MXPA03005460A - Sintesis de derivados polimericos no peptidicos de peso molecular alto. - Google Patents

Abstract

Se preparan derivados de peso molecular alto de poli(etilenglicol) activado y polimeros similares en alta pureza, conjugando una molecula PEG grande en una molecula PEG pequena. La mayoria de las etapas de reaccion pueden ser realizadas en la molecula pequena mas facilmente purificada para evitar la purificacion laboriosa de los derivados de peso molecular alto.

Description

SÍNTESIS DE DERIVADOS POLIMERICOS NO PEPTIDICOS DE PESO MOLECULAR ALTO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a derivados de poli (etilenglicol) y polímeros relacionados, y método para su síntesis. Más particularmente, la invención se refiere a derivados de peso molecular alto y a métodos para producir derivados de peso molecular alto.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La unión covalente del polímero hidrofílico de poli(etilen glicol) PEG abreviado, también se conoce como poli (oxido de etileno) PEO abreviado, a moléculas y superficies, es de utilidad considerable en la biotecnología y medicina. En su forma más común, el PEG es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo : HO-CH2CH20- (C¾C¾0) n-CH2C¾-OH El polímero anterior, a,?-dihidroxipoli ( etilenglicol ) , puede ser representado en forma corta como HO-PEG-OH, en donde se entiende que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural: -CHz-CH20- (CH2CH20) n-CH2CH2- en donde n típicamente varía desde alrededor de 3 hasta alrededor de 4000. El PEG es comúnmente usado como metoxi-PEG-OH, o mPEG en corto, en el cual un término es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras el otro término es un grupo hidroxilo que es sometido a fácil modificación química. La estructura del mPEG se da abajo. CH.-,?- (C¾CH,- ) n-CH2CH?-OH Los copolimeros de óxido de etileno y óxido de propileno están estrechamente relacionados a PEG en su química, y pueden ser substituidos por PEG en muchas de sus aplicaciones . HO-CH¾CHRO(C¾CHRO)nCH2C¾-OH en donde R= H o alquilo, tal como CH3. El PEG es también comúnmente usado en forma de brazos múltiples en los cuales los PEG lineales están unidos a un núcleo central: R- (-O-PEG-OH) „ donde R es un núcleo derivado de, por ejemplo, pentaeritritol u oligómeros de glicerol. Los PEG pueden también ser preparados con enlaces que se degradan en la estructura . El PEG es un polímero que tiene las propiedades de solubilidad en agua y en muchos solventes orgánicos, carece de toxicidad y carece de inmunogenicidad. Un uso del PEG es unir covalentemente el polímero a las moléculas insolubles para hacer el "conjugado" de la molécula PEG resultante soluble. Por ejemplo, se ha mostrado que el fármaco insoluble en agua, paclitaxel, cuando se acopla a PEG, llega a ser soluble en agua. Greenwald, et al., J. Org. Chem. , 60:331-336 (1995). Para acoplar el PEG a una molécula, tal como una protelna, es a menudo necesario "activar" el PEG para preparar un derivado del PEG que tiene un grupo funcional en el término. El grupo funcional puede reaccionar con ciertas porciones en la proteína, tal como un grupo amino, formando de este modo un conjugado de proteína PEG. Se han descrito muchos derivados activados de PEG. Un ejemplo de tal derivado activado es el "éster activo" de succinato de succinimidilo : CH ,0-PEG-02C-C¾C¾-C02-NS en donde NS= Más adelante, la porción de éster activo de succinimidilo será representada como -C0?-NS. Tales PEG activados pueden también ser preparados a partir de las formas de brazos múltiples descritas o a partir de formas ramificadas tal como: (PEG-O-CO-NH) 2LYS-NS como se describe en Harris, et al., U.S. 5,932, 462, la cual se incorpora por referencia aqui en su totalidad. Los grupos funcionales pueden estar unidos al término PEG por conversión directa del hidroxilo iniciador a las otras formas, o por unión de los grupos separadores orgánicos al grupo hidroxilo. Por ejemplo, el PEG de succinato anterior, se prepara por unión de anhídrido succínico a PEG. De manera similar, se puede hacer reaccionar anhídrido glutárico para preparar glutarato de PEG, PEG-02C-CH2CH?CH2-CO?H. Aún, pueden ser agregados grandes separadores alifáticos. Como se describe en Okamoto, et al., Eur. Polym. J. , 19, 341-346 (1983), el PEG puede ser convertido a una amina PEG haciendo reaccionar PEG-OH con ONC (CH?) 6-NCO y después convertir el isocianato restante al producto de amina PEG-02CNH- (CH2 ) e- H2. Como aplicaciones de la química de PEG han llegado a ser más sofisticadas, ha habido una necesidad incrementada para derivados PEG de alta pureza, de peso molecular alto. La síntesis de estos compuestos es complicada por la dificultad en la remoción de las impurezas poliméricas que se acumulan durante las preparaciones de etapas múltiples. Las impurezas de moléculas pequeñas son normalmente removidas de manera fácil, por procedimientos simples, tal como precipitación. Sin embargo, derivados poliméricos de peso molecular alto son generalmente casi difíciles de remover y requieren utilización de técnicas cromatográficas costosas y que requieren tiempo. Permanece una necesidad en la técnica de métodos mejorados para la preparación de derivados PEG con peso molecular alto.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención incluye derivados poliméricos activados de peso molecular alto y métodos para elaborarlos. Un derivado pequeño, difuncional de oligo (etilenglicol) ("OEG"), u oligómero similar o polímero pequeño, está covalentemente ligado a un derivado polimérico grande de poli (etilenglicol ) ("PEG") o polímero similar. En esta forma, la mayoría de las transformaciones químicas se pueden conducir en el compuesto oligomérico o polimérico pequeño. Las impurezas poliméricas grandes son más difíciles de separar a partir del producto deseado, que las más pequeñas, y los productos de estas reacciona que involucran estos polímeros, típicamente incluyen reactivos sin reaccionar, componentes difuncionales que pueden resultar en reticulaciones, componentes que reaccionan parcialmente, y otras impurezas poliméricas. La invención evita estas impurezas reduciendo el número de reacciones necesarias para crear los polímeros grandes. De este modo, como se muestra abajo, uno pede elaborar un compuesto polimérico complicado en una etapa, haciendo reaccionar un oligómero complicado por ejemplo, Y' -OEG-Y, en donde Y e Y' , son porciones activas con un simple compuesto polimérico de peso molecular alto por ejemplo, mPEG-Z, en donde Z reacciona con uno de Y o Y' , para elaborar un nuevo grupo enlazante X, entre el PG más grande y el PEG más pequeño. En esta forma, las impurezas poliméricas no se acumulan. Y e Y' pueden ser lo mismos o diferentes, pero se deben elegir de manera que las dos porciones sean compatibles y que no reaccionarán entre sí. En una reacción típica para producir una molécula grande monofuncional, de peso molecular alto, se hace reaccionar poli (etilenglicol ) monometoxi, con un polímero PEG más pequeño, en el cual, el grupo funcional Z en el polímero PEG más grande monofuncional, reacciona con el grupo funcional Y' en el polímero heterobifuncional más pequeño. El producto de peso molecular alto retiene el grupo activo Y. Los reactivos son enlazados por un grupo X formado por la reacción de las porciones Z y Y' . Esta reacción se puede ilustrar como sigue: mPEG-Z + Y' -OEG-Y ? mPEG-X-OEG-Y Por ejemplo, un ácido mPEG-propiónico de peso molecular 32,000, el cual es un compuesto elaborado típicamente en varias etapas a partir de mPEG-OH, se puede preparar en una etapa única, haciendo reaccionar un carbonato de mPEG activado de 30,000 que se ha preparado en una etapa a partir de mPEG-OH, con ácido a-amino-?-propiónico de peso molecular 2000. La mayoría de las transformaciones químicas se pueden realizar en el PEG 2000 pequeño, barato, más fácilmente purificado. Las moléculas grandes monofuncionales, homobifuncionales y heterobifuncionales, pueden ser preparadas por la práctica de la invención, aunque no necesariamente todas con resultados equivalentes. Las reacciones que tienden a introducir complicaciones en el componente polimérico más grande de la molécula del producto, pueden reducir la efectividad del método si las impurezas se incrementan con las etapas de reacción múltiples . En una modalidad un poco más generalizada, que muestra un polímero de poli ( etilenglicol ) con especi icidad mayor, la estructura de los productos de la invención se puede describir como sigue: R- (OCH?C¾) n-X- (CH2CHz-0) „-Y La estructura anterior se prepara haciendo reaccionar R- (OCH2CH2) n-Z con Y' - (CH2CH2-0) ,,,-Y, en donde Z es un grupo reactivo con Y' y ni Y ni R son reactivos con Z o R puede ser una porción cubierta, que incluye varias porciones alquilo, típicamente metoxi unido a PEG. R puede también ser un grupo reactivo o un grupo reactivo protegido Y' ' , en el cual, el grupo reactivo puede ser desprotegido y disponible para la reacción después en algún tiempo deseado. Y e Y' ' pueden ser los mismos, si Y'' ha sido un grupo protegido o un grupo diferente que no participa en las reacciones usadas para crear la molécula del producto. Los grupos funcionales incluyen, pero no se limitan a, aldehido, maleimida, éster activo, tiosulfonato o amina. X es un enlazador hidrofilico, menor, tal como amida o carbamato; n es desde alrededor de 200 a 2000; y m es desde alrededor de 1 a 120. X es deseablemente una porción pequeña e hidrófila que no impactará contrariamente las propiedades químicas y físicas del polímero de peso molecular alto resultante. Alternativamente, un segmento polimérico grande que es bífuncional o tiene funcionalidad adicional, puede ser ligado a moléculas más pequeñas en una o más funcionalidades. La funcionalidad del producto de molécula grande puede originarse a partir del segmento polimérico grande o del segmente oligomérico o polimérico más pequeño, como se desee. La estructura polimérica puede tener grupos o enlazadores sometidos a hidrólisis o degradación enzimática incorporada dentro de la estructura si se desea, para controlar la degradabilidad de la molécula del producto . Los segmentos poliméricos anteriores pueden ampliamente ser considerados como (Poli) para el segmento de polimero más grande y (Poli)b para el segmento de polímero más pequeño, en donde poli puede ser cualquiera de los polímeros incluyendo poli (etilenglicol ) en sus varias formas y polímeros considerados en la técnica por ser de características similares. De este modo, un polímero de peso molecular alto puede ser preparado a partir de un polímero de peso molecular más bajo, a partir del cual es mucho menos problemático remover las impurezas y un polímero de peso molecular superior que no se ha sometido a una serie de reacciones o etapas de purificación complejas para remover las impurezas poliméricas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención será ahora descrita más completamente aquí posteriormente. Esta invención puede, sin embargo, ser incluida en muchas diferentes formas y no debe ser construida como limitante a las modalidades expuestas aquí; sin embargo, estas modalidades son proporcionadas de manera que esta descripción será entera y completa, y llevará completamente el ámbito de la invención a aquellos expertos en la técnica.

