JPH08511530A

JPH08511530A - 内因性酸化窒素生成又は活性の調節による血管変性疾患の治療

Info

Publication number: JPH08511530A
Application number: JP7501932A
Authority: JP
Inventors: ピー．クーク，ジョン; ジェイ．ドザウ，ビクター; エイチ．ギボンズ，ゲイリー
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-06-02
Publication date: 1996-12-03
Also published as: DE69432413T2; EP0702518A1; EP0702518A4; EP1027834A1; DE69432413D1; ES2196027T3; EP0702518B1; WO1994028721A1; CA2164632A1

Abstract

(57)【要約】宿主のＮＯ誘発性弛緩経路中の内因性酸化窒素又は他の中間生成物のレベルを増大する生理学的に許容可能な化合物の長期投与によりアテローム性動脈硬化症及び再狭窄を治療する。あるいは、直接又は生理学的工程で酸化窒素の短期増強を提供する他の化合物を組合せて投与し得る。さらに細胞を遺伝子工学処理して酸化窒素に対する合成経路中の成分を提供して、特に酸化窒素前駆体の投与を併用して酸化窒素濃度を増強するための工程を進行させる。

Description

【発明の詳細な説明】内因性酸化窒素生成又は活性の調節による血管変性疾患の治療本発明は認可番号１ＫＯ７ＨＣＯ２６６０（ＮＨＬＢＩ）下でアメリカ合衆国政府により一部支持された。米国政府は本出願に利権を有する。産業上の利用分野本発明の分野は、ＮＯ活性の調節であって、これは血管変性疾患、特にアテローム性動脈硬化症及び再狭窄の治療に使用法を見いだす。背景アテローム性動脈硬化症及び血管血栓症は罹患率及び死亡率の主因であって、冠動脈疾患、心筋梗塞及び発作を引き起こす。アテローム性動脈硬化症は血管を裏打ちする内皮の変性で始まる。内皮性変性は、内皮裏打ちを透過して血管の内皮と血管平滑筋との間の内膜下間隙に居を定める単核球の付着を引き起こす。単核球は漸増量のコレステロール（主として酸化又は修飾低密度リポタンパク質の形態で）を吸収して泡沫細胞を形成する。酸化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールは内皮を変性させ、下層の泡沫細胞が歪んで、ついには内皮を通り抜けて破裂することさえある。血小板は内皮破裂領域に付着して、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を含めた多数の成長因子を放出する。泡沫細胞によっても放出されるＰＤＧＦは内皮細胞を変性し、血管平滑筋細胞の病変部への移動及び増殖を刺激する。これらの平滑筋細胞は細胞外マトリックス（コラーゲン及びエラスチン）を放出し、病変部は拡張し続ける。病変内のマクロファージはプロテアーゼを同化し、その結果生じた細胞損傷は細胞屑及び脂質で満たされた壊死性コアを作る。その場合、病変は”複合病変”と呼ばれる。この病変が破裂すると、血管の血栓及び閉塞を生じる。冠動脈の場合、複合病変の破裂は心筋梗塞を促進するが、一方頚動脈の場合は発作が続いて起こる。心臓病専門医及び他の介在者が血小板により狭窄した血管を再び開くために用いる治療の１つがバルーン血管形成術である（年間約300,000例の冠動脈及び100 ,000例の末梢血管形成術が実施される）。バルーン血管形成術は血管切開の症例で高いパーセンテージで成功するが、残念ながらその工程で内皮を裸出させ、血管を損傷する。この損傷は血管の平滑筋細胞の損傷領域への移動及び増殖を引き起こして、筋内膜過形成又は再狭窄として公知の病変を形成する。この新規の病変は、有意の比率（30〜40％）の患者で血管形成術後３〜６カ月以内に症状を再発させる。その大きな罹患率及び重篤な結果のために、アテローム性動脈硬化症、血管血栓症及び再狭窄の発生率を減少し得る治療法を見いだすことが極めて重要である。理論的には、このような療法はアテローム性動脈硬化症に関連した病理学的過程を阻害し、それにより予防法を提供するか又は変性過程の進行を遅延させる。上記に要約したように、これらの病理学的過程は非常に複雑で、その特性、組成及び活性、並びにそれらが分泌する因子及びアップ又はダウン調節される受容体の性質に変化を蒙る種々の異なる細胞が関与する。内皮により放出される物質、即ち”内皮由来弛緩因子”（ＥＤＲＦ）は、これらの病的過程を阻害するのに重要な役割を演じる。ＥＤＲＦは酸化窒素（ＮＯ）又はＮＯを遊離させる不安定なニトロソ化合物であることが目下公知である（本発明のためには、別記しない限り、酸化窒素（ＮＯ）は酸化窒素又は不安定前駆体を意図する）。この物質は血管平滑筋を弛緩させ、血小板凝集を阻害し、培養血管平滑筋の有糸分裂誘発及び増殖、並びに白血球付着を阻害する。ＮＯは、血管壁及び血管の変性疾患に関連した種々の細胞に直接または間接的に及ぼす他の作用を有する。関連参考文献 Girerd，et al.（1990）Circulation Research 67,1301-1308は、Ｌ−アルギニンの静脈内投与がコレステロール食ウサギの後肢の内皮依存性弛緩を増強することを報告する。著者は、ＥＤＲＦの合成が高コレステロール血症においてＬ− アルギニンにより増大されると結論づけた。Rossitch，et al.（1991）J．Clin ．Invst.87，1295-1299は、高コレステロール血症ウサギの脳底動脈へのＬ−アルギニンのin vitro投与は内皮依存性血管拡張の損傷を元に戻し、血管収縮を低減すると報告している。彼らは、高コレステロール血症動物における異常血管反応は酸化窒素への代謝のための細胞内アルギニンの利用可能性の可逆的低減によると結論した。 Creager，et al.（1992）J．Clin．Invst．90,1248-1253は、Ｌ−アルギニンの静脈内投与が高コレステロール血症患者における内皮由来ＮＯ依存性血管拡張を改善すると報告している。 Cooke，et al.,”Endothelial Dysfunction in Hypercholesterolemia is Cor rected by L-arginine,”Endothelial Mechanisms of Vasomotor Control，eds ．