JP2005538947A - 化学修飾のための活性糖質含有保護試薬、その製造及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１個のヒドロキシル基でポリマー鎖に結合されており、かつ糖質中心単位のアノマー位で活性結合基に結合している糖質中心単位により表される新規の活性糖質含有保護試薬に関する。前記の新規化合物は、活性糖質含有保護試薬、グリコデンドリマー及び関連する親水性オリゴマーである。更に、本発明は、その製造法、及び、バイオテクノロジー的使用のために有利な前記試薬により修飾されている生体活性分子の製造のためのその使用に関する。

Description

本発明は、少なくとも１個のヒドロキシル基でポリマー鎖に結合されており、かつ糖質中心単位のアノマー位で活性結合基に結合している糖質中心単位により表される新規の活性糖質含有保護試薬に関する。前記の新規化合物は、糖質含有保護試薬、グリコデンドリマー及び関連する親水性オリゴマーである。更に、本発明は、その製造法、及び、バイオテクノロジー的使用に有利な前記試薬により修飾されている生体活性分子の製造のためのその使用に関する。

それぞれ種々の有機体から単離及び製造されたより一層多くの生体活性高分子と共に、バイオテクノロジーの新時代が到来している。更に、タンパク質をベースとする医薬品は薬物市場へますます進出している。バイオテクノロジーにより製造された多くの医薬品は、インビボでの比較的短い半減期（クリアランス及び免疫媒介失活）及び強度の免疫原性を被っている。

上記の欠点を回避するための１つの可能性は、生体活性分子又は薬物担体への親水性ポリマーの共有結合による化学修飾である。そのようなポリマーを用いた小分子薬物の変性が、より低い毒性をもたらし、かつ、小分子薬物の製薬学的特性にその他の有利な効果を示すことも認められている。

最も一般的な親水性ポリマーはポリエチレングリコールであり、これは単に”ＰＥＧ”と呼称される。これが一般的に使用されている理由は、ポリマーＰＥＧの低い毒性であり、これはポリマーＰＥＧが生物学的適合性であることを意味する。バイオテクノロジー的な適用のための例として、市販の活性化されたポリマーＰＥＧは、タンパク質及び酵素に結合される。このような複合体は、インビボで、劇的に増加された半減期、低下された毒性及び腎臓クリアランスの低下された速度を示す。更に、複合体は、水性系中での高められた溶解度を示す。そのような適用に関する適当な概観は、N. K. Jainら、Pharmazie 2002, 57, 5-29 ”Pegnology: a review of PEG-ylated systems”により与えられている。

小分子薬物の場合、化学療法のドキソルビシンを含有する複合体が、修飾されていないドキソルビシンと比較して著しく低下された毒性を示すことが明らかとなっている(F. Kratzら、Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7, 2517-2524)。

近年、生物学的適合性ポリマー、例えばＰＥＧ又はその他の親水性ポリマーを用いてタンパク質を共有結合により修飾するための数多くの手段が存在する。タンパク質の修飾は、循環時間の延長、及びそれぞれ免疫原性又は毒性の回避を目的としている(Zalipsky, S. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, 16, 157-182)。

この技術が更に開発されたとしても、幾つかの重大な欠点が残る：多くの場合におけるＰＥＧでの生物薬物の修飾は、その生体活性の劇的な低下をもたらす。更に、ＰＥＧのようなポリマーは幅広い範囲の種々の分子量により特徴付けられており（多分散性）、これは、それぞれ、製造及び／又は修飾の再現性に関する問題を引き起こす。ｍＰＥＧ（モノメトキシＰＥＧ）の品質及び活性のタイプに応じて、不所望の架橋反応が生じる場合もある。

要約すれば、バイオテクノロジー的生成物（例えば、タンパク質、表面）又は小薬物の修飾のために使用することができる、新規の親水性オリゴマー又はポリマーが非常に求められている。本発明は、この不足を克服することを目的としている。本発明の基礎となる課題は、バイオテクノロジー的生成物及び小分子薬物の修飾のために使用することができるそのような親水性の物質を創作することである。上記の従来技術に関して、本発明は、その課題のために、タンパク質又はペプチドのアミノ官能基及びバイオテクノロジー的生成物の他の官能基と水溶液中で穏やかな条件下で反応する活性化された結合基を有するポリマーを提供しなければならない。