De iniciones Los términos "grupo funcional"/ "porción activa", "grupo de activación, "sitio reactivo", "grupo final" "grupo químicamente reactivo" y "porción químicamente reactiva", son usados en la técnica y en este documento, para referirse a porciones distintas, definibles o unidades de una molécula. Los términos son un poco sinónimos en las artes químicas y son usados aquí para indicar las porciones de las moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "activo" cuando se usa en conjunto con grupos funcionales, está propuesto para incluir aquellos grupos funcionales que reaccionan fácilmente con grupos electrofílicos o nucleofílieos en otras moléculas, contrario con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción altamente imprácticas para reaccionar (es decir, grupos "no reactivos" o "inertes"). Por ejemplo, como podría ser entendido en la técnica, el término "éster activo", podría incluir aquellos ésteres que reaccionan fácilmente con grupos nucleofílieos tal como aminas. Los ésteres activos ejemplares incluyen, ésteres de N-hidroxisuccinimidilo o ésteres de 1-benzotriazolilo . Típicamente, un éster activo reaccionará con una amina en un medio acuoso en cuestión de minutos, mientras que ciertos ásteres, tal como ésteres de metilo o etilo, requieren un catalizador fuerte para reaccionar con un grupo nucleofilico . El término "alquilo" se refiere a cadenas de hidrocarburos que típicamente varian desde alrededor de 1 hasta alrededor de 12 átomos de carbono en longitud, e incluyen cadenas laterales y rami icadas. Las cadenas de hidrocarburos pueden ser saturadas o insaturadas . El término "alquilo substituido" se refiere a un grupo alquilo substituido con uno o más substituyentes que no interfieren, tal como pero no limitado a, cicloalquilo Ca-Ce, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, y similares; acetileno; ciano; alcoxi, por ejemplo, metoxi, etoxi y similares; alcanoiloxi inferior por ejemplo, acetoxi; hidroxi; carbonilo; amino; alquilamino inferior, por ejemplo, metilamino; cetona; halo, por ejemplo, cloro o bromo; fenilo; fenilo substituido y similares. Como se usa aqui, "no peptidico" se refiere a una estructura polimérica substancialmente libre de enlaces peptidicos. Sin embargo, la estructura polimérica puede incluir un número menor de enlaces peptidicos separados junto con la longitud de la estructura tal como, por ejemplo, no más de alrededor de 1 enlace peptidico por alrededor de 50 unidades monoméricas.

