DE69432413T2

DE69432413T2 - Behandlung degenerativer gefaesserkrankungen durch modulation der endogenen stickoxidproduktion oder-aktivitaet

Info

Publication number: DE69432413T2
Application number: DE69432413T
Authority: DE
Inventors: P. John COOKE; J. Victor DZAU; H. Gary GIBBONS
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2014-06-03
Also published as: EP0702518B1; DE69432413D1; ES2196027T3; CA2164632A1; JPH08511530A; WO1994028721A1; EP0702518A1; EP0702518A4; EP1027834A1

Description

Die vorliegende Erfindung wurde durch Zuschuss 1 KO7HCO2660 (NHLBI) teilweise von der Regierung der Vereinigten Staaten unterstützt. Die US-Regierung hat möglicherweise ein Interesse an der vorliegenden Anmeldung.
Das Gebiet der vorliegenden Erfindung ist die Modulation von NO-Aktivität, die bei der Behandlung degenerativer Gefäßerkrankungen, insbesondere von Atherosklerose und Restenose, zum Einsatz kommt.
Atherosklerose und Gefäßthrombose sind eine wesentliche Ursache für viele Erkrankungen und Sterbefälle verantwortlich und führen zu Koronararterienerkrankung, Myokardinfarkt und Schlaganfall. Atherosklerose beginnt mit einer Veränderung des Endothels, das die Blutgefäße auskleidet. Die Endothelveränderung führt zum Anhaften von Monozyten, die die Endothelauskleidung durchdringen und sich im subintimalen Raum zwischen dem Endothel und dem Gefäß-Glattmuskel der Blutgefäße einnisten. Die Monozyten absorbieren zunehmende Mengen an Cholesterin (weitgehend in Form von oxidiertem oder modifiziertem Lipoprotein mit geringer Dichte), wodurch Schaumzellen gebildet werden. Cholesterin in Form von oxidiertem Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL) verändert das Endothel, und die darunterliegenden Schaumzellen verformen das Endothel und können dieses schlussendlich sogar durchbrechen.
Blutplättchen bleiben im Bereich der Endothelbrüche hätten und setzen eine Anzahl von Wachstumsfaktoren frei, darunter den "platelet derived growth factor" (PDGF). PDGF, der auch durch Schaumzellen und veränderte Endothelzellen freigesetzt wird, stimuliert die Wanderung und Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen in die Läsion. Diese Glattmuskelzellen setzen extrazelluläre Matrix (Kollagen und Elastin) frei, und die Läsion dehnt sich weiter aus. Makrophagen in der Läsion entwickeln Proteasen, und die resultierende Zellschädigung erzeugt einen nekrotischen Kern, der mit Zelltrümmern und Lipid gefüllt ist. Die Läsion wird dann als "komplexe Läsion" bezeichnet. Das Brechen dieser Läsion kann zu Thrombose und einem Verschluss des Blutgefäßes führen.
Im Fall einer Koronararterie kann das Brechen einer komplexen Läsion einen Myokardinfarkt auslösen, während im Fall einer Karotis ein Schlaganfall folgen kann.
Eine der Behandlungen, die Kardiologen und andere Interventionsärzte einsetzen, um ein durch Plaques verengtes Blutgefäß wieder zu öffnen, ist Ballon-Angioplastie (jährlich werden etwa 300.000 Koronar- und 100.000 periphere Angioplastien durchgeführt). Mit Ballon-Angiographie ist es zwar in einem hohen Prozentsatz der Fälle erfolgreich möglich, das Gefäß zu öffnen, aber unglücklicherweise legt sie das Endothel frei und verletzt das Gefäß im Verlauf des Verfahrens. Diese Schädigung verursacht die Wanderung und Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen des Blutgefäßes in den Bereich der Verletzung, wodurch eine Läsion gebildet wird, die als myoinitimale Hyperplasie oder Restenose bekannt ist. Diese neue Läsions führt bei einem beträchtlichen Anteil der Patienten (30 bis 40%) zu einem Wiederauftreten der Symptome innerhalb von drei bis sechs Monaten nach der Angioplastie.
Aufgrund ihrer weiten Verbreitung und ihrer ernsthaften Folgen ist es von entscheidender Bedeutung, Therapien zu finden, mit denen das Auftreten von Atherosklerose, Gefäßthrombose und Restenose eingedämmt werden kann. Idealerweise hemmen derartige Therapien die pathologischen Prozesse, die mit Atherosklerose verbunden sind, wodurch Prophylaxe bewirkt oder das Fortschreiten des degenerativen Prozesses verzögert wird.
Wie oben kurz zusammengefasst wurde, sind diese pathologischen Prozesse höchst komplex und betreffen eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen, die Veränderungen erfahren, was ihre Beschaffenheit, ihre Zusammensetzung und ihre Aktivität sowie die Art der Faktoren, die sie ausscheiden, und der Rezeptoren betrifft, die nach oben oder nach unten reguliert werden. Eine Substanz, die vom Endothel freigesetzt wird, "endothelium derived relaxing factor" (EDRF) kann eine wichtige Rolle dabei spielen, diese pathologischen Prozesse zu hemmen. Es ist nun bekannt, dass EDRF Stickstoffoxid (NO) oder eine labile Nitrosoverbindung ist, die NO freisetzt. (Für die Zwecke der vorliegenden Er findung wird, wenn nicht anders angegeben, der Begriff Stickstoffoxid (NO) für Stickstoffoxid oder den labilen Vorläufer verwendet.) Von dieser Substanz ist berichtet worden, dass sie Gefäßmuskelzellen entspannt, die Blutplättchenanhäufung hemmt, die Mitogenese und Vermehrung von kultiviertem Gefäß-Glattmuskel und die Leukozytenhaftung hemmt. NO kann andere, direkte oder indirekte Wirkungen auf die verschiedenen Zellen haben, die mit Gefäßwänden und degenerativen Erkrankungen des Gefäßes verbunden sind.
Relevante Literatur
Girerd et al., Circulation Research 67, 1301–1308 (1990), berichten, dass die intravenöse Verabreichung von L-Arginin die von Endothel abhängige Relaxation in den hinteren Gliedmaßen von mit Cholesterin gefütterten Kaninchen verstärkt. Die Autoren kommen zu dem Schluss, dass die Synthese von EDRF durch L-Arginin bei Hypercholesterolämie erhöht werden kann. Rossitch et al., J. Clin. Invest. 87, 1295–1299 (1991), berichten, dass die In-vitro-Verabreichung von L-Arginin an die Basisarterien von hypercholesterolämischen Kaninchen die Beeinträchtigung von von Endothel abhängiger Gefäßerweiterung umkehrt und die Gefäßverengung verringert. Sie schließen daraus, dass die abnormalen Gefäßreaktionen bei hypercholesterolämischen Tieren auf eine reversible Reduktion der intrazellulären Argininverfügbarkeit für den Stoffwechsel für Stickstoffoxid zurückzuführen ist.