Drexler，Zeiher，Bassenge，and Just；Steinkopff Verlag Darmstadt，1991 ，pp.173-181は、初期の参考文献の結果を再検討し、”これらの研究の結果を外挿するならば、Ｌ−アルギニンの外因性投与（即ち食事補充物の形態で）はアテローム性動脈硬化症の治療及び／又は防止における治療付加物を示す”ことを示唆する。 Cooke，（1990）Current Opinion in Cardiology 5，637-644は、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄における内皮の役割を、そしてこれらの障害が有する内皮機能に及ぼす作用を考察する。 Cooke，（1992）J．Clin．Invest.90，1168-1172は、アテローム性動脈硬化症に及ぼす高コレステロール血症動物における経口Ｌ−アルギニンの慢性投与の効果を記載する。これは、経口Ｌ−アルギニン補充物が血管壁からのＮＯの放出を改善し得ることを最初に立証したものである。血管壁からのＮＯ放出の増大は、高コレステロール血症動物におけるアテローム性動脈硬化症の著しい低減に関連した。これは、血管壁による漸増ＮＯ生成がアテローム性動脈硬化症の発症を阻害するという仮説を支持する最初の証拠である。 Cooke and Tsao，（1992）Current Opinion in Cardiology 7,799-804は、アテローム性動脈硬化症の進行メカニズムを記載し、酸化窒素の阻害が血管恒常性を乱し、アテローム性動脈硬化症に寄与すると示唆している。 Cooke and Santosa，（1993）In：Steroid Hormones and Dysfunctional Blee ding，AAAS Pressは種々の役割におけるＥＤＲＦの活性を再検討し、内皮機能不全の可逆性がアテローム性動脈硬化症の段階に左右されることを示唆する。彼らは、ＥＤＲＦが強力な血管拡張薬であり、導管及び耐性血管トーンの調節に鍵となる役割を演じ、細胞成長及び循環血液細胞と血管壁との相互作用に重要な影響を及ぼすと、そしてＥＤＲＦ活性の攪乱は敗血症ショック、高血圧、血管痙攣、毒血症及びアテローム性動脈硬化症を開始し又は関与し得る。 Fitzpatrick，et al.，American Journal of Physiology 265（Heart Circ．P hysiol．34）:H774-H778，1993は、ワイン及び他のブドウ副産物がin vitroで内皮依存性血管緊張低下活性を有することを報告する。ＮＯ又はその前駆体に関連した他の参考文献を以下に示す： Pohl and Busse(1989)Circ.Res.65:1798-1803;Radomski et al.(1987)Br.J.Ph armacol.92:181-187;and Stamler et al.(1989)Circ.Res.65: 789-795;anti-pla telet activity);Garg and Hassid(1989)J.Clin.Invest.83:1774-1777;and Weid inger et al，(1990)Circulation 81:1667-1679;(NO activity in relation to vascular smooth muscle growth);Ross(1986)N.Engl.J.Med.314:488-500;Bath e t al.(1991)Arterioscler.Thromb.11:254-260;Kubes et al.(1991)Proc.Natl.Ac ad.Scl.USA 89:6348-6352;Lefer et al.(1990)in:Endothellum-Derived Contrac ting Factors.Basel，S.Karger.pp.190-197:(NO activity in relation to leuk ocyte adhesion and migration);Heistad et al.(1984)Circ.Res.43:711-718:Ro ssitch et al.(1991)J.Clin.Invest.87:1295-1299;Yamamoto et al.(1988)ibid8 1:1752-1758;Andrews et al.(1987)Nature 327:237-239;Tomita et al.(1990)Ci rc.Res.66:18-27;Kugiyama et al.(1990)Nature 344:160-162;Mitchell et al.( 1992)J.Vasc.Res.29:169(abst.);and Minor et al.(1990)J.Clin.Invest.86:210 9-2116;(NO activity in relation to hypercholesterolemia);Tanner et al.(1 991)Circulation 83:2012-2020;Kuo et al.(1992)Circ.Res.70:f465-476;Drexle r et al.(1991)Lancet 338:1546-1550;and Nakanishi et al.(1992)In:Scientif ic Conference on Functional and Structural Mechanisms of Vascular Contro l，Snowbird，UT，p.86(abstr.);relation of L-arginine to NO-dependent vas odilation. 本発明の要約生理学的部位の酸化窒素又は活性前駆体のレベルを調節することにより細胞付着、浸潤及び増殖を調節する方法が提供される。本方法は、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄の治療に用途を見出す。生理学的部位での内因性酸化窒素又は二次メッセンジャー利用可能性を増強すると、再狭窄及びアテローム性動脈硬化症の進行が阻害される。アテローム性動脈硬化症に罹りやすい宿主に対する予防又は治療として、有効投与量で薬物を慢性投与する。再狭窄に関しては、この病理学工程が一般に血管損傷（即ち血管形成術又はアテローム切除）後３−６か月消滅するために、薬物を限定期間投与する。