Un "conjugado polimérico" se refiere a una estructura polimérica soluble en agua, covalentemente unida a una molécula biológicamente activa como se define aquí. En el caso de que un conjugado polimérico se haga reaccionar con un segundo polímero para formar una estructura polimérica extendida, si o no la reunión del polímero es con un enlace peptidico u otro, el término "conjugado polimérico" se refiere a la longitud total del polímero unido al agente biológicamente activo. El término "enlace", "enlazador" o "grupo enlazante", se usa aquí para referirse a grupos o enlaces que normalmente se forman como el resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes. Los enlaces hidroliticamente estables, significan que los enlaces son substancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a pH usados, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas por un periodo de tiempo prolongado, preferiblemente indefinido. Los enlaces hidroliticamente inestables o degradables, significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas, incluyendo por ejemplo, sangre. Los enlaces enzimáticamente inestables o que se degradan, significan que el enlace puede ser degradado por una o más enzimas. El término "molécula biológicamente activa", "porción biológicamente activa", "agente biológicamente activo", o "fármaco", cuando se usan aquí, significan cualquier substancia la cual puede afectar cualquiera de las propiedades físicas o bioquímicas de un organismo biológico, incluyendo pero no limitado a virus, bacterias, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se usa aquí, las moléculas biológicamente activas incluyen cualquier substancia propuesta para diagnóstico, mitigación de cura, tratamiento o prevención de enfermedades en humanos u otros animales, o a otra forma de mejoramiento físico o mental de seres humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen pero no se limitan a, péptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, tintes, lípidos, nucleósidos, oligonucleósidos , células, virus, liposomas, micropartículas y micelios. Las clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para uso con la invención incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, fungicidas, agentes anti-virales, agentes antiinflamatorios, agentes anti-tumores, agentes cardiovasculares, agentes anti-ansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esferoidales y similares. Los términos "polímero de peso bajo" y "polímero de peso molecular bajo", se refieren ampliamente a estructuras poliméricas lineales, ramificadas, de brazos múltiples o bifurcadas, que comprenden un polímero soluble en agua y no peptidico que tiene desde 1 hasta alrededor de 120 unidades de repetición. Estos polímeros típicamente tienen de 1 a 2 grupos funcionales, típicamente localizados en término opuesto en un polímero lineal, hasta alrededor de 300, los cuales pueden ser localizados al término de estructuras altamente ramificadas o de brazos múltiples, aunque un número más pequeño puede ser localizado junto a al estructura polimérica. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, poli ( alquilenglicol ) , tal como poli (etilenglicol) ( PEG) , poli (propilenglicol ) ( PPG) , copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli(poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirrolidona) , poli (hidroxipropilmetacrilamida ) , poli (a-hidroxiácido) , poli (alcohol vinílico) , polifosfaceno, polioxazolina , y copolímeros, terpolímeros , derivados y mezclas de los mismos. Se debe entender que las longitudes oligoméricas y aún monoméricas, están incluidas en los anteriores. Aunque el peso molecular del polímero u oligómero pequeño puede variar, está típicamente en el intervalo desde alrededor de 100 Da hasta alrededor de 10,000 Da, dependiendo por supuesto, del peso molecular de las unidades de repetición individuales. En el caso de PEG, una unidad de monómero de PEG tiene un peso molecular de alrededor de 44 Da y polímeros de peso bajo tendrán un peso molecular desde alrededor de 44 Da hasta alrededor de 5280 Da. Los pesos moleculares de 2000, 3200, 3400 y 5,000 están habitualmente disponibles comercialmente . Aquellos de habilidades ordinarias en la técnica, reconocerán que la lista mencionada anteriormente para las estructuras poliméricas substancialmente solubles en agua y no peptidicas no es por medio exhaustivo, sino es meramente ilustrativo, y que están contemplados todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas anteriormente . Los términos "polímero de peso alto" y "polímero de peso molecular alto", se refieren ampliamente a una estructura polimérica lineal, ramificada o de brazos múltiples, que comprende un polímero soluble en agua, no peptídico que tiene más de alrededor de 200 unidades de repetición. Estos polímeros típicamente tienen desde 1 a 2 grupos funcionales, típicamente localizados en el término opuesto en un polímero lineal, hasta alrededor de 300, los cuales pueden ser localizados junto con la estructura polimérica en el término de estructuras altamente ramificadas o de brazos múltiples. Las estructuras bifurcadas están también contempladas, en las cuales un término es ramificado para proporcionar dos funcionalidades. Los polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a estos mismos polímeros a partir de los cuales se selecciona el polímero de peso bajo. Aunque el peso molecular del polímero puede variar, es típicamente mayor que alrededor de 8,000 Da, dependiendo por su puesto, del peso molecular de las unidades monoméricas individuales. En el caso de PEG, polímeros de peso alto tienen un peso molecular arriba del alrededor de 8,800 Da. Los PtíG comercialraente disponibles son aquellos que tienen un peso molecular nominal de 10,000, 12,000, 15,000 y 18,000 y 20,000, 30,000, 40,000 y superiores. Los PEG ramificados son fácilmente disponibles en pesos moleculares superiores. Aquellos de habilidades ordinarias en la técnica, reconocerán que la lista mencionada anteriormente para la estructura polimérica substancialmente soluble en agua y no peptídica, no es por medios exhaustivos, y es meramente ilustrativa, y que están contemplados todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas anteriormente . Como se usa aquí, " PEG" se refiere ampliamente a una estructura de polímero lineal, de brazos múltiples o ramificada, que comprende un polímero soluble en agua y no peptídico que tiene unidades de repetición CH2CH20. El polímero a-?-dihidroxipoli (etilenglicol) , puede ser representado en forma corta como HO-PEG-OH, en donde se entiende que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural -CH2CH20- (C¾CH20) ri-CH?CH2- en donde n típicamente varía desde alrededor de 3 hasta alrededor de 2000. La familia PEG de polímeros presenta de manera general, las propiedades de solubilidad en agua y en muchos solventes orgánicos, carece de toxicidad y carece de inmunogenicidad. El término PEG debe ser entendido por ser inclusivo e incluir poli (etilenglicol ) en cualquiera de sus formas lineales, ramificadas o de brazos múltiples, incluyendo PEG alcoxi, PEG bifuncional, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendiente o PEG con enlaces que se degradan en estos . El PEG, en cualquiera de las formas descritas aquí, es típicamente claro, incoloro, inoloro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no hidroliza para deteriorarse (a menos que específicamente se designe para hacer esto) , y de manera general no es tóxico. El poli (etilenglicol ) , es considerado por ser biocompatible, lo cual dice que el PEG es capaz de coexistir con tejidos u organismos vivientes sin causar daño. Más específicamente, el PEG substancialmente no es inmunogénico, lo cual dice que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se une a una molécula que tiene alguna función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune, de manera que un organismo puede tolerar la presencia del agente. Los conjugados PEG no tienen a producir una respuesta inmune substancial o causar aglutinamiento u otros efectos indeseables . Los copolímeros de bloque o aleatorios de óxido de etileno y óxido de propileno, muestran cualquiera de los polímeros de peso molecular alto o peso molecular bajo de la invención, en donde -PEG- es reemplazado con: -CH2CHRO (CH2CHRO) cCH,-CHR- y en donde cada R es independientemente H o CH3, y c es como se describe anteriormente para m y n, dependiendo de si la molécula es pequeña o grande. El término "derivado polimérico", es algunas veces usado para describir el producto polimérico de peso alto de la invención, que tiene un segmento polimérico de peso alto y un segmento polimérico de peso bajo, unido por un enlace. El término es meramente uno de conveniencia, y es usado para diferenciar el polímero del producto de sus componentes poliméricos de peso alto y peso bajo cuando se indica . En una forma empleada en la invención, el polímero de peso molecular alto es PEG lineal terminado en un extremo con un grupo hidrófilo y el otro extremo con un grupo funcional Z: HO-CH2CH?0- (CH2CH?0) ri-CH2C¾-Z El polimero anterior puede ser representado en la forma corta como HO-PEG-Z en donde se entiende que el símbolo -PEG-representa la siguiente unidad estructural: CH2C¾0-CH2C¾0) n-CH2CH2- en donde n es mayor que 200, y típicamente varia desde alrededor de 200 hasta alrededor de 2000 para el polímero de peso alto. Este polímero puede también ser representado más genéricamente como R- (Poli) ¡,-Z, en donde (Poli) n representa el componente de polímero grande de la invención y R es una porción de cubierta o un grupo reactivo adecuado o grupo reactivo protegido Y' ' . Otro tipo de PEG empleado como el polimero de peso alto de la invención (Poli)a, es metoxi-PEG-Z o mPEG-Z en corto, en el cual, un término es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras el otro término es el grupo funcional Z. La estructura de mPEG se da por: CH,0- (CH2C¾0) n-CH2CH2-Z . en donde n es como se describe anteriormente. El uso de un mPEG que tiene un grupo funciona, Z, o que tiene otros sitios activos del polimero de Z cubierto por alquilo, arilo u otros grupos no reactivos o grupos protectores, previene al polimero de peso alto de auto polimerizarse y de combinarse indeseablemente con otras moléculas en la mezcla de reacción. Se selecciona el grupo funcional Z del polimero de peso alto, de manera que el grupo Z que forma fácilmente un enlace covalente con especies reactivas correspondientes, Y o Y' , se encuentra en el polímero de peso bajo, formando con ello, un enlace X entre el polímero de peso alto y el polímero de peso bajo cuando se hacen reaccionar. Los grupos funcionales adecuados se discuten abajo. Como una forma ejemplar empleada en la práctica de la invención, el polímero de peso molecular bajo es un polímero PEG lineal terminado en un extremo con un grupo funcional, Y o Y' , capaz de formar fácilmente un grupo enlazante hidrolíticamente estable, cuando se hace reaccionar con el componente Z del polímero de peso alto, y un grupo funcional adicional, Y o ?' , capaz de formar un enlace covalente con un agente biológicamente activo o de ser modificado a una forma la cual es capaz de formar un enlace covalente con un agente biológicamente activo: Y' -C¾CH20- (CH2CH20)m-CH2CH2-Y El polímero anterior puede ser representado en forma corta como Y' -PEG-Y, en donde se entiende que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural: -CH2CH2O- (CH2C¾0)m-C¾CH2- en donde m varía desde alrededor de 1 hasta alrededor de 120, y es típicamente menor de alrededor de 60, para el polímero de peso bajo. De manera más general, el polímero puede ser representado como Y' (Poli)b-Y, en donde (Poli)b representa el componente polimérico menor de la invención. Se seleccionan los grupos funcionales Y' e Y del polímero de peso bajo, de manera que no se enlazan fácilmente entre sí bajo condiciones de reacción, esto evita la auto-polimerización del polímero de peso bajo. Los grupos Y' e Y aceptables están especificados más completamente abajo. abajo, están estrechamente relacionados a PEG en su química, y pueden ser usados como la estructura polimérica . Las estructuras poliméricas pueden también comprender una estructura ramificada, típicamente que tiene una porción nuclear ramificada central y una pluralidad de cadenas poliméricas, preferiblemente cadenas poliméricas lineales, ligadas al núcleo central. En una modalidad, el PEG es usado en una forma ramificada preparada por ejemplo, por adición de óxido de etileno a varias estructuras nucleares centrales de polioles, tal como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. Cualquier poliol que proporciona una pluralidad de grupos hidroxilo disponible para conjugación a las cadenas poliméricas, puede ser usado en la práctica de la invención. La estructura nuclear de ramificación de poliol, puede proporcionar desde alrededor de 3 hasta 100 grupos hidroxi disponibles, y típicamente proporciona alrededor de 3 hasta 20, de manera que la estructura polimérica ramificada tiene desde alrededor de 3 hasta 100 cadenas poliméricas. Las moléculas poli (etilenglicol) ramificadas de este tipo, pueden ser representadas en forma general como R(-PEG-OH)a, en la cual R se deriva de una porción nuclear central, tal como glicerolr oligómeros de glicerol, o pentaeritritol, y "a" representa el número de brazos, típicamente alrededor de 3 a 20. Para uso como el polímero de peso molecular alto, los grupos hidroxilo de PEG ramificado, normalmente se convierten a grupos funcionales Z, previo a la combinación con el polímero de peso bajo. Los polímeros de peso alte ramificados o de brazos múltiples, tienen la forma R(-PEG-Z)a, y son capaces de enlazarse alrededor de 3 a 20 de los polímeros de peso bajo de la invención, dependiendo del grado de ramificación o el número de brazos que tienen los grupos activos. La porción nuclear central de la molécula ramificada puede ser derivada de cualquier número de aminoácidos, tal como lisina, en donde la porción nuclear central típicamente proporciona dos o más sitios, por ejemplo, grupos amino, para unión de cadenas poliméricas. Las moléculas PEG de brazos múltiples tal como aquellas que se describen en la Patente Estadounidense No. 5,932,426, la cual está incorporada por referencia en este documento en su totalidad, pueden también ser usadas como la estructuras poliméricas.

La estructura polimérica del polímero de peso alto, puede alternativamente, comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de PEG bifurcado está representado por PEG-ACHZ2, en donde A es un grupo enlazante y Z es un grupo terminal activado ligado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. La Solicitud Internacional No. PCT/US99/05333, el contenido de la cual está incorporado aquí por referencia, describe varias estructuras PEG bifurcadas para uso en una modalidad de la invención. La cadena de átomos enlazantes al grupo funcional Z al átomo de carbono ramificando, sirve como un grupo atador y puede comprender por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de las mismas. Los grupos funcionales Z pueden ser usados en la presente invención para reaccionar con uno de los grupos funcionales Y o Y' , en el polímero de peso bajo para formar un enlace entre los polímeros de peso bajo y los polímeros de peso alto. La estructura polimérica de ya sea el polímero de peso alto o bajo, puede comprender una molécula PEG pendiente que tiene grupos funcionales, Z, Y o Y' como sea el caso, puede estar covalentemente unida junto a la longitud de la estructura PEG preferentemente al extremo de la cadena PEG. Los grupos reactivos pendientes pueden estar unidos a la estructura PEG directamente o a través de una porción enlazante, tal como alquileno. En el caso de un polímero de peso alto que tiene más de un grupo funcional, Z, existen muchos sitios junto al polímero en donde el grupo funcional correspondiente, Y o Y' en el polímero de peso alto puede unirse. Los derivados poliméricos producidos a partir de estos, están representados por conveniencia como: PEG-[X-(C¾CH20),„-Y]H en donde PEG es un poli (etilenglicol ) lineal, alcoxi-poli (etilenglicol) , un poli (etilenglicol) ramificado, o un poli (etilenglicol) bifurcado, en donde el PEG tiene un grado de polimerización de al menos alrededor de 200, preferiblemente mayor de alrededor de 1000, y preferiblemente menos de alrededor de 2000, X es la porción enlazante, m es desde 1 hasta alrededor de 120, y preferiblemente menos de 60, Y es un grupo funcional para unión a un agente biológicamente activo y q es igual al número de grupo terminales poliméricos y puede ser desde 1 hasta alrededor de 500. En donde q es 2, entonces Y' puede ser el mismo o diferente, pero si q es mucho mayor que 3 ó 4, el Y' normalmente todos serán el mismo grupo. De manera más general, en la estructura anterior, el PEG puede ser (Poli) y la unidad monomérica CH2CH2O puede ser representada como (Poli)b, para incluir polímeros menores similares, copolímeros, oligómeros y similares.

