DE69528644T2

DE69528644T2 - Verfahren zu Feststellung von DNA-Mulationen in einer Probe eines Patienten

Info

Publication number: DE69528644T2
Application number: DE69528644T
Authority: DE
Inventors: Denis Capatos; M. Dunn; David E. Matthews; K. Stevens
Original assignee: Visible Genetics Inc
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 2003-04-03
Anticipated expiration: 2015-07-08
Also published as: WO1996007761A3; DE69528644D1; US6270963B1; CA2191233A1; EP0760011B1; US5545527A; AU4321696A; US5552283A; AU690795B2; JPH10504897A; WO1996007761A2; EP0760011A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Diese Anmeldung betrifft das Überprüfen von DNA aus einer Patientenprobe auf Mutationen und spezieller das Überprüfen auf Mutationen, die mit Krebs oder anderen Krankheiten verbunden sind, zur Verwendung in der Diagnose und Target- Durchmusterung.
Es wird zunehmend klarer, dass viele Krankheiten durch genetische Mutationen verursacht werden. In einigen Fällen sind diese Mutationen vererbt. In anderen sind die Mutationen während der Lebenszeit des Individuums erworben, beispielsweise als Ergebnis der Einwirkung von Strahlung oder karzinogenen Chemikalien. Die frühe Diagnose und optimale Behandlung von Krankheiten, die die Folge derartiger Mutationen sind, hängt häufig von der Fähigkeit ab, die Mutation nachzuweisen, und in einigen Fällen, die spezielle Natur der Mutation nachzuweisen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Verfahren zum Überprüfen auf genetische Mutationen entwickelt worden.
Eine Klasse von Tests verwendet immunodiagnostische Techniken, wie ELISA, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Proteinprodukts des diagnostisch wichtigen Gens nachzuweisen. Derartige Tests verwenden einen Antikörper, der sich selektiv entweder an das normale Proteinprodukt des Gens oder das Proteinprodukt des mutierten Gens bindet, und weist die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bindung nach. Diese Tests verursachen im Allgemeinen relativ geringe Kosten. Sie leiden jedoch an geringer klinischer Genauigkeit, da sie viele falsch negative Ergebnisse hervorbringen. Dies hat dazu geführt, dass Arbeiter auf diesem Gebiet den Wert von immunodiagnostischen Tests für die Diagnose oder die Durchmusterung bezüglich genetischer Krankheiten in Frage stellen. Siehe Beebe et al., J. Clin. Microbiol. 31: 2535-7 (1993); Warren, et al., J. Clin. Microbiol. 31: 1663-6 (1993); Roberts et al., The Lancet 336: 1523 (1990); De Cresce et al., Medical Laboratory Observer 25: 28 (1993); Einstein et al., New Engl. J. Med. 322: 178-183 (1990); Hall P. A., J. Pathology 172: 1-4 (1994).
Eine zweite Klasse von Tests für die Identifizierung von Genmutationen in Patientenproben verwendet Nucleinsäure-Sonden, die speziell mit dem Abschnitt des Gens hybridisieren, der den Mutationsort enthält. Test auf Sonden-Basis weisen eine hohe Genauigkeit (wenige falsch Negative) und Spezifität (wenige falsch Positive) für die spezifische Mutation auf. Ein Nachteil von Tests auf Sonden-Basis ist jedoch genau diese Spezifität, die von vorneherein eine detaillierte Kenntnis der zu überprüfenden Mutation erfordert, einen einzigartigen Satz von Reagenzien für jede Mutation erfordert und darin versagen kann, neue Arten von Mutationen nachzuweisen. Wegen dieser Nachteile haben einige kritisiert, dass diese Klasse von Tests ebenfalls für die Erfüllung der diagnostischen und Durchmusterungs-Aufgaben der Zukunft ungeeignet ist. Ewanowich et al., J. Clin. Microbiol. 31: 1715-25 (1993); Hatcher et al., Prenat. Diagn. 13: 171-7 (1993); Bull et al., The Lancet 340: 1360 (1992).
Eine dritte Klasse von Tests erhält die volle Sequenz der DNA für ein spezielles Gen, das aus der Probe gewonnen wurde. Erickson, D., Scientific American 267: 116 (1992). Anstelle der Durchführung einer Diagnose mittels indirekter Sonden- oder Proteintests lesen diese Tests die DNA-Sequenz des interessierenden Gens Base für Base. Dieses Verfahren, das als Sequenz-basierte Diagnose oder SBD bekannt ist, weist den Vorteil von nahezu 100%-iger Genauigkeit und 100%-iger Spezifität auf. Der Nachteil dieses Verfahrens sind jedoch die Kosten (etwa $ 1,00 pro Base), was das Verfahren für Durchmusterungs-Anwendungen und selbst für viele diagnostische Anwendungen tatsächlich unerschwinglich macht.
Da zunehmende Zahlen von Tests für verschiedene Zustände, Krankheiten und Prädispositionen, die mit genetischen Mutationen in Beziehung stehen, verfügbar werden, ist die Aufgabe, mit der man konfrontiert wird, die effektive Nutzung dieser Tests, um eine genaue, spezifische und dennoch kostengünstige Diagnose und Target-Durchmusterung bereitzustellen. Dünn et al., J. Cell. Biochem., Bd. Supp. 18C, Februar 1994, Seite 199, offenbart die Verwendung einer Reihe von Tests, um eine Probe bezüglich Mutationen im RB1-Gen auszuwerten. Es ist jedoch keine allgemeine Nützlichkeit für das Testverfahren offenbart, noch gibt es irgendeine Lehre einer Vorgehensweise bezüglich Mitteln zur Optimierung der Wahl der Tests für irgendeine gegebene Mutation.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erstellung von Test-"Algorithmen" bereitzustellen, welche die optimale Ausgewogenheit von verfügbaren Testverfahren zur Verwendung in Verbindung mit irgendeiner speziellen genetischen Mutation bereitstellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese und andere Ziele der Erfindung werden erreicht, indem man eine Hierarchie von mindestens zwei verschiedenen Assay-Techniken erstellt, welche verwendet wird, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation in einem interessierenden Gen zu überprüfen, wie es in den beigefügten Ansprüchen definiert ist. Qualitativ wird der erste Assay in der Hierarchie so ausgewählt, dass er einen hochspezifischen Test für das Vorhandensein der mit der Krankheit verbundenen Mutation bereitstellt, obwohl die Empfindlichkeit des Tests nicht hoch sein muß. Der letzte Assay in der Hierarchie wird so gewählt, dass er einen hochempfindlichen und hochspezifischen Test für das Vorhandensein der mit der Krankheit verbundenen Mutation bereitstellt. Dazwischenliegenden Tests mit fortschreitend größerer Empfindlichkeit können ebenfalls in der Hierarchie eingeschlossen sein. Die Wahl eines optimalen oder nahezu optimalen diagnostischen Algorithmus muß jedoch eine Überlegung der Kosten für jeden Test sowie die Empfindlichkeit und Spezifität der Tests einschließen. Weiter kann, wenn mehr als ein oder zwei Tests verfügbar sind, aus denen ausgewählt werden kann, die Auswahl des korrekten Satzes von Tests die Kosten des Gesamt-Testverfahrens ohne Verlust an Leistung beträchtlich verringern, während die Auswahl eines verschiedenen Satzes von Tests nicht den gleichen Grad an Einsparungen liefern können, ungeachtet der Tatsache, dass beide Testsätze für eine hierarchische Erhöhung der Kosten und der Empfindlichkeit sorgen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Mechanismus zur Bewertung von Testprotokollen bereit, um einen diagnostischen Algorithmus zu definieren, der aus bekannten Testverfahren zusammengestellt ist und die Gesamtleistung optimiert, während die Kosten minimiert werden. Gemäß der Erfindung ist der erste Schritt in dem Verfahren die Kalibrierung der verfügbaren Tests für eine gegebene genetische Mutation, um eine relative Empfindlichkeit, Spezifität und die relativen Kosten für jeden verfügbaren Test zu erstellen. Jede mögliche Kombination von Tests bis zu einer vordefinierten maximalen Anzahl von Tests wird dann ausgewertet, um die Gesamtempfindlichkeit, Gesamtspezifität, den Vorhersagewert eines positiven Tests und den Vorhersagewert eines negativen Tests zu bestimmen. Bei denjenigen Kombinationen, bei denen diese Werte alle einen Schwellenwert der Verläßlichkeit überschreiten, werden die erwarteten Kosten des Tests, E [CA], unter Verwendung der Formel
berechnet, in der ρA,r die Grenz-Wahrscheinlichkeit ist, dass der r. Test durchgeführt werden muß, um das Ergebnis zu erzielen, und C(j) die Kosten des j. Test sind. Für jeden gegebenen Satz von verfügbaren Tests ist der bevorzugte diagnostische Algorithmus oder die bevorzugte diagnostische Hierarchie der Test, der die geringsten zu erwartenden Kosten verursacht.
Wenn einmal die Hierarchie für eine gegebene, mit Mutation verbundene Krankheit ausgewählt ist, wird die Patientenprobe unter Verwendung jedes auf einander folgenden Assays in der Hierarchie analysiert. Wenn das Ergebnis des ersten Assays bezüglich der Anwesenheit von mit Krankheit verbundener Mutation negativ ist, wird der nächste Assay in der Hierarchie durchgeführt. Falls das Ergebnis positiv ist, können die nachfolgenden Assays in der Hierarchie durchgeführt werden oder nicht, abhängig von der Spezifität des ersten Assays, wie sie innerhalb des diagnos tischen Algorithmus definiert ist. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis der End- Assay bei allen Proben durchgeführt worden ist, die negative oder zweideutige Ergebnisse ergaben, als sie durch alle weniger empfindlichen Assays in der Hierarchie getestet wurden.
Ein Hauptvorteil des beanspruchten Verfahrens, das oben beschrieben wurde, ist die Fähigkeit, die Kosten für eine genetische Target-Durchmusterung und Diagnose pro Probe dramatisch zu verringern. Unter Verwendung von Verfahren mit fortschreitend größerer Empfindlichkeit und größeren Kosten nur dann, wenn die erhöhte Genauigkeit tatsächlich benötigt wird, und durch Auswahl eines diagnostischen Algorithmus, der den inhärenten Stärken und Schwächen von verfügbaren Tests Rechnung trägt, kann die Verläßlichkeit, von der man gedacht hatte, dass sie nur durch ein extrem kostspieliges Verfahren einer Sequenz-basierten Diagnose erhältlich sind, bei durchschnittlichen Kosten pro Patient erzielt werden, welche ein Bruchteil der Kosten ausmachen, die normalerweise mit der Durchführung einer Sequenz-basierten Diagnose verbunden sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt ein Fließdiagramm des zugrunde liegenden Konzepts der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 zeigt eine Kostenauswertung, welche die Kosten einer Hierarchie mit 3 Ebenen der in Fig. 1 gezeigten Art vergleicht;
Fig. 3 zeigt eine Hierarchie, die für die Diagnostik und Target-Durchmusterung auf Mutationen in RB1-Gen geeignet ist;
Fig. 4 zeigt eine Unterhierarchie, die bei Tests auf Mutationen im RB1-Gen nützlich ist; und
Fig. 5 zeigt eine Probenbestimmung eines Pharmacia A.L.F.-Sequenzierers unter Verwendung von Fluorescein-markierten Primern, um die Länge von Amplifikationsprodukten anzuzeigen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Verwendung eines strukturierten diagnostischen Ansatzes für die Identifikation von mit Krankheit verbundenen Mutationen in Patientenproben. Das zugrunde liegende Konzept der Erfindung ist die Verwendung einer Testhierarchie, die aus einer Mehrzahl von Assay-Techniken mit zunehmender Empfindlichkeit (und so im Allgemeinen zunehmenden Kosten) zusammengesetzt ist, als ein Target-Durchmusterungs- oder diagnostisches Verfahren für die Auswertung von Patientenproben. Die niedrigste Assay-Technik in der Hierarchie wird auf alle Proben angewendet, die für Tests vorgelegt wurden. Wenn im ersten Assay ein positives Ergebnis erhalten wird, kann ein Bericht erstellt werden, der ein positives Ergebnis für die Probe anzeigt, oder zusätzliche Tests können durchgeführt werden, abhängig von dem diagnostischen Algorithmus. Wenn ein negatives Ergebnis erhalten wird, wird die Probe immer unter Verwendung des nächtshöheren Assays in der Hierarchie weiter getestet. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis die höchste Stufe der Hierarchie erreicht worden ist.
