DE69412509T2 - Nukleinsäureanaloga mit chelatisierender funktionalität - Google Patents
Nukleinsäureanaloga mit chelatisierender funktionalitätInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäure-Analoga mit Chelatbildungsfunktionalität, ihre Verwendung in Analysenverfahren, Verfahren zum Abfangen derselben auf festen Trägern und Verfahren zum Einengen von Lösungen derselben.
- Nucleinsäure-Analoga mit wichtigen neuen Nutzbereichen in Analysenverfahren und auf dem Gebiet der Diagnostik sind in WO 92/20703 beschrieben. Diese Nucleinsäure-Analoga besitzen eine Reihe neuartiger Eigenschaften, die ihnen besondere Bedeutung auf dem Gebiet der Diagnostik sowie auf dem Gebiet der Antisense-Therapeutik verleiht.
- Sie zeichnen sich typischerweise durch ein Polyamid-Gerüst aus, das eine Sequenz aus Liganden trägt, die Nucleinsäure- Basen sind. Die dort beschriebenen Analoga besitzen die Eigenschaft, mit hoher Spezifität und Stabilität an natürliche Nucleinsäuren komplementärer Sequenz zu hybridisieren.
- Um Nachweis und Handhabung derartiger Nucleinsäure-Analoga bei diagnostischen oder anderen analytischen Verfahren und dergleichen Arbeitsgängen zu erleichtern, ist es wünschenswert, die Nucleinsäure-Analoga mit nachweisbaren Markierungen zu versehen. Wünschenswert ist auch das Auffinden von Möglichkeiten, die Nucleinsäure-Analoga auf festen Trägern abzufangen. Verschiedene Markierungen sind in WO 92/20703 beschrieben. Beschrieben ist auch das Abfangen von Nucleinsäure-Analoga auf festen Trägern über gebundene Nucleinsäure- oder nucleinsäureanaloge Sequenzen, die als Abfangsonden fungieren.
- Erwünscht ist es jedoch, alternative Abfangmethoden zu finden und insbesondere solche Methoden, die keine maß geschneiderte, sequenzspezifische Abfangsonde erfordern, sondern vielmehr allgemein auf derartige Nucleinsäure- Analoga anwendbar sind.
- In EP-A-0 097 373 ist die Synthese von Nucleinsäuren beschrieben, die mit einem Komplexbildner markiert sind. Die Synthese dieser Verbindungen scheint allerdings kompliziert zu sein.
- Zwar werden natürliche Nucleinsäuren durch Ausfällen aus einer Lösung mittels Ethanol, Zentrifugieren und Resuspendieren problemlos und routinemäßig aufkonzentriert, doch gibt es gegenwärtig kein zweckmäßiges Verfahren, um all jene zu unterstützen, die mit diesen Nucleinsäure- Analoga arbeiten.
- Demgemäß macht die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt jetzt ein Nucleinsäure-Analogon verfügbar, umfassend einen polymeren Strang, der eine Sequenz aus Liganden enthält, die an ein Gerüst gebunden sind, das aus verknüpften Gerüsteinheiten besteht, wobei das Analogon imstande ist, an eine Nucleinsäure komplementärer Sequenz zu hybridisieren, des weiteren umfassend eine chelatbildende Einheit, vorzugsweise an einem terminalen Ende des Gerüsts, die wenigstens ein Metall-Ion durch Chelatbildung binden kann.
- Das Gerüst ist vorzugsweise ein Polyamid-, Polythioamid-, Polysulfinamid- oder Polysulfonamid-Gerüst, und vorzugsweise liegt die chelatbildende Einheit am N-terminalen Ende vor.
- Die chelatbildende Einheit umfaßt vorzugsweise eine Sequenz Peptid-gebundener Aminosäuren.
- Bevorzugte Aminosäure-Sequenzen zur Verwendung als chelatbildende Einheiten sind -His, Gly, Asp oder (His)n, wobei n = 3 bis 10 ist, z. B. 5 oder 6. Längere Sequenzen können mehr als ein Metall-Ion pro Molekül Nucleinsäure-Analogon binden.
- Alternativ kann die chelatbildende Einheit ein Polycarbonsäure-substituiertes Amin sein wie etwa Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Aminotriessigsäure (NTA) und dergleichen.
- Vorzugsweise kann das Nucleinsäure-Analogon an eine Nucleinsäure komplementärer Sequenz hybridisieren, um ein Hybrid zu bilden, das stabiler gegen Denaturierung durch Wärme ist als ein Hybrid zwischen dem herkömmlichen, in der Sequenz dem Analogon entsprechenden Deoxyribonucleotid und der Nucleinsäure.
- Vorzugsweise ist das Nucleinsäure-Analogon eine Peptidnucleinsäure, bei der das Gerüst ein Polyamid-Gerüst ist, wobei jeder Ligand direkt oder indirekt an ein Aza-Stickstoff-Atom im Gerüst gebunden ist, und die Liganden tragenden Stickstoff-Atome vorwiegend durch 4 bis 8 dazwischenliegende Atome voneinander im Gerüst getrennt sind.
- Vorzugsweise kann das Analogon an eine doppelsträngige Nucleinsäure hybridisieren, in der ein Strang eine zu dem Analogon komplementäre Sequenz aufweist, um so den anderen Strang von diesem einen Strang zu verdrängen.