食事補充物としてのＬ− アルギニンの経口投与は、ＮＯ同化を増大し、それによりアテローム発生の作用を低減する。ＮＯ合成の利用可能性を増大するといったような、ＮＯ又は二次メッセンジャー利用可能性を増強する他の方法を用い得る。例えば、血管壁における、特に病変部位でのＮＯ合成の発現増強は、血管壁からのＮＯの放出を、あるいはＮＯ又は二次メッセンジャーである環状グアノシンモノホスフェート（”ｃＧＭＰ”）の分解低減を引き起こす。図面の簡単な説明図１は、高コレステロール血症動物におけるアテローム性動脈硬化プラークに及ぼすＬ−アルギニンの作用の組織形態測定試験の棒グラフである（実施例１参照）。図２は、アデノシン二リン酸により開始される血小板凝集によって立証した場合の血小板反応性に及ぼすＬ−アルギニン食事補充物の作用の比濁スキャンである（実施例２参照）。図３は、高コレステロール血症動物の大動脈内皮に結合する細胞に及ぼすＬ− アルギニン食事補充物の作用を比較する棒グラフである（実施例４参照）。図４は、対照ベクター又は未処置損傷血管と比較した場合のＥＣ −ＮＯＳ処置動物における内膜病変厚の形態測定の棒グラフである（実施例６参照）。特定の態様の説明本発明によれば、アテローム性動脈硬化症、血管血栓症及び再狭窄のような一般的な血管変性疾患を、内皮由来弛緩因子（”ＥＤＲＦ”）に対する細胞の反応に起因する生理学的シグナルを増強することにより、例えば長期間に亘って予定レジメンに従って血管壁での酸化窒素、その前駆体又は弛緩シグナルに関連した二次メッセンジャー、例えば環状グアノシン−リン酸（”ｃＧＭＰ”）の増強レベルを保持することにより、予防的に及び／又は治療的に処置する。増強レベルの酸化窒素（このような増強レベルを生じる酸化窒素のあらゆる前駆体を含めるものとする）は、酸化窒素合成経路における酸化窒素の生成に関連するあらゆる成分の活性、合成又は濃度を調節することにより、あるいは酸化窒素、その前駆体又は弛緩シグナルに関連した二次メッセンジャーの分解速度を抑制することにより達成し得る。酸化窒素のレベル増強は、酸化窒素（又はその生理学的等価物）の生成のための代謝経路の中間代謝物質を患者に投与した結果であり、酵素レベル増強は、酸化窒素又は酸化窒素を直接又は間接的に生成させる生理学的に許容可能な前駆体の産生に関連した。薬剤は、天然食物源、例えば天然タンパク質源としての食肉又は植物、果物又はそれからえられる副産物、例えばワイン等以外の形態で投与される。一つのアプローチは、食事補充物としてＬ−アルギニンを用いることである。このアミノ酸は、あらゆる生理学的許容可能な塩、例えば塩酸塩、グルタミン酸塩等として投与し得る。それは、ＮＯ前駆体の血漿レベルを増大するために、ペプチド（即ちポリ−Ｌ−アルギニン）として投与してもよい。天然供給源としては、プロタミンが挙げられる。Ｌ−アルギニン又は他の便利なＮＯ前駆体の投与は、予定レジメンに従って、少なくとも１週間に１度、長時間に亘って、一般に少なくとも１か月間、さらに普通は少なくとも３か月、慢性治療としてなされ、宿主の寿命を含めて１年又はそれ以上持続し得る。投与量は、投与の頻度、所望の血中レベル、他の併用治療、症状の重症度、処置が予防のためか治療のためか、患者の年齢、患者におけるＮＯの自然レベル等に依っている。望ましくは、使用するＬ−アルギニン又は生物学的に等価の化合物の量は、一般的に約0.2mM−30mMの範囲の血漿レベルを提供する。Ｌ−アルギニンの経口投与は、ピル、粉末、カプセル、液体溶液又は分散液、特に水性分散液等としてＬ−アルギニンを提供することにより達成し得る。種々の担体及び賦形剤は、ＮＯ前駆体、例えばラクトース、白土、スクロース、ゼラチン、水性培地、生理学的に許容可能な油、例えば落花生油等を処方するのに用途を見出し得る。通常、毎日としても、ヒト宿主に対するＬ−アルギニンの投与は約１−12ｇ／日である。Ｌ−アルギニンの投与は、アテローム性動脈硬化症又は再狭窄を阻止するために予防的に、あるいはアテローム発生が開始した後治療的に行われる。したがって、例えばバルーン血管形成術を受けるべき患者は、実質的にバルーン血管形成術前に、好ましくは少なくとも約１週間又は実質的にはそれより長く投与されるＬ−アルギニンのレジメンを有する。あるいは、アテローム性動脈硬化症の疑いがある患者においては、Ｌ−アルギニンの投与はいつでも開始し得る。特に興味深いのは、食物中の補充物としてＬ−アルギニンを組み入れたもの、例えばヘルスバー、例えばグラノーラ、他の穀物、フルーツバー、例えばデイトバー、イチジクバー、アプリコットバー等である。Ｌ−アルギニン又は等価物の量は、１回投与量当たり又はバー１本当たり約２−25ｇ、好ましくは約３−15ｇである。経口投与の代わりに、血管内投与を用いてもよく、特にこの場合は血管系の酸化窒素レベルのより迅速な増強が望ましく（即ち重大な導管の急性血栓を有する場合）、そうすれば患者の要求にしたがって経口及び非経口投与の組合せを用いうる。さらに非経口投与は、消化管から血管系へ粘膜を通して用意に運搬されない化合物の投与を可能にする。別のアプローチは、ブドウ果皮抽出物の活性成分を投与することである（上記 Fitzpatrik et al.（1993）参照）。分離技術を用いて、得られた各々の分画の活性を検定することにより、抽出物の活性成分濃度を高める。一次ゲル透過において成分の大きさにより抽出物を分けるための分離を用いてブドウ果皮抽出物を分画に分ける。適切な検定により活性分画を確定する（実験の項参照）。ＨＰＬＣ及び適切な溶離液を用いて（水性アセトニトリル又はプロパノールのアイソクラチック溶離液あるいはの直線的に変化する溶離液が便利である）、活性分画をさらに分離し得る。薄層クロマトグラフィー、質量分光測光法、ガス相クロマトグラフィー等により活性で実質的に純粋な、例えば少なくとも80重量％であることが示された分画を、次に赤外線核磁気共鳴質量又は他の分光法を用いて特性表示し得る。血管内投与に関しては、広範囲の個々の又は組合せの生理学的に許容可能な組成物が用いられ、これらは全身性投与または病変部位近くに提供される。したがって、ペルオキシ化合物又は他の酸素含有酸化剤（ここで酸化剤は生理学的に許容可能である）を窒素供給源、例えば置換グアニジン、例えばＬ−アルギニン、アミジン等と一緒に組合せて提供し得る。