Creager et al., J. Clin. Invest. 90, 1248–1253 (1992), berichten, dass die intravenöse Verabreichung von L-Arginin die vom Endothel stammende NO-abhängige Gefäßerweiterung bei hypercholesterolämischen Patienten verbessert.
Janssens et al., J. Biol. Chem. 267, 14519–14522 (1992), zeigen, dass NO in Endothelzellen von L-Arginin durch NO-Synthase synthetisiert wird und berichten das Klonieren und die Expression von cDNA, die für Human-Endothel-NO-Synthase kodiert.
Cooke et al., "Endothelial Dysfunction in Nyperchloesterolemia is Corrected by L-arginin", Endothelial Mechanisms of Vasomotor Control, Drexler, Zeiher, Bassenger und Just (Hrsg.); Steinkopff Verlag Darmstadt, 1991, S. 173–181, geben einen Überblick über die Ergebnisse der früheren Literaturstellen und meinen: "Wenn das Ergebnis dieser Untersuchungen extrapoliert werden kann, könnte exogene Verabreichung von L-Arginin (d. h. in Form von Nahrungsergänzungen) ein therapeutisches Adjunkt bei der Behandlung und/oder Prävention von Atherosklerose darstellen." Cooke, Current Opinion in Cardiology 5, 637–644 (1990), erörtert die Rolle des Endothels bei der Atherosklerose und Restenose und die Wirkung, die diese Störungen auf die Endothelfunktion haben.
Cooke, J. Clin. Invest. 90, 1168–1172 (1992), beschreibt die Wirkung der chronischen Verabreichung von oralem L-Arginin bei hypercholesterolämischen Tieren auf Atherosklerose. Das ist die erste Demonstration, dass orale L-Arginin-Ergänzungen die Freisetzung von NO von der Gefäßwand verbessern können. Die Zunahme der NO-Freisetzung aus der Gefäßwand war mit einer augenfälligen Verringerung von Atherosklerose bei hypercholesterolämischen Tieren verbunden. Das ist der erste Beleg für die Hypothese, dass eine erhöhte NO-Produktion durch die Gefäßwand die Entwicklung von Atherosklerose hemmt.
Cooke und Tsao, Current Opinion in Cardiology 7, 799–804 (1992), beschreiben den Mechanismus des Fortschreitens von Atherosklerose und meinen, dass die Hemmung von Stickstoffoxid die Gefäßhomostase stören und zu Atherogenese beitragen könnte.
Cooke und Santosa, "Steroid Normones and Dysfunctional Bleeding", AAAS Press (1993), geben einen Überblick über die Aktivitäten von EDRF in einer Vielzahl von Rollen und meinen, dass die Reversibilität von Endothel-Funktionsstörung durch das Atherosklerose-Stadium beeinflusst sein könnte. Sie kommen zu dem Schluss, dass EDRF ein wirksames gefäßerweiterndes Mittel ist, eine Schlüsselrolle bei der Modulation von Ver halten und Widerstandsgefäßtonus spielt, entscheidende Wirkungen auf das Zellwachstum und Wechselwirkungen von Blutzellen im Kreislauf mit einer Gefäßwand hat, und dass Störungen der EDRF-Aktivität septischen Schock, Bluthochdruck, Gefäßkrampf, Toxämie und Atherosklerose auslösen oder dazu beitragen können.
Fitzpatrick et al., American Journal of Physiology 265 (Heart Circ. Physiol. 34), H774– H778 (1993), berichten, dass Wein und andere Weintraubenprodukte in vitro von Endothel abhängige, gefäßentspannende Aktivität aufweisen können.
Andere Literaturstellen, die sich auf Aktivitäten beziehen, die NO oder seinem Vorläufer zugeschrieben werden, sind u. a.: Pohl und Busse, Circ. Res. 65, 1798–1803 (1989); Radomski et al., Br. J. Pharmacol. 92, 181–187 (1987); und Stamler et al., Circ. Res. 65, 789–795 (1989) (Anti-Blutplättchen-Aktivität); Garg und Hassid, J. Clin. Invest. 83, 1774– 1777 (1989); und Weidinger et al., Circulation 81, 1667–1679 (1990) (NO-Aktivität in Bezug auf Gefäß-Glattmuskel-Wachstum); Ross, N. Engl. J. Med. 314, 488–500 (1986); Bath et al., Arterioscler. Thromb. 11, 254–260 (1991); Kubes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6348–6352 (1991); Lefer et al., "Endothelium-Derived Contracting Factors", Basel, S. Karger, S. 190–197 (1990) (NO-Aktivität in Bezug auf Leukozyten-Haftung und -Wanderung); Heistad et al., Circ. Res. 43, 711–718 (1984); Rossitch et al., J. Clin. Invest. 87, 1295–1299 (1991); Yamamoto et al., ebda. 81, 1752–1758 (1988); Andrews et al., Nature 237, 237–239 (1987); Tomita et al., Circ. Res: 66, 18–27 (1990); Kugiyama et al., Nature 344, 160–162 (1990); Mitchell et al., J. Vasc. Res. 29, 169 (1992) (Zusammenfassung); und Minor et al., J. Clin. Invest. 86, 2109–2116 (1990) (NO-Aktivität in Bezug auf Hypercholesterolämie); Tanner et al., Circulation 83, 2012–2020 (1991); Kuo et al., Circ. Res. 70, f465–476 (1992); Drexler et al., Lancet 338, 1546–1550 (1991); und Nakanishi et al., "Scientific Conference on Functional and Structural Mechanisms of Vascular Control, Snowbird, UT, S. 86 (1992) (Zusammenfassung) (Beziehung zwischen L-Arginin und NO-abhängiger Gefäßerweiterung).
Die Erfindung sieht die Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Atherosklerose und Restenose vor. Die Verstärkung der endogenen Stickstoffoxid- oder Sekundärmessenger-Verfügbarkeit an einer physiologischen Stelle hemmt das Fortschreiten von Restenose und Atherosklerose. Als Prophylaxe oder Behandlung für für Atherosklerose anfällige Wirte wird das Medikament chronisch in einer wirksamen Dosis verabreicht. Bei Restenose kann das Medikament für einen beschränkten Zeitraum verabreicht werden, da dieser pathologische Prozess im Allgemeinen 3 bis 6 Monate nach der Gefäßverletzung (d. h. Angioplastie oder Atherektomie) nachlässt. NO- oder Sekundärmessenger-Verfügbarkeit kann dadurch erhöht werden, dass die Zusammensetzung ein Gen, das für NO-Synthase kodiert, in einem Expressionsvektor für die Transfektion von Gefäßzellen umfasst, wodurch die verstärkte Expression von NO-Synthese in der Gefäßwand, insbesondere an der Läsionsstelle, zur Freisetzung von NO aus der Gefäßwand oder einer Reduktion des Abbaus von NO oder des Sekundärmessengers, zyklischem Guanosinmonophosphat ("cGMP") führt.