本発明は、少なくとも１個のそのヒドロキシル基でポリマー鎖に結合されており、かつ、糖質中心単位のアノマー位（１位）で活性化結合単位に結合している、糖質中心単位により表される活性糖質含有保護試薬、この化合物のクラスの合成処理（方法）、及び、以下に記載されるようなバイオテクノロジー的生成物及び小分子薬物の官能基への共有結合のためのその使用に関する。本発明による活性糖質含有保護試薬は、いかなる架橋反応をも支持しない単一の活性化官能基を有する（例えば活性エステル）。

新規の活性糖質含有化合物は、親水性の生物学的適合性化合物である。これらは製造が容易であり、特性は、幅広い範囲の適用を可能にする。前記の活性糖質含有化合物と生体活性物質との複合体は、延長された治療のための適当である。更に、新規の活性糖質含有化合物は、これらを医学的材料として使用するため、即ち、例えばウイルス又はバクテリア感染の治療のための、又はガン治療のための新規のマスキング剤を含有する生体活性化合物の複合体の治療用量を投与するためにも適当である。

本発明によれば、活性糖質含有保護試薬と、生体活性化合物、例えばタンパク質（例えばヒト成長因子）、酵素、リポソーム、抗体、薬物、リン脂質、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、微生物、ヒト細胞及び表面との複合体も提供される。

活性糖質含有保護試薬は、一般式Ｉ

［式中、
グリコシド中心単位Ｇは、少なくとも１個のヒドロキシル基でポリマー鎖に結合されており、かつアノマー位（１−位）で、他の官能基と容易に反応することができる活性化結合基に結合しており、その際、
Ｇは、グリコシド中心単位であり、これは、単糖類、それぞれ単糖類単位を構成するオリゴ糖類及び多糖類、アミノ糖又はポリオールであり、
Ｒ−ｐｏｌｙ−は、１個以上の繰り返しモノマー単位を有するポリマー鎖、又は
結合基を介して別のグリコシド単位Ｇに結合している繰り返し構成単位ＩＩ

（ここで、
Ｐはアミノ保護基、又は次の繰り返し構成単位、又は末端単位Ｉであり、
ここで、
Ｒは、Ｈ、ＯＨ、又は、アルキル、Ｏ−アルキル（１〜２０個のＣ原子）、ベンジル、アリール、アセタール、アルデヒド、アルケニル、アクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アルキルアミン、保護されたアルキルアミン、又はアミン、チオール及び保護されたチオールから成る群から選択されているか、又は、単糖類、それぞれ単糖類単位を構成するオリゴ糖類及び多糖類、アミノ糖質又はポリオールから成る群から選択されており、かつ
ｐｏｌｙは、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオレフィンアルコール及びポリアクリロモルホリンから選択されている）
であり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ_２−、Ｏ_２ＣＮＨ−、−ＣＳＮＨ−及び−ＮＨＣＳ−から選択されており、
ｍは、１〜１０、有利に１〜６であり、
Ｙは、（Ｏ−アルキル）_２、−ＯＳＯ_２ＣＨ_２ＣＦ_３（トレシル）、−ＣＯ−Ｑ、マレイミド、−Ｏ−ＣＯ−ニトロフェニル、又は−トリクロロフェニル、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）、−Ｓ−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、−Ｓ−Ｓ−アリール、−Ｓ−ベンジル、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＯＨ、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＮＨ_２、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＯＳＯ_２ＣＨ_２ＣＦ_３及び−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＣＯ_２−Ｑ、−ＳＯ−アルケニル、−ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）の群から選択されており、
ここで、
Ｑは、Ｈ又はＯＨであるか、又は、Ｏ−アリール、Ｏ−ベンジル、Ｏ−Ｎ−スクシンイミド、Ｏ−Ｎ−スルホスクシンイミド、Ｏ−Ｎ−フタルイミド、Ｏ−Ｎ−グルタルイミド、Ｏ−Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、−Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの群から選択されており、
かつ、
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−、−Ｎ（アルキルＣ_１〜Ｃ_２０）−、−Ｎ（アリール）−、−Ｎ（ベンジル）−、−Ｎ（アルキルＣ_１〜Ｃ_２０−ＯＨ）−、−Ｎ（アルキルＣ_１〜Ｃ_２０−ＮＨ_２）−及び−Ｎ（アルケニル）−から選択されている］
により表される。

グリコシド中心単位は、Ｌ−又はＤ−配位で表され、グリコシド中心単位のアノマー位（１−位）での配位は、アルファ、ベータ又は両者の混合物である。

本発明によれば、有利なグリコシド単位は、単糖類、例えばアルドース、有利にグルコース；ケトース、有利にフルクトース；ピラノース、有利にマンノース、グルコース；フラノース、有利にリボース及びアラビノースである。それぞれ単糖類単位を構成する特定のオリゴ糖類及び多糖類の例は、ラクトース及びメリビオースである。典型的な単糖類は、アミノ糖質、有利にマンノースアミン、グルコースアミン及びラクトースアミンである。