- Mehrbevorzugte PNA-Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung haben die Formel: Formel I
- worin:
- n wenigstens 2 ist;
- jedes der L¹-Ln unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nucleobasen, nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-intercalierenden Agenzien, Nucleobase-bindenden Gruppen, heterocyclischen Einheiten, Reporter-Liganden und chelatbildenden Einheiten; jedes der C¹-Cn (CR&sup6;R&sup7;)y ist (vorzugsweise CR&sup6;R&sup7;, CHR&sup6;CHR&sup7; oder CR&sup6;R&sup7;CH&sub2;), wobei R&sup6; Wasserstoff ist und R&sup7; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Seitenketten natürlich vorkommender α-Aminosäuren, oder R&sup6; und R&sup7; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)-Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)- Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkylthio, NR³R&sup4; und SR&sup5;, wobei R³ und R&sup4; wie nachstehend definiert sind, und·R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub6;)- Alkyl, hydroxy-, alkoxy- oder alkylthiosubstituiertes (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl ist, oder R&sup6; und R&sup7; zusammengenommen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen; jedes der D¹-Dn (CR&sup6;R&sup7;)z ist (vorzugsweise CR&sup6;R&sup7;, CHR&sup6;CHR&sup7; oder CH&sub2;CR&sup6;R&sup7;), wobei R&sup6; und R&sup7; wie vorstehend definiert sind;
- y und z jeweils null oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind, wobei die Summe y + z wenigstens 2, vorzugsweise größer als 2, aber nicht größer als 10 ist;
- G¹-Gn-1 jeweils -NR³CO-, -NR³CS-, -NR³SO- oder -NR³SO&sub2;- in anderer Orientierung sind, wobei R³ wie nachstehend definiert ist;
- jedes der A¹-An und B¹-Bn so ausgewählt sind, daß:
- (a) A eine Gruppe der Formel (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId) ist, und B N oder R³N&spplus; ist; oder
- (b) A eine Gruppe der Formel (IId) ist, und B CH ist;
- worin:
- X O, S. Se, NR³, CH&sub2; oder C(CH&sub3;)&sub2; ist;
- Y eine Einfachbindung, O, S oder NR&sup4; ist;
- p und q jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, wobei die Summe p + q nicht größer als 10 ist;
- r und s jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind, wobei die Summe r + s nicht größer als 10 ist;
- R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, das hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiert sein kann, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen; und
- R³ und R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, hydroxy- oder alk oxy- oder alkylthiosubstituiertem (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino;
- Q -CO&sub2;H, -CONR'R", -SO&sub3;H oder -SO&sub2;NR'R" oder ein aktiviertes Derivat von -CO&sub2;H oder -SO&sub3;H ist; und
- I -NR'R' ist, wobei R' und R" unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Schutzgruppen für Amino, Reporter-Liganden, intercalierenden Agenzien, Chelatbildnern, Peptiden, Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Nucleosiden, Nucleotiden, Nucleotiddiphosphaten, Nucleotidtriphosphaten, Oligonucleotiden, darunter sowohl Oligoribonucleotide als auch Oligodeoxyribonucleotide, Oligonucleosiden sowie löslichen und nichtlöslichen Polymeren und R''' eine chelatbildende Einheit ist. Zu den "Oligonucleosiden" gehören Nucleobasen, die an Ribose gebunden und über ein anderes Gerüst als das normale Phosphat-Gerüst von Nucleinsäuren verknüpft sind.
- Die obigen Strukturen, worin R' oder R" ein Oligonucleotid oder Oligonucleosid ist, können als chimäre Strukturen zwischen den PNA-Verbindungen und dem Oligonucleotid oder Oligonucleosid aufgefaßt werden.
- Im allgemeinen ist wenigstens eines der L¹-Ln eine natürlich vorkommende Nucleobase, eine nicht natürlich vorkommende Nucleobase, ein DNA-intercalierendes Agens oder eine Nucleobase-bindende Gruppe.
- Bevorzugte PNA enthaltende Verbindungen, die brauchbar sind, um Bindung an RNA, ssDNA und dsDNA erfolgen zu lassen und Triplex-Strukturen zu bilden, sind Verbindungen der Formeln III, IV oder V:
- worin:
- L jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Phenyl, heterocyclischen Einheiten, natürlich vorkommenden Nucleobasen und nicht natürlich vorkommenden Nucleobasen;
- R&sup7; jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten natürlich vorkommender α-Aminosäuren;
- n eine ganze Zahl größer 1 ist;
- k, 1 und m jeweils unabhängig null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind;
- p jeweils null oder 1 ist;
- Rh OH, NH&sub2; oder -NHLysNH&sub2; ist; und R' eine chelatbildende Einheit ist.
- Gemäß einem zweiten Aspekt umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Abfangen eines Nucleinsäure-Analogons der vorstehend beschriebenen Art, umfassend das Einwirkenlassen des Nucleinsäure-Analogons auf einen festen Träger, der chelatisierbare Metall-Ionen trägt, die unter solchen Bedingungen an diesen gebunden sind, daß die chelatbildende Einheit des Nucleinsäure-Analogons die gebundenen Metall- Ionen chelatisiert, so daß das Nucleinsäure-Analogon am festen Träger abgefangen wird.
- Alternativ kann der Abfangprozeß das Einwirkenlassen des Nucleinsäure-Analogvns und der chelatisierbaren Metall- Ionen auf einen festen Träger umfassen, der die Metall- Ionen unter solchen Bedingungen binden kann, daß die Metall-Ionen an den festen Träger gebunden und durch die chelatbildende Einheit des Nucleinsäure-Analogons chelatisiert werden. Falls bevorzugt, können die Metall-Ionen durch das Nucleinsäure-Analogon oder an den festen Träger chelatisiert werden, ehe das Nucleinsäure-Analogon und der feste Träger aufeinander einwirken.
- Der feste Träger kann einen Chelatbildner wie etwa NTA oder EDTA umfassen, der durch chelatbildende Ionen wie etwa Nickel oder Kupfer-Ionen daran gebunden ist, die des weiteren durch das Nucleinsäure-Analogon chelatisiert werden.
- Ein besonders bevorzugter fester Träger ist Agarose-Gel, und der die chelatisierbaren Metall-Ionen tragende feste Träger kann vorzugsweise Ni-NTA-Agarose sein. Zweckmäßigerweise kann sich das Gel in einer Säule befinden, durch die eine Lösung, die das abzufangende Nucleinsäure-Analogon enthält, hindurchgeschickt werden kann, z. B. eine Zentrifugiersäule, durch die die Lösung zentrifugiert wird. Eine andere bevorzugte Form eines festen Trägers sind magnetische Teilchen mit einer chelatisierbare Metall-Ionen tragenden Oberfläche, die durch Chelatbildner wie vorstehend beschrieben darauf festgehalten werden können.
- Ein derartiges Verfahren umfaßt vorzugsweise das Abfangen des Nucleinsäure-Analogons aus einem ersten Volumen einer Lösung mit Hilfe eines wie beschriebenen Verfahrens, Entfernen des festen Trägers und des abgefangenen Nucleinsäure-Analogons aus der Lösung und Eluieren des Nucleinsäure-Analogons vom festen Träger in eine Flüssigkeitsmenge, so daß sich ein zweites Volumen einer Lösung des Nucleinsäure-Analogons ergibt, das kleiner ist als das erste Lösungsvolumen. Dadurch wird das Nucleinsäure-Analogon bezüglich der Konzentration seiner Ausgangslösung aufkonzentriert. Die Elution kann mit einem Überschuß an Chelatbildner wie etwa EDTA durchgeführt werden.
- Ein fester Träger, der ein daran gebundenes Nucleinsäure- Analogon aufweist oder in der Lage ist, ein solches Nucleinsäure-Analogon mit Hilfe der -vorstehend beschriebenen Techniken abzufangen, kann zum Abfangen einer Nucleinsäure komplementärer Sequenz aus einer Lösung verwendet werden. Ein besonderer Vorzug dieser Technik besteht darin, daß man dann die Wahl hat, die abgefangene Nucleinsäure entweder mit oder ohne das Nucleinsäure-Analogon vom festen Träger zu entfernen.