In den Zeichnungen:
ist 1 ein Balkendiagramm histomorphometrischer Untersuchungen der Wirkung von L-Arginin auf Atheroskleroseplaques bei hypercholesterolämischen Tieren (siehe Beispiel 1);
ist 2 eine nephelometrische Abtastung der Wirkung von L-Arginin-Nahrungsergänzung auf die Blutplättchen-Reaktivität, wie durch von Adenosindiphosphat in Gang gesetzte Blutplättchenanhäufung gezeigt (siehe Beispiel 2);
ist 3 ein Balkendiagramm, das die Wirkung von L-Arginin-Diätergänzung auf die Zellbindung an Aortenendothel von hypercholesterolämischen Tieren vergleicht (siehe Beispiel 4); und
ist 4 ein Balkendiagramm der morphometrischen Messungen der intimalen Läsionsdicke bei mit EC-NOs behandelten Tieren im Vergleich zu Kontrollvektor oder unbehandelten verletzten Gefäßen (siehe Beispiel 6).
Gemäß vorliegender Erfindung werden weitverbreitete degenerative Gefäßerkrankungen wie Atherosklerose, Gefäßthrombose und Restense prophylaktisch und/oder therapeutisch behandelt, indem das physiologische Signal verstärkt wird, das aus Zellreaktion auf EDRF resultiert, beispielsweise durch Aufrechterhaltung einer erhöhten Menge an Stickstoffoxid, seines Vorläufers oder eines Sekundärmessengers, der mit dem Relaxationssignal verbunden ist, z. B. zyklischem Guanosonmonophosphat ("cGMP") an der Gefäßwand gemäß einem vorbestimmten Verabreichungsplan über einen längeren Zeitraum. Die erhöhte Menge an Stickstoffoxid (womit auch jeder Stickstoffoxid-Vorläufer gemeint ist, der zu einer solchen erhöhten Menge führt) kann erreicht werden, indem die Aktivität, Synthese oder Konzentration einer der Komponenten erhöht wird, die mit der Bildung von Stickstoffoxid im Stickstoffoxid-Syntheseweg verbunden sind, oder die Abbaurate von Stickstoffoxid, seiner Vorläufer oder der Sekundärmessenger gehemmt wird, die mit dem Relaxationssignal verbunden sind, indem die Menge an Stickstoffoxid-Synthetase erhöht wird, die in der Gefäßwand, insbesondere an der Stelle der Läsionen, vorhanden ist. Das kann durch lokale Verabreichung an die Läsionsstelle oder systemisch in das Gefäßsystem erfolgen.
Zellen werden durch genetisches Engineering verändert, um für die konstitutive oder induzierbare Expression eines oder mehrerer Gene zu sorgen, was für die gewünschte Relaxationsreaktion sorgt, indem NO-Synthase oder andere Enzyme oder Proteine exprimiert werden, die ausgeschiedenen werden und extrazellulär wirken können. Somit können (virale oder Plasmid-) Expressionsvektoren hergestellt werden, die das bzw. die entsprechende(n) Gene) enthalten und die in Wirtszellen eingeführt werden können, die dann hohe Konzentrationen an Stickstoffoxid oder anderen Zwischenverbindungen im Relaxationsweg erzeugen. Diese Zellen können an der Läsionsstelle oder an einer anderen Stelle in den Wirt eingeführt werden, wo die Expression die entsprechende Reaktion in Bezug auf Relaxation, Vermehrung usw. herbeiführt. Die NO-Synthese oder Zellen, die NO-Synthase exprimieren, können als Depots durch Einkapselung und Positionierung an der Stelle von Interesse vorliegen. Beispielsweise können poröse Stents hergestellt werden, die das Enzym oder die Zellen einkapseln, um das Enzym vor Abbau und Beseitigung zu schützen, oder, was die Zellen betrifft, diese vor dem Immunsystem zu schützen.
Kultivierte Zellen können mit Expressionsvektoren, die die NO-Synthase oder ein anders Gen enthalten, ex vivo transfiziert und dann in die Gefäßwand eingebracht werden, wobei verschiedene intraarterielle oder intravenöse Katheter-Abgabesysteme zum Einsatz kommen. Alternativ können Gentransfer-Techniken in vivo eingesetzt werden, um Gefäßzellen innerhalb des intakten Gefäßes in vivo zu transfizieren. Das Gen bzw. die Gene kann bzw. können in hohen konstitutiven Mengen exprimiert oder mit einem induzierbaren Promotor (der Gewebespezifität aufweisen kann) verbunden werden, um die Regulierung der Expression zu ermöglichen.
Es werden DNA-Konstrukte hergestellt, wo das entsprechende Gen, z. B. ein NO-Synthase-Gen, entweder mit einer nativen Terminationsregion oder einer anderen Terminationsregion, die für verbesserte Stabilität der Messenger-RNA sorgen kann, an einen geeigneten Promotor angefügt ist. Konstitutive Promotoren, die speziell von Interesse sind, kommen von Viren, wie z. B. Simian-Virus, Papillomavirus, Adenovirus, HIV, Rous-Sarcomavirus, Cytomegalovirus oder dergleichen, wobei die Promotoren Promotoren für frühe oder späte Gene oder lange terminate Wiederholungen umfassen. Endogene Promotoren können β-Actinpromotor oder Zelltypen-spezifische Promotoren umfassen.
Ein Konstrukt wird nach herkömmlichen Techniken hergestellt, wobei die verschiedenen DNA-Fragmente in einen geeigneten Plasmid- oder viralen Vektor eingeführt wird, normalerweise einen Vektor, der zur Replikation einem bakteriellen und/oder eukaryotischen Wirt fähig ist. Normalerweise umfasst der Vektor einen Marker, was die Selektion von Zellen ermöglicht, die den Vektor tragen, beispielsweise Antibiotikaresistenz. Der Vektor kann normalerweise auch einen Ursprung umfassen, der im Wirt Replikation bewirkt. Im Vektor können auch andere funktionelle Elemente vorhanden sein.