Además de las formas descritas anteriormente de PEG, cualquiera de los polimeros anteriores puede también ser preparado con uno o más enlaces débiles o degradables en la estructura. Por ejemplo, el PEG puede ser preparado con enlaces de éster en la estructura polimérica que se somete a hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en el desdoblamiento del polímero en fragmentos de peso molecular más bajo: -PEG-CO2-PEG- + H70 ? -PEG-CO2H + HO-PEG- De manera similar, una estructura polimérica puede estar covalentemente unida a un agente biológicamente activo a través de una porción enlazante débil o que se degrada. Por ejemplo, enlaces de éster formados por reacción de ácidos carboxilicos de PEG, o ácidos carboxilicos de PEG activados con grupos alcoholes en un agente biológicamente activo, se hidrolizan de manera general bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente . Otros enlaces que se degradan de manera hidrolitica, empleados ya sea como un enlace que se degrada dentro de una estructura polimérica o como un enlace que se degrada que se conecta a una estructura polimérica a un agente biológicamente activo, incluyen enlaces de carbonato; enlaces de imina que resultan de por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehido (véase por ejemplo, Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(l):582-3 (1997), la cual está incorporada aquí por referencia); enlaces de ésteres de fosfatos, formados por ejemplo, haciendo reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazonas los cuales son típicamente formados por reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces de acetal que son típicamente formados por reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoésteres que son por ejemplo, formados por reacción entre un formiato y un alcohol; enlaces peptídicos formados por un grupo amina, por ejemplo, al final de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces de oligonucleótidos formados mediante, por ejemplo, un grupo fosforamidita , por ejemplo, al final de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido . Muchos otros polímeros son también adecuados para la invención. Las estructuras poliméricas que no son peptídicas y solubles en agua, son particularmente empleadas en la invención. Ejemplos de polímeros adecuados que pueden ser usados en lugar de PEG en la manera especificada anteriormente incluyen, pero no se limitan a, otros poli (alquilenglicoles ) , tal como poli (propilenglicol) (PPG), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poli (alcohol olefínico), poli (vinilpirrolidona ) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli ( sacáridos ) , poli (a-hidroxiácido) , poli (alcohol vinílico) , polifosfaceno, polioxazolina , poli (N-acriloilmorfolina ) , tal como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,629,384, la cual está incorporada por referencia aqui en su totalidad, y copolímeros, terpolimeros y mezclas de los mismos. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, reconocerán que la lista mencionada anteriormente para polímeros substancialmente solubles en agua, no es por medios exhaustivos y es meramente ilustrativa, y que están contemplados todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas anteriormente.

Componentes que forman el grupo enlazante X Como se mencionó, el método y polímero funcionalizado resultante puede ser representado por: R-(Poli)a-Z+Y'-(Poli)i-Y ? Y-(Poli) -X-(Poli);-X-(Poli)b-Y Z es un grupo final funcionalizado del polímero de peso alto (Poli)* y Y e Y' son grupos finales funcionalizados del polímero de peso bajo (Poli)b. R puede incluir un grupo final funcionalizado Z, si se desea producir un polímero homobifuncional como se muestra, o un grupo reactivo protegido del último acoplamiento a otro polímero más pequeño activado, activado con un grupo Y' ' diferente, si se desea un polímero heterobifuncional grande . Varios grupos reactivos Y, ?' , Y' ' y Z incluyen pero no se limitan a, carbonato de N-succinimidilo (véase por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,281,698, 5,468,478), amina (véase por ejemplo, Buckman et al. Makromol.Chem. 182 : 1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur . Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Véase por ejemplo, Andresz et al. Makromol. Chem, 179:301 (1978)), propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo (véase por ejemplo, Olson et al. en Poly(ethylen glycol) Chemistry & Biological Applications, pp . 170-181, Harris & Zaplipsky Eds . , ACS, Washington, DC, 1997; véase también Patente Estadounidense No. 5,672,662), succinato de succinimidilo (Véase por ejemplo, Abuchowski et al. C ncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) y Joppich et al. Macrolol . Chem. 180:1381 (1979), éster de succinimidilo (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No, 4,670,417), carbonato de benzotriazol (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,650,234), éter de glicidilo (véase por ejemplo, Pitha et al. Eur. J. Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Bioch .

Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (véase por ejemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), carbonato de p-nitrofenilo (véase por ejemplo, Veronese, et al-, App. Biochem, Biotech., 11:141 (1985); y Sartore et al.r App. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (véase por ejemplo, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), Patente Estadounidense No. 5,824,784, Patente Estadounidense 5,252,714), maleimida (véase por ejemplo, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Corran. 22:2417 (1992)), disulfuro de ortopiridilo (véase por ejemplo., Woghiren, et al. Bioconj . Chem. 4:314 (1993)), acriloilo (véase por ejemplo, Sawhney et al,, Macromolecules , 26:581 (1993)), vinilsulfona (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,900,461). Todas las referencias anteriores están incorporadas aqui por referencia . Se seleccionan los grupos finales Z y los grupos reactivos Y, Y' o Y' ' con Z, de manera que las porciones de los grupos finales sean complementarias, significando que los grupos finales reaccionan fácilmente unos con otros, bajo condiciones de reacción para formar un grupo enlazante X, el cual es típicamente hidrolíticamente estable bajo condiciones fisiológicas. Es la formación del grupo enlazante X, la cual enlaza el polímero de peso molecular alto al polímero de peso molecular bajo, formando con ello, un derivado polimérico funcionalizado de peso molecular alto total. Y, Y' e Y' ' , pueden ser los mismos o diferentes, tan pronto como no sean reactivos entre si. Adicionalmente, al menos un grupo reactivo Y o Y' no debe reaccionar con Z, para proporcionar funcionalidad para el polímero completado . Pueden ser seleccionados los grupos funcionales o grupos químicamente reactivos en el polímero de peso bajo, a partir del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenílo, acrilato, metracrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato y tresilato . Los grupos finales reactivos pueden ser seleccionados a partir de una combinación de los siguientes:- (CH2)rC02H, - (CH¿) r- C02NS, - (CH2) r<C02Bt, -(CH2)rCH(0R)2, -(CH?)cCH0, -(CH2)2-NH2, - (CH2) rM, -(CH2)r(S-SO;;-R, en donde r es 1-5, r' es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es N-succimidilo, Bt es 1-benzotriazolilo, y M es N-maleimidilo . Típicamente, la porción enlazante X es hidrofílica y corta. Sin embargo, el grupo enlazante puede ser preparado a partir de componentes hidrofóbicos tan pronto como sean hidrofilicos o hidrofóbicos; el grupo enlazante no altera substancialmente las propiedades del polímero. Esto es, en el caso de PEG, el grupo enlazante no debe alterar las propiedades como se expone anteriormente en la definición de PEG.

Condiciones de Reacción Los solventes adecuados que proporcionan un medio para la reacción de los grupos finales Z y Y, Y' o Y' ' , en formación del grupo enlazante X, incluyen pero no se limitan a tolueno, tetrahidrofurano, dioxano, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, benceno, xilenos y solventes, con características químicas similares. Se ha encontrado que los polímeros de peso bajo de la invención, modificados y conjugados, pueden ser filtrados, separados y purificados con más eficiencia y con mejores resultados que los polímeros de peso alto del pasado, conjugados o modificados de manera similar. En general, es más fácil separar mezclas de polímeros de peso bajo en especies componentes, que con polímeros de peso superior similares . La modificación y conjugación del grupo final, es un proceso de manera general de etapas múltiples, con cada etapa de la funcionalización que resulta en las impurezas poliméricas. Si la purificación no es efectiva, lo cual puede ser el caso cuando se comportan con polímeros de peso alto, las impurezas se acumulan a través de la funcionalización del polímero a un nivel inaceptable. Realizando primero el proceso de funcionalización y purificación en un polímero de peso bajo y subsecuentemente uniendo el polímero de peso bajo purificado con un polímero de peso alto de conformidad con esta invención, se minimizan las etapas del proceso que involucran el polímero de peso alto, resultando en un polímero conjugado o funcionalizado de peso alto, derivado de pureza completamente deseable.