あるいは、酸素由来遊離基（例えばスーパーオキシド陰イオン）は酸化窒素を不活化し得ることが公知であるので、酸化防止剤又は酸素由来遊離基の掃去剤（例えばスルフヒドリル含有化合物）又は酸素由来遊離基の産生を防止する化合物（例えばスーパーオキシドジスムターゼ）を用いて内因性酸化窒素の分解を低減し得る。チオール化合物、並びにそれらの誘導体、例えばジスルフィド、スルホン酸、チオールエステル、チオノチオールエステル等も用途を見出し得る。用途を見出し得る他の化合物としては、部分的酸化窒素化合物、例えばヒドロキシルアミン、オキサゾール、オキサジン、ニトロソ化合物等が挙げられる。生理学的に許容可能な安定遊離基化合物、例えばニトロキシル化合物も用途を見出し得るが、この場合、無対電子がＮＯと同様に窒素又は酸素上にある。これらの化合物は、大部分は、一般に少なくとも約100 、通常約2000Ｄ未満の分子量を有する合成有機化合物である。用途を見出し得る他の組成物としては、亜硝酸エステルを含めた亜硝酸塩、炭酸塩、チオ炭酸塩のエステル等が挙げられる。これらの組成物を病変部位に投与して、酸化窒素濃度の迅速な増強を提供し、それによりプラーク形成又は再狭窄に存在し関連する酸化窒素のレベルに左右される種々の生理学的工程を開始又は阻害し得る。特に、内皮層の血管平滑筋（”ＶＳＭ”）細胞増殖及び侵襲に関連した工程を調節し得る。あるいは、酸化窒素に対する前駆体の増強と一緒に又は別々に、酸化窒素代謝経路の成分を増強し得る。例えば特に病変部位の、血管壁中に存在する酸化窒素シンセターゼの量を増強し得る。これは病変部位への局所投与により、又は血管系への全身性投与によりなされる。シンターゼはリポソーム、緩徐放出粒子を用いて、又はデポー製剤の形態で、例えばコラーゲン、ヒアルロン酸、生物適合性ゲル、血管ステント又は病変部位に所望の濃度のＮＯシンターゼを提供する他の手段を用いて投与し得る。当該生理学的部位にＮＯの増強を提供する代わりに、酸化窒素が存在する結果として変換される信号の寿命を延ばすよう選択し得る。ｃＧＭＰは酸化窒素誘導信号の結果として細胞内に産生されるため、産生を引き起こす薬物の使用又はｃＧＭＰの寿命の延長が成される。例証薬物としては、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ阻害剤又はグアニレートシクラーゼの量を増大する薬物が挙げられる。あるいは、タンパク質キナーゼＣリン酸化のレベルで介入して、所望の弛緩信号を提供し得る。あるいは、細胞を遺伝子工学処理して、ＮＯシンターゼ、あるいは分泌されて細胞外で作用する他の酵素又はタンパク質を発現することにより、所望の弛緩反応を提供する１つまたはそれ以上の遺伝子の構成的又は誘導可能な発現を提供する。したがって、適切な遺伝子（単数又は複数）を含有し、その後高濃度の酸化窒素又は弛緩経路の他の中間生成物を産生する宿主細胞中に導入し得る発現ベクター（ウイルス又はプラスミド）を調製し得る。これらの細胞は病変部位に又は宿主の別の部位に導入し得るが、この場合発現は、弛緩、増殖等のための適切な反応を誘発する。ＮＯシンターゼ又はＮＯシンターゼを発現する細胞はカプセル封入によりデポー製剤として存在し、当該部位に位置し得る。例えば酵素又は細胞をカプセル封入して酵素が分解及び除去されないよう保護する、又は細胞に関しては免疫系から細胞を護る多孔質ステントを作成し得る。培養細胞をＮＯシンターゼを含有する発現ベクター又は他の遺伝子でex-vivo で形質転換した後、種々の動脈内又は静脈内カテーテル供給システムを用いて血管壁中に導入する。あるいは、in vivo遺伝子トランスファーの技術を用いて無傷血管内でin vivoで血管細胞をトランスフェクトし得る。遺伝子（１個又は複数）を高構成レベルで発現し得るか又は誘導性プロモーター（組織特異性を有する）と連結させて発現を調節させ得る。適切な遺伝子、例えばＮＯシンターゼ遺伝子を固有終結領域又は異なる終結領域を有する適切なプロモーターと連結させて、メッセンジャーＲＮＡの安定性増強を提供するＤＮＡ構築物を調製する。特に興味深い構成プロモーターは、ウイルス、例えばサルウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ＨＩＶ、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス等に由来し、この場合プロモーターは初期又は後期遺伝子のためのプロモーター、あるいは長い末端反復を包含する。内因性プロモーターは、β−アクチンプロモーター、又は細胞型特異性プロモーターを包含する。慣用的技法に従って構築物を調製する。種々のＤＮＡ断片を適切なプラスミド又はウイルスベクター中に導入する。通常、ベクターは細菌及び／又は真核生物宿主中で複製可能である。通常、ベクターは、ベクターを保有する細胞を選別させるマーカー、例えば抗生物質耐性を含有する。ベクターはさらに通常、複製のために宿主中で機能するオリジンを含有する。他の機能性要素もベクター中に存在する。いったんベクターを調製し複製した後、それを宿主細胞中に導入するために用いる。プラスミドベクター構築物をトランスフェクションを容易にするためにウイルス因子と連結することによりさらに修飾し、選別のためのマーカー、例えば抗生物質耐性、又は他の機能性要素を提供する。プラスミドベクター構築物の宿主細胞中への導入は、リン酸カルシウム沈降ＤＮＡ、トランスフェクション、電気穿孔法、融合、リポフェクション、ウイルスカプシド介在トランスファー等により達成し得る。あるいは、ウイルスベクター内の発現構築物は、標準感染技術により導入し得る。体性細胞遺伝子治療に関しては、自系細胞が一般に用いられるが、しかしいくつかの場合には、同種細胞又は組換え的修飾細胞が用いられる。時としては、遺伝子修飾のために使用する細胞は原種細胞、特に初期原種細胞である。例えば筋肉細胞又は造血幹細胞に関しては筋原細胞を用い、リンパ及び／又は骨髄単球細胞に関しては高増殖能細胞を用い得る。細胞の性質に依り、それらを同一の又は異なる細胞性質を有する組織中に注入し、血管系に注入し得るが、その場合それらは移動性細胞のままであるか、又は特定の部位（即ち病変部）に向かって進む。ＮＯシンターゼ遺伝子に関しては、投与される細胞数は細胞の性質、ＮＯシンターゼ産生レベル、宿主血管系中のＮＯシンターゼの所望レベル、病変部位等に依っており、ＮＯシンターゼのレベル増強が唯一の治療であるか又は酸化窒素合成経路の他の成分と一緒に用いるか否か等に依っている。