- So kann durch Behandeln des Systems mit einem Überschuß eines Chelatbildners wie z. B. EDTA das chelatisierte Metall entfernt werden, wodurch das Nucleinsäure-Analogon und jegliche hybridisierte Nucleinsäure freigesetzt wird. Alternativ kann die Nucleinsäure durch Wärme oder mit Hilfe anderer denaturierender Methoden vom Nucleinsäure-Analogon auf dem Träger abgelöst werden.
- Ein Beispiel für ein solches Abfangen einer Nucleinsäure wäre, eine Nucleinsäure an die eine chelatbildende Einheit tragende Nucleinsäureanalogon-Abfangsonde zu hybridisieren und dann den resultierenden Komplex an einem Metall-Ionen tragenden Feststoff abzufangen.
- Bei der Verwendung üblicher DNA-Sonden in Hybridselektionsverfahren besteht eine schwerwiegende Einschränkung darin, daß die Zielsequenz aufgrund konkurrierender Hybridisierungsvorgänge nicht zugänglich ist. Sind beispielsweise doppelsträngige PCR-Produkte das Ziel, so konkurriert die DNA-Sonde mit dem komplementären Nichtziel-PCR-Strang. Der Grund für die Unzugänglichkeit einer Zielsequenz können auch sekundäre und höhergeordnete Strukturen in der Ziel- Nucleinsäure sein. Bei vielen metabolisch stabilen RNAs (RNA, tRNA und snRNAs) sind diese Strukturen gut charakterisiert. Wir haben gezeigt, daß eine PNA über einen weiten Bereich an Salz-Konzentrationen ohne Affinitäts- und Spezifitätsverlust an ihre komplementäre Nucleinsäure hybridisieren kann. Tatsächlich nimmt die Affinität der PNA mit abnehmender Salz-Konzentration im Puffer zu. Theoretisch ist dies ist eine überaus nützliche Eigenschaft der PNA, da sie eine Hybridisierung an deren Zielsequenz unter Bedingungen geringer Salz-Konzentration ermöglicht, die normale Nucleinsäure-Strukturen destabilisieren. Wir haben ein Beispiel dafür geliefert, daß diese PNA-Eigenschaft zum Abfangen eines "schwierigen" Oligonucleotids genutzt werden kann, in dem die PNA-Zielsequenz so ausgestaltet ist, daß sie eine Seite eines intramolekularen, fehlerlos passenden 15 bp-Stammbereichs bildet.
- Verfahren, welche die schnelle Reinigung von Nucleinsäuren aus komplexen biologischen Proben erleichtern, sind wichtige Hilfsmittel sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der DNA-Diagnostik. Gegenüber Verfahren, die auf physikalischen Eigenschaften der zu reinigenden Nucleinsäuren beruhen, etwa Dichte, Bindung an Oberflächen und Löslichkeit, bietet das hier beschriebene Hybridselektionsverfahren zwei große Vorteile. Zum ersten wird eine Eigenschaft ausgenutzt, die nur Nucleinsäuren eigen ist, nämlich die Fähigkeit, an eine Sonde komplementärer Sequenz zu hybridisieren. Daher ist die Möglichkeit wahrscheinlich minimal, daß andere Zellbestandteile mitgereinigt werden, die sich für nachfolgende Anwendungen als hemmend erweisen könnten. Zum zweiten ermöglicht das Verfahren die Auswahl bestimmter Ziel-Nucleinsäuren, wodurch große Mengen an DNA und RNA abgetrennt werden, die zur Bildung eines unspezifischen Hintergrunds bei nachfolgenden Zielnachweisverfahren beitragen können.
- In einem dritten Aspekt umfaßt die Erfindung ein markiertes Nucleinsäure-Analogon, umfassend ein Nucleinsäure-Analogon gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, das über die chelatbildende Einheit ein Metall-Ion als Markierung an sich chelatisiert aufweist oder eine Markierungseinheit aufweist, die über ein Metall-Ion, das durch die chelatbildende Einheit chelatisiert ist, daran gebunden ist.
- Das Metall-Ion ist vorzugsweise eine Radiomarkierung wie etwa ¹¹¹Indium oder &sup9;&sup9;Technetium oder eine Fluoreszenzmarkierung wie z. B. Europium oder Terbium.
- Die Verbindungen und Methoden der vorliegenden Erfindung ergeben ein sehr schnelles Verfahren zum Analysieren von Nucleinsäuren. Die Hybridisierung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen kann herangezogen werden, um sehr wirkungsvolle Assays mit hoher Spezifität zu definieren. Durch Anwendung von Bedingungen mit wenig Salz ergibt sich ein Verfahren zur Analyse auch solcher Nucleinsäuren, die Haarnadelstrukturen enthalten. Es erlaubt des weiteren die Trennung von Nucleinsäuren, die sich nur durch ein Nucleotid unterscheiden. Die Verbindungen sind sehr leicht herzustellen, da man sich zur Bindung des Komplexbildners an das Gerüst der Peptid-Chemie bedienen kann.
- Des weiteren können die vorliegenden Verbindungen wirksam als markierte Sonden bei der Analyse von PCR-Produkten verwendet werden, da sie sehr wirkungsvoll mit den gegensinnigen Strängen konkurrieren. Weiterhin zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die hervorragende Eigenschaft, daß auch große RNAs abgefangen und/oder bestimmt werden können.
- Die Nucleinsäure-Analoga gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung lassen sich herstellen, indem zunächst eine PNA mit Hilfe der in WO 92/20703 beschriebenen Festphasen-Techniken synthetisiert wird, um eine Boc-terminierte PNA zu ergeben, die mit ihrem Carboxy-Ende an einen festen Träger gebunden ist. Die PNA läßt sich dann verlängern durch Abspalten der Boc-Gruppe, um einen Ausgangspunkt für eine standardmäßige Boc- oder Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese zu ergeben, wobei die erforderlichen chelatbildenden Aminosäuren mit Hilfe des Linkers 6-Aminohexansäure angefügt werden. Die Schutzgruppen können dann entfernt und das Produkt mit Hilfe des Low-High TFMSA-Verfahrens vom Harz abgespalten werden. Das Rohprodukt kann dann mittels präparativer HLPC (geeignete Bedingungen wären: Umkehrphase-C&sub1;&sub8;, Elution mit einem Gradienten aus A: 0,1% TFA in Wasser und B: 0,1%, 10% Wasser, 89% Acetonitril).
- Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen erläutert.
- Fig. 1 ist eine Balkengraphik, welche die Radioaktivitätszählungen zeigt, die bei den in Beispiel 1 beschriebenen Messungen erhalten wurden.