Ｒのための有利なアセタール基には（ＣＨ_３Ｏ）_２−及び（ＣＨ_３−ＣＨ_２Ｏ）_２−が含まれ、アルデヒド基はＯＨＣ−ＣＨ_２−Ｏ−であり、アルケニル基はＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＨ_２−Ｏ−であり、アクリレート基はＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＯ_２−であり、メタクリレート基はＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−ＣＯ_２−であり、アクリルアミド基にはＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−が含まれ、アミノアルキル基はＨ_２Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−であり、保護されたアミノアルキル基にはＷ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−が含まれ、その際、Ｗはアミノ保護基、例えばＢｏｃ、Ｆｍｏｃ及びＣｂｚであり、チオアルキル基はＨＳ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−であり、保護されたチオアルキル基にはＶ−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−が含まれ、その際、Ｖはチオール保護基である。

ここで用いられている”ポリ”という用語は、ポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、例えばモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）又はオキシエチル化トリエタノールアミン、ＴＥＡ（ＯＥ）、ポリオレフィンアルコール、例えばポリビニルアルコールを指す。

ポリマー鎖が片側でメトキシ基を末端基とするポリマーは有利である。

更に、ポリマー鎖が、一般構造式：
Ｒ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｘ−
［式中、
Ｒ及びＸは上記に定義された通りであり、ｎは０〜２０００であるか、又は、
Ｒは、以下の構造式ＩＩＩ又はＩＶ

（ここで、
ｎ、ｍ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記に定義された通りであり、
ａｌｋｙｌは、１〜２０個のＣ原子を表し、
Ｕは、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＨ−から選択されている）
の１つを有する繰り返し構成単位でもあり、
その際、本発明による保護試薬において、グリコデンドリマー繰り返し構成単位が一般に４〜１０００回含まれている］
により表されるポリエチレングリコールであるポリマーは有利である。

更に、ポリマー鎖は末端を除き非置換鎖であってもよいし、ランダムコポリマー又はブロックコポリマー又はターポリマーであってもよい。以下の構造式Ｖ：

［式中、
ｍ、ｐｏｌｙ、Ｑ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記に定義された通りである］
を有するグリコシド中心単位としてのグルコースを有する活性保護試薬は殊に有利である。

本発明の活性糖質含有保護試薬（Ｉ）は、有利に、アルキル化（ウィリアムソンエーテル合成）、又は、アノマー位にペンテニル基を有するグリコシドとポリマーとの間のその他の求核置換反応（例えばウレタン形成）により製造されることができる。反応は溶液中で実施される。生じる合成中間生成物のペンテニル基は、合成スキーム１に示すように活性糖質含有保護試薬へと変換される（Fraser-Reid, B.; Journal of Organic Chemistry 2000, vol. 65, pp. 958-963）。

活性保護試薬を製造するために使用される有利なポリマーはポリエチレングリコールであり、これは４−ペンテン−１−イルグリコシドに共有結合している。ペンテニル基は多官能価基であり、これは数多くの種々の活性化されたリンカーへと変換されることができる。このポリマーを含有するペンテニルグリコシドは構成単位としても使用され、より大きな分枝鎖の集合体（グリコデンドリマー又はその一部）が形成される。分枝鎖の活性糖質含有保護試薬は、緩やかな反応条件下で水溶液中でタンパク質及びペプチドのアミノ官能基と容易に反応する。樹枝状化合物は、アミド、ウレタン、チオウレタン、カルバメート、エーテル、チオエーテル、２級アミンの形成により（還元アミノ化、トレシル化又はハロゲン化結合単位との反応）ポリペプチド主鎖に結合される。

本発明による活性糖質含有保護試薬は、特別な分子量のものである必要はない。活性糖質含有保護試薬の有利な調製物は、５００〜６００００、更に有利に８００〜２００００の分子量を有する。

本発明による活性糖質含有保護試薬の優先性は、まず、小サイズの試薬が単分散化合物であるという事実であり、これは、均質な保護試薬の製造、これらの試薬を有する複合体の分析において、これらの複合体の精製において、及び調節の問題に関する規格の定義において有利である。