Método para formar el polímero activado de peso molecular alto de la invención Un polímero de peso molecular alto, soluble en agua, no peptídico, que tiene al menos un grupo funcional Z, está covalentemente unido a un polímero de peso molecular bajo, típicamente oligomérico, soluble en agua, no peptídico, que tiene al menos dos grupos funcionales Y' e Y, los cuales pueden ser los mismos o diferentes, tan pronto como Y no sea reactivo con Y' , y Z sea reactivo con al menos uno de Y o Y' . La invención también incluye una conjugación del derivado polímérico con un agente biológicamente activo después de que el derivado polimérico funcionalizado se produce de conformidad con la invención . En general, el método y polímero funcionalizado resultante está representado por: (Poli)a-Z + Y'-(Poli)b-Y ? ( Poli )a-X-( Poli )b-Y en donde Poli,, tiene al menos alrededor de 200 unidades de repetición, típicamente al menos alrededor de 1000, y más típicamente entre 1000 y 2000; y el Polib tiene desde alrededor de 120 y típicamente menos de 60 unidades de repetición. Y e Y' , pueden ser los mismos o diferentes, tan pronto como Y' no sea reactivo con Y, y son grupos funcionales y X es una molécula enlazante formada por la reacción de Z y los componentes Y o Y' . En el ejemplo anterior, Z es reactivo con Y' para formar un enlace X. El (Poli) a puede ser adicionalmente funcionalizado para producir un polímero homobifuncional con los grupos reactivos Y en cada término. Si el grupo adicional es protegido de la reacción, el grupo protector puede ser removido del conjugado polimérico resultante para crear un polímero heterobifuncional . Los derivados poliméricos resultantes de la invención comprenden, un segmento polimérico soluble en agua de peso molecular alto, el cual está covalentemente conectado, vía un grupo enlazante, a un segmento polimérico soluble en agua de peso molecular bajo. El segmento polimérico de peso molecular bajo tiene un grupo final uncionalizado, Y, además del grupo final el cual proporciona el enlace con el segmento polimérico de peso alto. El grupo final funcionalizado adicional Yr después del segmento polimérico de peso bajo, proporciona un grupo enlazante para enlazar covalentemente con un agente biológicamente activo o para conversión en tal grupo. Se ofrecen los siguientes ejemplos como no limitantes de la invención.

Ejemplo 1. Síntesis de -t-Boc amino-ffl-metanosulfonato PEG (3400) Se azeotropió a-?-t-Boc amino-co-hidroxi PEG (3400) (PM 3318 Da, 4.0 g, 0.0012 moles ) ( Shearwater Corp.) en cloroformo (80 mi), en un evaporador giratorio a 35°C a sequedad y se agregó cloroformo (50 mi) al jarabe residual. La solución se enfrió a 40°C bajo argón y se inyectó trietilamina (0.31 mi, 0.0022 moles), seguida por inyección lenta de cloruro de metanosulfonilo (0.15 mlr 0.0019 moles) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche bajo argón mientras el baño se dejó para enjuagar a temperatura ambiente. Se agregó carbonato de sodio anhidro (4.0 gm) a la mezcla de reacción, y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente por una hora. La mezcla entonces se filtró y lo filtrado se concentró a sequedad. Se agregó isopropanol (40 mi) y el producto precipitado se colectó por filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento 3.7 g de a-t-Boc amino-ro-metanosulfonato PEG(3400). RMN (DMSO-d6) : 1.37 ppm (s, -OC(CH;Í)3), 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.31 ppm (t, -CH7S02-) , 6.76 ppm ( -CH2NH-CO-) . Este Ejemplo demuestra como el grupo funcional Y, del polímero de peso bajo, a-?-t-Boc amino-o-hidroxi (PEG(3400), se modificó con un buen rendimiento del polímero de peso bajo modificado.

Ejemplo 2. Síntesis de cc-t-Boc amino-ta-p- toluentiosulfonato de PEG(34Q0) Se azeotropió a sequedad a-t-Boc amino-?-metanosulfonato PEG(3400)(el producto del Ejemplo 1) (1.0 g, 0.30 mmoles) en cloroformo (30 mi), en un evaporador giratorio a 35 °C, y se agregó etanol anhidro (15 mi) al jarabe residual. Se agregó p-toluentiosulfonato de potasio (292 mg, 1.25 mmoles) y la mezcla se sometió a reflujo bajo argón durante la noche. El solvente se removió en un evaporador giratorio a 40°C y el residuo se secó bajo vacío por 30 minutos. El producto crudo se disolvió en 100 mi, 1 M de una solución amortiguadora de NaH2P04-Na;>HP0 (que contiene 10% en peso de NaCl) a pH 5.8, y la solución resultante se extrajo con diclorometano (100ml x 3). La fase de diclorometano se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y lo filtrado se concentró casi a sequedad en un evaporador giratorio. El producto se precipitó por adición de isopropanol/éter (40 ml/20 mi), se colectó por filtración, y se secó bajo vacío. Rendimiento: 0.7 g de a-t-Boc amino-ro-p-toluentiosulfonato PEG(3400). RMN: (DMSO-d6) : 1.37 ppm (s, -OC ( CH.-¡) 3) , 2.43 ppm (sf CH3-CH2=CH2/Ar) , 3.51 ppm (s, estructura PEG), 6.76 ppm (t, -CHÍNH-CO) , 7.49 ppm (dd, CH3-C¾=CH2/Ar) , 7.82 ppm (dd, CH3-CH2—Cl Ar) . Este ejemplo nuevamente demuestra como el grupo funcional Y, del polímero de peso bajo, a-t-Boc amino-ro-metanosulfonato PEG(3400), se modificó con un buen rendimiento del polímero de peso bajo modificado.

Ejemplo 3. Síntesis de a-NH2-ú>-p~toluentiosulfonato PEG (3400) Se disolvió a-t-Boc amino-iü-p-toluenotiosulfonato PEG(3400) (el producto del Ejemplo 2) (0.7 g) , en diclorometano anhidro (3.5 mi) y ácido trifluoroacético (3.5 mi) bajo argón. La solución se agitó a temperatura ambiente por una hora y se concentro a sequedad. Se agregó isopropanol (20 mi) y el producto precipitado se colectó por filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento: 0.6 g de a-NH2-c»-p-toluentiosulfonato PEG(3400). RMN (DMS0-d6) : 2.43 ppm (s, CH3-CH2=CH2/Ar) , 2.95 ppm (t, -OCH2CH2NH2) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 7.49 ppm (dd, CH.3-C¾=CH2/Ar) , 7.82 ppm (dd, CH3-CH2=C¾/Ar) . Este ejemplo nuevamente demuestra como el grupo funcional Y, del polímero de peso bajo, a-t-Boc amino-co-p-toluentiosulfonato PEG(3400)f se modificó con un buen rendimiento del polímero de peso bajo modificado .

Ejemplo 4, Síntesis de mPEG(23.4 kDa ) -p-toluentiosulfonato Se disolvieron MPEG(20 kD ) -1-benzotriazol (813 mg, PM 21kDa, 0.039 mmoles) (Shearwater Corp.) y PEG(3400)-a-NH2-oo-p-toluentiosulfonato (el producto del Ejemplo 3) (PM 3T05 Da, 200 mg, 0.053 mmoles) en diclorometano anhidro (20 mi) bajo argón, y se inyectó trietilamina (30.8 µ?, 0.22 mmoles) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche, entonces se concentró a sequedad. Se agregó 2-propanol (10 mi) y el producto precipitado se colectó por filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento: 843 mg. El mPEG(23.4 kDa ) -p-toluentiosulfonato crudo (560 mg) en 50 mL de agua desionizada, se cargó en una columna envasada con 50 mi de medio Poroso. La columna se eluyó cor. 100 mi de agua desionizada. Se agregó cloruro de sodio (15 g) al eluyente, y la solución resultante se extrajo con diclorometano (100 mi x 3). El extracto se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y lo filtrado se concentró casi a sequedad en un evaporador giratorio. Se agregó éter etílico (50 mi) al producto precipitado. El producto se colectó por filtración y se secó bajo vacío. Rendimiento 495 mg de mPEG(23.4 kDa ) -p-toluentiosulfonato . RMN (DMSO-d6) : 2.43 ppm (s, CH3-CH;-CH;/Ar) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 7.23 ppm (t,-NHCOO-), 7.49 ppm (dd, CH3- ) . Este ejemplo demuestra la combinación de un polímero de peso alto, MPEG (20 KDa) -1-benzotriazol, con un polímero de peso bajo modificado, PEG (3400 ) -a-NE -co-p-toluentiosulfonato , por reacción del grupo funcional Z, benzotriazol, con el grupo funcional Y' , amina, para formar un grupo enlazante entre los segmentos de polímeros de peso alto y de peso bajo.

Ejemplo 5. PEGilación de al-antitripsina A una solución de al-antitripsina (1 mg, Sigma, PM 25 kDa) en 100 mM de fosfato de sodio (pH 7.2, 1 mi), se agregó 2.8 mg de p-toluentiosulfonato mPEG (el producto del Ejemplo 4) (24 kDa), y la solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La electroforesis capilar indicó que el conjugado de al-antitripsina PEG se formó en 36% de rendimiento. La electroforesis en gel de SDS también demostró la presencia del conjugado PEG. El tratamiento del conjugado de PEG con ß-mercaptoetanol resultó en la formación de al-antitripsina como se evidenció por la electroforesis en gel, indicando de este modo, la presencia de un enlace de disulfuro en el conjugado de al-antitripsina PEG. Este ejemplo demuestra la combinación de un agente biológicamente activo, a?-antitripsina, con el derivado polimérico de peso alto del Ejemplo 4, vía el grupo final Y funcionalizado , p-toluentiosulfonato .

Ejemplo 6: ácido m-PEG(22 KDa) -propiónico A una solución de carbonato de m-PEG(20 KDa)-benzotriazol (2.0 g, 0.0001 moles) (Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 mi), se agregaron ácido PEG(2 KDa) -a-amino-o-propiónico (0.24 g, 0.00012 moles) (Shearwater Corporation) y trietilamina (0.060 mi), y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después, la mezcla se filtró y el solvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropilico . El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento 1.9 g. RMK (de-DMSO) : 2.44 ppm (t, -CH2-COO-) , 3.11 pp (q, -C¾-NH~) , 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG), 4.04 ppm (m, -CH2-0 (C=0) -) , 7.11 ppm (t, - (C=0) -NH-) . La cromatografía de intercambio aniónico proporcionó Ácido m-PEG(22 KDa) -propiónico (93%) y m-PEG-2 OKDa (7%). Este ejemplo demuestra la combinación de un polímero de peso alto, carbonato de m-PEG(20 KDa) -benzotriazol, con un polímero de peso bajo, ácido PEG(2 KDa ) -a-amino-?-propiónico, vía el carbonato funcionalizado, Z, y los grupos finales Y' , amino.