- Fig. 2 zeigt die Flexibilität des PNA-Aufbaus im Hinblick auf Linker oder Anhängsel.
- Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Schmelzkurven von der Konzentration an Natrium-Ionen.
- Fig. 4A zeigt die Sequenz eines intramolekularen Stammbereichs eines Oligonucleotids. Der PNA-Zielort ist markiert. In Fig. 4B sind die Ergebnisse von Retentionsexperimenten unter verschiedenen Salz-Bedingungen gezeigt.
- In Fig. 5 ist die Wirksamkeit des Abfangens von Oligonucleotiden durch die PNAs gezeigt.
- In Fig. 6 ist die Spezifität des Abfangens von in vitro erzeugten RNAs durch PNA gezeigt.
- In den folgenden Beispielen hat die verwendete PNA ein Aminoethylglycin-Gerüst und wird mit Hilfe von Verfahren hergestellt, die im einzelnen in WO 92/20703 beschrieben sind. Die dort hinsichtlich der PNAs verwendete Nomenklatur wird auch hier angewandt.
- Die PNA:
- Boc-NH-TG(Z)T. A(Z)C(Z)G(Z).TC(Z)A(Z).C(Z)A(Z)A(Z).C(Z)TA(Z)-CONH-Harz wurde aufgebaut. Diese wurde wie folgt zur markierten PNA:
- H-His&sub5;-NH(CH&sub2;)&sub5;CONH-TGTACGTCACAACTA-NH&sub2; verlängert:
- Die geschützte PNA auf MBHA-Harz wurde mittels Boc-Festphasensynthese mit dem Linker 6-Aminohexansäure verknüpft.
- Nach Boc-Schutzgruppenabspaltung am Amino-Terminus wurde das His&sub5;-Motiv mit Hilfe der. Fmoc-Strategie aufgebaut. Fmoc-His(Trt)-OH wurde 2 · 1 h mit Diisopropylcarbodiimid in DCM/DMF angekuppelt. Die Fmoc-Gruppe wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin in DMF (1 · 5 min und 1 · 10 min) abgespalten. Ankuppeln und Fmoc-Schutzgruppenabspaltung wurden noch viermal wiederholt. Die Trityl-Schutzgruppe wurde mit 50% TFA in DCM (2 · 30 min) entfernt. Schließlich wurden die Z-Gruppen entfernt und das Produkt mit Hilfe des üblichen HP-Verfahrens vom Harz abgespalten. Das rohe Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt.
- Die mit dem Anhängsel versehene PNA wurde mit komplementären bzw. nichtkomplementären ³²P-markierten Oligonucleotiden in einem 20 ul Reaktionsvolumen, enthaltend 20 mM NaH&sub2;PO&sub4; (pH 8,0) und 0,5 M NaCl inkubiert. Das Inkubieren wurde bei Raumtemperatur über 15 min durchgeführt. Am Ende der Inkubationszeit wurden 180 ul Puffer 1 (20 mM NaH&sub2;PO&sub4; (pH 8,0), 0,5 M NaCl) zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde auf eine 0,22 uM Duraphore-Zentrifugiersäule (Millipore) aufgegeben, die mit 200 ul Ni-NTA-Agarose (Pharmacia) gepackt war. Die Säule wurde 30 Sekunden lang bei 1000 U/min zentrifugiert, und die Radioaktivität im Durchlauf (als Sup bezeichnet) wurde mit einem Geiger-Müller- Rohr gezählt.
- Die Säule wurde dreimal mit 200 ul Puffer 1 gewaschen, und die Radioaktivität im Durchlauf (bezeichnet als Wäsche I- IV) wurde gezählt. Die Säule wurde mit 200 ul Puffer 1 beschickt, 5 min bei 95ºC inkubiert und 30 Sekunden lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Die Radioaktivität im Durchlauf (als Elu I-II bezeichnet) wurde gezählt.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Wie gezeigt, verschwinden sämtliche nichtkomplementären Oligonucleotide (schwarze Balken) bei der anfänglichen Wäsche von der Säule, während das komplementäre Oligonucleotid (weiße Balken) auf der Säule verbleibt, bis die Bindung zur PNA durch Wärmedenaturierung aufgebrochen wird. Somit ist gezeigt, daß PNA, die ein His&sub5;-Anhängsel trägt, als wirksames Hilfsmittel bei der Reinigung von Nucleinsäuren fungieren kann, die komplementäre Zielsequenzen enthalten.
- Ein PNA-Oligomer ("Oligomer 1") der Sequenz:
- Ado-TGT. ACG. TCACAACTA
- wurde aufgebaut, worin "Ado" der Linker 8-Amino-3,6- dioxaoctansäure ist, der über seinen-Carbonsäure-Terminus an den Amino-Terminus der PNA-Sequenz geknüpft ist. Das PNA-Oligomer 1 wurde mit Hilfe des in WO 92/20703 beschriebenen Festphasensyntheseverfahrens auf MBHA-Harz (150 mg, Beladung: 0,1 mmol/g) aufgebaut. Das Produkt wurde vom Harz abgespalten. Das PNA-Oligomer 1 (0,1 mg) wurde in 1 ml 50 mM NaHCO&sub3;-Puffer, pH 8,3, enthaltend 0,9% NaCl, gelöst und mit 0,2 mg des Europium-Salzes von N-(4-Isothiocyanatophenyl)methyldiethylentriamin-N, N,N",N"-tetraessigsäure vermischt. Die Markierungsreaktion wurde 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur ablaufen gelassen, und das Produkt wurde mittels Gelchromatographie (G-25) gereinigt.
- Das PNA-Oligomer 1 wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, doch wurde vor der Abspaltung vom Harz die terminale Amino-Gruppe des Ado-Linkers mit Trifluoressigsäure von der Boc-Schutzgruppe befreit und dann mit Diethylentriaminpentaessigsäuredianhyrid (200 mg in 25 ml DMF) gekuppelt. Das Produkt wurde mit Hilfe des üblichen TFMSA-Verfahrens vom Harz abgespalten und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Das Produkt wurde in Wasser (1 mg/ml) gelöst und einer 10 mM Lösung von Europiumchlorid in Wasser zugesetzt, um den Europium-Komplex zu bilden. Überschüssiges Europiumchlorid wurde mittels Filtration durch eine Sephadex G-25-Säule abgetrennt.
- Die Tm-Werte der PNA/DNA-Duplexe wurden spektrophotometrisch bei 260 nm in den angegebenen Puffern bestimmt, die 1,5 uM PNA und 1,5 uM DNA enthielten.