したがって、使用される特定数の細胞を、特定の患者の要件に従って経験的に確定する。標準血管移植物質（即ちダクロンDacron又はポリテトラフルオロエチレン移植片）、又は他の合成血管導管又は血管生体プロテーゼの表面にそれらを先ず増殖させることにより、これらの細胞を循環中に導入し得る。この方法で、細胞を植えつけた血管移植片を導入することにより、細胞を宿主中に導入し得る。あるいは、アデノウイルス又はレトロウイルスといったin vivoで細胞を感染させ得るウイルスベクターを用い得る。この場合、ＮＯシンターゼ遺伝子又は弛緩経路に関与する他の遺伝子を含有するウイルスベクターを当該部位に直接投与すると、それは多数の細胞中に入って、細胞ゲノムと一体化する。したがって、ウイルスの１回又はそれ以上の投与を提供し、したがって分泌されるシンターゼ又は産生される他のタンパク質の量を漸増することにより、分泌される酸化窒素シンターゼ、又は発現される他のタンパク質の所望レベルを滴定し得る。あるいは、ＮＯシンターゼ又は他の遺伝子を含有するベクターの血管内投与のためのビヒクルとして修飾リポソームを用い得る。このような修飾リポソーム技術は、リポソームをＮＯシンターゼを含有するベクターと混合することを含む。遺伝子発現構築物含有ベクターが一旦リポソーム中に組み込まれると、リポソームは血管壁に対するリポソームの親和性を増大するタンパク質（例えばセンダイウイルスのウイルスコートタンパク質）で覆われる。いくつかの状況では、ＮＯシンターゼ又は弛緩経路の他の遺伝子を、Ｌ−アルギニンの細胞内供給源としてタンパク質分解性切断を受けやすい富アルギニンポリペプチドをコードする人工遺伝子で同時トランスフェクトする。他の状況では、ＮＯシンターゼ又は他の遺伝子をスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子で同時トランスフェクトして、酸化窒素の分解を阻止する。いくつかの状況では、１回又は２−３回の投与を要する急性治療を包含する。これは通常は、酸化窒素前駆体として作用し得る、天然化合物以外のものである化合物に関連するか、あるいは酸化窒素の生成率を増強するために天然化合物と一緒に付加される化合物である。したがって、限定期間中に酸化窒素濃度を増大するためのＬ−アルギニン及びスーパーオキシドジスムターゼの急性投与が提供される。これらの投与は、長期レジメンとは無関係であるか又は関連がある。以下の実施例で本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。実施例実施例１．経口アルギニンの抗アテローム発生作用：試験計画：（上記Cooke et al.,1992 参照）雄ニュージーランドシロウサギ（ｎ＝49）を３つの処置群の１つに割り当てた：10羽には正常ウサギ餌を10週間与えた（対照）；19羽には１％コレステロールで濃厚にした餌を与えた（Ｃｈｏｌ）；そして20羽には飲料水中に2.5％塩酸Ｌ−アルギニンを補充した１％コレステロール食を与えた（Ａｒｇ）。餌に手を加えて10週間後に、動物を軽く鎮静させ、動脈内血圧測定のために耳中心動脈にカニューレを挿入し、その後血清化学物質及び血漿アルギニンのために血液標本を採集した。次いで動物を屠殺して左主冠動脈及び胸大動脈を血管反応性及び組織形態測定の試験用に採取した。いくつかの動物では、血小板及び単核球反応性の試験用に血液を採集した。結果：生化学的及び生理学的測定値経口Ｌ−アルギニン補充（Ａｒｇ）投与で維持された高コレステロール血症動物は、正常（対照）又は１％コレステロール（Ｃｈｏ１）食のみの動物に比して、血漿アルギニンレベルが２倍に上昇した；血漿アルギニンの上昇は、試験経過中保持された。血清コレステロール測定値は、１％コレステロール食を摂取中の両群で等しく上昇した（対照（＝10），Ｃｈｏｌ（＝13）及びＡｒｇ（＝14）に関してそれぞれ50±６対1629±422対1852±356mg/dl）。群間に血液動態測定値の有意差は認められなかった。単離血管の器官小室試験：ＮＯ−非依存性反応に関しては、ノルエピネフリン（血管収縮薬）又はニトログリセリン（ニトロ血管拡張薬）に対する最大反応又は感受性に処置群間の差は認められなかった。これに対比して、ＮＯ依存性弛緩は、アセチルコリンに対する最大反応の低減及びカルシウムイオノファに対する感受性の低減を示す高コレステロール血症動物から採取した血管で減衰した。比較した場合、Ｌ−アルギニン補充を受けている高コレステロール血症動物から採取した血管は、ＮＯ依存性弛緩を改善した。同様に、カルシウムイオノファＡ 23187に対する血管の感受性は、Ａｒｇ群でより大きかった。別々の試験において、ＮＯ依存性弛緩を改善するための慢性アルギニン補充の効果が高コレステロール血症ウサギ腹大動脈で確証された。組織形態測定試験（ＥＶＧ染色切片の面積測定）：盲検組織形態測定分析から、胸大動脈の中膜横断面積が群間で異ならないことが明示された。これに対比して、Ｌ−アルギニン補充を受けている高コレステロール血症動物からの血管の内膜横断面積（即ちアテローム性動脈硬化性プラークの量）は、コレステロール食のみ摂取動物と比較して低減した。Ａｒｇ動物では、内膜病変の低減は上行胸大動脈及び左主冠動脈で最も顕著であった。アルギニン摂取高コレステロール血症動物の左主冠動脈では、アテローム性動脈硬化性プラークは事実上全く現れなかった。病変表面積の変化：試験の二次シリーズにおいて、病変を伴う胸大動脈の程度を調べた。ビヒクル（ｎ＝６）又はＬ−アルギニン補充物（ｎ＝６）摂取高コレステロール血症ウサギにおいて、胸大動脈（左鎖骨下動脈から横隔膜まで）を治療10週間後に採取し、縦に二分して、オイルレッドＯで染色した。血管を写真撮影し、血管及び病変表面積を測面法で測定した。ビヒクル摂取高コレステロール血症動物からの胸大動脈においては総面積の約40％がプラークで覆われ、一方アルギニン処置高コレステロール血症動物からの胸大動脈では、プラークで覆われた面積は10％であった。要約すると、食事アルギニン補充は血漿アルギニンレベルを増大するが、しかし血清コレステロールは変えなかった。これは、バイオアッセイによって判定した場合、ＮＯ依存性血管拡張の有意の改善に関連する。最後に、ＮＯ依存性血管拡張の改善は、高コレステロール血症動物からの血管の病変の厚み及び面積の低減に関連する。実施例２．