Sobald der Vektor hergestellt und repliziert worden ist, kann er zum Einführen in Wirtszellen verwendet werden. Das Plasmidvektorkonstrukt kann weiters modifiziert werden, indem es an vitale Elemente angefügt wird, die leichte Transfektion ermöglichen, einen Marken für die Selektion, z. B. Antibiotikaresistenz, bereitstellen können, oder an andere funktionelle Elemente. Das Einführen das Plasmidvektorkonstrukts in die Wirtszellen kann durch Calciumphosphat-gefällte DNA, Transfektion, Elektroporation, Fusion, Lipofektion, vitalen Capsid-vermittelten Transfer oder dergleichen erfolgen. Alternativ dazu kann das Expressionskonstrukt innerhalb vitaler Vektoren durch Standardinfektionstechniken eingeführt werden. Zur Somazellen-Gentherapie werden im Allgemeinen autologe Zellen eingesetzt, obwohl in manchen Fällen allogene Zellen oder rekombinant modifizierte Zellen eingesetzt werden können. Üblicherweise sind die für genetische Modifikation eingesetzten Zellen reife Endothel- oder Gefäß-Glattmuskelzellen. Gelegentlich sind die zur genetischen Modifikation eingesetzten Zellen Progenitorzellen, insbesondere frühe Progenitorzellen. Beispielsweise können für Muskelzellen Myoblasten eingesetzt werden, oder für Lymphoid- und/oder myelomonozytische Zellen hämatopoetische Stammzellen oder hochproliferative potentielle Zellen eingesetzt werden.
Je nach Beschaffenheit der Zellen können sie in Gewebe mit gleicher oder anderer zellulärer Beschaffenheit injiziert werden, sie können in das Gefäßsystem injiziert werden, wo sie als mobile Zellen verbleiben oder sich an einer bestimmten Stelle (d. h. der Läsion) festsetzen können. Beim NO-Synthase-Gen hängt die Anzahl an Zellen, die verabreicht werden, von der Beschaffenheit der Zellen, der Produktionsmenge der NO-Synthese, der gewünschten Menge an NO-Synthase im Wirtsgefäßsystem, an der Läsionsstelle oder dergleichen ab, davon, ob die erhöhte Menge an NO-Synthase die einzige Behandlung ist, oder ob sie in Verbindung mit anderen Komponenten des Stickstoffoxid-Synthesewegs eingesetzt wird, und dergleichen. Daher wird die jeweilige Anzahl an einzusetzenden Zellen empirisch gemäß der Anforderungen für den jeweiligen Patienten bestimmt.
Diese Zellen können auch in den Kreislauf eingeführt werden, indem sie zunächst auf der Oberfläche von Standard-Gefäßtransplantatmaterial (d. h. Dacron- oder Polytetrafluorethylen-Transplantaten) oder anderen synthetischen Gefäßleitungen oder Gefäß-Bioprothesen gezüchtet werden. Auf diese Weise können die Zellen in den Wirt eingeführt werden, indem das mit den Zellen besäte Gefäßtransplantat eingeführt wird.
Alternativ dazu können virale Vektoren verwendet werden, die in Lage sind, Zellen in vivo zu infizieren, wie Adenovirus oder Retrovirus. In diesem Fall wird der virale Vektor, der das NO-Synthase-Gen oder ein anderes Gen enthält, das am Relaxationsweg beteiligt ist, direkt an die Stelle von Interesse verabreicht, wo er in eine Anzahl von Zellen eindringt und in das Zellgenom integriert wird. So kann die gewünschte Menge an Stickstoffoxid-Synthase, die sekretiert wird, oder an anderem Protein, das exprimiert wird, titriert werden, indem eine oder mehrere Verabreichungen des Virus vorgesehen werden, wodurch die Menge an Synthase, die sekretiert wird, oder an anderem Protein, das erzeugt wird, schrittweise erhöht wird.
Alternativ dazu können modifizierte Liposomen als Vehikel für die endovaskuläre Verabreichung des Vektor verwendet werden, der die NO-Synthase oder ein anderes Gen enthält. Eine solche modifizierte Liposom-Technik umfasst das Mischen der Liposomen mit dem Vektor, der NO-Synthase enthält. Sobald der Gen-Expressionskonstrukt enthaltende Vektor in das Liposom aufgenommen wurde, werden die Liposome mit einem Protein (z. B. dem viralen Hüllprotein des Hemagglutinating Virus of Japan) beschichtet, das die Affinität des Liposoms für die Gefäßwand erhöht.
In manchen Situationen kann die NO-Synthase oder ein anders Gen im Relaxationsweg mit einem künstlichen Gen, das für ein Arginin-reiches Polypeptid kodiert, das für proteolytische Spaltung anfällig ist, als intrazelluläre Quelle für L-Arginin cotransfiziert wer den. In anderen Situationen kann die NO-Synthase oder ein anderes Gen mit dem Superoxid-Dismutasegen cotransfiziert werden, um den Abbau des Stickstoffoxids zu hemmen.
Die folgenden Erörterungen und Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
Experimenteller Teil
Anti-athergene Wirkungen von oralem Arginin:
Untersuchungsschema: (siehe Cooke et al., 1992, oben). Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (n = 49) wurden einer von drei Behandlungsgruppen zugeordnet: 10 wurden für 10 Wochen mit normalem Kaninchenfutter gefüttert (Kontrolle); 19 erhielten mit 1 Cholesterin angereichertes Futter (Chol); und 20 erhielten eine 1%-Cholesterin-Diät, ergänzt mit 2,5% L-Argininhydrochlorid im Trinkwasser (Arg.). Nach 10 Wochen diätischer Intervention wurden die Tiere leicht sediert und die Mittelohrarterie kannüliert, um den intraarteriellen Blutdruck zu messen, gefolgt vom Entnehmen von Blutproben für Serumchemien und Plasmaarginin. Daraufhin wurden die Tiere getötet, und die linke Hauptkoronararterie und die Thoraxaorta wurden entnommen, um die Gefäßreaktivität und die Histomorphometrie zu untersuchen. Manchen Tieren wurde Blut abgenommen, um die Blutplättchen- und Monozyten-Reaktivität zu untersuchen.
Ergebnisse: Biochemische und physiologische Messungen.
Hypercholesterolämische Tiere, die auf orale L-Arginin-Ergänzung (Arg) gehalten wurden, erfuhren im Vergleich zu Tieren mit einer normalen (Kontrolle) oder 1%-Cholesterin- (Chol-) Diät alleine eine Verdoppelung der Argininspiegel im Plasma; der Anstieg des Plasma-Arginins wurde während des gesamten Verlaufs der Studie beibehalten. Serum-Cholesterinmessungen waren bei beiden Gruppen, die die 1%-Cholesterin-Diät erhielten, gleichermaßen erhöht. [50 ± 6 gegenüber 1629 ± 422 gegenüber 1852 ± 356 mg/dl für Kontrolle (= 10), Chol (= 13) bzw. Arg (= 14)]. Es gab keine wesentlichen Unterschiede der Hämodynamikmessungen zwischen den Gruppen.