- Bei den verwendeten Abkürzungen und Symbolen handelt es sich um die übliche Oligopeptid/Nucleotid-Nomenklatur: H-. von Schutzgruppen befreite terminale Amino-Gruppe; -NH2: C-terminale Amino-Gruppe; Boc: tert-Butylcarbonyl; Fmoc: 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl; HBTU: O-Benzotriazol-1-yl- N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorophosphat; Ado: 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure; Gly: Glycin-Rest; PNA-Monomere: PNAD 153 ((His)&sub6;-(ado)&sub3;TCTCAACAGCGGTAA-NH&sub2;) und PNAD 154 ((His)&sub6;-(ado)&sub3;GAAGGTAACTGGCTT-NH&sub2;) wurden von Biosearch (MA) erworben.
- Die folgenden PNAs wurden synthetisiert: PNAD 103 (H- TGTACGTCACAACTA-NH&sub2;), PNAD 106 (H-(ado)&sub3;-TGTACGTCACAACTA- NH&sub2;), PNAD 111A ((His)&sub6;-(ado)&sub3;-TGTACGTCACAACTA-Gly-NH&sub2;), PNAD 113 ((His)&sub6;-(ado)&sub3;-GATCCTGTACGTCACAACTA-Gly-NH&sub2;), PNAD 133 ((His)&sub6;-(ado)&sub3;-GGCTGCAGGAATTCGA-Gly-NH&sub2;) sowie 3 bis 8 Histidin-Reste enthaltende Derivate von PNAD 111. Die PNA- Segmente mit den ado-Linkem wurden manuell mit Hilfe des verbesserten Festphasen-PNA-Syntheseverfahrens in Anlehnung an die Boc-Strategie synthetisiert. Die Ankupplungen erfolgten durch Zugabe von HBTU zu den PNA-Monomeren, und Acetanhydrid wurde als Capping-Reagens verwendet. Die Boc- Schutzgruppen wurden durch Zugabe von TFA/m-Cresol (95/5) entfernt. Die Histidin-Segmente wurden mit Hilfe der Fmoc- Strategie synthetisiert, und das molare Verhältnis von Fmoc-His(Trt)-OH/Diisopropylcarbodümid war das gleiche wie das Verhältnis von PNA-Monomere/HBTU bei den PNA-Segment- Synthesen. Bei den Ankupplungen wurde DMF/DCM verwendet, und die Schutzgruppenabspaltung wurde durch Zugabe von 20% Piperidin in DMF (2 · 10 min) durchgeführt. Bei der Polyhistidin-Synthese erfolgte kein Capping nach den Ankupplungen. Schließlich wurden die Trityl-Schutzgruppen durch Behandeln mit TFA (3 · 30 min) entfernt, und die PNAs wurden von den Schutzgruppen befreit und mit Hilfe des standardmäßigen Low-High TFMSA-Verfahrens vom Harz abge spalten. Die Roh-PNAs wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
- 5 ul der His-PNA-Sonden (5 OD&sub2;&sub6;&sub0;/ml) wurden mit 10 ul P-markierten DNA-Oligonucleotids (0,2 uM) oder 10 ul ³²Pmarkierter, in vitro transkribierter RNA, 50 ul 8 M Harnstoff, 100 ul Selektionspuffer (20 mM Na&sub2;HPO&sub4;, (pH 8,0), 500 mM NaCl und 0,1% Triton X-100) und 35 ul Wasser in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt. Die Lösung wurde 5 min lang auf 95ºC erhitzt und 10 min in einem Heizblock bei der angegebenen Temperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurde eine 400 ul-Probe Ni-NTA-Harz (Quiagen) auf eine Eppendorf- Zentrifugiersäule (Durapore 0,45 um, Millipore) aufgebracht und 30 s lang bei 200 U/min zentrifugiert, um den Ni-NTA- Aufbewahrungspuffer zu entfernen. Die Säule wurde dreimal mit 200 ul Wasser gewaschen und in 200 ul Selektionspuffer äquilibriert. Nach Ablauf der Hybridisierungszeitspanne wurde die Mischung auf die Säule aufgebracht und 30 s lang bei 200 U/min zentrifugiert. Die Säule wurde mehrmals mit 200 ul Selektionspuffer gewaschen, um unspezifisch gebundene Nucleinsäuren zu entfernen. Schließlich wurden die gereinigten Ziel-Nucleinsäuren aus der Säule eluiert durch 1) Zugabe von 200 ul Selektionspuffer auf die Säule, 2) Sminütiges Inkubieren der Säule in einem Heizblock bei 95ºC, und 3) 30 s Zentrifugieren bei 200 U/min.
- Die Radioaktivität in den Säulenfraktionen wurde entweder mit einem Geiger-Müller-Zähler oder einem Szintillationszähler gezählt. Bei Durchführung der Analyse mittels Gelelektrophorese wurde die Nucleinsäure in den Säulenfraktionen durch Zugabe von 5 ug CarriertRNA, 1 Volumen 4 M Ammoniumacetat und 2 Volumina 96% Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte Nucleinsäure wurde durch 30minütiges Zentrifugieren bei 20 000 U/min gewonnen, unter Vakuum getrocknet, in Formamid-Beschickungspuffer wieder gelöst und auf denaturierende 16% Polyacrylamid-Gele aufgebracht.
- Nach Elektrophorese wurden die Gele einer Autoradiographie unterzogen.
- 20 umol der Oligonucleotide wurden mit γ-³²P-ATP und T4- Polynucleotidkinase wie beschrieben radioaktiv markiert. Zur Entfernung von nicht eingebautem γ-³²P-ATP wurden die markierten Oligonucleotide durch Zugabe von 5 ug CarriertRNA, 1 Volumen 4 M Ammoniumacetat und 2 Volumina 96% Ethanol ausgefällt. Die ausgefällten Oligonucleotide wurden durch Zentrifugieren gewonnen, unter Vakuum getrocknet und in 100 ul Wasser gelöst. Es wurden zwei Fällungen durchgeführt, und die markierten Oligonucleotide wurden in Wasser gelöst.
- Das Plasmid (pd62KS-4) wurde aufgebaut durch Klonieren der komplementären Oligonucleotide (5'-TCGAGGCAACCGAATAGTTGT- GACGTACATTTTTTA-3 und 5'-AGCTTAAAAAATGTACGTCACAACTATTCG- GTTGCC-3') in das mit XhoI und HindIll abgedaute Bluescript KS+plasmid (Stratagene). Das Plasmid wurde mit PvuII linearisiert und zur Herstellung markierter Runoff-RNA- Transkripte mit 257 nt. und 290 nt. (Kontrolle) eingesetzt, wobei entweder T3- oder T7-RNA-Polymerase und α-³²P-CTP verwendet wurde wie beschrieben in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y..