経口Ｌ−アルギニンによる血小板凝集の阻害：上記のように正常餌（対照；ｎ＝６）、１％コレステロール食（Ｃｈｏｌ；ｎ＝５）又は経ロアルギニンを補充した１％コレステロール食（Ａｒｇ；ｎ＝６）を摂取したウサギの血小板反応性に及ぼすＬ−アルギニン補充の作用を調べた。中心耳動脈カニューレ挿入後に得られた動脈血を13mM クエン酸ナトリウムで凝固防止処理した。カルシウム無含有Krebs-Henseleit溶液中で血小板を洗浄し、それらをアルブミンを含有するTyrode溶液中に再懸濁して、富血小板懸濁液を調製した。貧血小板血漿を付加して、血小板数を2.5x10⁴血小板／μｌに調整した。アデノシン二リン酸を付加して凝集を開始させ、標準比濁法でモニタリングした。Ｃｈｏｌ動物から得られた血小板では、対照動物（Ａ）からの血小板と比較して、凝集は速度又は最大程度に差は認められなかった。これに対比して、Ａｒｇ動物からの血小板の凝集は、50％だけ低減した（Ｂ）。血小板凝集のこの低減は、アルギニン処置動物からの凝集血小板の２倍も多いｃＧＭＰ含量に関連した。血小板反応性の低減は、in vitroのＮ−メチルアルギニン（10^-4Ｍ）の投与により逆転し得る（図２）。したがって、慢性経口アルギニン投与の抗血小板作用は、内因性ＮＯの合成増大に帰せられる。さらにＮＯ合成は、血小板及び内皮の両方で誘発される。実施例３．単核球付着の阻害Ａ．機能性結合検定：経口アルギニン補充が単核球付着に作用するか否かを確かめるために、上記のように正常餌（＝６）、１％コレステロール食（＝６）又は経ロアルギニンを補充した１％コレステロール食（＝６）摂取ウサギから血液を採集した。Ficoll-paque密度勾配遠心分離により血液から単核球を精製した。これらの予備試験では、血中白血球の形質転換内皮細胞株ｂＥｎｄ３（マウス脳由来ポリオーマ中央Ｔ抗原形質転換内皮細胞）との付着を調べた。Ｂｅｎｄ３細胞は内皮細胞の形態を示し、ヒトのように内皮細胞はアセチル化低密度リポタンパク質を取り込むことが出来て、サイトカイニン調節様式で付着分子を発現する。培養細胞を0.5cm²Lab-Tekチェンバースライド（Miles Scientific）で増殖させて集密にし、対照培地で又はＬＰＳ（１mg/ml）又はＴＮＦａ（25U/ml）で18時間処置した。培養を新鮮な検定緩衝液で洗浄し、低、中又は高濃度の白血球（それぞれO.75，1.5又は3ｘ10⁵細胞／ml ）をウエル当たりで加えた。室温で振盪台上で30分間インキュベートして結合させた後、スライドを逆さにして、２％（v/v）グルタールアルデヒドを含有する緩衝液中に浸漬して、非付着細胞を無くさせて付着細胞を単一層に固定した。付着単核球をビデオ光学顕微鏡を用いて数えた。高コレステロール血症動物（Ｃｈｏｌ）からの単核球はより大きな付着を示し、これは高コレステロール血症ネコ又はヒトからの単核球が培養内皮細胞とのより大きな付着を示すという他の著者の観察と一致した（deGruijter，et a.(1991 )Metabol．Clin．Exp．40,1119-1121；Fan，et al.(1991)Virchows Arch．B Cel l Pathol.61，1927）。ビヒクル処置高コレステロール血症動物（Ｃｈｏｌ）由来単核球と比較した場合、アルギニン処置高コレステロール血症動物（Ａｒｇ）からのものはあまり付着しなかった。このデータは、アルギニン処置が単核球の内皮への付着を阻害することを示し、これはアテローム発生で観察された最初のできごとである。実施例４．食事Ｌ−アルギニンは高コレステロール血症における内皮−単核球相互作用増強を阻害する高コレステロール血症動物の血管壁の再初期に観察される異常は、内皮への単核球付着の増強であって、これは高コレステロール食の１週間以内に起きる。このできごとは高コレステロール血症により誘発される内皮付着分子及び走化性タンパク質の表面発現によって媒介されると考えられる。平行して生じる別の内皮変化は、Ｌ−アルギニンの代謝から得られる酸化窒素（即ちＮＯ）の活性低減である。上記のように、Ｌ−アルギニンの慢性食事補充は高コレステロール血症ウサギのＮＯ依存性血管拡張を元に戻し、ＮＯ活性のこの改善は顕著な抗アテローム発生作用に関連する。以下の試験で、食事アルギニンの抗アテローム発生作用が単核球−内皮細胞相互作用を阻害する内皮由来ＮＯにより媒介されるという仮説を試験した。方法動物．雄ニュージーランド白ウサギをつがいで飼って餌をやり、以下の２週間の食事干渉の１つを施した：正常ウサギ餌（対照；ｎ＝７）；１％コレステロールで濃厚にしたウサギ餌（Ｃｈｏｌ；ｎ＝７）；又は試験中自由に飲める飲料水中に2.25％塩酸アルギニンを補充した１％コレステロール食（Ａｒｇ；ｎ＝７）。単核球−内皮細胞相互作用に及ぼす内因性ＮＯの役割をさらに調べるために意図された二次シリーズ試験において、別の群のウサギを番いにして餌をやり、試験中自由に飲める飲料水中に投与したビヒクル対照（ｎ＝５）又はＮＯシンターゼ拮抗薬ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＡ，10mg／100ml；ｎ＝５）を補充した正常ウサギ餌を与えて、ルの血小板反応性に及ぼすＬ−アルギニン補充の作用を調べた（１日平均用量13.5mg/kg/日）。第３シリーズの実験では、動物は正常餌及び飲料水に２週間付加したビヒクル（ｎ＝４）、Ｌ−ＮＡ（13.5mg/k g/日，ｎ＝４）、又はＬ−ＮＡ及びヒドララジン（ｎ＝４）を摂取した。この用量では、ヒドララジン（５mg/kg／日）は、Ｌ−ＮＡにより誘発された血圧増大を逆にした。屠殺（食事干渉２週間後）の１日前に、動物を軽く鎮静させて、中心耳動脈にカニューレを挿入して血液標本を採集した。単核球細胞培養及び単離：ネズミ単核球様細胞ＷＥＨＩ７８／２４細胞を、10％ウシ胎仔血清（v/v）を補充したDulbecco変法イーグル培地中で増殖させて、５％ＣＯ₂／95％空気の大気中に保持した。結合試験前に、単核球細胞をＴＲＩＴＣ（３μｇ／ml）で蛍光標識した。ＷＥＨＩ細胞を用いて結果を確証するために、いくつかの試験ではウサギ単核球を用いて結合試験を平行して実施した。屠殺前の対照ウサギの新鮮な全血から単核球を単離した。大動脈内皮の調製及び結合検定：食事干渉の２週間後に、胸大動脈を切除して冷酸素付加食塩水中に入れた。胸大動脈の15mmセグメントを左鎖骨下動脈の直遠位点から中央胸大動脈まで切り取った。次にセグメントを注意深く縦に切開して、ＨＢＳＳ培地を含入する培養皿に載せた。大動脈ストリップを25ゲージ針を用いて培養皿に固定して、内皮表面が培地に曝露されるようにした。