本発明において提供される、”傘状”構造の活性糖質含有保護試薬は、複合された生体活性化合物のタンパク質分解に対する高められた安定性による保護特性が示された。そのような複合体の生体活性は保持され、修飾反応の間、いかなる架橋も生じない。それに対して、修飾のために一般的な活性化されたｍＰＥＧが使用される場合、不所望の架橋反応は重大な問題であり、それというのも、市販のｍＰＥＧは適当な量のジヒドロキシポリエチレングリコールを含有し、これは、ｍＰＥＧのための製造プロセスの間に活性化され、その後、架橋剤として機能する。本発明において、そのような分枝鎖の試薬は、タンパク質分解からのタンパク質の保護において、及び免疫原性の低減において、より効果的である。

活性糖質含有保護試薬は、少なくとも１つの生体活性分子、表面又は全細胞との、水溶性及び分離性複合体の製造において使用される。生体活性分子は、有利に、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド（例えばヒト成長因子）、酵素、リポソーム、抗体、薬剤、リン脂質、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、微生物、ヒト細胞、染料及び表面の群から選択されている。

有利な実施態様において、水溶性及び分離性複合体は、構造式ＶＩ又はＶＩＩ：

［式中、
ｍ、ｐｏｌｙ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記の意味を有し、単位ＮＨ−ＰＥＰは、生体活性分子の修飾されたアミノ基（例えばリシン基）を表す］
を有する。

本発明において、活性糖質含有保護試薬との複合体が使用され、生体活性化合物が保護され、これらの生体活性化合物の分子量が増加され、従って腎臓クリアランスが低減され、それぞれ抗体及び抗原処理細胞の形成が阻害され、かつタンパク質分解が最小化される。更に、そのような化学修飾は、薬物の溶解性に関する生物物理学的特性を改善するために使用される。活性糖質含有保護試薬は、（ＡＰＩの）疎水性活性製薬学的成分の溶解性を高めるために使用される。これらの製薬学的処方物の特別な種は、疎水性薬物の投与を容易にする。

更に、活性糖質含有保護試薬は、有機溶剤中での良好な溶解性によっても特徴付けられ、従って、新規の保護試薬を用いた生体触媒（例えば酵素）の修飾は、有機溶剤中での修飾された生体触媒の溶解性を増大させ、これは工業的な使用のための重要な適用である。

更に、本発明による活性糖質含有保護試薬は、薬物輸送及び標的となる系（例えばリポソーム及び抗体）を修飾するのに使用され、これは、これらの技術のための適用の新規の分野を開拓するものである。

更に、活性糖質含有保護試薬は、生体活性分子を同じか又は異なっていてよい他の生体活性分子に結合すること、又は生体活性分子を表面に結合させることができる。

有利な実施態様において、本発明の試薬は、酵素、例えばアスパラギナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）、グルコセレブロシダーゼの化学修飾、サイトカイン、例えばアルファ−インターフェロン、インターフェロンベータ１−ｂ、Ｇ−ＣＳＦの化学修飾、又はその他の治療において適当なタンパク質、例えばＴＮＦ、ヒトインスリン、抗体又は抗体断片及び小分子薬物、例えばドキソルビシン及びパクリタキセルの化学修飾のために適当である。

新規の糖質含有保護試薬は、殊に、製薬学的活性成分の化学修飾のために適当である。製薬学的有用性は、（例えば）複合体の著しく増加されたプロテアーゼ安定性により特徴付けられる。従って、新規の糖質含有保護試薬を用いた修飾は、インビボでの循環時間を延長し、これは、多くのバイオテクノロジー的生成物を製薬学的に使用するために必要とされている。

以下の実施例は本発明を説明するために与えられるものであるが、本発明を制限するべきではない：

実施例１
合成
例構造
以下に示されたスキームＶＩＩＩ及びＩＸでは、ポリエチレングリコール鎖は、エーテル結合を介して糖質中心単位に共役結合されている。

ｎは０〜１０００で定義されている。

以下に示されたスキームＸ及びＸＩでは、ポリエチレングリコール鎖は、カルバメート結合を介して糖質中心単位に共役結合されている。

ｎは０〜１０００で定義されている。

以下のスキームＸＩＩは、２つの結合手段を結合している、分枝鎖の大サイズの構造を示す。

実施例１ａ
化合物６の合成

ジクロロメタン（２０ｍｌ）及び４−ペンテン−１−オール（２．７ｍＬ）中の１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノース（５ｇ）の溶液に、ＢＦ_３Ｅｔ_２Ｏ（３．２ｍＬ）を２０〜３０℃で添加する。反応混合物を２０〜２５℃で４時間撹拌する。その後、反応混合物をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、次いで、ＮａＯＨ溶液（０．５Ｍ、７０ｍＬ）を添加し、反応混合物のｐＨを約６に調節する。有機相を分離し、重炭酸塩溶液（５％、５０ｍＬ）で洗浄する。有機相の蒸発により、粗製グリコシル化生成物（６ｇ）が黄色の油状物として得られた。