- Das Plasmid (pd62KS-2) wurde in zwei Klonierungsdurchgängen aufgebaut. Zum ersten wurden die komplementären Oligonucleotide (5'-GATCCTGTACGTCACAACTA-3' und 5'-GATCTAGTTGT- GACGTACAG-3') in das mit BamHI abgedaute Bluescript KS+Plasmid (Stratagene) kloniert, um das Plasmid pd62RS zu ergeben. Zum zweiten wurden die komplementären Oligonucleotide (5'-GATCCGGCAACCGG-3' und 5'-AATTCCGGTTGCGG-3') in das mit BamIH und EcoRI abgedaute pd62KS kloniert, um das Plasmid pd62KS-2 zu ergeben. Das Plasmid (pd62KS-2) wurde mit SspI linearisiert und zur Herstellung markierter Runoff-RNA-Transkripte mit 2224 nt. eingesetzt, wobei T7- RNA-Polymerase und α-³²P-CTP verwendet wurden. Nicht eingebautes α-³²P-CTP wurde durch zwei aufeinanderfolgende Fällungen mit Ammoniumacetat/Ethanol wie vorstehend beschrieben abgetrennt. Die Qualität des RNA-Transkripts wurde wie bei Sambrook et al. beschrieben, siehe oben, mittels Elektrophorese durch Formaldehyd-Agarose-Gele und anschließende Autoradiographie analysiert. Es wurde gefunden, daß die vorherrschenden Transkripte von beiden Plasmid-Matrizen ihre volle Länge aufwiesen.
- Um zu bestimmen, ob die Hybridisierungseigenschaften eines PNA-Oligomers durch die Gegenwart eines Oligohistidin- Anhängsels beeinflußt wird, haben wir eine His&sub6;-PNA (PNAD 111) synthetisiert, bei der das His&sub6;-Motiv von der PNA- Domäne durch drei "ado"-Linker getrennt ist. Als Kontrolle haben wir die Nicht-His-PNA (PNAD 106, ohne Histidin-Reste) und die native PNA (PNAD 103; ohne Histidin-Reste und ado- Linker) synthetisiert. Die PNAs wurden jeweils getrennt an die Oligonucleotide hybridisiert, die entweder einen komplementären oder einen um eine einzige Base fehlgepaarten PNA-Zielort enthielten, und die Schmelztemperatur eines jeden Duplex (Tm) wurde spektrophotometrisch bestimmt. Um die normalerweise bei Hybridisierungsexperimenten angetroffene Situation (d. h., der Sondenzielort ist Teil einer großen Nucleinsäure) nachzuahmen, wurden die Oligonucleotide als 40mere synthetisiert, die den 15 nt.-PNA-Zielort in der Mitte aufwiesen. Wie in Fig. 2 gezeigt, hat weder das Anfügen der ado-Linker noch des His&sub6;-Anhängsels irgendeine signifikante Wirkung auf die Affinität oder Spezifität der PNA. So haben die zwischen dem voll komplementären Oligonucleotid und jeder der drei PNAs gebildeten Duplexe im wesentlichen ähnliche Tm-Werte. Ebenso sind die Tm-Werte für die verschiedenen, um eine einzige Base fehlgepaarten Komplexe recht ähnlich.
- Für eine optimale Abfangwirksamkeit muß die PNA genügend Histidin-Reste tragen, um feste Bindung an das Ni-NTA-Harz zu ergeben. Zur Bestimmung der Anzahl Histidin-Reste, die optimales Abfangen ergeben, wurden Derivate von PNAD 111 synthetisiert, die 3 bis 8 Histidine tragen, und unter Verwendung des komplementären markierten 40mer- Oligonucleotids wie oben analysiert. Wie in Fig. 2 gezeigt, verbessert sich die Abfangwirksamkeit bis zu 5-6 Histidin-Resten. Weiteres Erhöhen der Anzahl Histidin-Reste auf 7 oder 8 ergibt keine Steigerung der Abfangwirksamkeit. Somit wurde das ursprünglich gewählte His&sub6;-Anhängsel bei allen weiteren Experimenten eingesetzt.
- Es ist bereits gezeigt worden (Nature 365, 566-568 (1993)), daß sich die Wärmebeständigkeit eines PNA/DNA-Duplex leicht erhöht, wenn die Ionenstärke des Puffers von 100 mM auf 10 mM Na&spplus; herabgesetzt wird. Bei Verwendung als Hybridselektionssonde ist diese Eigenschaft der PNA sehr nützlich, da sie Hybridisierung unter Bedingungen sehr geringer Salz-Konzentrationen erlaubt, die Nucleinsäure- Strukturen, welche die Sondenbindung stören könnten, selektiv destabilisieren. Die veröffentlichte Analyse war auf einen voll komplementären PNA/DNA-Duplex beschränkt und befaßte sich daher nicht mit der Frage, ob die Spezifität der PNA/DNA-Duplexbildung unter Bedingungen geringer Salz- Konzentration erhalten bleibt. Um dies zu bewerten, haben wir die Tm-Werte vollkommen fehlerlos gepaarter und um eine einzige Base fehlgepaarter His&sub6;-PNA/DNA-Duplexe bei verschiedenen Salz-Konzentrationen gemessen. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde die bereits berichtete Affinitätszunahme des voll komplementären PNA/DNA-Duplex mit abnehmender Salz- Konzentration von uns bestätigt. So beobachteten wir innerhalb des angewandten Na&spplus;-Konzentrationsbereichs (1 bis 540 mM) eine Affinitätszunahme von etwa 12ºC. Ein ähnliches Verhalten wurde bei Duplexen beobachtet, die Einzelbasen- Fehlpaarungen enthielten, was zeigt, daß die Spezifität der PNAs über den gesamten Bereich der überprüften Ionenstärke erhalten blieb. Zur Veranschaulichung der Destabilisierung von Nucleinsäure-Strukturen bei ähnlichen Salzbedingungen enthält Fig. 3 die Tm-Werte für die entsprechenden PNA/DNA-Duplexe. Bei einer Konzentration von 2 mM Na&spplus; ergaben die komplementären DNAs innerhalb eines Temperaturbereichs von 10-90ºC keine Schmelzkurven, was darauf hindeutet, daß keine Hybridisierung stattfindet. Ein Oligonucleotid wurde so konzipiert, daß der gesamte PNA-Zielort eine Seite eines intramolekularen Stammbereichs bildet (Fig. 4A). Das markierte Oligonucleotid wurde bei Raumtemperatur in Gegenwart der komplementären His&sub6;-PNA (PNAD 111) in beiden Puffern mit wenig Salz (1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 8,0, 500 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 und 2 M Harnstoff) inkubiert, und das Selektionsverfahren wurde wie vorher durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 4B dargestellt. Bei Durchführung der Selektion in Puffer mit viel Salz (weiße Balken), wobei die intramolekulare Stamm-/Haarnadel-Struktur stabil sein sollte, betrug die beobachtete Abfangwirksamkeit etwa 3%. Dagegen belief sich die Abfangwirksamkeit auf etwa 56%, wenn die Hybridisierung in Puffer mit wenig Salz (schwarze Balken) durchgeführt wurde, wobei die Stamm-/Haarnadel- Struktur entweder sehr instabil oder nicht vorhanden sein sollte.