次に培養皿を室温で振盪台上に置いた。 10分後、ＨＢＳＳ培地をＷＥＨＩ細胞を含有する結合培地と取り換えた。大動脈ストリップを単核球とともに30分間インキュベートした。次いで培地を新鮮な細胞無含有結合培地と取り換えて、非付着細胞を除去した。その後大動脈セグメントを取り出して、ガラススライド上に置いて、付着細胞を、各セグメントに関して少なくとも30の部位から、上蛍光顕微鏡下で計数した。結果ウサギ大動脈内皮への単核球付着：ＷＥＨＩ７８／２４細胞を正常ウサギ大動脈内皮に曝露すると、本ex vivo付着検定で最小細胞結合が生じた。しかしながらＷＥＨＩ細胞を高コレステロール血症動物（Ｃｈｏｌ；ｎ＝７）からの大動脈内皮とともにインキュベートすると、対照（ｎ＝７）に比して細胞結合が３倍に増強された。高コレステロール血症動物の大動脈内皮により立証される細胞結合の増大は、Ｌ−アルギニン補充（ｎ＝７）により有意に減衰された（図３）。同様の結果は、３つのうちの各々において、対照動物（ｎ＝２）から新たに単離された単核球を用いて、平行して付着検定を実施した場合に達成された。内皮付着に及ぼす慢性ＮＯシンターゼ阻害の作用：内皮−単核球相互作用を調節する場合の内皮由来ＮＯの役割をさらに調べるために、ビヒクル（ｎ＝５）又はＮＯシンターゼ阻害剤Ｌ−ＮＡ（ｎ＝５）を補充した通例の餌を摂取した動物からの胸大動脈を用いて、さらに別のシリーズの結合試験を実施した。ＷＥＨＩ細胞の付着は、対照内皮に比して、Ｌ−ＮＡ動物からの大動脈内皮とともにインキュベートした場合に顕著に増大した。この作用は、ヒドララジンの同時投与が血圧を正常化したがしかしＬ−ＮＡにより誘発された細胞結合の増強を元に戻さなかったために、Ｌ−ＮＡにより引き起こされた高血圧の影響は受けなかった。一連の分離試験において、Ｌ−ＮＡ（ＮＯシンターゼの阻害剤）の慢性投与は、ビヒクル又はアルギニンで処置した動物からの血管に比して、血管壁からのＮＯの生成及び放出（化学発光により測定）を有意に阻害することが確証された。本試験の目立った所見を以下に示す：１）単核球の内皮とのexｖivo結合は、高コレステロール血症動物からの血管で増大される；２）単核球結合のこの増大は、ＮＯ前駆体Ｌ−アルギニンで慢性的に処置した高コレステロール血症動物においては減衰される；３）単核球の内皮との結合は、ＮＯシンターゼ拮抗薬Ｌ−ニトロ−アルギニンで処置した正常コレステロール血動物からの血管で増大される；並びに４）ＮＯシンターゼ拮抗のこの作用は、血圧を正常化刷るのに十分な用量でのヒドララジンの投与によっては元に戻らなかった。これらの所見は、ＮＯが単核球−内皮細胞相互作用を阻害するという仮説と一致する。要するに、単核球結合のex vivoモデルを用いて、高コレステロール血症により誘発される内皮付着の増大を調べた。内皮付着の減衰は、ＮＯ前駆体Ｌ−アルギニンの経口投与により減衰されることが明示される。その逆に、ニトローアルギニンの経口投与によるＮＯシンターゼ活性の阻害は、ex vivoでの単核球に対する内皮親和性を顕著に増大する。データは、ＮＯが内因性抗アテローム発生分子であるということと一致する。実施例５．血管平滑筋細胞の増殖に及ぼすＮＯシンターゼ発現の作用：融合静止状態下の培養ラット大動脈平滑筋細胞を試験した。有効ウイルスコートタンパク質媒介ＤＮＡトランスファー法を用いてβアクチンプロモーター及びエンハンサーにより駆動されるＮＯシンターゼ遺伝子で細胞をトランスフェクトした。これは、対照ベクタートランスフェクト細胞と比較して、ＮＯシンターゼ活性（アルギニン−シトルリン変換検定により測定）の増大を生じた。ＮＯシンターゼ遺伝子のトランスフェクションは、対照ベクタートランスフェクションに比して、血清剌激性ＤＮＡ合成を完全になくした。これらの結果は、ＮＯシンターゼの発現増大（ＮＯ産生の増大に関連）が血管平滑筋の過剰増殖を阻害することを示した。この阻害は、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄の治療と相関し得る。実施例６．ＮＯシンターゼｃＤＮＡを用いた遺伝子治療は再狭窄を防止する実施例５の試験は、ＮＯが血管平滑筋細胞の増殖を阻害することを示した。アテローム発生及び再狭窄において、血管平滑筋細胞の過剰増殖は、病変形成に関与する。アテローム性動脈硬化症における並びにカテーテル挿入後の内皮への損傷は、明らかにＮＯの有益な影響を低減又は除去する。以下の試験は、ＮＯシンターゼに関する遺伝子の血管壁への供給が病変形成を阻止することを示す。内皮型ＮＯシンターゼ（ＥＣ−ＮＯＳ）のｃＤＮＡをコードするプラスミド構築物を合成した。ＥＣ−ＮＯＳをコードする全長ｃＤＮＡを、ｐＵＣｃａｇｇｓ発現ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。Sprague-Dawleyラットの頚動脈のバルーン血管形成術を実施し、ＨＶＪ−リポソームをＥＣ−ＮＯＳｃＤＮＡをコードするプラスミドと融合し、あるいはＥＣ−ＮＯＳｃＤＮＡを欠いたプラスミド（対照ベクター）と融合した。４日−２週間後、ラットを屠殺して、頸動脈を採取して下記に用いた：１）組織形態測定；２）ＤＮＡ合成の測定；並びに３）バイオアッセイ及び化学発光によるＮＯ合成及び放出のex vivo測定。結果損傷後２週間の形態測定から、対照ベクター処置（Ｉｎｊ＋ＣＶ）又は未処置（ＣｔｒＩｎｊ）損傷血管と比較した場合のＥＣ−ＮＯＳ処置（Ｉｎｊ＋ＮＯＳ）における内膜損傷厚の有意の（68％）低減が明示された（図４）。ＤＮＡ合成の測定は、ブロモデオキシウリジンを用いて損傷後４日目に実施した。ＥＣ− ＮＯＳトランスフェクションは、対照ベクター処置又は未処置損傷血管と比較して、ブロモデオキシウリジン取込みを有意に（25％だけ）限定した。ＮＯ放出に関するバイオアッセイのための器官小室法を用いて血管セグメントをex vivoで調べた。カルシウムイオノファは細胞内カルシウム増大し、ＮＯシンターゼを活性化してＮＯを生成する。カルシウムイオノファは、非損傷血管が15％だけである対照ベクターで形質転換した損傷頸動脈に弛緩を誘発した。ＥＣ−ＮＯＳでトランスフェクトされていた損傷動脈は、非損傷血管で観察されたものの約50％をより高度に弛緩した。培地中に放出されたＮＯの直接測定（化学発光による）からは、損傷組織（対照ベクターでトランスフェクト）により放出されたＮＯは、正常非損傷組織により放出されたものの20％に過ぎなかった。