Organkammer-Untersuchungen isolierter Gefäße: Was die NO-unabhängigen Reaktionen betrifft, gab es keine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen bezüglich der maximalen Reaktion oder der Empfindlichkeit für Norepinephrin (ein gefäßverengendes Mittel) oder für Nitroglycerin (einen Nitrovasodilator). Im Gegensatz dazu waren die NO-abhängigen Relaxationen bei Gefäßen, die von hyperchloesterolämischen Tieren entnommen wurden, abgeschwächt, mit einer Reduktion der maximalen Reaktion auf Acetylcholin und einer Reduktion der Empfindlichkeit für Calciumionophor. Im Vergleich dazu wiesen Gefäße, die von hypercholesterolämischen Tieren entnommen wurden, die L-Arginin-Ergänzung erhielten, verbesserte NO-abhängige Relaxation auf. Ebenso war die Empfindlichkeit von Gefäßen für Calciumionophor A23187 bei der Arg-Gruppe höher. In einer eigenen Untersuchung wurde die Wirkung von chronischer Arginin-Ergänzung zur Verbesserung der NO-abhängigen Relaxation in der Bauchschlagader eines hypercholesterolämischen Kaninchens bestätigt.
Histomorphometrische Untersuchungen (Planimetrie von EVG-gefärbten Schnitten):
Eine histomorphometrische Blind-Analyse zeigte, dass es keinen Unterschied zwischen den Gruppen gab, was die mittlere Querschnittsfläche der Brustaorta betrifft. Im Gegensatz dazu war die Intima-Querschnittsfläche (d. h. die Menge an atherosklerotischen Plaques) von Gefäßen von hyperchloesterolämischen Tieren, die L-Arginin-Ergänzung erhielten, im Vergleich zu jenen von Tieren, die Cholesterin-Diät alleine erhielten, verringert. Bei den Arg-Tieren war die Reduktion der Intima-Läsion in der aufsteigenden Brustaorta und der linken Haupt-Koronarartie am ausgeprägtesten. In der linken Haupt-Koronarartie von hyperchloesterolämischen Tieren, die Arginin erhielten, entwickelte sich im Wesentlichen keine atherosklerotischen Plaques.
Veränderungen der Läsionsoberfläche: Bei einer zweiten Reihe von Untersuchungen wurde untersucht in welchem Ausmaß die Brustaorta von Läsionen betroffen war. Bei hypercholesterolämischen Kaninchen, die Vehikel (n = 6) oder L-Arginin-Ergänzung (n = 6) erhielten, wurden Brustaorten (von der linken Schlüsselbeinarterie bis zur Membran) nach 10 Wochen Behandlung entnommen, in Längsrichtung in zwei Teile geschnitten und mit Ölrot O gefärbt. Die Gefäße wurden fotografiert und die Gefäß- und Läsionsoberfläche durch Planimetrie bestimmt. Bei den Brustaorten von hypercholesterolämischen Tieren, die Vehikel erhielten, waren etwa 40% der Gesamtoberfläche mit Plaques bedeckt, während bei den Brustaorten von mit Arginin behandelten hypercholesterolämischen Tieren weniger als 10% der Oberfläche mit Plaques bedeckt waren.
Zusammenfassend erhöht die diätische Arginin-Ergänzung die Argininspiegel im Plasma, verändert aber das Cholesterin im Serum nicht. Das ist mit einer deutlichen Verbesserung der NO-abhängigen Gefäßerweiterung verbunden, wie durch Bioassay beurteilt. Schließlich ist die Verbesserung der NO-abhängigen Gefäßerweiterung mit einer Reduktion der Dicke und Fläche der Läsionen in Gefäßen von hypercholesterolämischen Tieren verbunden.
Hemmung der Blutplättchen-Anhäufung durch orales L-Arginin:
Es wurde die Wirkung von L-Arginin-Ergänzung auf die Blutplättchen-Reaktivität bei Kaninchen die normales Futter (Kontrolle; n = 6), eine 1%-Cholesterin-Diät (Chol; n = 5) oder eine 1%-Cholesterin-Diät ergänzt mit oralem Arginin (Arg; n = 6) erhielten, wie oben ausgeführt, untersucht. Arterielles Blut, das nach Mittelohrarterien-Kannülierung erhalten wurde, wurde mit 13 mM Natriumcitrat am Gerinnen gehindert. An Blutplättchen reiche Suspension wurde hergestellt, indem Blutplättchen in kalziumfreier Krebs-Henseleit-Lösung gewaschen und in Tyrode's Lösung mit Albumin resuspendiert wurde. Die Blutplättchen-Zählung wurde durch die Zugabe von Blutplättchen-armem Plasma auf 2,5 × 10⁴ Blutplättchen/μl eingestellt. Die Anhäufung wurde durch die Zugabe von Adenosindiphosphat in Gang gesetzt und durch herkömmliche nephelometrische Techniken überwacht. Bei Blutplättchen, die von Chol-Tieren stammten, unterschied sich die Rate oder das maximale Ausmaß der Anhäufung im Vergleich zu Blutplättchen von Kon troll-Tieren (A) nicht. Im Gegensatz dazu war die Anhäufung von Blutplättchen von Arg-Tieren um 50% geringer (B).
Diese Reduktion der Blutplättchen-Anhäufung war mit einem doppelt so hohen cGMP-Gehalt bei angehäuften Blutplättchen von mit Arginin behandelten Tieren verbunden. Die Reduktion der Blutplättchen-Reaktivität konnte durch die Verabreichung von N-Methylarginin (10^–4 M) in vitro (C) umgekehrt werden (2). Daher kann die Anti-Blutplättchen-Wirkung chronischer oraler Arginin-Verabreichung einer erhöhten Synthese von endogenem NO zugeschrieben werden. Weiters kann NO-Synthese sowohl bei Blutplättchen als auch im Endothet herbeigeführt werden.