- Die His&sub6;-PNA ermöglicht die selektive Reinigung komplementärer Oligonucleotide gegen einen Hintergrund von Oligonucleotiden, die Einzelbasen-Fehlpaarungen der PIA enthalten
- Die selektive Reinigung von Zielsequenzen, die sich nur durch ein Basenpaar unterscheiden, stellt die schwierigste Aufgabe bei jedem Hybridselektionsverfahren dar. Um die Leistungsfähigkeit des His&sub6;-PNA-Selektionssystems in dieser Hinsicht zu bewerten, haben wir eine Mischung aus Oligonucleotiden verwendet, die entweder komplementär zur PNA waren, oder eine Einzelbasen-Fehlpaarung enthielten, oder eine gänzlich nichtkomplementäre Sequenz aufwiesen. Ein 20facher molarer Überschuß an His&sub6;-PNA wurde der Mischung zugesetzt, und die Hybridisierung wurde 10 min lang bei 55ºC durchgeführt. Nach dem ersten Selektionsdurchgang auf der Ni-NTA-Säule wurde die gleiche Menge frischer PNA einer Hälfte des Eluats aus der Säule im Durchlauf zugesetzt, und die Wäschen und Eluate wurden dann mit Ethanol ausgefällt und durch Gelelektrophorese auf einem denaturierenden 16% Polyacrylamid-Gel und anschließende Autoradiographie analysiert. Fig. 5 zeigt, daß ein Großteil des nichtkomplementären Oligonucleotids (mittlere Bande) im ersten Selektionsdurchgang entfernt wurde - ein Hinweis dafür, daß die unspezifische Bindung von Oligonucleotiden an die Säule sehr gering war. Gleichzeitig wurde eine beträchtliche Anreicherung komplementären Oligonucleotids (obere Bande) gegenüber dem um eine einzige Base fehlgepaarten Oligonucleotid (untere Bande) erzielt. Beim Ablesen des Autoradiogramms zeigte sich, daß ca. 72% des komplementären Oligonucleotids und 7% des um eine einzige Base fehlgepaarten Oligonucleotids sich im Eluat wiederfanden, was einem Reinigungsfaktor von 10 entspricht. Im zweiten Selektionsdurchgang wurde die selektive Anreicherung weiter verstärkt. So ist die vorherrschende Spezies, die im Eluat II anzutreffen ist, das komplementäre Ziel- Oligonucleotid. Beim Ablesen des Autoradiogramms zeigte sich wiederum ein Anreicherungsfaktor von etwa 10, was einem Gesamtreinigungsfaktor in den beiden Selektionsdurchgängen von 100 entspricht.
- Große, einsträngige RNAs können mit dem His&sub6;-PNA-System selektiert werden
- Wir haben die Beziehung zwischen Abfangwirksamkeit und Größe der Ziel-Nucleinsäure analysiert. Es wurden markierte Runoff-RNA-Transkripte mit 257 nt. und 2224 nt., die Ziel- Sequenzen für verschiedene (His)&sub6;-PNAs enthielten, und eine Kontroll-RNA mit 290 nt., die keinen PNA-Zielort enthielt, in vitro unter Verwendung linearisierter Plasmide als Matrize synthetisiert. Die RNAs wurden jeweils entweder ohne (His)&sub6;-PNAs oder mit einer oder mehreren verschiedenen (His)&sub6;-PNAs inkubiert, und die Selektion wurde wie vorher durchgeführt. Wie in Fig. 6 gezeigt, wird im wesentlichen keine RNA auf der Säule bei den Reaktionen abgefangen, bei denen entweder die 290 nt.-Kontroll-RNA in Kombination mit den nichtkomplementären (His)&sub6;-PNAs verwendet wird (Reihe 1 und 2), oder bei denen die (His)&sub6;-PNAs ausgeschlossen sind (Reihe 3 und 7). Dagegen wird spezifisches Abfangen beobachtet, wenn die RNAs mit 257 nt. und 2224 nt. mit den komplementären (His)&sub6;-PNAs inkubiert werden. Im Fall der 257 nt.-RNA beträgt die beobachtete Abfangwirksamkeit etwa 45% bei Verwendung von Einzel-(His)&sub6;-PNAs (Reihe 4 und 5).
- Die Abfangwirksamkeit verringert sich mit zunehmender Größe der Ziel-RNA. So ist die PNAD 111, die zu beiden RNAs komplementär ist, etwa doppelt so wirksam bei der Selektion der 257 nt.-RNA (44,0%, Reihe 4) als bei der der 2224 nt.- RNA (25%, Reihe 8). Ähnliche Unterschiede in den Abfangwirksamkeiten der 257- und 2224 nt.-RNA-Transkripte ergeben sich auch bei der Mehrheit der anderen überprüften PNAs (PNAD 133: Reihe 5; PNAD 113, Reihe 9; und PNAD 154, Reihe 11). Die PNAD 153 (Reihe 10) ist jedoch etwa 50% wirksamer beim Abfangen des 2224-RNA-Transkripts als die anderen PNAs. Der Grund für diese erhöhte Abfangwirksamkeit ist unklar.
- Die Lage des PNA-Zielorts in der RNA scheint keinen signifikanten Einfluß auf die Abfangwirksamkeiten zu haben. So sind PNAD 111 (Reihe 8) und PNAD 154 (Reihe 11), deren Zielsequenzen sich am Ende bzw. in der Mitte der 2224-RNA befinden, gleich wirksam beim Abfangen, und dies gilt auch für die beiden gegen das 257 nt.-RNA-Transkript gerichteten PNAs (PNAD 111, Reihe 4, und PNAD 133, Reihe 5).