Bei der Auswahl von Assays, die zur Verwendung in der beanspruchten Erfindung geeignet sind, ist die Bedeutung von mehreren Ausdrücken von Bedeutung. Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Anmeldung verwendet, betrifft der Ausdruck "Spezifität" das Vorkommen von falsch positiven Ergebnissen in einem speziellen Test, oder anders ausgedrückt, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum, bei dem eine gegebene Mutation abwesend ist, korrekt identifiziert wird. Ein Test, der eine "hohe Spezifität" aufweist, ergibt weniger als 1% falsch positive Ergebnisse und zeigt demgemäß selten, falls überhaupt, eine fehlerhafte Anzeige, dass eine Mutation vorliegt, kann aber darin versagen, die Mutation in einigen oder selbst vielen Fällen nachzuweisen. Im Gegensatz dazu betrifft der Ausdruck "Empfindlichkeit" das Vorkommen von falsch negativen Ergebnissen, d. h. die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum, bei dem eine gegebene Mutation vorliegt, korrekt identifiziert wird. Ein Test, der eine "hohe Empfindlichkeit" aufweist, zeigt weniger als 1% falsch negative Ergebnisse und wird selten, falls überhaupt, die Anwesenheit einer Mutation verfehlen, obwohl er eine inkorrekte Diagnose für die Anwesenheit der Mutation bereitstellen könnte. Tests mit niedrigerer oder höherer Spezifität und Empfindlichkeit, z. B. mit einer Irrtumsrate von mehr als 5% oder weniger als 0,1%, können natürlich verwendet werden, falls das Gesamtergebnis der hierarchischen Analyse vorteilhaft ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "mit Krankheit verbundene Mutation" auf alle Mutationen, die zu einem nicht-funktionierenden oder defekten Genprodukt führen, oder auf das Versagen, irgendein Genprodukt aus dem mutierten Gen zu erzeugen. Derartige Mutationen können Punktmutationen (d. h. Mutationen, in denen eine oder mehrere Basen innerhalb der Nucleinsäure-Sequenz durch eine verschiedene Base ersetzt worden sind), Insertionsmutationen (d. h. Mutationen, in denen die Gesamtlänge des interessierenden Gens durch die Insertion einer oder mehrerer Basen erhöht worden ist), Deletionsmutationen (Mutationen, in denen die Gesamtlänge des interessierenden Gens durch Entfernung einer oder mehrer Basen verringert worden ist) und Inversionsmutationen (Mutationen, in denen eine Region von zwei oder mehr Basen um 180º gedreht worden ist) oder Kombinationen derselben sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Target-Durchmusterung" auf Durchmusterungstests, die bei Individuen durchgeführt werden, welche als Ergebnis von familiärer Verwandtschaft, Einwirkung von gefährlichen Umgebungen oder anderen Faktoren als innerhalb einer Risikogruppe für eine spezielle Form von genetischer Krankheit liegend identifiziert worden sind.
Bei jeder gegebenen mit Krankheit verbundenen Mutation können die Tests, welche die Hierarchie gemäß der vorliegenden Erfindung bilden, aus allen Tests ausgewählt werden, welche die Anwesenheit der mit der Krankheit verbundenen Mutation widerspiegeln, obwohl Tests mit höherer Spezifität im Allgemeinen bevorzugt werden. Die spezifischen Tests, die am geeignetsten ausgewählt werden, hängen von einer Anzahl von Faktoren ab. Um die Auswahlkriterien für die Assay-Hierarchie zu erläutern, werden mehrere repräsentative Beispiele betrachtet.
Fig. 1 zeigt eine geeignete Hierarchie zur Verwendung in Tests auf eine mit Krankheit verbundenen Mutation, welche die Erzeugung eines defekten Genprodukts zum Ergebnis hat, das normalerweise aus einer oder mehreren zuvor identifizierten Punktmutationen herrührt. Wie gezeigt, werden die Proben von einer Mehrzahl von Patienten zuerst bezüglich einer mit Krankheit verbundenen Mutation in einem interessierenden Gen getestet, indem man zuerst einen Immunoassay bei einem Teil der Probe durchführt, die von jedem Patienten erhalten wurde. Ein derartiger Test wird im Allgemeinen so ausgewählt, dass er eine positive Reaktion in Anwesenheit eines Genprodukts eines mutierten Gens liefert. Der Immunoassay wird so ausgewählt, dass er hochspezifisch ist, so dass jedes positive Ergebnis ein zuverlässiger Indikator des Vorhandenseins der mit Krankheit verbundenen Mutation ist, muss aber nicht hochgenau sein.
Proben von Patienten, bei denen die Immunoassay-Ergebnisse negativ waren, werden als nächstes unter Verwendung eines Assays auf Sonden-Basis getestet. Im Allgemeinen wird der Assay auf Sonden-Basis mindestens eine Oligonucleotid-Sonde verwenden, die spezifisch und selektiv mit dem interessierenden Gen in seiner mutierten Form hybridisiert. So zeigt die Bildung eines doppelsträngigen Nucleinsäure-Hybrids, das die Nucleinsäure-Sonde enthält, die Anwesenheit der Mutation in dem interessierenden Gen an. Wiederum kann man sich wegen der hohen Spezifität von Tests auf Sonden-Basis auf jedes positive Ergebnis als Indikator für die Anwesenheit der getesteten mit Krankheit verbundenen Mutation verlassen.
Proben, bei denen sowohl der Immunoassay als auch der Test auf Sonden- Basis negativ sind, werden weiter gemäß der Erfindung analysiert, indem man die DNA-Sequenz in mindestens einer ausgewählten Region des interessierenden Gens bestimmt. Die Sequenz wird dann mit bekannten Sequenzen von normalen (Wild- Typ oder polymorphen) oder mutierten Formen des interessierenden Gens verglichen. Dieser Endschritt ergibt ein Ergebnis, das nicht nur unzweifelhaft anzeigt, ob eine Mutation vorliegt, sondern auch die Art der Mutation.
Eine Hierarchie der in Fig. 1 gezeigten Art könnte beispielsweise bei der Diagnose und Target-Durchmusterung auf p53-Mutationen verwendet werden, welche ein defektes Genprodukt erzeugen, das im Allgemeinen das Ergebnis von einer oder mehreren identifizierten Punktmutationen ist. Assays, die für p53-Mutationen spezifisch sind, werden verwendet, um weiter die Erörterung dieser Ausführungsform der Erfindung zu erleichtern, aber es versteht sich, dass die Anwendbarkeit dieser Ausführungsform der Hierarchie nicht auf den Nachweis von p53-Mutationen beschränkt ist und beispielsweise für den Nachweis von k-Ras-, APC-, DCC-, p16- und HLA-Mutationen ebenfalls verwendet werden könnte.
Die Verfahren zur Züchtung von Antikörpern gegen spezifische Genprodukte sind in der Literatur gut beschrieben, beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4,172,124 und 4,474,893, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Normalerweise werden Antikörper gezüchtet, die sich an Abschnitte des Genprodukts binden, die entfernt von üblichen Mutationsorten liegen, so dass sich derselbe Antikörper sowohl an das mutierte als auch an das normale Protein bindet. Bei p53 sind Antikörper dieser Art im Handel von einer Vielfalt von Firmen erhältlich, einschließlich BioGenex (Bp53-12) und Oncogene Science (1801). Bevorzugte Antikörper zur Verwendung in dieser Erfindung sind wegen ihrer verbesserten Voraussagefähigkeit und Spezifität monoklonale Antikörper. Es versteht sich jedoch, dass im Wesentlichen jeder Antikörper, der den gewünschten hohen Grad an Spezifität besitzt, verwendet werden kann, und dass eine Optimierung, um eine hohe Genauigkeit zu erzielen, nicht erforderlich ist.
Der Antikörper, der gegen das defekte Genprodukt gezüchtet worden ist, wird zu einem Teil der Patientenprobe unter Bedingungen gegeben, bei denen eine immunologische Reaktion stattfindet, falls das defekte Genprodukt anwesend ist, und die Probe wird dann ausgewertet, um zu sehen, ob eine Reaktion stattgefunden hat. Das spezielle Verfahren zur Durchführung dieser Auswertung ist nicht kritisch. Beispiele für geeignete Verfahren umfassen Enzym-verknüpfte Immunoassays (ELISA), beschrieben im US-Patent Nr. 4,016,043, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird, Fluoreszenz-Enzymimmunoassays (FEIA oder ELFA), die dem ELISA ähnlich sind, außer dass ein fluorogenes Enzymsubstrat, wie 4-Methylumbelliferyl-β-galactosid anstelle eines chromogenen Substrats verwendet wird, und Radioimmun-Assays (RIA).
Aus der Auswertung des ersten Assays wird der nächste in dem Verfahren durchzuführende Schritt festgelegt. Falls das Ergebnis positiv ist, erlaubt die hohe Spezifität des Tests die Herstellung eines Berichts entweder in Form eines gedruckten Berichts oder einer elektronischen Mitteilung, beispielsweise durch elektronische Post oder Faksimile übertragen. Der Bericht kann auch in Form eines Eintrags in eine Patienten-Computerdatei stattfinden, die später durch den Arzt des Patienten aufgerufen werden kann.
Wenn das Ergebnis des Immunoassays negativ ist, verhindert die Möglichkeit eines falsch negativen Tests, dass irgendeine sichere Schlußfolgerung über die Existenz einer Mutation getroffen wird. In diesem Fall wird die Probe unter Verwendung des nächsten Tests in der Hierarchie nochmals getestet.
Im Beispiel von p53, wo es anerkannte Orte von wahrscheinlichen Punktmutationen gibt, wird ein geeigneter zweiter Test auf der Basis von Nucleinsäure- Hybridisierung durchgeführt. Geeignete Sonden für Hybridisierungsassays überlappen mit den bekannten Mutationsorten, die bei den Aminsäuren 175, 248 und 273 des p53-Proteins auftreten, und können so synthetisiert werden, dass sie entweder zu der normalen Nucleinsäure-Sequenz oder zu den bekannten Mutationen komplementär sind.
Bei den Tests auf Sonden-Basis gemäß der Erfindung kann es sich um irgendeinen der mehreren allgemeinen Typen handeln. Ein Typ von Test auf Sonden-Basis verwendet Amplifikationsprimer, welche den Ort einer möglichen Mutation flankieren. Die amplifizierte DNA wird dann mit einer markierten Oligonucleotid-Sonde vereinigt, die sich spezifisch an einen Abschnitt der amplifizierten DNA bindet, welche den möglichen Mutationsort entweder in ihrer Mutante oder ihrer Wildtyp-Form überspannt. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Hybridisierung wird nachgewiesen und zeigt die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation an.
Es sind zahlreiche Abwandlungen dieses grundsätzlichen Verfahrens bekannt und können bei der Durchführung dieses Verfahrens verwendet werden. Beispielsweise kann die amplifizierte DNA unter Verwendung von biotinylierten Primern hergestellt werden, welche die Immobilisierung der amplifizierten DNA und damit die Abtrennung von ungebundener markierter Sonde von der amplifizierten DNA erleichtern. Eine Palette von Sonden, die für verschiedene bekannte Mutationen spezifisch sind, kann auf eine Weise als Matrix auf einem Träger immobilisiert werden, die für die HLA-Typisierung verwendet worden ist.
Vor dem Testen einer Probe unter Verwendung des oben beschriebenen direkten Hybridisierungsverfahrens können die Nucleinsäure in der Probe selektiv unter Verwendung einer Technik wie der Polymerase Chain Reaction-(PCR-)Amplifikation selektiv amplifiziert werden. Diese Technik, die in den US-Patenten Nr. 4,683,202 und 4,683,195 beschrieben ist, verwendet zwei Amplifikationsprimer, von denen jeder mit einem unterschiedlichen der beiden Stränge des DNA-Doppelstrangs in einer Region, die von dem zu testenden Mutationsort entfernt liegt, hybridisiert. Vorzugsweise hybridisieren die Primer mit nicht-kodierenden Abschnitten der DNA-Sequenz (d. h. Introns), die angrenzend an den kodierenden Abschnitt der DNA-Sequenz (Exon), der den Mutationsort enthält, liegen. Mehrere Zyklen von Primerverlängerung und Denaturierung werden verwendet, um zusätzliche Kopien der DNA zu erzeugen, mit denen die Primer hybridisieren können. Auf diese Weise kann die Anzahl der Kopien des interessierenden Gens oder Exons erhöht werden, wodurch sowohl die Spezifität als auch die Genauigkeit des Verfahrens erhöht wird.
PCR kann auch als Teil eines Molekulargewichts-Sonden-Assays verwendet werden, um Insertions- oder Deletions-Mutationen nachzuweisen. In diesem Verfahren wird die DNA in einer Probe unter Verwendung eines definierten Primerpaars für jedes Exon des interessierenden Gens amplifiziert, und das amplifizierte Produkt wird unter Verwendung von Elektrophorese analysiert. Falls die Primer so ausgewählt sind, dass sie an ein Intron binden, das einem interessierenden Mutationsort benachbart ist, kann die Anwesenheit von Insertions- oder Deletionsmutationen bestimmt werden, indem man das Molekulargewicht des amplifizierten Abschnitts des Gens auswertet. Dieses Verfahren kann vorteilhaft in einer "Multiplex"-Form durchgeführt werden, in der Primer für eine Mehrzahl von Exons (im allgemeinen 4-8) coamplifiziert und gleichzeitig auf einem einzigen Gel ausgewertet werden. Dies wird durch sorgfältige Auswahl der Primer für jedes Exon ermöglicht, wobei das amplifizierte Fragment, welches das normale Exon überspannt, eine Länge aufweist, die von den Fragmenten verschieden ist, die alle anderen normalen Exons überspannen. Die Verwendung dieser Technik weist den Vorteil des Nachweises sowohl von normalen als auch mutierten Allelen in heterozygoten Individuen auf. Weiter kann sie durch die Verwendung der Multiplex-Amplifizierung sehr kostengünstig sein.
Alternativ können PCR-Primer, die sich spezifisch an mutierte Exons binden, bei der Amplifikation verwendet werden, um sowohl Schlüssel-Punktmutationen als auch Insertions- und Deletions-Mutationen nachzuweisen. In diesem Fall wird das Produkt in dem Elektrophoresegel nur beobachtet, wenn eine Hybridisierung des Primers stattgefunden hat. So ist das Auftreten von Amplifikationsprodukten ein Indikator für die Anwesenheit der Mutation, während die Länge des Amplifikationsproduktes die Anwesenheit von zusätzlichen Mutationen anzeigen kann.