メタノール（４ｍＬ）中に溶解されたナトリウム（３２０ｍｇ）を、メタノール（２６ｍＬ）中の粗製材料（６ｇ）の溶液に２０〜２５℃で添加する。ナトリウムメチレートの添加後すぐに、白色沈殿が生じる。反応混合物を２０〜２５℃で２時間撹拌する。その後、反応混合物のｐＨが５〜６に調節されるまで塩酸（１Ｍ）を添加することにより反応をクエンチする。溶剤の蒸発及び粗製材料の精製により、２（１．８ｇ）が無色の油状物として得られた。

ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解された２（２．２ｇ）に、水素化ナトリウム（１．５ｇ、油中で６０％）を２０〜２５℃で添加する。形成された懸濁液を４０℃に加熱し、この温度で３０分間撹拌する。２０〜２５℃に冷却した後、前もって相応するアルコールから製造された、モノ−メトキシトリエチレングリコールｐ−トルエンスルホネート（１３．３ｇ）を添加する。撹拌を２０〜２５℃で２４時間続ける。その後、ＭｅＯＨ／水（５．０ｍＬ）を添加することにより反応混合物をクエンチする。エチルアセテート及びジクロロメタンを用いて抽出し、有機相を蒸発させ、最後にフラッシュクロマトグラフィーにより精製することによって、３が無色の油状物（１．６６ｇ、収率８５％）として得られた。

ジクロロメタン／アセトニトリル／水（２：２：３、４０ｍＬ）の混合物中のＮａＩＯ_４（１．９１ｇ）及びＲｕＣｌ_３＊Ｈ_２Ｏ（１７．８ｍｇ）の溶液に、３（１．８ｇ）を２０〜２５℃で添加する。撹拌しながら氷酢酸２００μｌを添加する。反応混合物を２時間撹拌した後、第二の量のＮａＩＯ_４（１．９ｇ）を添加する。２０〜２５℃で更に２時間撹拌し、反応を完了させる。その後、反応混合物を水で希釈し、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出し、粗生成物が得られた。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、４が薄黄色の油状物（１．８２ｇ、収率９７％）として得られた。

ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の４（１．８ｇ）の溶液に、ＤＣＣ（６８６ｍｇ）及びＮＨＳ（３０８ｍｇ）を添加する。反応混合物を２０〜２５℃で１５時間撹拌する。その後、沈殿した尿素を濾過し、濾液を蒸発させる。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、活性エステル６が薄黄色の粘性油状物（１．０３３ｇ、収率５１％）として得られた。

実施例１ｂ：
Ｒ_１＝−ＣＯ_２−Ｐｈである化合物７の合成
２（２．０ｇ、実施例１ａに記載の通りに合成されたもの）をＴＨＦ（２５ｍＬ）ＤＢＵ（１ｍＬ）及びピリジン（７ｍＬ）の混合物中に溶解させる。反応混合物を０℃に冷却する。冷却しながらフェニルクロロホルメート（４．３ｍＬ）を３０分の期間に亘り少量づつ添加する（発熱反応）。その後、反応混合物を２０〜２５℃で２４時間撹拌する。反応混合物をエチルアセテート（５０ｍＬ）で希釈し、次いで重炭酸ナトリウム溶液（５％、３５ｍＬ）を添加する。相分離、溶剤蒸発及びフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、７（６．１ｇ、生成物はフェノールを幾分か含む）が粘性のフォーム状物として得られた。

実施例２
生体活性化合物の修飾
以下の実施例は、本発明の有用性を説明するために与えられるものであるが、本発明を制限するべきではない：
一般的方法：タンパク質濃度を、ローリー法（Lowryら、１９５１）により測定する。電気泳動実験（ＳＤＳ−Ｐａｇｅ）を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてLaemmli（１９７０）により記載された通りに実施し、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて染色した。酵素（例えばEscherichia coliからの）Ｌ−アスパラギナーゼ、及びシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）は、それぞれ、アミノ酸Ｌ−アスパラギン及びＬ−グルタミンのアミド分解を触媒するアミド加水分解である。反応の間にアンモニアが遊離されるが、これは、Roberts, J.(1976)により記載されたようなネスラー試薬を用いることにより測定することができる。Ｌ−アスパラギナーゼのための処理ｐＨは８．６であり、ＰＧＡのための処理ｐＨは７．２である。

