einsatz. Wasser übernimmt bei dieser U-3CR die Funktion der Säurekomponente, wobei ein sekundäres Amin gebildet wird. Dieses sekundäre Amin kann danach durch verschiedene Amidierungsmethoden, die aus der Peptidchemie bereits bekannt sind, an verzweigte oder unverzweigte Carbonsäurefunktionalitäten gekoppelt werden. Im Fall der U- 3CR wird in flüssiger Phase die Aminkomponente mit der Oxokomponente, der Säurekomponente (z.B. Schwefelsäure) und einer Isocyanokomponente nach der folgenden allgemeinen Formel zur Reaktion gebracht:
Schema 3: allgemeines Reaktionsschema U-3CR
Figure imgf000036_0001
Vorteilhaft ist es, je ein Äquivalent der Einzelkomponenten bei der Umsetzung zu verwenden. Weiterhin kann es auch von Vorteil sein, das Azomethin durch eine Vorkondensation zu bilden. Als Lösungsmittel können aprotische, polar sowie unpolar, und protische, polare verwendet werden. Besonders eigenen sich hierfür als protische Lösungsmittel Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Wasser bzw. Wasser/Alkoholgemische sowie DMF oder Acetonitril. Bei den aprotischen Lösungsmitteln werden häufig Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Chloroform verwendet. Üblicherweise werden die Reaktionen bei -20°C bis 100°C durchgeführt, jedoch sind Reaktionstemperaturen zwischen 0°C und 50°C bevorzugt.
Allgemeine Vorschrift:
Eine Lösung aus der Aminkomponente (1 ,2 mmol) und der Oxokomponente (1 ,2 mmol) in Methanol (2 mL) wird 10 - 15 min gerührt. Zu dieser Lösung wird anschließend das Isonitril (1 ,2 mmol) und die Säure oder eine Lewis Säure (1 ,2 mmol) zugegeben. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt chromatographisch oder durch Kristallisation gereinigt. Beispiel 7:
Figure imgf000037_0001
14
MS (ES+): m/z: 349,4 [M+H]+, 371 ,4 [M+Na]+; C16H32N2O6
Umwandlung zu einem Aktivester am Beispiel von 7
Die Spaltung des tert-Butylesters erfolgt unter Standardbedingungen z.B. mit Mineralsäuren wie HCI oder HCI in Dioxan. Alternativ dazu kann auch Trifluoressigsäure verwendet werden.
Figure imgf000037_0002
MS (ES+): m/z: 451 ,2 [M+H]+, 473,2 [M+Na]+; C19H34N2O10
Durch Umsetzung von 15 mit DCC und N-Hydroxysuccinimid wird 16 erhalten.
Figure imgf000037_0003
1H-NMR (200 MHz, CDCI3): δ = 1 ,23 (t, 3H); 2,64-2,70 (2H); 2,82 (bs, 4H); 2,93-3,00 (2H) 3,36 (s, 3H) 3,50-3,72 (16H); 3,96-4,05 (2H); 4,08-4,20 (4H); 7,14 (t, NH) MS (ES+): m/z: 548,3 [M+H]+, 570,3 [M+Na]+; C23H37N3O12 B. Beispiele für die Modifikation von biopharmazeutischen, pharmazeutischen oder/und synthetischen Wirkstoffen mit erfindungsgemäßen Verbindungen
Die folgenden Beispiele sollen den Nutzen der erfindungsgemäßen Verbindungen demonstrieren, die Erfindung jedoch nicht einschränken.
Allgemeine Methoden: Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford mit Coomassie Brilliant Blau G-250 mit Rinderserumalbumin als Referenzprotein ermittelt (Bradford 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254. ). Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (SDS-PGAE) wurden nach Laemmli (1970) mit 7,5% Polyacrylamidgelen durchgeführt. Proteine wurden anschließend mit Coomassie Brilliant Blau R-250 angefärbt. Der Grad der Modifikation von Lysinresten wurde nach der Methode von Stocks et al. (Stocks et. al. 1986, Anal. Biochem. 154, 232-234) durch Quantifizierung der nicht modifzierten Aminogruppen mit Fluorescamin bestimmt (λex = 390nm; λem= 475nm).
Für die Experimente wurden Rinderserumalbumin (kurz: BSA, Sigma), L- Asparaginase (kurz: ASNase, ProThera), Streptokinase (Sigma), Trypsin (Sigma) und Chymotrypsin (Sigma) verwendet.
Bestimmung der Enzymaktivitäten: L-Asparaginase katalysiert die Deamidierung von L-Asparagin zu L-Asparaginsäure. Bei dieser Reaktion freiwerdendes Ammonium wurde zur Bestimmung der Enzymaktivität mittels Neßler Reagenz quantifiziert. Streptokinase aktiviert Plasminogen. Auf diese Weise aktiviertes Plasminogen katalysiert die Hydrolyse des Tripeptid- Derivates D-Val-Leu-Lys-para-Nitroanilid (S-2251). Zur indirekten Bestimmung der Aktivität von Streptokinase wurde die Menge an freigesetzten Nitroanilins photometrisch bei 405nm quantifiziert. Die peptidolytische Aktivität von Trypsin wurde mithilfe des para-Nitroanilid- Derivates α-Benzoyl-Arginin-para-Nitroanilid durch Quantifizierung des freigesetzten Nitroanilins photometrisch bei 405nm ermittelt.