Ein weiterer Test-Typ erfordert keine PCR-Amplifikation. In diesen Tests wird eine für eine DNA-Sequenz spezifische Sonde mit einem RNA-Linker hergestellt, der durch DNA flankiert ist. Ein Ende der Sonde wird markiert. Die Sonde wird mit der Target-DNA bei der Temperatur gemischt, welche gestattet, dass die Sonde mit voller Länge mit dem Target hybridisiert. In der Mischung befindet sich das Enzym RNase H, das spezifisch RNA in RNA:DNA-Hybriden, aber nicht einzelsträngige RNA spaltet. Wenn die Temperatur erniedrigt wird, wird das Enzym aktiv, und wenn die Sonde ein Target gefunden hat, wird sie durch das Enzym gespalten. Die Temperatur wird dann erhöht, und jegliche gespaltene Sonde (die nun kürzer ist) wird sich vom Target trennen, was einen Raum zum Binden einer weiterer Sonde mit voller Länge öffnet. Dieses Verfahren wird wiederholt, um eine ausreichende Menge an gespaltener Sonde aufzubauen, die durch Gelelektrophorese nachweisbar ist.
In den vorangehenden Test-Typen ist die Art der verwendeten nachweisbaren Markierung nicht kritisch. Geeignete Markierungen umfassen radioaktive Isotope, beispielsweise ³&sup5;S, lumineszierende Markierungen, wie Fluorescein, ABC-Kits oder Chemilumineszenz.
Die Auswertung von Genprodukten durch Immunoassay und Nucleinsäure- Hybridisierungs-Assays auf Sonden-Basis werden genau genommen als "indirekte" Verfahren angesehen, da die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation aus der Wechselwirkung der Probe mit einem Testreagens gefolgert wird. Andere indirekte Testverfahren können in dem Verfahren der Erfindung ebenfalls als ein Test in der Hierarchie von Testverfahren entweder anstelle von oder zusätzlich zu Immunoassay oder Verfahren auf Sonden-Basis verwendet werden. Beispielsweise kann in Fällen, in denen sie das erforderliche Maß an Spezifität bieten, ein einzelsträngiger Konformations-Polymorphismus (SSCP), der auf der Form des gefalteten Gens beruht, ein Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP), der auf der Länge der spezifischen DNA-Fragmente beruht, die unter Verwendung von Restriktions- Endonucleasen erzeugt werden, oder ein Heteroduplex-DNA-Nachweis verwendet werden. Derartige Verfahren sind in den US-Patenten Nr. 4,582,788, 4,683,194, und 5,227,292 beschrieben.
Der Endtest in der Hierarchie der Erfindung sollte ein Test sein, der sowohl eine hohe Spezifität als auch eine hohe Genauigkeit liefert. Ein geeigneter Test für diesen Zweck ist die Bestimmung der Sequenz des interessierenden Gens oder Exons.
Die DNA-Sequenzierung kann unter Verwendung automatisierter Systeme durchgeführt werden, die für eine Laboranwendung ausgelegt sind. Verfahren und Vorrichtungen zur Sequenzierung von DNA sind in den US-Patenten Nr. 4,811,218; 4,823,007; 5,062,942; 5,091,652; 5,119,316 and 5,122,345 beschrieben. Das allgemeine Verfahren, das in diesen Systemen verwendet wird, beinhaltet die Amplifikation (beispielsweise mit PCR) der interessierenden DNA-Fragmente; das Vereinigen der amplifizierten DNA mit einem Sequenzierungsprimer, welcher der gleiche oder ein anderer als die Amplifikationsprimer sein kann; das Verlängern des Sequenzierungsprimers in Anwesenheit von normalem Nucleotid (A, C, G und T) und einem Kettenabbruch-Nucleotid, wie einem Didesoxynucleotid, das die weitere Verlängerung des Primers verhindert, wenn es eingebaut ist; und die Analyse des Produkts bezüglich der Länge der erhaltenen verlängerten Fragmente. Die Analyse der Fragmente kann durch Elektrophorese, z. B. auf einem Polyacrylamidgel, durchgeführt werden.
Während derartige Verfahren, die auf dem ursprünglichen Didesoxy-Sequenzierungsverfahren beruhen, das von Sanger et al. offenbart wurde, in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, ist der Endassay nicht auf derartige Verfahren beschränkt. Beispielsweise können andere Verfahren zur Bestimmung der Sequenz des interessierenden Gens oder eines Abschnitts desselben ebenfalls verwendet werden. Alternative Verfahren umfassen Abwandlungen des Didesoxy-Verfahrens und Verfahren, die überhaupt nicht auf kettenabbrechenden Nucleotiden beruhen, wie dasjenige, das im US-Patent Nr. 4,971,903 offenbart ist.
Fig. 2 zeigt eine Kostenbewertung, welche die Kosten einer Hierarchie mit drei Ebenen der in Fig. 1 gezeigten Art mit den Kosten der Verwendung einer Sequenzbasierten Diagnose bei allen Individuen vergleicht. Wie ersichtlich ist, sind die potentiellen Einsparungen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung beträchtlich.
Um weiter das Verfahren der Erfindung zu erläutern, zeigt Fig. 3 eine Hierarchie, die für die Diagnose und Target-Durchmusterung auf Mutationen im RB1-Gen geeignet ist. Mutationen in diesem Gen sind mit der Initiierung eines Augenkrebses verbunden, der als Retinoblastom bekannt ist, und sind an dem Fortschreiten anderer Krebse, wie Lungenkrebs und Brustkrebs, beteiligt.
Mit Krankheit verbundene Mutationen im RB1-Gen erzeugen im Allgemeinen kein defektes Genprodukt, sondern haben vielmehr ein Versagen, das RB-Protein zu erzeugen, zur Folge. Da dieses Protein an der Regulierung der Zellteilung beteiligt ist, hat ein Versagen, das RB-Protein zu erzeugen, eine unkontrollierte Zellteilung und Tumorbildung zur Folge. Weiter sind die mit Krankheit verbundenen Mutationen im RB-Gen hoch mannigfaltig und häufig von Familie zu Familie einzigartig. Dies macht Assay-Verfahren für RB1-Mutationen zu einer besonderen Herausforderung.
Da das Ergebnis einer Mutation im RB1-Gen normalerweise die Abwesenheit des normalen Genprodukts anstelle eines defekten Genprodukts ist, sind Immunoassays beim Nachweis von RB1-Mutationen wenig brauchbar, obwohl ein quantitativer Immunoassay in einigen Fällen verwendet werden kann, um eine Heterozygotie nachzuweisen, welche die Produktion der Hälfte der normalen Menge an Protein zur Folge hat. Bignon et al., Genes Dev. 7: 1654-1662 (1993). Antikörper für diesen Zweck können, falls gewünscht, durch normale Techniken gezüchtet werden, wie in Lee et al., Nature 329: 642-645 (1987) beschrieben. Alternativ können synthetische Antigene, welche Teile der Struktur des RB-Genprodukts nachahmen, verwendet werden, um die Antikörperproduktion zu stimulieren. Derartige Antikörper sind beispielsweise in den internationalen Patentveröffentlichungen Nr. 92/12807, 89/06703 und dem europäischen Patent Nr. 390 530 beschrieben.
Das bevorzugte Verfahren zum Nachweis von RB-Mutanten und ähnlichen Mutanten läßt jedoch den Immunoassay weg und schreitet direkt zu einem Assay, der so ausgelegt ist, dass er Insertions- oder Deletionsmutationen nachweist. Wie in mehr Einzelheit in der gleichzeitig eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 08/271,942 beschrieben, ist dies besonders im Fall von Retinoblastom nützlich, bei dem etwa 50% der Mutationen Insertionen oder Deletionen von einem oder mehreren Basenpaaren beinhaltet.
Das Verfahren zur Identifikation von Mutationen im RB1-Gen beruht auf einem hierarchischen Ansatz, in dem eine Probe, die von einem Patienten mit Retinoblastom-Diagnose abstammt, zuerst mit einem Test mit mäßiger Genauigkeit aber hoher Spezifität getestet wird, d. h. einem Test, der etwa 50% aller Mutationen nachweist (etwa 50% falsch negative), aber im Wesentlichen niemals ein falsch positives Ergebnis ergibt. Eine Probe, die ein negatives Ergebnis zeigt, wird anschließend einem kostspieligeren, aber genaueren Test unterzogen, um zu bestimmen, ob eine Mutation vorliegt. Durch Ausschalten dieses Test bei über der Hälfte der Proben erniedrigen sich jedoch die Durchschnittskosten für den Test, ohne dass die analytische Leistung geopfert wird.
Im Fall von Tests für Mutationen im RB1-Gen besteht die Hierarchie vorzugsweise aus zwei Ebenen. Die Ebene 1, wie in Fig. 3 gezeigt, beinhaltet einen Test, der bei allen Patientenproben durchgeführt wird. In diesem Test werden ein oder mehrere Exons des RB1-Gens einzeln amplifiziert, und die Längen der amplifizierten Fragmente werden bestimmt. Wenn es irgendeinen Unterschied zwischen der Länge von irgendeinem amplifizierten Exon und der normalen Länge dieses Exons gibt, ist dies die Anzeige einer Insertions- oder Deletions-Mutation in diesem Exon.
Die Anzahl von Exons, die in der Ebene 1 der Hierarchie getestet wird, ist für den Benutzer eine Frage der Wahl. Beispielsweise wurde beobachtet, dass mit Krankheit verbundene Mutationen im RB1-Gen selten in den Exons 5, 25, 26 und 27 auftreten. Es kann deshalb wünschenswert sein, diese Exons zuletzt nach dem Testen der anderen Exons zu testen, um zu sehen, ob eine Mutation, die ausreicht, um die Krankheit zu verursachen, festgestellt wird, bevor die Ausgabe vorgenommen wird, diese weniger wahrscheinlichen Exons zu testen. Beim Testen dieser anderen Exons hat der Benutzer die Wahl, sie einzeln zu einem Zeitpunkt oder in einer Multiplex-Gruppe zu einem Zeitpunkt zu testen. Alternativ kann der Benutzer die Wahl treffen, alle Exons gleichzeitig in der ersten Ebene der Hierarchie zu testen.
Wenn eine Mutation in der Ebene der Hierarchie festgestellt wird, ist es nicht erforderlich, zusätzliche Tests mit der Patientenprobe durchzuführen, um das Identifikationsverfahren zu vervollständigen. Vorzugsweise wird jedoch die Sequenz des mutierten Exons als Teil der zweiten Ebene der Hierarchie bestimmt, um zu bestätigen, dass die nachgewiesen Mutation in der Tat eine Ursache der beobachteten Krankheit sein kann.
Wenn in der ersten Ebene der Tests keine Mutation nachgewiesen wird, wird die zweite Ebene der Tests durchgeführt. Dies beinhaltet die Bestimmung der Sequenz der Exons, um den Ort der Mutation festzustellen. Da jedoch die Sequenzierung teuer ist, kann es wünschenswert sein, in dieser Ebene des Testens eine Unterhierarchie zu verwenden, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass alle Exons sequenziert werden müssen. In diesem Fall ist eine geeignete Unterhierarchie in Fig. 4 gezeigt. Gemäß dieser Unterhierarchie sind die ersten sequenzierten Exons (Ebene 2A) diejenigen, die leicht zu sequenzieren sind und die der Ort von anderen mit Krankheit verbundenen Mutationen gewesen sind. Als nächstes werden, wenn keine Mutation gefunden wird, die ein Retinoblastom zur Folge haben könnte, Exons sequenziert, die schwierig zu sequenzieren sind und die der Ort von anderen mit Krankheit verbundenen Mutationen gewesen sind (Ebene 2B). Die dritte Ebene der Unterhierarchie schließt Exons ein, die leicht zu sequenzieren sind, von denen aber niemals gezeigt worden ist, dass sie eine mit Krankheit verbundene Mutation enthalten (Ebene 2C). Schließlich werden Exons sequenziert, die schwierig zu sequenzieren sind, von denen aber niemals gezeigt worden ist, dass sie eine mit Krankheit verbundene Mutation enthalten (Ebene 2D).
Die Primer, die verwendet werden, um die Proben-DNA beim ersten Test in der Hierarchie zu amplifizieren, sind Oligonucleotide mit definierter Sequenz, die so ausgewählt sind, dass sie selektiv in speziellen Abschnitten des RB1-Gens hybridisieren. Jeder Primer weist eine daran gebundene nachweisbare Markierung auf. Ein bevorzugtes Beispiel für eine derartige Markierung ist Fluorescein, das eine Standardmarkierung ist, die in Nucleinsäure-Sequenzierungssystemen unter Verwendung von Laserlicht als Nachweissystem verwendet wird. Es können jedoch andere nachweisbare Markierungen ebenfalls verwendet werden, einschließlich anderer Fluorophore, chemilumineszierender Markierungen, Radiomarkierungen, chemischer Kuppler, wie Biotin, das mit Streptavidin-verknüpften Enzymen nachgewiesen werden kann, und Epitop-Markierungen, wie Digoxigenin, das unter Verwendung von Antikörpern, die von Boehringer-Mannheim erhältlich sind, nachgewiesen wird.
Während eine beträchtliche Variation der Sequenz der Primer möglich ist, die bei der Amplifikation der Exons beim ersten Schritt in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind die bei der Amplifikation verwendeten Primer und die Bedingungen der Amplifikation vorzugsweise zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung optimiert. Wenn man zuerst die verwendeten Primer betrachtet, versteht es sich, dass, um die Möglichkeit von falsch positiven Ergebnissen zu vermeiden, das Primerpaar, d. h. die Kombination des 5'-Primers und des 5'-Primers für irgendein gegebenes Exon, einzigartig für das RB1-Gen sein muß, damit nur das RB1-Gen amplifiziert wird. Dies bedeutet, dass die Primersequenzen im Allgemeinen etwas länger sind als das Minimum, das als Amplifikationsprimer verwendet werden kann. Bevorzugte Primer weisen eine Länge von 18 bis 23 Nucleotiden ohne innere Homologie oder Primer-Primer-Homologie auf. Es ist auch wünschenswert, dass die Primer stabilere Duplexe mit der Target-DNA an den 5'-Enden des Primers als an ihren 3'-Enden bilden, da dies zu weniger falschem Primen führt. Die Stabilität kann durch den GC-Gehalt abgeschätzt werden, da GC-Basenpaare stabiler sind als AT- Paare, oder durch die thermodynamischen Nächste-Nachbar-Parameter. Breslauer et al., "Predicting DNA duplex stability from base sequence", Proc. Nat'l Acad. Bei. U.S.A. 83: 3746-3750 (1986). Zusätzlich werden die zwei Primer eines Paars vorzugsweise so ausgewählt, dass sie in den Introns hybridisieren, die unmittelbar das unter Verwendung des Primerpaars zu amplifizierende Exon flankieren, um eine vollständige Amplifikation jedes Exons sicherzustellen.