Hemmung der Monozyten-Haftung:
A. Funktioneller Bindungstest: Um zu bestimmen, ob orale Arginin-Ergänzung die Monozytenhaftung beeinträchtigt, wurde Blut von Kaninchen entnommen, die mit normalem Futter (= 6), einer 1%-Cholesterin-Diät (= 6) oder einer 1%-Cholesterin-Diät, ergänzt mit L-Arginin (= 6) gefüttert wurden, wie oben beschrieben. Einkernige Zellen wurden aus Blut durch Ficoll-Plaque-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Bei diesen vorbereitenden Untersuchungen wurde die Haftung von Blut-Leukozyten an einer transformierten Endothel-Zelllinie, bEnd3 (von Mäusegehirn stammende Polyom-Mittel-T-Antigen-transformierte Endothelzellen) untersucht. Die Bend3-Zellen zeigen die Morphologie von Endothelzellen und sind wie Human-Endothelzellen zur Aufnahme von acetyliertem Lipoprotein geringer Dichte fähig und exprimieren Adhäsionsmoleküle auf durch Cytokin regulierbare Weise. Kultivierte Zellen wurden in Lab-Tek-Kammer-Objektträgern mit 0,5 cm² (MilesScientific) bis zur Konfluenz gezüchtet und mit Kontrollmedium oder mit LPS (1 mg/ml) oder TNFa (25E/ml) 18 h lang behandelt. Die Kulturen wurden mit frischem Testpuffer gewaschen, und pro Napf wurden niedrige, mittlere oder hohe Konzentrationen an Leukozyten (0,75, 1,5 bzw. 3 × 10⁵ Zellen/ml) zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation auf einer Rüttelplattform bei Raumtemperatur, um Bindung zu ermöglichen, wurden die Objektträger umgedreht und in Puffer eingetaucht, der 2 Vol.-% Glutaraldehyd enthielt, so dass nicht anhaftende Zellen verloren gingen und haftende Zellen an der Monolage fixiert wurden. Die anhaftenden einkernigen Zellen wurden unter Verwendung von Video-Lichtmikroskopie gezählt.
Monozyten von hypercholesterolämischen Tieren (Chol) wiesen eine stärkere Haftung auf, in Übereinstimmung mit der durch andere gemachten Beobachtung, dass Monozyten von hypercholesterolämischen Katzen oder Menschen stärkere Haftung an kultivierten Endothelzellen aufweisen (deGruijter et al., Metabol. Clin. Ex. 40, 1119–1121 (1991); Fan et al., Virchows Arch. B Cell Pathol. 61, 19–27 (1991)).
Im Vergleich zu Monozyten, die von mit Vehikel behandelten hypercholesterolämischen Tieren (Chol) stammten, waren jene von Arginin-behandelten hypercholesterolämischen Tieren (Arg) viel weniger stark haftend. Diese Daten zeigen, dass die Arginin-Behandlung die Haftung von Monozyten am Endothel hemmt, die das erste beobachtbare Ereignis bei Atherogenese ist.
Diätische L-Arginin hemmt die verstärkte Endothel-Monozyten-Wechselwirkung bei Hyperchloesterolämie
Die früheste beobachtbare Anomalie der Gefäßwand bei hypercholesterolämischen Tieren ist die verstärkte Monozyten-Haftung am Endothel, die innerhalb einer Woche Cholesterin-reicher Nahrung auftritt. Es wird angenommen, dass dieses Ereignis durch die Oberflächenexpression von Endothel-Haftmolekülen und chemotaktischen Proteinen vermittelt wird, die durch Hypercholesterolämie herbeigeführt werden.
Eine weitere Endothel-Veränderung, die parallel dazu auftritt, ist eine verringerte Stickstoffoxid- (d. h. NO-) Aktivität, die vom L-Arginin-Stoffwechsel stammt. Wie oben gezeigt stellt die chronische diätische Ergänzung mit L-Arginin die NO-abhängige Gefäßerweiterung bei hypercholesterolämischen Kaninchen wieder her, und diese Verbesserung der NO-Aktivität ist mit einer augenfälligen antiatherogenen Wirkung verbunden. In der folgenden Untersuchung wurde die Hypothese getestet, das die antiatherogene Wirkung von diätischem Arginin durch von Endothel stammendes NO vermittelt wurde, das die Monozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung hemmt.
Verfahren
Tiere. Männliche weiße New Zealand-Kaninchen wurden paarweise gefüttert, wobei sie für 2 Wochen eine der folgenden diätischen Interventionen erhielten: normales Kaninchenfutter (Kontrolle, n = 7), mit 1% Cholesterin angereichertes Kaninchenfutter (Chol, n = 7), oder 1%-Cholesterin-Futter, ergänzt mit 2,25% L-Arginin HCl im Trinkwasser (Arg, n = 7) ad libitum während der gesamten Dauer der Untersuchung. In einer zweiten Reihe von Untersuchungen, die dazu bestimmt war, die Rolle von endogenem NO auf die Monozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung genauer zu erforschen, wurde eine weitere Gruppe von Tieren paarweise gefüttert, wobei sie eine normale Kanichen-Nahrung, entweder ergänzt mit Vehikel als Kontrolle (N = 5) oder dem NO-Synthase-Antagonisten, Nitro-L-arginin (L-NA, 10 mg/100 ml; n = 5), verabreicht im Trinkwasser ad libitum während des gesamten Verlaufs der Untersuchung (für eine mittlere tägliche Dosis von 13,5 mg/kg/Tag) erhielten. Bei einer dritten Reihe von Versuchen erhielten die Tiere normale Nahrung und entweder Vehikel (n = 4), L-NA (13,5 mg/kg/Tag; n = 4) oder L-NA und Hydralazin (n = 4), das dem Trinkwasser 2 Wochen lang zugegeben wurde. In dieser Dosis kehrte Hydralazin (5 mg/kg/Tag) die durch L-NA herbeigeführte Zunahme des Blutdrucks um. Einen Tag vor dem Töten (nach 2 Wochen diätischer Intervention) wurden die Tiere leicht sediert, und die Mittelohrarterie wurde kannüliert, um Blutproben zu entnehmen.
Kultur und Isolierung einkerniger Zellen. Mäuse-Monocytenzellen, WEHT 78/24-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ergänzt mit 10 Vol.-% Kalbsfötenserum, gezüchtet und wurden in einer Atmosphäre 5% CO₂/95% Luft gehalten. Vor den Bindungsuntersuchungen wurden einkernige Zellen Fluoreszenzmarkierung mit TRITC (3 μg/ml) unterzogen. Um die Ergebnisse unter Verwendung von WEHI-Zellen zu bestätigen, wurden bei manchen Untersuchungen parallel dazu Bindungsuntersuchungen durchgeführt, bei denen einkernige Kaninchenzellen eingesetzt wurden. Einkernige Zellen wurden aus frischem Gesamtblut von Kontroll-Kaninchen vor der Tötung isoliert.
Präparierung von Aortenendothel und Bindungstest. Nach 2-wöchiger diätischer Intervention wurden die Brustaorten entfernt und in kalte, mit Sauerstoff angereicherte Kochsalzlösung eingelegt. Ein 15-mm-Segment Brustaorta wurde von einem Punkt unmittelbar distal zur linken Schlüsselbeinarterie bis zur Mitte der Brustaorta ausgeschnitten. Die Segmente wurden dann vorsichtig in Längsrichtung geöffnet und in Kulturplatten gelegt, die HBSS-Medium enthielten. Aortenstreifen wurden an der Kulturplatte unter Verwendung von 25-Gauge-Nadeln befestigt, um das Medium auf die Endotheloberfläche einwirken zu lassen. Kulturplatten wurden dann bei Raumtemperatur auf einer Rüttelplattform platziert.