参照タンパク質：プロピレングリコールで修飾されたＬ−アスパラギナーゼ（ＰＥＧ−アスパラギナーゼ）をSigmaから購入した。ポリエチレングリコールで修飾されたシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＥＧ−ＰＧＡ）は、Medical Enzymes AGにより提供されたものである。これらの酵素を修飾するために使用される各ＰＥＧ鎖は、５０００ｇ／モルの分子量を有する。

実施例２ａ
修飾されたＬ−アスパラギナーゼ（簡潔には”ＡＳＮａｓｅ”）の製造
下記の反応をエッペンドルフ(Eppendorf)試験管中で実施した。重炭酸塩緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ８．５〜９）中のＬ−アスパラギナーゼの溶液（ProThera GmbH,１０．４ｍｇ／ｍＬ）に、ＤＭＳＯ（２００ｍｇ／ｍＬ）中に溶解された化合物６（１４．４μＬ、０．８当量）を添加する。反応混合物を２０〜２５℃で３０分間わずかに撹拌する。未反応の、及び加水分解された保護試薬（６）を、水を用いたダイアフィルトレーションにより除去する。Ｌ−アスパラギナーゼの修飾の割合は、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Mass Spectrometry（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ；マトリックス：シナピン酸)により測定された２６％である。それとは別に、修飾の割合は、Habeeb(Anal. Biochem. 1966, 14, 328-336)により記載されたようなアミノ官能基のトリニトロベンゼンスルホネート滴定により測定することができる。

第二の実験において、Ｌ−アスパラギナーゼは大過剰の保護試薬６（３２．３μＬ、１．８当量）を使用して修飾される。反応及び精製を上記の通りに行う。修飾により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより測定された３５％の修飾の割合が生じる。修飾された各Ｌ−アスパラギナーゼ試料は、未修飾のＬ−アスパラギナーゼと比較して、酵素活性の９５％を保っていた。図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる種々のＬ−アスパラギナーゼ調製物の分析を示す。

実施例２ｂ
修飾されたシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）の製造
この修飾反応を、Ｌ−アスパラギナーゼのための記載された（実施例２ａ）のと同一の条件下に、同一の材料を用いて実施した。保護試薬６ ０．８当量を用いたＰＧＡの修飾反応により、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより測定された３２％の修飾の割合が生じる。修飾されたＰＧＡの場合、未修飾のＰＧＡと比較して酵素活性の９０％が保たれている。

第二の調製物を、６ １．８当量を用いることにより製造し、これによりＭＡＬＤＩ−ＭＳにより測定された４１％の修飾の割合が生じた。修飾されたＰＧＡの酵素活性は、そのような修飾なしの活性の８５％に低下した。図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる種々のＰＧＡ調製物の分析を示す。

実施例３
本発明の有用性を証明するためのインビトロアッセイ
製薬学的適用における新規の糖質含有保護試薬の有用性のための度合いとして、プロテアーゼトリプシンに対する、それぞれ修飾されたＬ−アスパラギナーゼ及び修飾されたＰＧＡの安定性を、非修飾の酵素と比較して調査した。修飾されたＬ−アスパラギナーゼ及び修飾されたＰＧＡを、それぞれ実施例２ａ及び実施例２ｂに記載された通りに製造する。更に、”ブランク”と呼称される酵素フラクションを実施例２ａ及び２ｂに記載されたのと同様に処理するが、但し、活性糖質含有保護試薬を添加しない。試験管は、それぞれ、”ブランク”、修飾された酵素及び未修飾の酵素１〜２ＩＵ／ｍＬを含有し、トリプシン０．２５μｇ／ｍＬの存在で、トリス／Ｃｌ緩衝溶液中で３７℃でインキュベートする。対照標準は、トリプシンの不在でトリス／Ｃｌ緩衝溶液中で３７℃でインキュベートされた母酵素溶液からの未修飾酵素である。０、１０、３０、６０及び９０分後に、各試験管の部分標本及び対照標準から酵素活性を測定する。