Untersuchung der Stabilität der erfindungsgemäßen Konjugate gegenüber Proteolyse durch Trypsin bzw. Chymotrypsin: Die Konjugate, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung kovalent gekoppelt an einen biopharmazeutischen, pharmazeutischen oder synthetischen Wirkstoff, wurden in Gegenwart von Trypsin oder Chymotrypsin für mindestens 90min bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und aus diesen die Restaktivität des zu untersuchenden Konjugats bestimmt. Trypsin spaltet Peptide und Proteine vorzugsweise C- terminal von basischen Aminosäuren (Lysin- und Argininresten), Chymotrypsin vorzugsweise C-terminal von aromatischen Aminosäuren (Tryptophan-, Phenylalanin- und Tyrosinresten).
Beispiel B1 :
Herstellung eines Konjugates aus einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Substanz 16 und L-Asparaginase.
Zu 75μL einer L-Asparaginase-Lösung (0,5mg/mL) in Natriumcarbonat- Puffer (pH 8,5 bis 9,5) wurde Substanz 16 (0,5eq./0,7μL, 1eq./1 ,4μL, 2eq./2,7μL, 5eq./6,8μL, 10eq./13,7μL bzw. 20eq./27,3μL) gelöst in Dimethylsulfoxid (10mg/mL) gegeben und mit Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) auf ein Gesamtvolumen von 150μL aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde 1h bei 25°C und 300rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Substanz 16 mittels Filtration in Zentrifugenfiltrationseinheiten (10kDa cut-off) mit Wasser als Spülflüssigkeit entfernt.
Durch die Modifizierung wird die Aktivität der L-Asparaginase nur geringfügig vermindert. Bei einem PEGlyierungsgrad von 41% auf 75% Restaktivität, bei einem PEGylierungsgrad von 43% auf 60% Restaktivität, (vgl. Tabelle 1)
Die Stabilität gegenüber Proteasen (Trypsin und Chymotrypsin) wird durch die PEGylierung mit Substanz 16 dagegen deutlich gesteigert, (vgl.
Abbildungen 1 und 2) Tabelle 1 : Grad der Modifizierung und Restaktivität der Konjugate aus L- Asparaginase und Substanz 16
Figure imgf000040_0001
Beispiel B2:
Herstellung eines Konjugates aus einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Substanz 16 und Streptokinase. Zu 120μL einer Streptokinase-Lösung (0,25mg/mL) in Natriumcarbonat- Puffer (pH 8,5 bis 9,5) wurde Substanz 16 (0,5eq./0,9μL, 1eq./2,1 μL, 2eq./3,9μL, 5eq./10,2μL bzw. 10eq./20,1 μL) gelöst in Dimethylsulfoxid (5mg/mL) gegeben und mit Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) auf ein Gesamtvolumen von 150μL aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde 1 h bei 25°C und 300rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Substanz 16 mittels Filtration in Zentrifugenfiltrationseinheiten (10kDa cut-off) mit Wasser als Spülflüssigkeit entfernt.
Streptokinase wird bei 10 eingesetzten Äquivalenten der Substanz 16 zu 100% an den Lysin-Resten modifiziert, (vgl. Tabelle 2)
Tabelle 2: Grad der Modifizierung der Konjugate aus Streptokinase und Substanz 16
Figure imgf000040_0002
Beispiel B3:
Herstellung eines Konjugates aus einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Substanz 16 und Trypsin.
Zu 120μL einer Trγpsin-Lösung (1 ,0mg/mL) in Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) wurde Substanz 16 (0,5eq./1 ,5μL, 1eq./2,7μL, 2eq./5,4μL, 5eq. I3,8μL bzw. 10eq./27,3μL) gelöst in Dimethylsulfoxid (10mg/mL) gegeben und mit Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) auf ein Gesamtvolumen von 150μL aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde 1 h bei 25°C und 300rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Substanz 16 mittels Filtration in Zentrifugenfiltrationseinheiten (10kDa cut-off) mit Wasser als Spülflüssigkeit entfernt.
Trypsin wird mit 10 Äquivalenten Substanz 16 zu 44% an den Lysin-Resten modifiziert. Die Restaktivität steigt dabei auf 137%. Die Aktivitätszunahme durch Modifizierung mit Polyethylenglykolhaltigen Reagenzien wird in der Literatur durch eine Veränderung der Mikroumgebung des aktiven Zentrums erklärt (Zhang, Z., He, Z. & Guan, G. (1999) in Biotechnology Techniques 13: 781-786).