Zusätzliche Faktoren betreffen die Auswahl von Primern für eine Multiplex-Amplifikation von Exons. Diese Faktoren sind in Rylchik, W., "Selection of Primers for Polymerase Chain Reaction", in Methods in Molecular Biology, Bd. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White, B. A. Hsg., Humana Press, Totowa, N. J., 1993 erörtert. Kurz werden bei der Anwendung dieser Faktoren Primerpaare durch die Position, Ähnlichkeit der Schmelztemperatur, innere Stabilität, Abwesenheit von innerer Homologie oder Homologie mit einander ausgewählt, d. h. sie kleben nicht aneinander oder an sich selbst, und das 3'-Ende bildet keine stabile Haarnadelschleife zurück auf sich selbst.
So ist im vorliegenden Fall das Ziel, über Sätze von Primerpaaren mit ungefähr dem gleichen thermischen Profil zu verfügen, so dass sie effizient zusammen coamplifiziert werden können. Dieses Ziel kann erreicht werden, indem man über Gruppen von Primerpaaren mit etwa der gleichen Länge und dem gleichen G/C-Gehalt verfügt. Zusätzlich wird es bevorzugt, dass die Länge der Genregion zwischen den Primer-Bindungsstellen auf einem normalen RB1-Gen für jedes Exon verschieden ist, das als Gruppe Multiplex-amplifiziert werden soll. Unterschiede von lediglich der Länge einer Base sind ausreichend, vorausgesetzt, dass ein hochauflösendes Gel, das Einbasen-Unterschiede auflösen kann, bei der Analyse der Amplifikationsprodukte verwendet wird. Jedoch werden größere Längenunterschiede bevorzugt.
Zusätzlich zu der Auswahl von geeigneten Primern werden die besten Ergebnisse bei der Fragmentlängen-Analyse erhalten, wenn die Amplifikationsreaktion über eine beschränkte Anzahl von Amplifikationszyklen durchgeführt wird. Es versteht sich, dass, je mehr Amplifikationszyklen durchgeführt werden, desto mehr gewünschtes Produkt hergestellt wird und demgemäß desto leichter sein Nachweis sein wird. Es sollte jedoch ebenfalls erkannt werden, dass während der anfänglichen Zyklen (im Allgemeinen der ersten 20-25 Zyklen) sich die Menge an DNA der gewünschten Sequenz in jedem Zyklus verdoppelt, während anschließend die Ausbeute des gewünschten Produkts abfällt. Für die maximale Wirksamkeit im Verfahren der vorliegenden Erfindung sollte die Amplifikation der Exons in der Patientenprobe nur über eine Zahl von Zyklen durchgeführt werden, bei denen eine Verdoppelung der DNA immer noch erzielt wird. Eine derartige Amplifikation wird in der Beschreibung und den Ansprüchen hierin als "quantitative Amplifikation bezeichnet.
Nach der Amplifikation der Exons des RB1-Gens werden die Amplifikationsprodukte elektrophoretisch unter Verwendung eines Sequenzierungsgels analysiert. Bevorzugte Gele weisen eine Auflösung von 1 Basenpaar auf, so dass Einbasen-Deletionen oder -Insertionen, die im Fall von Retinoblastom relativ üblich sind, identifiziert werden können. Ein geeignetes Gel ist ein Polyacrylamidgel der Art, die zur Verwendung mit dem Pharmacia A.L.F. Sequencer empfohlen wird.
Die Art von Nachweissystem, die verwendet wird, um das Gel zu analysieren, hängt von der Art der Markierung ab, die bei den Amplifikationsprimern verwendet wird. Beispielsweise könnte im Fall von radiomarkierten Primern das Gel durch Autoradiographie analysiert werden. Die bevorzugten Markierungen sind jedoch Fluorophore, die unter Verwendung von Photodioden, Photomultipliern oder anderen lichtempfindlichen Vorrichtungen nachgewiesen werden.
Fig. 5 zeigt ein Probenergebnis eines Pharmacia A.L.F. Sequencer unter Verwendung von Fluorescein-markierten Primern. Jeder Peak in dem Ergebnis entspricht einem einzelsträngigen Fluorescein-markierten amplifizierten DNA-Produkt aus einer PCR-Reaktion, das im Gel wandert. Jedes Exon des RB1-Gens und ein Kontroll-Exon von einem Gen auf dem Chromosom 15, das nicht mit RB1 verwandt ist, wandern mit einer unterschiedlichen Geschwindigkeit. Durch Vergleich der Peaks der Patientenproben mit denjenigen des Wildtyps kann festgestellt werden, dass eine Mutation vorliegt, in diesem Fall die vollständige Deletion des Exons 10 von einem Allel oder die Deletion eines Teils eines Exons und einer der Primer-Stellen. In einer Probe vom Gewebe des Tumors des Patienten ist die Mutation homozygot (kein Exon 10), während im Blut dieses Patienten der Exon 10-Peak um 50% verringert ist, was anzeigt, dass dieser Patient die Mutation in seinem somalischen Gewebe und deshalb wahrscheinlich in seiner Keimbahn trägt. Die Deletion des Exons 10 führt zu einem schwer verkürzten RBT-Protein, dem viele der Bereiche fehlen, die für eine richtige Funktion erforderlich sind, deshalb kann sicher angenommen werden, dass dieses die krankheitsverursachende Mutation ist.
Die zweite Ebene der Hierarchie fordert die Sequenzierung von einem oder mehreren Exons des RB1-Gens. Vorzugsweise wird dieses Sequenzierungsverfahren mit amplifizierter DNA durchgeführt. Die in der Präsequenzierungs-Amplifikation verwendeten Primer können dieselbe Sequenz aufweisen wie diejenigen, die in der ersten Ebene der Testhierarchie verwendet wurden, oder sie können verschieden sein. In jedem Fall wird es jedoch bevorzugt, dass anstelle der nachweisbaren Markierungen, die bei den Primern in der Amplifikation der ersten Ebene verwendet wurden, bei der Präsequenzierungs-Amplifikation einer der Primer von jedem Paar modifiziert wird, um die Gewinnung zu erleichtern. Beispielsweise kann ein Primer jedes Paars biotinyliert werden, so dass er durch Binden an einen mit Streptavidin beschichteten Träger gewonnen werden kann.
Einer der kritischen Parameter für eine erfolgreiche Gewebetransplantation ist, dass die HLA-Typen so nahe wie möglich angeglichen sind. Da die Wahrscheinlichkeit der Abstoßung abnimmt, wenn die Angleichung enger wird, ist eine erfolgreiche Transplantation um so wahrscheinlicher, je genauer die Bestimmung des HLA-Typs ist. Die direkte Bestimmung der DNA-Sequenz der HLA-Gene wäre deshalb vorteilhaft. Die große Zahl von möglichen Spendern, die durchmustert werden muss, macht jedoch die direkte Sequenzierung unter Verwendung der derzeitigen Technologie unmöglich. Deshalb ist ein schrittweiser, hierarchischer Durchmusterungsansatz gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Bestimmung der HLA-Typen nützlich.
Der erste Schritt in einer hierarchischen HLA-Typisierung ist eine serologische Auswertung, die mit dem Blut von möglichen Spendern und Empfängern durchgeführt wird. Es sind Antikörper verfügbar, die mit spezifischen Gruppen von HLA- Klasse I-Molekülen auf der Oberfläche der im Vollblut gefundenen Lymphozyten reagieren (d. h. sich an diese binden). Dies sind hochspezifische Tests für die HLA- Klasse I-Gruppen, aber sie weisen eine geringe Genauigkeit auf und sind nicht in der Lage, zwischen einem Mitglied der Gruppe und einem anderen zu unterscheiden. Diese Tests können auch rasch und wirtschaftlich bei einer sehr großen Zahl von möglichen Spendern durchgeführt werden. Die Spender werden dann gemäß ihrer serologischen Klassifizierung in Gruppen eingeteilt.
Mögliche Transplantat-Spender und -Empfänger werden dann getestet, um ihren HLA-Klasse II-Typ unter Verwendung eines Tests auf Sonden-Basis entweder mit dem Ansatz mit sequenzspezifischem Primer (SSP) oder Allel-spezifischem Oligonucleotid (ASO), der oben beschrieben wurde, zu bestimmen. Diese Test werden mit DNA durchgeführt, die aus peripheren Blutlymphozyten (PBL) unter Verwendung der Sätze von Sonden für spezielle HLA-Klasse II-Untertypen isoliert wurde. Beispiele für geeignete Tests auf Sonden-Basis für die HLA-Typisierung werden im US-Patent Nr. 4,582,788 gefunden.
Auf der Grundlage, dass die Klasse I- und Klasse II-Typen bei jedem möglichen Spender und Empfänger bekannt sind, wird das Feld der möglichen Spender für einen gegebenen Empfänger eingeengt. Die HLA-Gene dieser gewählten möglichen Spender und des Empfängers werden dann unter alleiniger Verwendung von Primern sequenziert, die für die Untertypen spezifisch sind, welche in den vorherigen Tests vorgefunden wurden. Auf diese Weise kann mit vernünftigen Kosten eine genaue Sequenz-Übereinstimmung der HLA-Gene aus einer großen Zahl von möglichen Spendern gefunden werden.
Ein weiteres Beispiel für eine Krankheit, die geeignet unter Verwendung des hierarchischen Verfahrens der Erfindung diagnostiziert wird, ist Fibrose cystica. Früher glaubte man, dass Fibröse cystica (CFTR) das Ergebnis von nur wenigen Mutationen ist, von denen man gedacht hat, dass sie vor vielen Generationen ent standen sind und seit daher in der Bevölkerung weitergetragen wurden. Mit der Klonierung des Gens und der detaillierten Suche nach Mutationen wissen wir jedoch nun, dass dies falsch ist. Obwohl es einige Mutationen gibt, die sehr vorherrschend sind, geht die Zahl der verschiedenen Mutationen, die bis jetzt gefunden wurden, in die Hunderte, und die Geschwindigkeit, mit der sie gefunden Werden, zeigt kein Zeichen der Abnahme. Dies macht es schwierig, zu einem vernünftigen Preis unter herkömmlichen Einzeltest-Strategien eine genaue genetische Beratung bereitzustellen.
Abhängig von dem genetischen Hintergrund des Patienten gibt es eine kleine Zahl von bekannten Mutationen (im Allgemeinen weniger als 20), die etwa 90% der CFTR-Mutationen Rechnung tragen, die in dieser Gruppe gefunden werden. Beispielsweise tragen 17 Mutationen 94% der mutierten CFTR-Chromosomen in der belgischen Bevölkerung Rechnung. Die übrigen Mutationen werden mit sehr geringer Häufigkeit, d. h. weniger als 0,1%, gefunden. Demgemäß ist Fibröse cystica ideal für eine hierarchische Target-Durchmusterung geeignet.
Wie bei RB wird anfänglich nur ein betroffenes Mitglied jeder Familie bezüglich der Identifikation der Mutation durchmustert. DNA von den PBLs des betroffenen Familienmitglieds wird unter Verwendung eines Satzes von DNA-Sonden, welcher die größte Information über deren genetischen Hintergrund liefert, oder, wenn der genetische Hintergrund unbekannt ist, eines Satzes von Sonden getestet, der über alle genetischen Hintergründe am meisten Information liefert. Diese Sonden können von der Art sein, die nur mit einem spezifischen Allel hybridisiert (ASO), sie können die Hälfte eines PCR-Primerpaars sein, das nur ein spezifisches Allel amplifiziert (SSP), oder sie können eine Region des Gens amplifizieren, die eine Mutation enthält, welche die Restriktionsendonucleasen-Erkennungsstelle ändert (PCR- RFLP). Die Anwesenheit einer gebundenen Sonde, eines amplifizierten Produkts oder einer erwarteten Restriktionsstelle wird dann ausgewertet, um zu sehen, ob eine der üblichsten Mutationen vorliegt.
Proben, die im ersten Schritt der hierarchischen Analyse keine Mutation zeigen, werden weiter unter Verwendung von Tests mit höherer Genauigkeit getestet.
Beispielsweise kann eine Fragmentlängen-Analyse von jedem amplifizierten Exon auf die oben für die RB-Mutationen erörterte Weise durchgeführt werden, um kleine und große Insertionen oder Deletionen aufzufinden. Dieselben Fragmente könnten auch durch Heteroduplex-Bildung analysiert werden. Diese Technik nimmt einen Vorteil aus der Tatsache wahr, dass die Mobilität von perfekt gepaarter doppelsträngiger DNA (Homoduplex) auf einem Polyacrylamidgel von der Mobilität einer doppelsträngigen DNA (Heteroduplex) verschieden ist, die nicht perfekt gepaart ist. Da das Blut eines heterozygoten Patienten sowohl das normale als auch das mutierte Allel trägt, kann die amplifizierte DNA denaturiert und dann reassoziiert werden. Dies hat die Bildung der ursprünglichen Homoduplexe, aber auch die Bildung von Heteroduplexen zur Folge, wenn in einem Allel eine Mutation vorliegt. Die reassoziierte Probe wird dann durch Gelelektrophorese aufgetrennt, und Verschiebungen in der Mobilität werden festgehalten. Andere Verfahren, wie Einzelstrang- Konformationspolymorphismus (SSCP) oder denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) können ebenfalls verwendet werden, um eine Abweichung innerhalb eines Genfragments nachzuweisen.