Nach 10 min wurde das HBSS-Medium durch Bindungsmedium ersetzt, das WEHI-Zellen enthielt. Die Aortenstreifen wurden mit den einkernigen Zellen 30 min lang inkubiert. Das Medium wurde dann durch frisches Bindungsmedium ohne Zellen ersetzt, um nicht anhaftende Zellen zu beseitigen. Die Aortensegmente wurden dann entnommen und auf einen Glas-Objekträger gelegt, und anhaftende Zellen wurden unter Epifluoreszenz-Mikroskopie von zumindest 30 Stellen auf jedem Segment gezählt.
Ergebnisse
Monozytenhaftung an Kaninchen-Aortenendothel. Einwirken von WEHT 78/24-Zellen auf normales Kaninchen-Aortenendothel führt bei diesem Ex-vivo-Bindungstest zu einer minimalen Zellbindung. Wenn die WEHI-Zellen jedoch mit Aortenendothel von hypercholesterolämischen Tieren (Col; n = 7) inkubiert wurden, wurde die Zellbindung im Vergleich zur Kontrolle (n = 7) um das Dreifache verstärkt. Die erhöhte Zellbindung, die das Aortenendothel von hyperchloesterolämischen Tieren zeig, wurde durch L-Arginin-Ergänzung (n = 7) wesentlich verringert. (3) Ähnliche Ergebnisse wurden bei jedem der drei erreicht, wenn Haftungstest parallel dazu mit einkernigen Zellen durchgeführt wurden, die frisch von Kontroll-Tieren (n = 2) isoliert waren.
Auswirkung chronischer NO-Synthase-Hemmung auf das Endothel-Haftvermögen. Um die Rolle von von Endothel stammendem NO bei der Modulation der Endothel-Monozyten-Wechselwirkung weiter zu untersuchen, wurde eine weitere Reihe von Bindungsuntersuchungen durchgeführt, bei denen die Brustaorta von Tieren verwendet wurde, die herkömmliches Futter, ergänzt mit Vehikel (n = 5) oder dem NO-Synthase-Hemmer L-NA (n = 5) erhielten. Die Haftung von WEHI-Zellen war, wenn sie mit Aortenendothel von L-NA-Tieren inkubiert waren, im Vergleich zu Kontroll-Endothel deutlich erhöht. Diese Wirkung konnte nicht auf Bluthochdruck zurückgeführt werden, durch durch L-NA bewirkt wurde, da die gleichzeitige Verabreichung von Hydralazin den Blutdruck normalisierte, aber die Erhöhung der durch L-NA herbeigeführten Zellbindung nicht rückgängig machte.
In einer eigenen Reihe von Versuchen wurde bestätigt, dass die chronische Verabreichung von L-NA (des Inhibitor von NO-Synthase) die Erzeugung und Freisetzung von NO von der Gefäßwand (gemessen durch Chemolumineszenz) im Vergleich zu Gefäßen von Tieren, die mit Vehikel oder Arginin behandelt wurden, signifikant hemmte.
Die hervorstechenden Ergebnisse dieser Untersuchung sind: 1) Monozyten-Bindung an das Endothel in vivo ist bei Gefäßen von hypercholesterämischen Tieren erhöht; 2) diese Zunahme der Monozytenbindung ist bei hyperchölesterämischen Tieren, die chronisch mit dem NO-Vorläufer L-Arginin behandelt wurden, geschwächt; 3) Monozyten-Bindung an das Endothel ist bei Gefäßen von normocholesterolämischen Tieren, die mit dem NO-Synthase-Antagonisten L-Nitro-Arginin behandelt wurden, erhöht; und 4) diese Wirkung des NO-Synthase-Antagonismus wurde durch die Verabreichung von Hydralazin in ausreichenden Dosen, um den Blutdruck zu normalisieren, nicht aufgehoben. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit der Hypothese, dass NO die Monozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung hemmt.
Abschließend gesagt wurde ein ex vivo-Modell der Monozytenbindung verwendet, um die Zunahme des durch Hypercholesterolämie herbeigeführten Endothel-Haftvermögens zu untersuchen. Die Schwächung des Endothel-Haftvermögens wird durch orale Verabreichung des NO-Vorläufers L-Arginin wie gezeigt verringert. Umgekehrt erhöht die Hemmung von NO-Synthase-Aktivität durch orale Verabreichung von Nitro-Arginin die Endothel-Affinität von Monozyten ex vitro deutlich. Die Daten stehen in Einklang damit, dass NO ein endogenes anti-atherogenes Molekül ist.
Beispiel 1
Auswirkung der NO-Synthase-Expression auf die Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen
Kultivierte Ratten-Aortagefäß-Glattmuskelzellen wurden unter konfluenten, ruhenden Bedingungen untersucht. Es wurde ein effizientes virales Hüllprotein-vermitteltes DNA-Transferverfahren eingesetzt, um die Zellen mit dem NO-Synthase-Gen zu transfizieren, das vom β-Actin-Promotor und CMV-Verstärker angetrieben wurde. Das führte zu erhöhter NO-Synthaseaktivität (gemessen durch den Arginin-zu-Citrullin-Umwandlungstest) im Vergleich zu mit Kontrollvektor transfizierten Zellen. Die Transfektion des NO-Synthase-Gens beseitigte die die durch Serum stimulierte DNA-Synthese im Vergleich zu Kontrollvektor-Transfektion vollständig. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die erhöhte Expression von NO-Synthase (verbunden mit erhöhte NO-Produktion) die übermäßige Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen hemmt. Diese Hemmung kann mit der Behandlung von Atherosklerose und Restenose in Korrelation gesetzt werden.
Beispiel 2
Gentherapie unter Verwendung von NO-Synthase-cDNA verhindert Restenose.
Die Untersuchung in Beispiel 1 wies darauf hin, dass NO die Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen hemmt. Bei Atherogenese und Restenose trägt übermäßige Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen zu Läsionsbildung bei. Die Verletzung am Endothel bei Atherosklerose und nach Katheter-Interventionen verringert oder beseitigt scheinbar den heilenden Einfluss von NO. Die folgende Untersuchung zeigt, dass die Abgabe des Gens für NO-Synthase an die Gefäßwand die Läsionsbildung hemmt.
Es wurde ein Plasmid-Kontrukt synthetisiert, das für die cDNA von NO-Synthase vom Endothel-Typ (EC-NOS) kodiert. Eine cDNA voller Länge, die für EC-NOS kodiert, wurde in die EcoRI-Stelle des pUCcaggs-Expressionsvektors insertiert. Ballon-Angioplastien der Kariotis von Sprague-Dawley-Ratten wurden durchgeführt und HVJ-Liposome mit Plasmiden infundiert, die für EC-NOS cDNA kodieren, oder Plasmide infundiert, denen EC-NOS cDNA (Kontrollvektor) fehlt. Nach 4 Tagen bis 2 Wochen wurden die Ratten getötet und die Karotis entnommen, für: 1) Histomorphometrie; 2) Messung der DNA-Synthese; und 3) Ex-vivo-Bestimmung der NO-Synthese und Freisetzung durch Biotest und durch Chemolumineszenz.