Tabelle 3: Grad der Modifizierung und Restaktivität der Konjugate aus Tryspin und Substanz 16
Figure imgf000041_0001
C. Weitere Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen gemäß Ansprüchen 1 bis 6
Figure imgf000042_0001
Formel (Xllb)
Ausführungsbeispiel für Formel (Xllb):
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000043_0001
Formel (Xllc)
Ausführungsbeispiel Formel (Xllc):
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000044_0001
Formel (XV)
Ausführungsbeispiel für Formel (XV):
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000045_0001
Formel (XVI)
Ausführungsbeispiel für Formel (XVI):
Figure imgf000045_0002
In den Beispielen C (Formeln Xllb, Xllc, XV und XVI) bedeuten: P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, C C4-Alkyl, O-R2 oder CO-R3, R1 H, OH oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen, R3 OH oder NR4R5,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, d, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000, c, x bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 10 und a, b, p, y unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 50 und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1.

Claims

Ansprüche
1. Verbindungen der Formel (I)
o w O
-N - -N - -V
W X Formel (la)
H O W o
-N- -O- -V
W Formel (Ib)
worin die Reste V, W, X und Z jeweils unabhängig voneinander einen
Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher Heteroatome enthalten kann oder/und V, W, oder/und X Wasserstoff darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Reste V, W, X oder/und Z eine Bindegruppe Y trägt und dass die Reste V, W, X und Z zusammen mindestens eine Gruppe der Formel (II)
Figure imgf000047_0001
Formel (II)
aufweisen, worin
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, O-R2 oder CO-R3 darstellt,
R., H oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome enthalten kann,
R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt,
R3 OH oder NR4R5 ist,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bindegruppe Y ausgewählt ist aus Gruppen, die mit einer Aminogruppe, einer Thiolgruppe, einer Carboxylgruppe, einer
Guanidingruppe, einer Carbonylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Heterozyklus, einer C-nukleophilen Gruppe, einer C-elektrophilen Gruppe, einem Phosphat oder einem Sulfat bindefähig sind oder ein Chelat oder einen Komplex mit Metallen bilden können oder eine Bindung an Silicium-haltigen Oberflächen eingehen können.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens zwei Gruppen der Formel (II) enthält.
4. Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reste X oder/und Z verzweigt ist und mindestens zwei Gruppen der Formel (II) enthält.
5. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reste X oder/und Z weiterhin eine Targeting-Gruppierung aufweist.
6. Verbindung mit der Formel (XIV)
Figure imgf000049_0001
worin h, i bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 sind, g und f bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, bevorzugt zwischen 0 und 5 sind, A bei jedem Auftreten für H oder -(CO)-NX2 steht und
Xι> X2> X3 ur|d X4 sowie X jeweils unabhängig voneinander die oben für X angegebenen Bedeutungen aufweisen.
7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer
Mehrkomponentenreaktion als Edukte die Verbindungen der Formeln
X'-NH2 (IV)
(W')2C = O (V)
Z'-NC (VI) und
V'-COOH (VII)
miteinander umsetzt, wobei V, W, X' und Z' jeweils unabhängig voneinander einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann oder/und V, W oder/und X' Wasserstoff darstellen, wobei wenigstens einer der Reste V, W, X' und Z' eine Bindegruppe Y trägt und wobei die Reste V, W, X' und 71 zusammen mindestens eine Gruppe der Formel (II)
Rt "(CH)X- -[Q]q- — (CH)y
n Formel (II)
aufweisen, worin
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, O-R2 oder CO-R3 darstellt,
R1 H oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome enthalten kann,
R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt,
R3 OH oder NR4R5 ist,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Reste V, W, X' oder/und Z mindestens eine weitere Funktionalität, ausgewählt aus NH2, C=O, NC oder/und COOH enthält.
9. Konjugat, umfassend eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der
Ansprüche 1 bis 6 definiert, kovalent gebunden an einen biopharmazeutischen, pharmazeutischen oder/und synthetischen Wirkstoff.
10. Konjugat, umfassend eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, kovalent gebunden an eine Oberfläche oder/und einen Biokatalysator.
11. Konjugat, umfassend eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, kovalent gebunden an ein Enzym.
12. Konjugat umfassend eine Verbindung der Formel (I) wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert kovalent gebunden an Medizinprodukte oder Hilfsmittel zur Darreichung von Wirkstoffen.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Konjugat nach Anspruch 9 oder 11.
14. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Konjugat nach Anspruch 9 oder 10.
15. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 9 zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung von Krebs oder Herz-Kreislauf- Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen, neuronale bzw. cerebrale Erkrankungen, z.B. Alzheimer oder Parkinson, oder entzündlichen Prozessen, z.B. Infektionen und Immun- oder Autoimmumerkrankungen, insbesondere rheumatoide Arthritis.
16. Verfahren zur Herstellung einer Substanzbibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass man gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 wenigstens zwei verschiedene Verbindungen gemäß Anspruch 1 herstellt.
17. Substanzbibliothek, umfassend mindestens zwei unterschiedliche Verbindungen der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.
18. Kit, umfassend
(a) wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie
(b) Pufferlösungen und gegebenenfalls (c) Standard proteine oder/und Mittel zur Aufreinigung von
Konjugaten, gebildet mit der Verbindung aus (a).
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