これに対比して、ＥＣ−ＮＯＳでトランスフェクトした損傷組織はより多くのＮＯ（正常の約75％）を放出した。最後に、ラット頚動脈のバルーン血管形成術はＮＯの内皮供給源を除去し、過剰血管平滑筋ＤＮＡ合成及び増殖を誘発し、その結果内膜損傷を引き起こす（再狭窄）。部分的バルーン損傷の時点でのＥＣ−ＮＯＳによる血管のトランスフェクションは、血管によるＮＯ産生を元に戻すが、これはＤＮＡ合成及び血管平滑筋増殖の低減に関連し、それにより病変形成を低減する。これらの結果は、ＮＯが内因性抗アテローム発生分子であるという結論と一致する。実施例７．観察結果を生じるような窒素又は熱量平衡増強の作用の排除：これらの結果の原因として窒素又は熱量平衡に及ぼすＬ−アルギニンの作用を排除するために、動物６例に、食事メチオニンを６倍に増量するために付加的メチオニンで補充した１％コレステロール食を投与した。10週間目に、血小板及び血管反応性の試験、並びに組織形態測定のために動物を屠殺した。内皮依存性弛緩、血小板凝集及び内膜厚は、１％コレステロール食単独摂取動物の場合と異ならなかった。これらの結果から、別のアミノ酸メチオニン（ＮＯの前駆体でない）はアミノ酸Ｌ−アルギニンの作用と同様でないことが明らかになる。したがって、Ｌ−アルギニンの作用はアミノ酸投与の幾つかの他の作用（即ち窒素又は熱量平衡の変化）というよりむしろ酸化窒素へのその代謝によるものと思われる。酸化窒素レベルを増強することにより、酸化窒素前駆体化合物又は酸化窒素経路中の他の化合物により、実質的利益が血管変性疾患患者にあとから起こるということが上記の結果から明らかである。この治療は、単核球及び血小板の付着を阻害することにより、並びに血管平滑筋細胞の増殖を低減することにより、アテローム性動脈硬化性プラーク及び再狭窄の形成を縮小する。宿主の、特に治療すべき部位での酸化窒素の軽度上昇レベルを維持するために、予定レジメンに基づいて宿主に投与することにより、又は酸化窒素の生成のための合成経路中の成分の供給を宿主に提供することによって、プラーク形成の発生率を実質的に減少させ得る。これは種々の方法で達成される：酸化窒素に関連した種々の化合物、例えばＬ−アルギニンについての予定レジメンに従った経口投与；直接又は内因性化合物、例えば酵素の生理学的作用の結果として、酸化窒素を生成し得る化合物の予定レジメンでその部位に投与；その作用により酸化窒素の生成を引き起こす化合物の組合せを使用；等。これらの個々の投与は、別々に、又は酸化窒素の生成に関連した他の化合物のレジメンと一緒に成し得る。あるいは、遺伝子工学的処理を用いて酸化窒素の生成のための合成経路中の成分、例えば酸化窒素シンターゼに関連した遺伝子を導入し得るが、この場合、このような化合物の生成強化は、酸化窒素の生成強化との平衡に至らせる作用を有する。したがって本発明は、酸化窒素の合成又は作用を強化するための、又は酸化窒素の分解を低減し、それにより内因性酸化窒素の作用を増大して血管病変の形成を防止し、再狭窄を阻止する多数の経路を提供する。本明細書中に引用した出版物及び特許出願はすべて、個々の出版物又は特許出願が各々特定的に及び個別に参照により含まれることを示されたように、参照により本明細書に含めるものとする。本発明を明確に理解するために前述の本文並びに実施例で本発明を詳細に説明したが、添付の請求の範囲の精神又は範囲を逸脱しない限りにおいて本発明は変更及び修正が成されうることは、当業者には容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ 15/09 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者ドザウ，ビクタージェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94022, ロスアルトスヒルズ，ドーンレーン 12101 (72)発明者ギボンズ，ゲイリーエイチ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94303, パロアルト，モリスドライブ 3212

Claims

【特許請求の範囲】１．アテローム性動脈硬化症又は再狭窄に罹りやすいヒト宿主の血管系におけるアテローム性動脈硬化症又は再狭窄の発症を阻止する方法であって、予定レジメンに従って上記宿主に予防的又は治療的用量の自然食物源以外の薬剤を投与して血管系の内因性ＮＯのレベルを増強する方法。２．上記薬剤がＮＯの前駆体である請求項１記載の方法。３．上記薬剤がＬ−アルギニン又は生理学的に許容可能なその塩である請求項２記載の方法。４．上記Ｌ−アルギニン又は生理学的に許容可能なその塩が約２−25ｇでヘルスバー中に存在する請求項２記載の方法。５．上記薬剤がＮＯの生成のための生合成経路中の酵素である請求項１記載の方法。６．上記酵素が上記酵素をコードする遺伝子を包含する細胞中に導入される遺伝子構築物を含有する細胞の存在の結果として発現される請求項３記載の方法。７．ヒト宿主の心臓血管系におけるプラーク形成を阻止する方法であって、生理学的に許容可能なアミノ化合物及びin vivoで反応し得る生理学的に許容可能な酸化剤を包含する化学物質を上記宿主に投与して心臓血管系中の内皮由来弛緩因子のレベルを増強する方法。８．上記アミノ化合物がグアニジノ化合物であり、上記酸化剤がペルオキシ化合物である請求項７記載の方法。９．ヒトの心臓血管系におけるプラーク形成を阻止する方法であって、以下の：ＮＯに対する生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を包含する遺伝子構築物で細胞をトランスフェクトして上記細胞中で発現させ、分泌させ；上記細胞が上記宿主に内因性であるか又は上記宿主中に導入され；それにより上記酵素が分泌されて心臓血管系中のＮＯのレベルを増強することを包含する方法。１０．上記細胞が血管注入により上記宿主中に導入される請求項９記載の方法。１１．上記細胞が上記細胞を接種された血管移植片として上記宿主中に導入される請求項９記載の方法。１２．上記遺伝子がＮＯシンターゼをコードする請求項９記載の方法。１３．上記方法がさらに予定レジメンに従って上記宿主に生理学的に許容可能なＮＯの化学前駆体を投与することを包含する請求項１２記載の方法。１４．上記薬剤がＬ−アルギニン又は生理学的に許容可能なその塩である請求項１３記載の方法。