Wenn ein Exon als eine Mutation enthaltend identifiziert worden ist, wird dieses Exon in anderen Risiko-Familienmitgliedern getestet, wie in dem oben erörterten Fall des RB-Gens. Weiter kann die Sequenz des identifizierten Exons bestimmt werden, um die Testergebnisse zu bestätigen. Wenn keine Mutation unter Verwendung der Tests der mittleren Ebene der Hierarchie in dem betroffenen Individuum nachgewiesen wird, wird das CFTR-Gen Exon um Exon sequenziert, bis der Ort der Mutation gefunden ist.
Während der vorangehende Ansatz die Wahl von Tests mit hoher Spezifität erfordert, damit ein positives Ergebnis als diagnostisches Werkzeug behandelt werden kann, um einen diagnostischen Algorithmus mit einem hohen Vertrauenswert und geringen Kosten bereitzustellen, ist er nur unter der Bedingung anwendbar, dass Tests mit hoher Spezifität leicht verfügbar sind. Wenn dies nicht der Fall ist, ist ein robusterer Ansatz für die Auswahl eines diagnostischen Algorithmus erforderlich.
Für eine verallgemeinerte Wahl eines optimalen oder nahezu optimalen diagnostischen Algorithmus besteht der erste Schritt in dem Verfahren in der Identifikation einer Gruppe von Tests, die in dem Testverfahren verwendet werden könnten, und die Kalibrierung dieser Tests, um das Ausmaß der falsch Positiven und falsch Negativen, die mit jedem dieser Tests verbunden sind, zu identifizieren.
Die Kalibrierung wird auf der Grundlage eines "goldenen Standard"-Tests bestimmt. Dieser Test ist durch Definition zu 100% spezifisch und zu 100% empfindlich, ohne falsch Positive und falsch Negative. Auf dem Gebiet der Molekularbiologie ist das nächste, mit dem wir zu einem goldenen Standard kommen, eine vollständige DNA-Sequenzierung. Während gewisse Fehler erwartet werden können, können wir für die Zwecke der Identifikation von genetischen Mutationen annehmen, dass eine vollständige DNA-Sequenzierung zumindest theoretisch 100% genau ist.
Das Verfahren der Kalibrierung ist wie folgt. Eine statistisch bedeutende Zahl von Patientenproben (d. h. n > 1000) wird von einer Klinik erhalten. Diese Proben können frisch oder gefroren sein, abhängig von den Erfordernissen des zu kalibrierenden Tests. Ein Teil jeder Probe wird präpariert, wie es vom Test gefordert wird. Beispielsweise erfordern gewisse Antikörpertests frisches Gewebe, das mit gewissen Detergenzien und anderen Abtrennungsmitteln behandelt wird. Die Gewebeprobe wird dann dem Antikörpertest unterzogen. Es wird ein Ergebnis erhalten, entweder positiv für das getestete Antigen oder negativ. Nach Testen der Patientenproben werden die Gesamtsummen von positiven und negativen Ergebnissen zusammengezählt.
Der nächste Schritt in der Kalibrierung besteht darin, alle Patientenproben mit dem goldenen Standard noch einmal zu testen. DNA wird aus jeder der Patientenproben präpariert und durch Sequenzierung auf Mutationen überprüft. Für jede Probe wird ein Ergebnis erhalten, und wieder werden alle Ergebnisse zusammengezählt.
Zuletzt werden zwei Sätze von Ergebnissen verglichen und vier Eigenschaften des Tests erstellt:
(1) die Empfindlichkeit des Tests, η, welche die Wahrscheinlichkeit ist, dass ein Individuum mit der interessierenden genetischen Mutation korrekt durch den Test identifiziert wird; und
(2) die Spezifität des Tests, θ, welche die Wahrscheinlichkeit ist, dass ein Individuum, das die interessierende genetische Mutation nicht aufweist, durch den Test korrekt identifiziert wird.
Mit diesen verfügbaren Kalibrierungswerten wertet man als nächstes verschiedene Kombinationen von Tests und Testergebnisse und die Kosten aus, die mit jedem Test verbunden sind, um die Kombination von Tests zu finden, die eine ausreichend hohe Leistung mit den niedrigstmöglichen Kosten ergibt. Dieses Verfahren kann unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten Gruppe von Tests für eine genetische Mutation mit einer Prävalenz π von 0,5 veranschaulicht werden. TABELLE 1
Um eine Matrix zu definieren und auszuwerten, müssen vorher mehrere Parameter definiert werden. Diese sind (1) die maximale Zahl der Tests, die mit irgendeiner Probe durchgeführt werden, und (2) die minimalen Anforderungen bezüglich der Gesamt-Empfindlichkeit, ηA, Gesamt-Spezifität, θA, des Gesamt- Vorhersagewerts eines positiven Algorithmus-Ergebnisses, PVPA, das durch die Gleichung
gegeben ist, in der π die Prävalenz des getesteten genetischen Zustands "G" in der Bevölkerung ist und Pr(A = + G = -) die Wahrscheinlichkeit ist, dass der Algorithmus A ein positives Ergebnis für den Zustand "G" liefert, wenn die Probe in Wahrheit negativ ist; und des Gesamt-Vorhersagewerts eines negativen Algorithmus-Ergebnisses, PVNA, das durch die Gleichung
gegeben ist, worin π die Prävalenz des genetischen Zustands, der getestet wird, in der Bevölkerung ist und Pr(A = - G = +) die Wahrscheinlichkeit ist, dass der Algorithmus A ein negatives Ergebnis für den Zustand "G" liefert, wenn die Probe in Wahrheit positiv ist.
Die verschiedenen möglichen Kombinationen der Tests werden innerhalb einer "Ergebnis-Kartierungsmatrix" aufgestellt. Eine beispielhafte Matrix für einige der möglichen Kombinationen der in Tabelle 1 gezeigten Tests unter der Annahme, dass die maximale Zahl der durchzuführenden Tests 3 ist, ist in Tabelle 2 gezeigt. Diese Tabelle wertet alle möglichen Kombinationen aus, außer denjenigen, in denen dem Test 4, dem genauesten und teuersten, ein weiterer Test folgt, da ein derartiger Test überflüssig wäre und nur die Kosten erhöhen würde, und stuft das Testergebnis als positiv (+) oder negativ (-) unter Verwendung einer "Mehrheitsregel" ein, wie es von Lachenbruch, P. A., "Multiple Reading Procedures: The Performance of Diagnostic Tests", Statistics in Medicine 7: 549-57 (1988) erörtert ist, mit der Ausnahme, dass ein Testergebnis für Test 4 (äquivalent zum goldenen Standard) als Kontrolle verwendet wird. TABELLE 2 TABELLE 2
Andere Standards für die Zuordnung eines Gesamt-Testergebnisses können in diesem Stadium der Analyse ebenfalls verwendet werden, einschließlich eines solchen, der hochempfindlichen und spezifischen Tests ein größeres Gewicht gibt oder eines, der Einstimmigkeit erfordert.
Welches Verfahren auch immer für die Zuordnung der Ergebnisse in der Ergebnis-Kartierungsmatrix verwendet wird, die Ergebnisse werden dann verwendet, um Werte für die Gesamt-Empfindlichkeit, ηA, Gesamt-Spezifität, θA, PVPA und PVNA zu bestimmen. Dieses Verfahren wird am besten durch die Verwendung der Beispiele verstanden, die Tabelle 2 entnommen sind.
Wenn man zuerst die Reihe der Testkombinationen 122 betrachtet, gibt es vier Kombinationen von Testergebnissen, die ein positives Gesamt-Testergebnis liefern. Die Gesamt-Empfindlichkeit ηA ist durch die Summe eines korrigierten Terms für jede derartige Ergebniskombination gegeben. Bei der ersten Ergebniskombination, +++, ist der Term für die korrigierte Empfindlichkeit η&sub1;·η&sub2;·η&sub3; oder im Fall der in Tabelle 1 gezeigten Werte 0,578. Für die zweite Ergebniskombination ++- ist der Term für die korrigierte Empfindlichkeit η&sub1;·η&sub2;·(1 - η&sub3;) oder 0. Für die dritte Ergebniskombinaton, +-+, ist der Term für die korrigierte Empfindlichkeit η&sub1;·(1 - η&sub2;)·η&sub3; oder 0,12. Schließlich ist für die vierte Ergebniskombination, -++, der Term für die korrigierte Empfindlichkeit (1 - η&sub1;)·η&sub2;·η&sub3; oder 0,17. Wenn diese Zahlen zusammen addiert werden, wird ein Gesamt-Empfindlichkeitsterm ηA von 0,97 erhalten.
Auf ähnliche Weise wird ein Gesamtwert für die Spezifität θA bestimmt. In diesem Fall werden die negativen Tests ausgewertet, und die Werte θ für die einzelnen Tests werden vereinigt. Im Fall des Tests 122 in Tabelle 2 liefert dies eine Gesamt-Spezifität von 0,972.
Unter Verwendung derselben Technik können die verbleibenden Werte für ηA und θA auf die gleiche Weise bestimmt werden. Die Werte für einige Algorithmen sind in Tabelle 3 gezeigt. Diese Werte können dann verwendet werden, um unter Verwendung der oben angegebenen Formeln PVPA und PVNA für diejenigen Kombinationen zu bestimmen, in denen ηA und θA innerhalb der Schwellenkriterien liegen.
Der Term Pr(A = + G = -) ist in Abwesenheit von zweideutigen Ergebnissen in der Ergebnis-Kartierungsmatrix (1 - θA). Wenn die Ergebnis-Kartierungsmatrix zweideutige Ergebnisse enthält (beispielsweise, wenn eine gerade Zahl von Tests unter Verwendung einer Mehrheitsregel ausgewertet wird), werden die Ergebniskombinationen, die positive Testergebnisse in der Ergebnis-Kartierungsmatrix liefern, als falsch Positive angenommen, und die Wahrscheinlichkeit einer derartigen falsch Positiven wird bestimmt, indem man die Multiplikation des Wertes (1 - θ) für positive Ergebnisse innerhalb der Kombination und θ für negative Ergebnisse innerhalb der Kombination nimmt. Im Gegensatz dazu ist Pr(A = - G = +) in Abwesenheit von zweideutigen Ergebnissen durch (1 - ηA) gegeben. TABELLE 3
Wenn alle Algorithmen in Betracht gezogen werden, kann ein Schwellenwert für einen annehmbare Leistung, d. h. ηA = 0,95, θA = 0,95, PVPA = 0,99 und PVNA = 0,99 angewendet werden, um einige der Algorithmen von der weiteren Überlegung auszuschließen. Für den Rest werden die erwarteten Kosten zur Durchführung der Tests, die durch den Algorithmus definiert sind, bestimmt.
Die erwarteten Kosten zur Durchführung des Tests E[CA] sind durch die Gleichung
gegeben, worin ρA,r die Wahrscheinlichkeit ist, dass eine gegebene Zahl von Tests (r) durchgeführt werden muß, um einen eindeutige Antwort zu erzielen, C(j) die Kosten für jeden Test j im Algorithmus sind und die Summe von j = 1 bis r die Summe der Kosten für die ersten r Tests im Algorithmus sind. Um diese Berechnung zu verstehen, kann man wiederum den Test 122 betrachten. In dem Fall, in dem die ersten zwei Tests beide entweder positiv oder beide negativ sind, wird die Ergebnis- Kartierungsmatrix durch diese Tests gesteuert, und der dritte Test muß nicht durchgeführt werden. Bei einem Individuum, das die interessierende Mutation trägt, ist die Wahrscheinlichkeit des Erhalts von positiven Tests bei Test 1 und 2 durch η&sub1;·η&sub2; oder 0,68 gegeben, während die Wahrscheinlichkeit des Erhalts von 2 negativen Testergebnissen durch (1 - η&sub1;)·(1 - η&sub2;) oder 0,03 gegeben ist. Bei einem mutationsfreien Individuum ist die Wahrscheinlichkeit des Erhalts von positiven Tests bei den Tests 1 und 2 durch (1 - θ&sub1;)·(1 - θ&sub2;) oder 0,01 gegeben, während die Wahrscheinlichkeit des Erhalts von zwei negativen Testergebnissen durch θ&sub1;·θ&sub2; oder 0,81 gebeben ist. ρA,2, die Wahrscheinlichkeit, dass diese beiden Tests ausreichend sind, ist dann gleich (0,68 + 0,03)π + (0,01 + 0,81) (1 - π) oder 0,765, Die Wahrscheinlichkeit, dass alle drei Tests vorgenommen werden müssen, ist 1 - 0,765 oder 0,235. Unter Anwendung dieser Zahlen der Kosten für die Tests 1 und 2 (11) und Tests 1, 2 und 3 (21) sind die Gesamtkosten des Tests 13,35.
Unter Anwendung dieser Art von Berechnung auf die gewählten Algorithmen der Tabelle 3 folgen die in Tabelle 4 gezeigten Kosten. TABELLE 4
Es versteht sich, dass das oben verwendet Beispiel, das nur vier mögliche Tests beinhaltet, tatsächlich ein einfaches Beispiel ist, und dass an einer normalen Analyse viel mehr Kombinationen von Tests beteiligt sein können oder dass eine größere oder kleinere Anzahl von Tests in der Analyse zugelassen werden kann. Zu sätzlich kann bei der Bestimmung des optimalen Algorithmus eine Bewertung der Kosten, die aus der Durchführung einer variierenden Anzahl von Tests, d. h. zwei Tests, drei Tests, vier Tests usw., resultieren, bei der Identifikation des Algorithmus nützlich sein, der tatsächlich für den größten wirtschaftlichen Vorteil sorgt. Weiter versteht es sich, dass die Wiederbewertung der optimalen Testkombination vorteilhaft durchgeführt würde, wann immer neue Tests für eine mit Krankheit verbundene Mutation verfügbar werden oder selbst als Antwort auf eine signifikante Änderung der Kosten für zuvor bewertete Tests. Diese Tests können leicht unter Verwendung der oben angegebenen Richtlinien bewertet werden.
Aus der vorangehenden Erörterung ist es offensichtlich, dass das hierarchische Verfahren der vorliegenden Erfindung auf eine große Vielfalt von Krankheiten und Zuständen angewendet werden kann. Die grundlegenden Techniken, die hierin beschrieben werden, können ohne weiteres auf andere Krankheiten und Zustände angepaßt werden, die hierin nicht speziell erörtert werden.