図３及び図４に示されているように、トリプシンの存在でのそれぞれ酵素Ｌ−アスパラギナーゼ及びＰＧＡのインキュベーションにより、３０〜９０分後の酵素活性が著しく損失される。Ｌ−アスパラギナーゼの場合、酵素活性におけるこの低下は、本発明において記載されたような活性糖質含有保護試薬を用いた酵素の修飾により完全に回避することができ、ＰＧＡの場合には部分的に回避することができる。結論として、酵素Ｌ−アスパラギナーゼ及びＰＧＡの修飾により、プロテアーゼトリプシンによる分解に対する安定が著しく増加する。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる種々のＬ−アスパラギナーゼ調製物の分析。タンパク質はクーマシーを用いて染色されている。修飾は、ProTheraにより提供されたＬ−アスパラギナーゼを用いて実施する。試料は：レーン１）Ｌ−アスパラギナーゼ（ProThera ２．５μｇ）、レーン２）ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（Sigma, ５μｇ）、レーン３）組換え型タンパク質標準（Amersham Bioscience, RPN 800）、レーン４）修飾されたＬ−アスパラギナーゼ（６ ０．８当量、２．５μｇ）及びレーン５）修飾されたＬ−アスパラギナーゼ（６ １．８当量、２．５μｇ）である。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる種々のＰＧＡ調製物の分析。タンパク質はクーマシーを用いて染色されている。修飾は、ProTheraにより提供されたＬ−アスパラギナーゼを用いて実施する。試料は：レーン１）PGA Medical Enzyme ２．５μｇ、レーン２）PGA Medical Enzyme ５μｇ、レーン３）組換え型タンパク質標準（Amersham Bioscience, RPN 800）、レーン４）修飾されたＰＧＡ（６ ０．８当量、２．５μｇ）及びレーン５）修飾されたＰＧＡ（６ １．８当量、２．５μｇ）である。

酵素活性の維持から導かれる、トリプシンの分解に対する安定性に対する、活性糖質含有保護試薬を用いたＬ−アスパラギナーゼの修飾の影響。

酵素活性の維持から導かれる、トリプシンの分解に対する安定性に対する、活性糖質含有保護試薬を用いたシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼの修飾の影響。

Claims (19)