Ejemplo 7: Éster N-hidroxisuccinimida del ácido m-PEG(22 KDa ) -propiónico A una solución de ácido m-PEG(22 KDa ) -propiónico (el producto del ejemplo 6) (1.1 g, 0.000050 moles) en cloruro de metileno anhidro (10 mi), se agregó N-hidroxisuccinimida (0.0063 g, 0.000055 moles), seguido por 1 , 3-diciclohexilcarbodiimida (solución 1.0 M en cloruro de metileno, 0.05 mi, 0.000055 moles). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón. Después, la mezcla se filtró y el solvente se evaporó. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con alcohol isopropílico y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 0.9 g. RMN (d6-DMSO) : 2.81 ppm (s, -CH2-C¾- ( succinato ) ) , 2.92 ppm (t, -CH2-COO-), 3.11 ppm (q, -CH2-NH-) , 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.03 ppm (m, -CH2-0(C=0) -) , 7.11 ppm (t, - (C=0) -NH-) . Este ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional Y, del polímero producido en el Ejemplo 6 a partir de ácido propiónico al éster N-hidroxisuccinimida del ácido propiónico.

Ejemplo 8: Éster metílico del ácido PEG(2 KDa ) -a-amino-?-propiónico A una solución de ácido PEG(2 KDa) -a-amino-eo-propiónico (10 g, 0.0050 moles ) ( Shearwater Corporation) en cloruro de metileno anhidro (100 mi), se agregó 1-hidroxibenzotriazol (0.30 g) , 4- (dimetilamino) piridina (1.0 g) , alcohol metílico (3.2 g, 0.100 moles) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (solución 1.0 M en cloruro de metileno, 7.5 mi, 0.0075 moles). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón.

Después, la mezcla se concentró a alrededor de 50 mi, se filtró y se agregó a 800 mi de éter dietílico frío. El producto precipitado se filtró completamente y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 9.5 g. RMN (de-DMSO) : 2.53 ppm (t, -CH2-COO-), 2.95 ppm (t, -CH2-amina) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) . Este ejemplo demuestra la modificación del grupo final funcional Y, del polímero de peso bajo, de ácido PEG (2 KDa) -a-amino-ro-propiónico, a partir del ácido propiónico al éster metílico del ácido propiónico.

Ejemplo 9: Éster metílico del ácido m-PEG(32 KDa)-propiónico A una solución de carbonato de m-PEG(30 KDa)-benzotriazol (3.0 g, 0.0001 moles) (Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 mi), se agregó éster metílico del ácido PEG(2 KDa ) -cc-amino-co-propiónico, (el producto del Ejemplo 8) (0.24 g, 0.00012 moles) y trietilamina (0.060 mi) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón. Después, la mezcla se filtró y el solvente se evaporó. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con alcohol isopropílico , y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 2.8 g, RMN (dL--DMS0) : 2.53 ppm (t, -CH2-COO-), 3.11 ppm (q, -CH2-NH-), 3.24 ppm (s, -OCH ) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.04 ppm (m, -C¾-0 ( C=0) - ) , 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de pese bajo producido en el Ejemplo 8, con el polímero de pese alto, carbonato de m-PEG(30 KDa) -benzotriazol, vía los grupos funcionales Z, carbonato de benzotriazol, y Y', amino.

Ejemplo 10: ácido m-PEG(32 KDa ) -propiónico Se disolvió el éster metílico del ácido m-PEG(32 KDa ) -propiónico, (el producto del Ejemplo 9) (2.8 g, 0.000082 moles) en 20 mi de agua desionizada y el pH se ajustó a 12.0 con solución de NaOH 0.5 M. La mezcla de reacción se agitó 1.5 h a pH = 12.0 +/- 0.1. Después se agregó cloruro de sodio (3 g) y el pH se ajustó a 3 con ácido fosfórico al 5%. El producto se extrajo 3 veces con cloruro de metileno y los extractos combinados se secaron con cloruro de magnesio anhidro. El solvente se removió bajo presión reducida y el producto se secó bajo presión reducida. Rendimiento 1.6 g, RMN (de-DMSO) : 2.44 ppm (t, -CH2-COO-), 3.11 ppm (q, -CHy-MH- ) , 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) 4.04 ppm (m, -CH2-0(C=0) -) , 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). La cromatografía de intercambio aniónico dio Ácido m-PEG(32 KDa) -propiónico (97.5%), m-PEG-30KDa (2.5%). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional Y, del polímero producido en el Ejemplo 9, a partir del éster metílico del ácido propiónico, al ácido propiónico .

Ejemplo 11: Éster N-hidroxisuccinimida del ácido m-PEG(32 KDa ) -propiónico A una solución de ácido m-PEG(32 KDa ) -propiónico (producto del Ejemplo 10) (1.6 g, 0.000050 moles) en cloruro de metileno anhidro (10 mi), se agregó N-hidroxisuccinimida (0.0063 g, 0.00055 moles), seguida por 1,3-diciclohexilcarbodiimida (solución 1.0 M en cloruro de metileno, 0.05 mi, 0.000055 moles). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón, se filtró y el solvente se evaporó. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con alcohol isopropilico, y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 0.9 g, RMN (dG-D SO) : 2.81 ppm (s, -CH2-CH2- (succinato) ) , 2.92 ppm (t, -CH2-C0O-) , 3.11 ppm (q, -CH2-NH-), 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.03 ppm (m, -CH2-0 (C=0) -) , 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional Y, del polímero producido en el Ejemplo 9 a partir del ácido propiónico al éster N-hidroxisuccinimida del ácido propiónico .

Ejemplo 12: ácido m-PEG(23.4 KDa ) -butanóico A una solución de carbonato de m-PEG(20 KDa)-benzotriazol (2.0 g, 0.0001 moles ) ( Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 mi), se agregó ácido PEG (3.4 KDa ) -a-amino-eo-butanóico (0.45 g, 0.00012 moles) (Shearwater Corporation) y trietilamina (0.060 mi), y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después, la mezcla se filtró y el solvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con alcohol isopropílico, y el producto se secó bajo presión reducida. Rendimiento 2.2 g. RMN (de-DMSO) : 1.72 ppm (q, CH2-CH2-COQ- ) 2.24 ppm (t, -C¾-COO-), 3.11 ppm (q, -CH2-NH-) , 3.24 ppm (s, -OCH¾) , 3.51 ppm (s, estructura PEG), 4.04 ppm (m, -CH2-0 (C=0) -) , 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). La cromatografía de intercambio aniónico proporcionó ácido m-PEG(23.4 KDa) -butanóico (92%), M-PEG-20 KDa (8%). Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de peso bajo, ácido PEG(3.4 KDa) -a-amino-o-butanóico, con el polímero de peso alto, carbonato m-PEG(20 KDa) -benzotriazol, vía el carbonato de benzotriazol Z, y los grupos funcionales Yr , amino .

Ejemplo 13: Éster N-hidroxisuccinimida del ácido m-PEG(22 KDa ) -butanóico A una solución del ácido m-PEG(23.4 KDa)-butanóico (producto del Ejemplo 12) (1.17 g, 0.000050 moles) en cloruro de metileno anhidro (10 mi), se agregó N-hidroxisuccinimida (0.0063 g, 0.000055 moles) seguido por 1, 3-diciclohexilcarbodiimida (solución 1.0 M en cloruro de metileno, 0.05 mi, 0.000055 moles). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo argón, se filtró y el solvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno, se precipitó con alcohol isopropílico, y se secó bajo presión reducida. Rendimiento 1.0 g. RM (d6-DMS0) : 1.83 ppm (q, CH2-CH2-COO-) , 2.70 ppm (t, -CH2-COO-), 2.81 ppm (s, -CH2-CH2- (succinato) ) , 2.92 ppm, 3.11 (q, -CH2-NH-) , 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.03 ppm (m, -CH;>-0(O0) -) , 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional Y, del polímero producido en el Ejemplo 12, a partir del ácido butanóico al éster N-hidroxisuccinimida del ácido butanóico .

Ejemplo 14: m-PEG(20 KDa) -amina A una solución de carbonato de m-PEG(20 KDa ) -benzotriazol (2.0 g, 0.0001 moles ) (Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 mi), se agregó diamina de trietilenglicol FW = 148.21 (0.3 g, 0.0020 moles) y la mezcla de reacción se agitó 2 horas a temperatura ambiente bajo argón. Después, el solvente se evaporó a sequedad y el producto crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropilico . El producto se secó bajo presión reducida. Rendimiento 1.8 g, RMN (de-DMSO) : 2.64 ppm (t, -CH2-amina-) , 3.11 ppm (q, -CH2-NH-) , 3.24 ppm (s, -0CH3), 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.04 ppm (m, -CH2-0(C=0) -) , 7.11 ppm (t, - (C=0) -NH-) . La cromatografía de intercambió catiónico proporcionó m-PEG(20 k) -amina (97.5%). Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de peso bajo, diamina de trietilenglicol, con el polímero de peso alto, carbonato de m-PEG-(20 KDa ) -benzotriazol, via los grupos funcionales carbonato de benzotriazol, Z, y Y' , amino .