BEISPIEL 1

Eine Blutprobe wird von einem Patienten erhalten, dessen Diagnose ein Retinoblastom ist. Genomische DNA wird unter Verwendung eines Qiagen QIAamp Kits gemäß den begleitenden Anweisungen aus den Proben präpariert. Kurz gesagt, wird eine Aliquote der Probe oder einer Lymphozyten-haltige Fraktion derselben mit Proteinase K vereinigt, gemischt und inkubieren gelassen, um die Zellen zu lysieren. Ethanol wird zugesetzt, und das Lysat wird in eine QIAamp-Spinnsäule überführt, aus der DNA nach mehreren Waschungen gewonnen wird.
Die genomische DNA wird als nächstes in fünf Sätzen unter Verwendung von Multiplex-Primern amplifiziert. Jede 50 ul-Multiplex-PCR-Reaktion enthält 0,5 pg genomische DNA, 150 ng von jedem Primer, 3,6 mM von jedem dNTP, 42,5 ug Rinder- Serumalbumin, 5 Einheiten Taq-Polymerase in einem Puffer, der 10% DMSO, 16 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 6,7 mM MgCl&sub2;, 6,8 uM EDTA (pH 8,0) und 1 mM β-Mercaptoethanol enthält. Die Reaktionsmischung wird anfänglich 5 Minuten bei 95ºC inkubiert und dann einer geeigneten Anzahl von PCR-Zyklen in einem Perkin-Elmer/Cetus- Thermozyklisierer wie folgt unterzogen:
Denaturierung 94ºC, 30 Sekunden
Reassoziation 53ºC oder 55ºC, 30 Sekunden
Verlängerung 72ºC, 4 Minuten - Endverlängerung 7 Minuten.
Im ersten Satz werden die Exons 2, 3, 5, 13 und 25 zusammen mit einer Kontrollsequenz, die ein DNA-Segment des Chromosoms 15 ist, das nicht mit RB1 verwandt ist, über 18 Zyklen amplifiziert. Die Primer, von denen einer von jedem Paar am 5'-Ende mit Fluorescein markiert ist, sind
Diese Primer haben amplifizierte Produkte mit normalen Fragmentlängen von 410, 262, 170, 461 bzw. 316 Basenpaaren zum Ergebnis. Die Kontrollsequenz erzeugt ein Fragment mit einer Länge von 325 Basenpaaren.
Im zweiten Satz werden die Exons 1, 8, 18, 21, 22 und 23 zusammen mit derselben Kontrollsequenz über 18 Zyklen amplifiziert. Die Primer, von denen einer von jedem Paar mit Fluorescein markiert ist, sind
Diese Primer haben amplifizierte Produkte mit normalen Fragmentlängen von 591, 366, 418, 251, 496 bzw. 283 Basenpaaren zum Ergebnis.
Im dritten Satz werden die Exons 6, 7, 9, 10, 11, 12 und 27 zusammen mit derselben Kontrollsequenz über 20 Zyklen amplifiziert. Die Primer, von denen einer von jedem Paar mit Fluorescein markiert ist, sind
Diese Primer haben amplifizierte Produkte mit normalen Fragmentlängen von 283, 423, 205, 264, 244, 270 bzw. 297 Basenpaaren zum Ergebnis.
Im vierten Satz werden die Exons 4, 14, 20, 24 und 26 zusammen mit derselben Kontrollsequenz über 18 Zyklen amplifiziert. Die Primer, von denen einer von jedem Paar mit Fluorescein markiert ist, sind
Diese Primer haben amplifizierte Produkte mit normalen Fragmentlängen von 228, 227, 343, 206 bzw. 203 Basenpaaren zum Ergebnis.
Im fünften Satz werden die Exons 15 und 16 zusammen mit den Exons 17, 19, der RB1-Promotorregion und derselben Kontrollsequenz über 20 Zyklen amplifiziert. Die Primer, von denen einer von jedem Paar mit Fluorescein markiert ist, sind:
Diese Primer haben amplifizierte Produkte mit normalen Fragmentlängen von 335, 371, 363 bzw. 316 Basenpaaren zum Ergebnis.
Nach der Amplifikation werden die Produkte von jeder Amplifikationsreaktion denaturiert und auf ein Polyacrylamid-Sequenzierungsgel in einem automatisierten Pharmacia A.L.F. Sequenzierer geladen. Die einzelsträngigen Amplifikationsprodukte wandern mit einer Geschwindigkeit durch das Gel, die durch ihre Länge bestimmt ist, und werden unter Verwendung der Fluoreszenz der Fluorescein-Markierung nachgewiesen, welche an den Primern angebracht worden ist.

BEISPIEL 2

Das Verfahren der Auswahl von Primern zur Verwendung in der Erfindung kann mit Bezug auf die Exons 4 und 6 des RB1-Gens erläutert werden. Für das Exon 4 sind 2 Primerpaare identifiziert worden und für das Exon 6 ist ein Primerpaar identifiziert worden. Der Primer 4X5'-A ist ein 20-mer mit der Sequenz
ATATAGTAGT GATTTGATGT [Seq 57]
die homolog zu einem Bereich in dem Intron ist, das unmittelbar dem 5'-Ende des Exons 4 des RB1-Gens benachbart ist. Diese Region beginnt 122 Basen vom 5'- Ende des Exons entfernt und erstreckt sich zu der Base, die 103 Basen vom Exon entfernt liegt. Der Primer weist eine vorhergesagte Schmelztemperatur von 50ºC auf.
Der Primer 4X3'-A istein 20-mer mit der Sequenz
ATGACATAAA AAATCAGAGT [Seq 58]
die homolog zu einer Region in dem Intron ist, das dem 3'-Ende des Exons 4 des RB1-Gens benachbart ist. Diese Region beginnt 28 Basen vom 3'-Ende des Exons entfernt und erstreckt sich bis zu der Base, die 47 Basen vom Exon entfernt ist. Dieser Primer weist ebenfalls eine Schmelztemperatur von 50ºC auf.
Der Primer 6X5' ist ein 22-mer mit der Sequenz
CACAAAAAGA AACACCCAAA AG [Seq 59]
die homolog zu einer Region in dem Intron ist, das dem 5'-Ende des Exons 6 des RB1-Gens benachbart ist. Diese Region beginnt 72 Basen vom 5'-Ende des Exons entfernt und erstreckt sich bis zu der Base, die 93 Basen vom Exon entfernt ist. Der Primer weist eine vorhergesagte Schmelztemperatur von 62ºC auf.
Der Primer 6X3' ist ein 22-mer mit der Sequenz
TAATAAGCCA AGCAGAGAAT GA [Seq 26]
die homolog zu einer Region in dem Intron ist, das dem 3'-Ende des Exons 6 des RB1-Gens benachbart ist. Diese Region beginnt 107 Basen vom 3'-Ende des Exons entfernt und erstreckt sich bis zu der Base, die 128 Basen vom Exon entfernt ist. Der Primer weist eine vorhergesagte Schmelztemperatur von 60ºC auf.
Diese zwei Primerpaare sind für die einzelne Amplifikation der Exons 4 und 6 wirksam. Sie sind jedoch nicht zur gemeinsamen Verwendung in einer Multiplex- Amplifikation geeignet, da die Schmelztemperaturen der zwei Paare zu unterschiedlich sind. Weiter erzeugen beide Primerpaare ein Amplifikationsprodukt, das eine Länge von 289 Basen aufweist. So können die beiden Primerpaare nicht mit einer gemeinsamen nachweisbaren Markierung in einer Multiplex-Reaktion verwendet werden.
Um das Exon 4 und das Exon 6 in einer einzigen Reaktion zu amplifizieren, ist es erforderlich, ein anderes Primerpaar für eines der zwei Exons zu identifizieren, das mit dem Primerpaar für das andere Exon kompatibel ist. In diesem Fall ist ein geeigneter Ersatz das Primerpaar, das von den Erfindern als 4X5'-B und 4X3'-B identifiziert wurde.
Der Primer 4X5'-B ist ein 22-mer mit der Sequenz
AGTAGTGATT TGATGTAGAG CT [Seq 60]
die homolog zu der Region in dem Intron ist, das dem 5'-Ende des Exons 4 benachbart ist, welche 98 Basen vom 5'-Ende des Exons beginnt und sich bis zu der Base erstreckt, die 119 Basen vom Exon entfernt ist. Der Primer weist eine Schmelztemperatur von 60ºC auf. Der Primer 4X3'-B ist ein 22-mer mit der Sequenz
ATAAAAAATC AGAGTGTAAC CC [Seq 40]
die homolog zu der Region in dem Intron ist, das dem 3'-Ende des Exons 4 benachbart ist, welche 21 Basen vom 5'-Ende des Exons beginnt und sich zu der Base erstreckt, die 42 Basen vom Exon entfernt ist. Dieser Primer weist eine Schmelztemperatur von 58ºC auf. Demgemäß weisen diese Primer Schmelztemperaturen auf, die viel näher bei der Schmelztemperatur der Primer des Exons 6 liegen. Darüber hinaus weist das Amplifikationsprodukt eine Länge von 280 Basen auf, was ein Unterschied von 9 Basen zum Amplifikationsprodukt der Primer des Exons 6 ist.