1. 活性糖質含有保護試薬において、
   ａ．少なくとも１個のヒドロキシル基でポリマー鎖に結合されており、かつ
   ｂ．アノマー位（１−位）で結合単位に結合している
   糖質中心単位Ｇにより表され、
   かつ、一般式Ｉ
   ［式中、
   Ｇは、グリコシド中心単位であり、これは、単糖類、それぞれ単糖類単位を構成するオリゴ糖類及び多糖類、アミノ糖質又はポリオールであり、
   Ｒ−ｐｏｌｙ−は、１個以上の繰り返しモノマー単位を有するポリマー鎖、又は
   結合基を介して別のグリコシド単位Ｇに結合している繰り返し構成単位ＩＩ
   （ここで、
   Ｐはアミノ保護基、又は次の繰り返し構成単位、又は末端単位Ｉであり、
   ここで、
   Ｒは、Ｈ、ＯＨ、又は、アルキル、Ｏ−アルキル（アルキルは１〜２０個のＣ原子を含む）、ベンジル、アリール、アセタール、アルデヒド、アルケニル、アクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アルキルアミン、保護されたアルキルアミン、チオール及び保護されたチオールから成る群から選択されているか、又は、単糖類、それぞれ単糖類単位を構成するオリゴ糖類及び多糖類、アミノ糖質又はポリオールから成る群から選択されており、かつ
   ｐｏｌｙは、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオレフィンアルコール及びポリアクリロモルホリンから選択されている）
   であり、
   Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ_２−、Ｏ_２ＣＮＨ−、−ＣＳＮＨ−及び−ＮＨＣＳ−から選択されており、
   ｍは、１〜１０であり、
   Ｙは、（Ｏ−アルキル）_２、−ＯＳＯ_２ＣＨ_２ＣＦ_３（トレシル）、−ＣＯ−Ｑ、マレイミド、−Ｏ−ＣＯ−ニトロフェニル、又は−トリクロロフェニル、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）、−Ｓ−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、−Ｓ−Ｓ−アリール、−Ｓ−ベンジル、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＯＨ、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＮＨ_２、−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＯＳＯ_２ＣＨ_２ＣＦ_３及び−Ｓ−アルキル（Ｃ_１〜Ｃ_６）−ＣＯ_２−Ｑ、−ＳＯ−アルケニル、−ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）の群から選択されており、
   ここで、
   Ｑは、Ｈ又はＯＨであるか、又は、Ｏ−アリール、Ｏ−ベンジル、Ｏ−Ｎ−スクシンイミド、Ｏ−Ｎ−スルホスクシンイミド、Ｏ−Ｎ−フタルイミド、Ｏ−Ｎ−グルタルイミド、Ｏ−Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、−Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール及びヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの群から選択されており、
   かつ、
   Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−又は−ＮＨ−、−Ｎ（アルキルＣ_１〜Ｃ_２０）−、−Ｎ（アリール）−、−Ｎ（ベンジル）−、−Ｎ（アルキルＣ_１〜Ｃ_２０−ＯＨ）−、−Ｎ（アルキルＣ_１〜Ｃ_２０−ＮＨ_２）−から選択されている］
   により表されることを特徴とする、活性糖質含有保護試薬。
2. 糖質中心単位が、Ｌ−又はＤ−配位で表される、請求項１記載の試薬。
3. グリコシド中心単位のアノマー位（１−位）での配位が、アルファ、ベータ又は両者の混合物である、請求項１又は２記載の試薬。
4. 単糖類が、アルドース、有利にグルコース；ケトース、有利にフルクトース；ピラノース、有利にマンノース、グルコース；フラノース、有利にリボース、アラビノースであり；それぞれ単糖類単位を構成するオリゴ糖類及び多糖類が、有利にラクトース、メリビオースであり、かつアミノ糖質及びオリゴ糖類又は多糖類を含有するアミノ糖質が、それぞれ有利にマンノースアミン、グルコースアミン、ラクトースアミンである、請求項１から３までのいずれか１項記載の試薬。
5. ポリマー鎖が片側でメトキシ基を末端基とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の試薬。
6. ポリマー鎖が、一般構造式
   Ｒ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｘ−
   ［式中、
   Ｒ及びＸは上記の意味の１つを有し、かつｎは０〜２０００である］
   により表されるポリエチレングリコールである、請求項１から５までのいずれか１項記載の試薬。
7. Ｒが、式ＩＩの基であるか、又は、以下の構造式：
   ［式中、
   ｎ、ｍ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記の意味を有し、
   Ｕは、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＨ−から選択されている］を有する繰り返し構成単位である、請求項６記載の試薬。
8. Ｒが、以下の構造式：
   ［式中、
   ｎ、ｍ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記の意味を有し、
   ａｌｋｙｌは、１〜２０個のＣ原子を有するアルキル基であり、かつ
   Ｕは、−Ｏ−、−Ｓ−及び−ＮＨ−から選択されている］を有する繰り返し構成単位である、請求項６記載の試薬。
9. 構成単位が４〜１０００回繰り返している、請求項７又は８記載の試薬。
10. ポリマー鎖が、末端基を除き非置換鎖である、請求項１から９までのいずれか１項記載の試薬。
11. ポリマー鎖は、ランダムコポリマー又はブロックコポリマー又はターポリマーである、請求項１から９までのいずれか１項記載の試薬。
12. 以下の構造式：
    ［式中、
    ｍ、ｐｏｌｙ、Ｑ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記の意味の１つを有する］
    を有する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の試薬。
13. 請求項１から１２までのいずれか１項記載の活性糖質含有保護試薬の製造法において、グリコシドのアノマー位にペンテニル基を有するグリコシドと、活性化ポリマー鎖との間の共役結合反応を溶液中で実施し、次いで、所望の合成中間体のペンテニル基を、式Ｉに示されるような活性化糖質含有保護試薬へと変換することを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項記載の活性糖質含有保護試薬の製造法、並びに、反応混合物からの活性化試薬の精製法。
14. 少なくとも１種の生体活性分子、表面又は全細胞との水溶性及び分離性の複合体の製造における、請求項１から１２までのいずれか１項記載の活性糖質含有保護試薬の使用。
15. 少なくとも１種の生体活性分子が、タンパク質、酵素、糖タンパク質、ポリペプチド、薬物、染料、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、抗体、脂質、リポソーム、リン脂質、リポソーム、微生物、ヒト細胞及び表面から成る群から選択されている、請求項１４記載の使用。
16. 少なくとも１種の生体活性分子が酵素である、請求項１５記載の使用。
17. 酵素が、アスパラギナーゼ又はグルタミナーゼ−アスパラギナーゼである、請求項１６記載の使用。
18. 化合物が、生体活性分子を、同じか又は異なっていてよい他の生体活性分子に結合させるために、又は生体活性分子を表面に結合させるために役立つ、請求項１４記載の使用。
19. 水溶性及び分離性複合体が以下の構造式：
    ［式中、
    ｍ、ｐｏｌｙ、Ｒ、Ｘ及びＺは上記の意味を有し、単位ＮＨ−ＰＥＰは、生体活性分子上のアミノ官能基を含有する残基を表す］
    を有する、請求項１４記載の使用。