Ejemplo 15: Acetal dietilico de PEG (3.4 KD ) - -amino-?-propionaldehido A una solución de acetal dietilico de PEG(3.4KDa)-a-hidroxi-Q-propionalde ido (NOF) (1.0 g, 0.000294 moles) en una mezcla de tolueno (20 mi) y diclorometano (5 mi), se agregó trietilamina (0.07 mi, 0.000502 moles, 171¾ de cantidad estequiométrica) y cloruro de metanosulfonilo (0.028 mi, 0.000362 moles, 123% de cantidad estequiométrica) y la mezcla resultante se agito durante la noche bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla se filtró y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. El residuo se agregó a la mezcla de 16 mi de hidróxido de amonio concentrado y 1,6 g de cloruro de amonio y se agitó 42 horas a temperatura ambiente. El producto de reacción se extrajo con diclorometano (20 mi, 3 veces) . El extracto se lavó con 5 mi, 1 M de ácido clorhídrico, 5 mi de agua destilada y se secó con sulfato de sodio anhidro. Después, el solvente se destiló bajo presión reducida dando 0.78 g de acetal dietilico de PEG(3.4 KDa ) -a-clorhidrato de amina-ca-propionaldehido. RMN (df-DMSO) : 1.10 ppm (t, CH3-, acetal), 1.74 ppm (q, -OCH2CH2CH-, acetal), 2.94 ppm (t, -CH;:-clorhidrato de amina), 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.55 ppm (t, -CH-, acetal), 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo final funcional, Y' del polímero de peso bajo, PEG (3.4 KDa ) -a-hidroxi-co-propionaldehído, a partir de un hidroxi a un grupo amina.

Ejemplo 16: acetal dietilico de m-PEG(23.4 KDa ) -propiona dehido A una solución de carbonato de m-PEG(20 KDa)-benzotriazol (2.0 g, 0.0001 moles) (Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (20 mi) , se agregó acetal dietilico de PEG(3.4 KDa) -a-amina-ca-propionaldehído (0.36 g, 0.000106 moles) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después, el solvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con alcohol isopropilico . El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento 1.8 g, RMN (d6-DMSO) : 1.10 ppm (t, CH3-, acetal), 1.74 ppm (q, -OCH2CH2CH-, acetal), 3.11 ppm (q, -CH?-NH-), 3.24 ppm (s, -0CH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.04 ppm (m, -C¾-0(O0)-), 4.55 ppm (t, -CH-, acetal), 7.11 ppm (t, -(C=0)-NH-). Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de peso bajo producido en el Ejemplo 15, acetal dietilico de PEG(3.4 KDa ) -a-amina-fü-propionaldehído, con el polímero de peso alto, carbonato de m-PEG(20 KDa) -benzotriazol, vía los grupos funcionales carbonato de benzotriazol, Z y amino, Y' .

Ejemplo 17: m-PEG(23.4 KDa) -propionaldehido Se disolvió acetal dietilico de m-PEG(23.4 KDa)-propionaldehido (el producto del Ejemplo 16) (1.8 g) en 20 mi de agua y el pH de la solución se ajustó a 3 con ácido fosfórico diluido. La solución se agitó 3 horas a temperatura ambiente y se usó hidróxido de sodio 0.5 M para ajustar el pH de la solución a 7. El producto se extrajo con cloruro de metileno, el extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro, el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento: 1.6 g. RMN (dg-DMSO) : 2.60 ppm (dt, -OCH2CH2CH-, aldehido), 3.24 ppm (q, -CH2-NH-) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.04 ppm (m, -C¾-0 (C=0) -) , 7.11 ppm (t, -(OO)-NH-), 9.65 ppm (t, -CH, aldehido). Este ejemplo demuestra la modificación del grupo funcional Y, del polímero producido en el Ejemplo 16 a partir de propionaldehido, acetal dietilico a propionaldehido.

Ejemplo 18: acetal dietilico de PEG2(43.4 KDa ) -propionaldehido ramificado A una solución de éster PEG2(40 KDa ) -N-hidroxisuccinimida ramificado (1.0 g, 0.000025 moles) (Shear ater Corporation) en cloruro de metileno (6 mi), se agregó acetal dietilico de PEG (3.4 KDa)-ct-clorhidrato de amina-oo-propionaldehido (0.12 g, 0.0000352 moles) y trietilamina (0.01 mi), y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después el solvente se evaporó a sequedad. El producto crudo se disolvió en cloruro de metileno y se precipitó con éter dietilico. El producto húmedo se secó bajo presión reducida. Rendimiento 0.83 g, RM (dfi-DMSO) : 1.10 ppm (t, CH3- , acetal ) , 1.74 ppm (q, -OCH2CH2CH-, acetal), 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG), 4.55 ppm (t, -CH-, acetal). Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de peso bajo, acetal dietilico de PEG (3.4 KDa ) -a-clorhidrato de amina-?-propionaldehído, con el polímero ramificado de peso alto, éster de PEG2(40 KDa) -N-hidroxisuccinimida , vía los grupos funcionales éster N-hidroxisuccinimida Z, y clorhidrato de amina, Y' .

Ejemplo 19: PEG2(43.4 KDa ) -propionaldehido ramificado Se disolvió acetal dietilico de PEG2(43.4 KDa)-propionaldehido ramificado (producto del Ejemplo 18) (0.4 g) en 10 mi de agua y el pH de la solución se ajustó a 3 cor. ácido fosfórico diluido. La solución se agitó 3 horas a temperatura ambiente y se usó 0.5 M de hidróxido de sodio para ajustar el pH de la solución a 7. El producto se extrajo con cloruro de metileno. El extracto se secó con sulfato de magnesio anhidro y el solvente se destiló completamente bajo presión reducida. Rendimiento 0.35 g, RMN (df-DMSO) : 2.60 ppm (dt, -OCH2CH2CH-, aldehido), 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG), 9.65 ppm (t, -CH, aldehido) . Este ejemplo demuestra la modificación del grupo final Y, del polímero producido en el Ejemplo 18 a partir de acetal dietilico de propionaldehido a propionaldehido .

Ejemplo 20: M-PEG20K-Maleimida A una solución de carbonato de m-PEG(20 KDa ) -benzotriazol (20.0 g, 0.001 moles ) ( Shearwater Corporation) en cloruro de metileno (200 mi), se agregó maleimida-trietilenglicol-amina TFA (0.68 g, 0.002 moles) y 4-metilmorfolina (0.44 mi, 0.004 moles). La mezcla de reacción se agitó por 4 horas a temperatura ambiente bajo argón. Después, el solvente se evaporó a sequedad y se precipitó con alcohol isopropílico (1000 mi) . Lo precipitado se colectó por filtración a vacio y se secó in vacuo durante la noche. Rendimiento: 19.5 g. R (d6-DMSO) : 3.11 ppm (q, -C¾-NH-), 3.24 ppm (s, -OCH3) , 3.51 ppm (s, estructura PEG) , 4.04 (t, -CH2-0(O0) -) , 7.04 (s, - (C=0) -CH=CH- (C=0) -) , 7.11 ppm (t, - ( C=0) -NH- ) . Este ejemplo demuestra la combinación del polímero de peso alto, carbonato de m-PEG(20 KDa) -benzotriazol, con el polímero de peso bajo, Maleimida-trietilenglicol-amina TFA via los grupos funcionales, carbonato de benzotriazol Z, y amina, Y' .