Ergebnisse
Morphometrische Messungen 2 Wochen nach der Verletzung zeigten eine signifikante (68%ige) Verringerung der Intima-Läsionsdicke bei mit EC-NOS behandelten (Inj + NOS) im Vergleich zu mit Kontrollvektor behandelten (Inj + CV) oder unbehandelten (Ctr Inj) verletzten Gefäßen. (4) Messungen der DNA-Synthese wurden 4 Tage nach der Verletzung unter Verwendung von Bromodesoxyuridin durchgeführt. EC-NOS-Transfektion begrenzte die Bromodesoxyuridin-Aufnahme im Vergleich zu mit Kontrollvektor behandelten oder unbehandelten verletzten Gefäßen deutlich (um 25%). Die Gefäßsegmente wurden ex vivo unter Einsatz von Organkammertechnik zum Biotest für die NO-Freisetzung untersucht. Calciumionophor erhöht das intrazelluläre Calcium und aktiviert die NO-Synthase, um NO zu erzeugen. Durch Calciumionophor herbeigeführte Relaxationen bei verletzten Karotisarterien, die mit Kontrollvektor transfiziert waren, die nur 15% der unverletzten Gefäße ausmachten. Verletzte Arterien, die mit EC-NOS transfiziert worden waren, entspannten sich in einem viel größeren Ausmaß, etwa 50% dessen, was bei unverletzten Gefäßen beobachtet wurde. Die direkte Messung von NO (durch Chemolumineszenz), das in das Medium freigesetzt wurde, zeigte, dass durch verletzte Gewebe (transfiziert mit dem Kontrollvektor) freigesetztes NO nur 20% dessen ausmachte, was von normalen unverletzten Geweben freigesetzt wurde. Im Gegensatz dazu setzten mit EC-NOS transfizierte verletzte Gewebe mehr NO frei (etwa 75% des Normalwerts).
Als Schlussfolgerung beseitigt Ballon-Angioplastie der Ratten-Karotis die Endthoel-Quelle für NO, führt übermäßige Gefäß-Glattmuskel-DNA-Synthese und Vermehrung herbei, was zu einer Initimaläsion (Restenose) führt. Die Transfektion des Gefäßes mit EC-NOS zum Zeitpunkt der Ballon-Verletzung stellt die NO-Produktion des Gefäßes teilweise wieder her, und das ist mit verringerter DNA-Synthese und Gefäß-Glattmuskel-Vermehrung verbunden, wodurch die Läsionsbildung verringert wird. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit der Schlussfolgerung, dass NO ein endogenes, antiatherogenes Molekül ist.
Vergleichsbeispiel
Ausschluss der Wirkung von verstärktem Stickstoff- oder Kalorien-Gleichgewicht als Ursache der beobachteten Ergebnisse:
Um die Wirkung von L-Arginin auf Stickstoff oder das Kaloriengleichgewicht als Ursache dieser Ergebnisse auszuschließen, erhielten sechs Tiere eine 1%-Cholesterin-Diät, ergänzt durch zusätzliches Methionin, um das diätische Methionin um das Sechsfache zu erhöhen. Nach 10 Wochen wurden die Tiere getötet, um die Blutplättchen- und Gefäß-Reaktivität zu untersuchen und Histomorphometrie durchzuführen. Von Endothel abhängige Relaxation, Blutplättchen-Anhäufung und die Intima-Dicke unterschieden sich nicht von jenen bei Tieren, denen 1%-Cholesterin-Diät allein gefüttert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine andere Aminosäure, Methionin (das kein Vorläufer von NO ist), die Wirkung der Aminosäure L-Arginin nicht nachahmt. Daher scheint es wahrscheinlich, dass die Wirkung von L-Arginin auf diesen Stoffwechsel auf Stickstoffoxid zurückzuführen ist und nicht auf eine andere Auswirkung der Aminosäureverabreichung (d. h. eine Änderung des Stickstoff- oder Kalorien-Gleichgewichts).
Aus den obigen Ergebnissen ist klar ersichtlich, dass sich durch Erhöhung der Stickstoffoxid-Mengen durch Stickstoffoxid-Vorläuferverbindungen oder andere Verbindungen im Stickstoffoxidweg beträchtliche Vorteile für Patienten mit degenerativen Gefäßerkrankungen ergeben. Diese Behandlung verringert die Bildung von atherosklerotischen Plaques und Restenose, indem sie die Haftung von Monozyten und Blutplättchen hemmt und die Vermehrung von Gefäß-Glattmuskelzellen verringert.
Somit haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes gezeigt, dass genetisches Engineering eingesetzt werden kann, um ein Gen einzuführen, das mit einer Komponente im synthetischen Weg für die Erzeugung von Stickstoffoxid, z. B. Stickstoffoxid-Synthase, verbunden ist, wobei die verstärkte Produktion derartiger Verbindungen die Wirkung haben wird, das Gleichgewicht zu einer verstärkten Produktion von Stickstoffoxid zu schieben. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von Wegen bereit, um die Synthese oder Wirkung von Stickstoffoxid zu verstärkten oder den Abbau von Stickstoffoxid zu verringern, wodurch die Wirkung des endogenen Stickstoffoxids erhöht wird, die Bildung von Gefäßläsionen zu verhindern und Restenose zu hemmen.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Atherosklerose oder Restenose im Herz-Kreislauf-System eines Säugetierwirts, wobei die Zusammensetzung Folgendes umfasst: ein genetisches Konstrukt, das ein Gen umfasst, das für eine Stickstoffoxid-Synthetase kodiert, in einem Expressionsvektor zur Transfektion von Gefäßzellen; worin die Stickstoffoxid-Synthetase von den Gefäßzellen an einer Stelle einer Läsion exprimiert wird, um die Stickstoffoxidmenge zu erhöhen und myointimale Hyperplasie zu hemmen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Stickstoffoxid-Synthetase Endothelzellen-Stickstoffoxid-Synthetase ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin das Medikament dazu formuliert ist, in den Wirt als Gefäßtransplantat eingeführt zu werden, das mit den Gefäßzellen versetzt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Gefäßzellen Endothelzellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Gefäßzellen Gefäß-Glattmuskelzellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Herstellung eines Medikaments das Vermischen des genetischen Konstrukts mit einem Liposom umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Vektor ein Plasmidvektor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Vektor ein viraler Vektor ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die myointimale Hyperplasie eine Folge Ballon-Angioplastie ist.