BEISPIEL 3

Die im Beispiel 1 präparierte genomische DNA wird in sechs Sätzen unter Verwendung von Multiplex-Primern amplifiziert. Jede 25 ul Mulitplex-PCR-Reaktion enthält 0,3 ug genomische DNA, 0,2 mM von jedem dNTP, 42,5 ug Rinder-Serumalbumin, 5 Einheiten Taq-Polymerase in einem Puffer, der 83 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 33,5 mM MgCl&sub2;, 34 mM EDTA (pH 8,0) und 50 mM β-Mercaptoethanol enthält. Die Reaktionsmischung wird zu Beginn bei 94ºC 1 Minute in einem Perkin Eimer 9600-Termozyklisierer oder 2 Minuten in einem Robocycler im Gradientenmodus inkubiert. Die anschließenden Zyklen hängen von der Multiplex-Gruppe und der verwendeten Thermozyklisierer-Ausrüstung ab.
Die erste Gruppe von Primern amplifiziert die Exons 4, 5, 7, 8, 10, 11, 19 und 25 des RB1-Gens unter Verwendung derselben Primer wie in Beispiel 1. Diese erste Gruppe enthält auch Primer, um dieselbe Kontrollsequenz, die in Beispiel 1 verwendet wurde, zu amplifizieren. Die Primer werden in einer Vorratsmischung vereinigt. 1,3 ul der Vorratsmischung werden in jeder 25 ul-Reaktionsmischung verwendet, so dass 100 ng von jedem der Primer für die Kontrollsequenz und für Exon 19 und 50 ng von jedem der Primer für die andere Exons bereitgestellt werden. Die Amplifikation wird in einem Perkin-Elmer 9600-Thermozyklisierer über 19 Zyklen wie folgt:
Denaturierung 94ºC, 30 Sekunden
Reassoziation 52ºC, 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 2 Minuten - Endverlängerung 2 Minuten,
oder in einem Robocycler Gradient Mode Thermocycler über 19 Minuten wie folgt durchgeführt:
Denaturierung 94ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Reassoziation 52ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 4 Minuten - Endverlängerung 7 Minuten.
Die zweite Gruppe von Primern amplifiziert die Exons 12, 15/16, 17, 18 und 21 des RB1-Gens unter Verwendung derselben Primer wie in Beispiel 1. Diese Gruppe enthält auch Primer, um dieselbe Kontrollsequenz, die in Beispiel 1 verwendet wurde, zu amplifizieren. Die Primer werden in einer Vorratsmischung vereinigt. 1,3 ul der Vorratsmischung werden in jeder 25 ul-Reaktionsmischung verwendet, um 100 ng von jedem der Primer für die Kontrollsequenz und für die Exons 12 und 18 und 50 ng von jedem der Primer für die anderen Exons bereitzustellen. Die Amplifikation wird in einem Perkin-Elmer 9600-Thermozyklisierer über 19 Zyklen wie folgt:
Denaturierung 94ºC, 30 Sekunden
Reassoziation 52ºC, 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 2 Minuten - Endverlängerung 2 Minuten,
oder in einem Robocycler Gradient Mode Thermocycler über 19 Zyklen wie folgt durchgeführt:
Denaturierung 94ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Reassoziation 52ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 4 Minuten - Endverlängerung 7 Minuten.
Die dritte Gruppe von Primern amplifiziert die Exons 3, 9, 13, 20, 23 und 24 des RB1-Gens unter Verwendung derselben Primer wie in Beispiel 1. Diese dritte Gruppe enthält auch Primer, um einen Teil des Chromosoms 15 als Kontrollsequenz zu amplifizieren. In diesem Fall werden jedoch die Primer so ausgewählt, dass sie eine kürzere Fragmentlänge von 282 Nt liefern, um eine mögliche Zweideutigkeit mit dem Exon 20-Fragment zu vermeiden. Die Sequenz dieser Primer ist wie folgt:
5'-Primer:
GCCCCTCACC CGCACCTAAGT [Seq61]
3'-Primer
GCCGTCCCTC CAAGCACTG [Seq 62]
Die Primer werden in einer Vorratsmischung zusammengegeben. 1,0 ul der Vorratsmischung werden in jeder 25 ul-Reaktionsmischung verwendet, um 100 ng von jedem der Primer für die Exons 3 und 20, 25 ng von jedem Primer für die Kontrollsequenz und Exon 9 und 50 ng für jeden der Primer für die anderen Exons bereitzustellen. Die Amplifikation wird in einem Perkin-Elmer 9600-Thermozyklisierer über 19 Zyklen wie folgt:
Denaturierung 94ºC, 30 Sekunden
Reassoziation 54ºC, 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 2 Minuten - Endverlängerung 2 Minuten,
oder in einem Robocycler Gradient Mode Thermocycler über 19 Zyklen wie folgt durchgeführt:
Denaturierung 94ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Reassoziation 54ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 4 Minuten - Endverlängerung 7 Minuten.
Die vierte Gruppe von Primern amplifiziert die Exons 2, 6, 14, 22, 26 und 27 des RB1-Gens unter Verwendung derselben Primer wie in Beispiel 1. Diese vierte Gruppe enthält auch Primer, um dieselbe Kontrollsequenz, die in der dritten Gruppe verwendet wurde, zu amplifizieren. Die Primer werden in einer Vorratslösung vereinigt. 1,4 ul der Vorratsmischung werden in jeder 25 ul-Reaktionsmischung verwendet, um 100 ng von jedem der Primer für die Kontrollsequenz und für die Exons 2, 22 und 27 und 50 ng von jedem der Primer für die anderen Exons bereitzustellen. Die Amplifikation wird in einem Perkin-Elmer 9600-Thermozyklisierer über 19 Zyklen wie folgt:
Denaturierung 94ºC, 30 Sekunden
Reassoziation 58ºC, 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 2 Minuten - Endverlängerung 2 Minuten,
oder in einem Robocycler Gradient Mode Thermocycler über 19 Zyklen wie folgt durchgeführt:
Denaturierung 94ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Reassoziation 58ºC, 1 Minute 30 Sekunden
Verlängerung 65ºC, 4 Minuten - Endverlängerung 7 Minuten.
Schließlich werden die Promotorregion und Exon 1 jeweils getrennt als fünfte und sechste Amplifikations-"Gruppe" amplifiziert. Diese fünfte und sechste Amplifikationsgruppe enthält Primer, um dieselbe Kontrollsequenz zu amplifizieren, die mit dem ersten Satz verwendet wurde. Die Primer werden in einer Vorratsmischung mit einem Puffer, welcher derselbe wie der oben beschriebene ist, mit der Zugabe von 10% DMSO (Volumen pro Volumen) vereinigt. 1,4 ul der Vorratsmischung werden in jeder 25 ul-Reaktionsmischung verwendet, um 100 ng von jedem der Primer für die Kontrollsequenz und Exon 1 bzw. den Promotor bereitzustellen. Die Amplifikation beginnt durch Reassoziierenlassen der Primer mit der genomischen DNA, nachdem man zuerst die Reaktionsmischung zwei Minuten auf 94 Grad erwärmt hatte. Die Amplifikation wird in einem Perkin-Elmer 9600-Thermozyklisierer über 19 Zyklen wie folgt durchgeführt:
Denaturierung 94ºC, 60 Sekunden
Reassoziation 61ºC, 90 Sekunden
Verlängerung 72ºC, . . . Sekunden mit einer Endverlängerung über 4 Minuten bei 72 Grad.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Visible Genetics Inc.
Stevens, John K.
Dunn, James M.
Capatos, Denis
Matthews, David E.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Verfahren zur Feststellung von DNA-Mutationen in einer Probe eines Patienten
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 60
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Oppedahl & Larson
(B) STRASSE: 1992 Commerce Street, Suite 309
(C) CITY: Yorktown Heights
(D) STAAT: NY
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 10598-4412
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Diskette, 3,5 Inch, 1,44 Mb
(B) COMPUTER: IBM kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: DOS 5.0
(D) SOFTWARE: Word Perfect
(vi) DERZEITIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 08/271,946
(B) EINREICHUNGSDATUM: 08. Jul. 1994
(viii) VERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Marina T. Larson
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 32038
(C) VERTRETERZEICHEN: VGEN. P-002-WO
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (914) 245-3252
(B) TELEFAX: (914) 962-4330
(C) TELEX:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 2 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
ACTGTGTGGT ATCCTTATTT TG 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN;
(A) LÄNGE: 23
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 2 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:
ATAGTGATTT GAAGTTGGTT TTA 23
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 3 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:
ATACAGTTTT AACATAGTAT CCA 23
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 3 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:
AAGTCTATTG AGAGGAAAAT CC 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 5 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:
CTACTATGAC TTCTAAATTA CG 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 5 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:
TCAAGATGTT TGAGATTATT CC 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ IDNR: 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 13 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 7:
TGCTTATGTT CAGTAGTTGT G 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ 10 NR: 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 13 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 8:
TAATGGGGTG GGAGGTAGTT T 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 25 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 9:
TCAAACTATA ACTTGAGGTT GC 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 25 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 10:
AAAGAAATTG GTATAAGCCA GG 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 19
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(vii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom 15
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Amplifikation von Kontrollregion aus Chromosom 15
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 11:
CTCACCCGCA CCTAAGTTT 19
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(vii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom 15
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Amplifikation von Kontrollregion aus Chromosom 15
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 12:
CCAGGATGAG AGCGGATGGC A 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 19
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 1 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 13:
GCCCCAGTTC CCCACAGAC 19
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 19
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 1 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 14:
ACCCCTCGCC CAAGAACCC 19
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 8 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 15:
TCTAATGAAA CCTAATAAGT A 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 16:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 8 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 16:
TGCTCATAAC AAAAGAAGTA A 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 17:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 18 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 17:
TTTTTGTGTG TGGGAAGTAC A 21
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 18:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 18 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 18:
ATTCTATTCC CTACAGTTTC TT 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 19:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 21 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 19:
GGCTAAAAGA AAGAAAATGG 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 20:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 21 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 20:
TTACCTATGT TATGTTATGG 20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 21:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISINN: nein
(v) FRAGMENTTYP: innerer
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Mensch
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Primer für Exon 22 des humanen RB1-Gens
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 21:
TATGTGCTTC TTACCAGTCA AA 22
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 22:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22
(B) TYP: Nucleinsäure

Claims

1. Verfahren zum Testen einer Mehrzahl von Patienten auf eine mit einer Krankheit verbundenen Mutation in einem interessierenden Gen, umfassend die Schritte:

(a) Durchführen eines Immunoassays bei Proben, die von jedem der Mehrzahl von Patienten erhalten wurden, indem man einen Teil der Probe mit einem Antikörper vereinigt, welcher durch Binden an ein Protein- Genprodukt des interessierenden Gens ein immunologisches Reaktionsprodukt bildet, und Überwachen auf die Bildung des immunologischen Reaktionsprodukts, wobei der Antikörper so ausgewählt ist, dass er eine Spezifität von mehr als 99% für das Protein-Genprodukt des interessierenden Gens aufweist, wobei die Bildung eines immunologischen Produkts die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation in dem interessierenden Gen anzeigt;

(b) Durchführen eines Assays auf Sonden-Basis bei jeder Patientenprobe, bei der die Ergebnisse des Immunoassays negativ waren, indem man einen zweiten Teil jeder Patientenprobe mit einer Nukleinsäure-Sonde vereinigt, die spezifisch und selektiv mit dem interessierenden Gen in seiner mutierten oder Wild-Typ-Form hybridisiert, wobei die Bildung eines doppelsträngigen Nükleinsäurehybrids, welches die Nukleinsäure-Sonde enthält, die Anwesenheit oder Abwesenheit der Mutation in dem interessierenden Gen anzeigt; und

(c) Bestimmen der Sequenz der DNA in mindestens einer ausgewählten Region des interessierenden Gens bei jeder Patientenprobe, für die die Ergebnisse des Assays auf Sonden-Basis negativ waren, und Vergleichen der bestimmten Sequenz mit bekannten Sequenzen von normalen oder mutierten Formen des interessierenden Gens.