Claims (35)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
2. REIVINDICACIONES 1. Un derivado polimérico activado, dichc derivado polimérico comprende uno o más primeros segmentos poliméricos solubles en agua, no peptidicos, que tienen al menos alrededor de 200 unidades de repetición unidas covalentemente a través de al menos una porción enlazante en al menos, un segundo segmento polimérico soluble en agua, no peptidico, que no tiene más de alrededor de 120 unidades de repetición, en donde dichas unidades de los segmentos poliméricos primero y segundo, pueden ser las mismas o diferentes, en donde al menos una porción de enlace no altera substancialmente las propiedades de dicho derivado polimérico, el derivado polimérico tiene al menos una porción activa seleccionada del grupo que consiste de porciones electrofilicas y porciones nucleofilicas localizadas en uno de los segmentos poliméricos primero y segundo . 2. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una porción activa es una porción única localizada en dicho segundo segmento polimérico .
3. 3. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho primer segmento de polímero además comprende un grupo funcional protegido.
4. 4. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque los segmentos poliméricos primero y segundo, se seleccionan independientemente del grupo que consiste de poli (alquilen glicol), poli (alcohol olefinico) , poli (vinilpirrolidona ) , poli (hidroxialquilmetacrilamida) , poli (hidroxialquilmetacrilato) , poli (sacáridos ) , poli (a-hidroxiácido) , poli (alcohol vinilico) , polifosfaceno, polioxazolina , poli (N-acriloilmorfolina) , y copolimeros, terpolímeros , y mezcla de los mismos.
5. 5. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho primer segmento polimérico tiene alrededor de 200 a 2000 unidades monoméricas de repetición.
6. 6. El derivado polimérico de la reivindicación 4, caracterizado porque dicho primer segmento polimérico tiene alrededor de 200 a 700 unidades de repetición.
7. 7. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho segundo segmento polimérico tiene de 1 hasta alrededor de 120 unidades de repetición.
8. 8. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho segundo segmento polimérico tiene de alrededor de 40 a 80 unidades de repetición.
9. 9. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dichos segmentos primero y segundo son pol (etilen glicol).
10. 10. El derivado polimérico de la reivindicación 1, en donde dicha porción de enlace entre los segmentos primero y segundo, es una porción hidrofilica seleccionada de un enlace de amida o carbamato.
11. 11. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha porción activa se selecciona del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol, tiol protegido, ácido carboxilico, ácido carboxilico protegido, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina , vinilpiridina , yodoacetamida , epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfona y tresilato.
12. 12. El derivado polimérico de la reivindicación 1, caracterizado porque dichos segmentos poliméricos se seleccionan del grupo que consiste de segmentos poliméricos lineales, ramificados y de brazos múltiples.
13. 13. Un derivado polimérico activado, dicho derivado polimérico comprende un segmento de poli (etilen glicol) monometoxi, lineal, que tiene de alrededor de 200 a 700 unidades monoméricas de repetición covalentemente unidas a través de al menos una porción de enlace de amida o carbamato a un termino de un segmento polifetilen glicol) lineal que tiene de 1 a 120 unidades monoméricas de repetición, y en donde dicho segmento de poli(etilen glicol) de 1 a 120 unidades monoméricas de repetición incluye al menos, una porción activa seleccionada del grupo que consiste de porciones electrofilicas y porciones nucleofilicas en el término del mismo segmento opuesto de polifetilen glicol), de 200 a 700 unidades monoméricas de repetición .
14. 14. Un derivado polimérico seleccionado del grupo que consiste de poli(etilen glicol ) -p-toluentiosulfonato de monometoxi; ácido poli(etilen glicol ) -propiónico de monometoxi; éster N-hidroxisuccinimida del ácido poli(etilen glicol ) -propiónico de monometoxi; éster metílico del ácido polifetilen glicol) -propiónico de monometoxi; ácido polifetilen glicol ) -butanóico de monometoxi; éster N-hidroxisuccinimida del ácido polifetilen glicol ) -butanóico de monometoxi; éster metílico del ácido polifetilen glicol ) -butanóico de monometoxi; polifetilen glicol ) -amina de monometoxi; polifetilen glicol ) -propionaldehído de monometoxi; acetal dietilico de polifetilen glicol) -propionaldehído de monometoxi; propionaldehído de polifetilen glicol ) -lisina de di-monometoxi; éster dietilico de propionaldehido de poli(etilen glicol) -lisina de di-monometoxi; y poli(etilen glicol ) -malemida de monometoxi; caracterizado porque dicho derivado polimérico tiene un peso molecular de al menos alrededor de 10,000 Daltons y tiene al menos dos segmentos de poli(etilen glicol) distintos unidos por un grupo enlazante .
15. 15. El derivado polimérico de la reivindicación 14, conjugado a una molécula biológicamente activa.
16. 16. El derivado polimérico de la reivindicación 1, que tiene la estructura ( Poli ) a-X- ( Poli ) i>-Y, caracterizado porque (Poli)a es un segmento polimérico soluble en agua, no peptidico, que tiene más de alrededor de 200 unidades de repetición, X es una porción enlazante que no altera substancialmente las propiedades del derivado polimérico, (Poli)b es un segmento polimérico, soluble en agua, no peptidico, que tiene de 1 a alrededor de 120 unidades de repetición, el cual puede ser el mismo o diferente de (Poli)a y Y es una porción electrofilica o nucleofilica .
17. 17. El derivado polimérico de la reivindicación 1, que tiene la estructura Y- (Poli) b~X~ (Poli) a-X- (Poli) b Yf caracterizado porque (Poli);., es un segmento polimérico, soluble en agua, no peptidico, que tiene más de alrededor de 200 unidades de repetición, X es una porción enlazante que no altera substancialmente las propiedades del derivado polimérico, (Poli)b es un segmento polimérico, soluble en agua, no peptidico, que tiene de 1 a alrededor de 120 unidades de repetición, y en donde Y es una porción electrofilica o nucleofilica .
18. 18. El polímero de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha porción activa se selecciona del grupo que consiste de -(CH2)rC0H, - (CH2) r'C<¾NS, -(CH2) ,CH(OR)2, -(CHK)cCHO, - (CH?)2-N¾, -(CH2)rM, - (C¾) r-S-S02-R, en donde r es 1-5, r' es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es N-succinimidilo , Bt es 1-benzotriazol, y M es N-maleimidilo.
19. 19. El polímero de la reivindicación 1, caracterizado porque uno o ambos segmentos poliméricos primero y segundo, además comprenden grupos que se degradan hidrolíticamente o enzimáticamente entre dichos monómeros .
20. 20. Un polímero que tiene la composición PEG- [X-(C¾C¾0)m-Y] q , caracterizado porque: PEG es un polímero soluble en agua, no peptidico seleccionado de un poli (etilen glicol) lineal, alcoxi-poli(etilen glicol), un poli (etilen glicol) ramificado, y un poli (etilen glicol) bifurcado, con o sin enlaces que se degradan hidrolíticamente o enzimáticamente, en donde el poli (etilen glicol) tiene al menos 200 unidades monoméricas de repetición. 56 X es una porción enlazante, m es de 1 a alrededor de 120 , Y es una porción que tiene un grupo electrofilico o nucleofílico terminal, y q es de 1 hasta alrededor de 150.
21. 21. El polímero de la reivindicación 20, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonatos y tresilatos .
22. 22. El polímero de la reivindicación 20, caracterizado porque q = 2, Y se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina , vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato y tresilato .
23. 23. El polímero de la reivindicación 20, caracterizado porque Y se selecciona de - (CH>- ) .-CO2H, -(CH?) r.C<¾NS, - (C¾) r-C02Bt, -(CH2)rCH(OR)2, - (C¾ ) r-CHO, -(CH2)2-NH2, -(CH¿)rM, - (C¾) r-S-S02-R, en donde r es 1-5, r' es 0-5, R es arilo o alquilo, NS es M-succinimidilo, Bt es 1-benzotriazolilo y M es N-maleimidilo.
24. 24. El polímero de la reivindicación 20, caracterizado porque X es un enlace de amida o carbamato.
25. 25. El polímero de la reivindicación 20, donde el poli(etilen glicol) tiene de alrededor de 200 a 2000 unidades de repetición.
26. 26. Un polímero que tiene la composición R- (0C¾C¾)„-X- (CH2CH2-0)m-Y donde : R se selecciona de un grupo alquilo que tiene de 1 a 5 átomos de carbono y una porción funcional que tiene un grupo electrofilico o nucleofílico terminal, n es mayor que 200, m está entre 1 y alrededor de 120, X es una porción enlazante, y Y es una porción que tiene un grupo electrofílico o nucleofílico terminal, el cual puede ser el mismo o diferente de R.
27. 27. Un método para formar un polímero soluble en agua, no peptídico, con al menos un grupo funcional, dicho método comprende de las etapas de: proporcionar un primer polímero soluble en agua, no peptídico, compuesto de al menos alrededor de 200 unidades de repetición y que tiene al menos un primer grupo funcional; proporcionar un segundo polímero soluble en agua, no peptídico, compuesto de 1 hasta alrededor 120 unidades de repetición y que tiene al menos un segundo grupo funcional, dicho segundo grupo funcional es reactivo con dicho primer grupo funcional del polímero de peso alto, al menos; y en donde al menos, uno de los polímeros primero y segundo, además comprende un grupo funcional que no es reactivo con cualquiera de los grupos funcionales primero y segundo; hacer reaccionar dichos grupos funcionales primero y segundo, con ello unir covalentemente dichos polímeros primero y segundo, para proporcionar un polímero soluble en agua, no peptídico, con al menos un grupo funcional .
28. 28. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque los grupos funcionales primero y segundo, se seleccionan de carbonato de N-succinimidílo, amina, hidrazida, propionato de succinimidilo y butanoato de succinimidilo, succinato de succinimidilo, éster de succinimidilo, carbonato de benzotriazol, éter de glicidilo, oxicarbonilimidazol, carbonato de p-nitrofenilo, aldehido, maleimida, disulfuro de ortopiridilo, acrilol y vinilsulfona .
29. 29. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque el grupo funcional que no es reactivo con los grupos funcionales primero y segundo, se selecciona del grupo que consiste de hidrófilo, hidroxilo protegido, éster activo, carbonato activo, acetal, aldehido, hidratos de aldehido, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol, tiol protegido, ácido carboxilico, ácido carboxilico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina , vinilpiridina , yodoacetamida , epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tiosulfonato y tresilato.
30. 30. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque los grupos funcionales primero y segundo se hacen reaccionar en la presencia de un solvente seleccionado del grupo que consiste de tolueno, tetrahidrofurano, dioxano, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, benceno, xileno y combinaciones de los mismos.
31. 31. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque los polímeros son cada uno poli(etilen glicol), seleccionado del grupo que consiste de formas lineales, ramificadas, de brazos múltiples y bifurcadas, monofuncionales y difuncionales .
32. 32. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque el primer polímero es un metoxi-poli (etilen glicol) lineal.
33. 33. El método de la reivindicación 27, además comprende la etapa de conjugar el grupo funcional que no es reactivo con los grupos funcionales primero y segundo, a un agente biológicamente activo.
34. 34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque el agente biológicamente activo se selecciona de una proteína, péptido, carbohidrato, oligonucleótido, ADN, ARN y lípido.
35. 35. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque el primer polímero comprende un grupo reactivo protegido y además, incluye la etapa de remover la porción protectora de los polímeros de peso alto y bajo covalentemente unidos, para crear una funcionalidad adicional .