2. Verfahren zum Testen einer Mehrzahl von Patienten auf eine mit einer Krankheit verbundenen Mutation in einem interessierenden Gen, umfassend die Schritte:

(a) Durchführen eines Immunoassays bei Proben, die von jedem der Mehrzahl von Patienten erhalten wurden, indem man einen Teil der Probe mit einem Antikörper vereinigt, welcher durch Binden an ein Protein- Genprodukt des interessierenden Gens ein immunologisches Reaktionsprodukt bildet, und Überwachen auf die Bildung des immunologischen Reaktionsprodukts, wobei der Antikörper so ausgewählt ist, dass er eine Spezifität von mehr als 99% für das Protein-Genprodukt des interessierenden Gens aufweist, wobei die Bildung eines immunologischen Produkts die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Mutation in dem interessierenden Gen anzeigt; und

(b) Durchführen eines Assays auf Sonden-Basis bei jeder Patientenprobe, bei der die Ergebnisse des Immunoassays negativ waren, indem man einen zweiten Teil jeder Patientenprobe mit einer Nukleinsäure-Sonde vereinigt, die spezifisch und selektiv mit dem interessierenden Gen in seiner mutierten oder Wild-Typ-Form hybridisiert, wobei die Bildung eines doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids, welches die Nukleinsäure-Sonde enthält, die Anwesenheit oder Abwesenheit der Mutation in dem interessierenden Gen anzeigt.

3. Verfahren zum Testen einer Mehrzahl von Patienten auf eine mit einer Krankheit verbundenen Mutation in einem interessierenden Gen, umfassend die Schritte:

(a) Durchführen eines Assays auf Sonden-Basis bei jeder Patientenprobe durch Vereinigen eines Teils jeder Patientenprobe mit einer Nukleinsäure-Sonde, die spezifisch und selektiv mit dem interessierenden Gen in seiner mutierten oder Wild-Typ-Form hybridisiert, wobei die Bildung eines doppelsträngigen Nukleinsäurehybrids, das die Nukleinsäure-Sonde enthält, die Anwesenheit oder Abwesenheit der Mutation in dem interessierenden Gen anzeigt; und

(b) Bestimmen der DNA-Sequenz in mindestens einer ausgewählten Region des interessierenden Gens bei jeder Patientenprobe, bei der die Ergebnisse des Assays auf Sonden-Basis negativ waren, und Vergleichen der bestimmten Sequenz mit bekannten Sequenzen von normalen oder mutierten Formen des interessierenden Gens.

4. Verfahren zum Testen einer Patientenprobe auf eine mit einer Krankheit verbundenen Mutation in einem interessierenden Gen, umfassend die Schritte:

(a) Wählen einer Hierarchie von Assay-Techniken, welche mindestens einen ersten und einen letzten Assay umfassen, wobei der erste Assay so ausgewählt ist, dass er für einen hochspezifischen Test bezüglich des Vorliegens der mit der Krankheit verbundenen Mutation sorgt, und der letzte Assay so ausgewählt ist, dass er für einen hochgenauen und hochspezifischen Test für die Anwesenheit der mit der Krankheit verbundenen Mutation sorgt;

(b) Analysieren der Patientenprobe unter Verwendung des ersten Assays; und, falls das Ergebnis des ersten Assays bezüglich der Anwesenheit einer mit einer Krankheit verbundenen Mutation negativ ist,

(c) Analysieren der Patientenprobe unter Verwendung des letzten Assays, wobei die Hierarchie von Tests durch ein Verfahren ausgewählt ist, welches die Schritte umfasst;

Identifizieren einer Mehrzahl von Tests für die mit der Krankheit verbundenen Mutation;

Bestimmen der Empfindlichkeit und Spezifität jedes Tests durch Vergleichen der Ergebnisse von Tests bei einer statistisch signifikanten Mehrheit von Proben mit den Ergebnissen von Tests bei den gleichen Proben unter Verwendung eines Testprotokolls, von dem anerkannt ist, dass es eine Empfindlichkeit und Spezifität von 100% aufweist;

Definieren einer Ergebnis-Kartierungsmatrix, die eine Mehrzahl von diagnostischen, Algorithmen enthält, von denen jeder eine Kombination von zu bewertenden Tests umfasst, und Beurteilen der Signifikanz aller möglichen Kombinationen von negativen und positiven Ergebnissen für die Algorithmen in der Matrix;

Bestimmen der Gesamt-Empfindlichkeit, der Gesamt- Spezifität, des Gesamt-Vorhersagewertes eines positiven Algorithmus- Ergebnisses und des Gesamt-Vorhersagewertes eines negativen Algorithmus-Ergebnisses für mindestens einige der Algorithmen in der Ergebnis-Matrix;

Bestimmen der geschätzten Testkosten für diejenigen Kombinationen, in denen die Gesamt-Empfindlichkeit, die Gesamt- Spezifität, der Gesamt-Vorhersagewert eines positiven Algorithmus- Ergebnisses und der Gesamt-Vorhersagewert eines negativen Algorithmus-Ergebnisses den vorbestimmten Schwellenwert erfüllen; und

Auswählen eines diagnostischen Algorithmus von Tests, der niedrige geschätzte Testkosten aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in dem der erste Assay ein Immunoassay ist, in dem die Probe mit einem Antikörper vereinigt wird, der ein immunologisches Reaktionsprodukt bildet, indem er sich an ein Protein-Genprodukt des interessierenden Gens bindet.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 4-5, in dem die Nukleinsäure-Sequenz mindestens einer Region des interessierenden Gens im Verlauf der Durchführung des letzten Assays bestimmt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 4-6, in dem mindestens ein Assay in der Hierarchie die Schritte umfasst:

quantitatives Amplifizieren eines oder mehrerer Exons des interessierenden Gens in der Probe unter Verwendung von Primern, die komplementär zu den Intronregionen sind, welche jedes amplifizierte Exon flankieren; und

Bestimmen der Längen der Amplifikationsprodukte bei jedem amplifizierten Probenexon und Vergleichen dieser Länge mit der Länge von Amplifikationsprodukten, die erhalten werden, wenn ein Wild-Typ-Gen unter Verwendung der gleichen Primer amplifiziert wird, wobei Unterschiede in der Länge zwischen einem amplifizierten Probenexon und dem entsprechenden amplifizierten Wild-Typ-Exon das Auftreten einer Insertions- oder Deletionsmutation in dem interessierenden Gen in der Probe widerspiegeln.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem die Länge der Amplifikationsprodukte durch Elektrophorese auf einem Sequenzierungsgel bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Sequenzierungsgel eine Auflösung von einem Basenpaar aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, in dem das Sequenzierungsgel ein Polyacrylamid-Gel ist.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 7-10, in dem die Primer jeweils mit einer nachweisbaren Markierung gekuppelt sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem die nachweisbare Markierung Fluorescein ist.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 7-12, in dem eine Mehrzahl von Exons des interessierenden Gens in einer einzigen Amplifikationsreaktion koamplifiziert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in dem die Primerpaare für jedes koamplifizierte Exon so ausgewählt sind, dass sie eine gemeinsame Schmelztemperatur aufweisen und Amplifikationsprodukte mit verschiedenen Längen erzeugen.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 5, 6 oder 7, in dem sich der Antikörper an das Genprodukt des Wild-Typs des interessierenden Gens bindet und die Beobachtung einer verringerten Konzentration des immunologischen Produkts die Anwesenheit einer Mutation anzeigt.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 5, 6 oder 7, in dem sich der Antikörper an ein mutiertes Genprodukt des interessierenden Gens bindet und die Beobachtung eines immunologischen Produkts die Anwesenheit einer Mutation anzeigt.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 3 oder 6-16, in dem die Sequenzen einer Mehrzahl von Regionen in dem interessierenden Gen bestimmt werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, in dem die Sequenzen der Mehrzahl von Regionen in mindestens zwei Phasen mit wachsender Schwierigkeit bestimmt werden.

19. Verfahren nach Anspruch 17, in dem die Sequenzen der Mehrzahl von Regionen in mindestens zwei Phasen bestimmt werden, in denen Mutationen mit einem größeren Auftreten in einer relevanten Population, zu welcher der Patient gehört, getestet werden, bevor Mutationen mit einem geringeren Vorkommen getestet werden.

20. Verfahren nach den Ansprüchen 4-19, in dem die Kosten pro Probe für die Durchführung des ersten Assays geringer sind als die Kosten pro Probe für die Durchführung des letzten Assays.

21. Verfahren nach den Ansprüchen 4-20, in dem die Hierarchie einen dazwischen liegenden Assay mit hoher Spezifität und größerer Genauigkeit als der erste Assay einschließt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, in dem der erste Assay ein Immunoassay ist und der dazwischen liegende Assay ein Assay auf der Basis einer Nukleinsäure-Hybridisierungssonde ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, in dem die Hierarchie des Tests durch ein Verfahren ausgewählt wird, das die Schritte umfasst:

Identifizieren einer Mehrzahl von Tests für die mit der Krankheit verbundene Mutation;

Bestimmen der Empfindlichkeit und Spezifität jedes Tests durch Vergleichen der Ergebnisse von Tests bei einer statistisch signifikanten Mehrheit von Proben mit den Ergebnissen von Tests bei denselben Proben unter Verwendung eines Testprotokolls, von dem anerkannt ist, dass es eine Empfindlichkeit und Spezifität von 100% aufweist;

Definieren einer Ergebniss-Kartierungsmatrix, die eine Mehrzahl von diagnostischen Algorithmen enthält, von denen jeder eine Kombination von auszuwertenden Tests umfasst, und Beurteilen der Signifikanz aller möglichen Kombinationen von negativen und positiven Ergebnissen für die Algorithmen in der Matrix;

Bestimmen der Gesamt-Empfindlichkeit, der Gesamt-Spezifität, des Gesamt-Vorhersagewertes eines positiven Algorithmus-Ergebnisses und des Gesamt-Vorhersagewertes eines negativen Algorithmus-Ergebnisses bei mindestens einigen der Algorithmen in der Ergebnis-Matrix;

Bestimmen der geschätzten Kosten der Tests für diejenigen Kombinationen, bei denen die Gesamt-Empfindlichkeit, die Gesamt- Spezifität, der Gesamt-Vorhersagewert eines positiven Algorithmus- Ergebnisses und der Gesamt-Vorhersagewert eines negativen Algorithmus- Ergebnisses den vorbestimmten Schwellenwert erfüllen; und

Auswählen eines diagnostischen Algorithmus von Tests, die geringe geschätzte Testkosten aufweisen.

24. Verfahren nach Anspruch 23, in dem die geschätzten Kosten der Tests unter Bestimmung der Gleichung

bestimmt werden, in der ρA,r die Wahrscheinlichkeit ist, dass ein gegebener Test (der r-te Test) durchgeführt werden muss, um das Ergebnis zu erzielen, und C(j) die Kosten des j-ten Tests sind.

25. Verwendung eines Testsatzes, umfassend:

- ein erstes Reagenz zur Durchführung des ersten Schrittes in dem Verfahren der Ansprüche 1-3 oder des ersten Assays in dem Verfahren der Ansprüche 4-24 und

- ein zweites Reagenz, das von dem ersten Reagenz verschieden ist, zum Durchführen des nächsten Schrittes in dem Verfahren der Ansprüche 1- 3 oder des letzten Assays in dem Verfahren der Ansprüche 4-24,

wobei das erste Reagenz ausgewählt ist aus

- einem Antikörper, der sich an ein Genprodukt des interessierenden Gens bindet,

- einer Oligonukleotid-Sonde, die spezifisch mit einer Region des interessierenden Gens hybridisiert,

- Amplifikationsprimern, welche die Stelle einer möglichen Mutation in dem interessierenden Gen flankieren,

- PCR-Primern, die sich spezifisch an mutierte Exons in dem interessierenden Gen binden,

und das zweite Reagenz ausgewählt ist aus

- einem Sequenzierungsprimer, der wirksam ist, um eine Region des interessierenden Gens zu sequenzieren,

zur Durchführung des Verfahrens der Ansprüche 1-24.