- Die Größe der PNA-Domäne in der (His)&sub6;-PNA-Chimäre scheint keinen Einfluß auf die Abfangwirksamkeit zu haben. So ist die PNAD 111 (eine 15mere PNA) bei der Selektion der 2224 nt.-RNA genausogut wie ihr um 5 Basen verlängertes 20meres Derivat PNAD 113 (vergleiche Reihe 8 und 9). Dies deutet darauf hin, daß die schwache Verknüpfung beim Selektionsvorgang entweder die Verknüpfung zwischen dem (His)6-Seqment und dem chelatisierten Ni²&spplus;-Ion oder die Verknüpfung zwischen dem Ni²&spplus;-Ion und dem NTA-Molekül auf dem Harz ist. Dieser Streitpunkt wird durch den Befund verstärkt, daß sich die Abfangwirksamkeiten verbessern, wenn zwei oder drei (His)&sub6;-PNAs gemeinsam verwendet werden, wodurch mehr Befestigungspunkte für den PNA/RNA-Komplex am Ni-NTA Harz bereitgestellt werden. Verwendet man beispielsweise 3 verschiedene (His)&sub6;-PNAs, so erhöht sich die Abfangen Wirksamkeit für die 2224 nt.-RNA auf 64,9% (Reihe 15) gegenüber etwa 25%, wenn jede (His)&sub6;-PNA für sich eingesetzt wird.
Claims (15)
1. Nucleinsäure-Analogon, umfassend einen polymeren
Strang, der eine Sequenz aus Liganden enthält, die an
ein Gerüst gebunden sind, das aus verknüpften
Gerüsteinheiten besteht, wobei das Analogon imstande ist, an
eine Nucleinsäure komplementärer Sequenz zu
hybridisieren, des weiteren umfassend eine chelatbildende
Einheit, die wenigstens ein Metall-Ion durch Chelatbildung
binden kann.
2. Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 1, wobei das Gerüst
ein Polyamid-, Polythioamid-, Polysulfinamid- oder
Polysulfonamid-Gerüst ist.
3. Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 2, wobei die
verknüpften Gerüsteinheiten Peptid-gebundene
Aminosäure-Einheiten sind.
4. Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 2 oder 3, wobei die
chelatbildende Einheit am N-terminalen Ende vorliegt.
5. Nucleinsäure-Analogon nach irgendeinem der vorstehenden
Ansprüche, wobei die chelatbildende Einheit eine
Sequenz aus Peptid-gebundenen Aminosäuren umfaßt.
6. Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 5, wobei die
Aminosäure-Sequenz -His, Gly, Asp oder -(His)&sub6; ist.
7. Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 1, wobei die
chelatbildende Einheit ein polysubstituiertes
Carbonsäure-Amin ist.
8. Nucleinsäure-Analogon nach irgendeinem der vorstehenden
Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon eine
Peptidnucleinsäure ist, bei der das Gerüst ein Polyamid-
Gerüst ist, wobei jeder Ligand direkt oder indirekt an
ein Aza-Stickstoff-Atom im Gerüst gebunden ist, und die
Liganden tragenden Stickstoff-Atome vorwiegend durch 4
bis 8 dazwischenliegende Atome voneinander im Gerüst
getrennt sind.
9. Nucleinsäure-Analogon nach irgendeinem der vorstehenden
Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon an eine
doppelsträngige Nucleinsäure hybridisieren kann, in der
ein Strang eine zu dem Analogon komplementäre Sequenz
aufweist, um so den anderen Strang von diesem einen
Strang zu verdrängen.
10. Nucleinsäure-Analogon nach irgendeinem der vorstehenden
Ansprüche, wobei das Nucleinsäure-Analogon die
allgemeine Formel I aufweist:
worin:
n wenigstens 2 ist;
jedes der L¹-Ln unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkanoyl,
natürlich vorkommenden Nucleobasen, nicht natürlich
vorkommenden Nucleobasen, aromatischen Einheiten,
DNAintercalierenden Agenzien, Nucleobase-bindenden
Gruppen, heterocyclischen Einheiten, Reporter-Liganden und
der chelatbildenen Einheiten;
jedes der C&sub1;-Cn (CR&sup6;R&sup7;)y ist, wobei R&sup6; Wasserstoff ist
und R&sup7; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den
Seitenketten natürlich vorkommender α-Aminosäuren, oder
R&sup6; und R&sup7; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe
bestehend aus Wasserstoff, (C&sub2;-C&sub6;)-Alkyl, Aryl, Aralkyl,
Heteroaryl, Hydroxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkoxy, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkylthio,
NR³R&sup4; und SR&sup5;, wobei R³ und R&sup4; wie nachstehend definiert
sind, und R&sup5; Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl, hydroxy-,
alkoxy- oder alkylthiosubstituiertes (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl ist,
oder R&sup6; und R&sup7; zusammengenommen ein alicyclisches oder
heterocyclisches System vervollständigen;
jedes der D¹-Dn (CR&sup6;R&sup7;)z ist, wobei R&sup6; und R&sup7; wie
vorstehend definiert sind;
y und z jeweils null oder eine ganze Zahl von 1 bis 10
sind, wobei die Summe y + z 2 bis 10 ist;
G¹-Gn jeweils -NR³CO-, -NR³CS-, -NR³SO- oder -NR³SO&sub2;- in
beiden Orientierungen sind, wobei R³ wie nachstehend
definiert ist;
jedes der A¹-An und B¹-Bn so ausgewählt ist, daß:
(a) A eine Gruppe der Formel (IIa), (IIb), (IIc) oder
(IId) ist, und B N oder R³N&spplus; ist; oder
(b) A eine Gruppe der Formel (IId) ist, und B CH ist;
worin:
X O, S. Se, NR³, CH&sub2; oder C(CHg)2 ist;
Y eine Einfachbindung, 0,5 oder NR&sup4; ist;
p und q jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5
sind, wobei die Summe p + q nicht größer als 10 ist;
r und s jeweils null oder ganze Zahlen von 1 bis 5
sind, wobei die Summe r + s nicht größer als 10 ist;
R¹ und R² jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der
Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, das
hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiert sein
kann, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio, Amino und Halogen;
und
R³ und R&sup4; jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der
Gruppe bestehend aus Wasserstoff, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl,
hydroxy- oder alkoxy- oder alkylthiosubstituiertem
(C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, Hydroxy, Alkoxy, Alkylthio und Amino;
Q -CO&sub2;H, -CONR'R", -SO&sub3;H oder -SO&sub2;NR'R" oder ein
aktiviertes Derivat von -CO&sub2;H oder -SO&sub3;H ist; und
I -NR'R " ' ist, wobeiR' und R " unabhängig ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl,
Schutzgruppen für Amino, Reporter-Liganden,
intercalierenden Agenzien, Chelatbildnern, Peptiden, Proteinen,
Kohlenhydraten, Lipiden, Steroiden, Nucleosiden,
Nucleotiden, Nucleotiddiphosphaten, Nucleotidtriphosphaten,
Oligonucleotiden, darunter sowohl Oligoribonucleotide
als auch Oligodeoxyribonucleotide, Oligonucleosiden
sowie löslichen und nichtlöslichen Polymeren, und -R'''
eine chelatbildende Einheit ist.
11. Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 10, wobei das
Nucleinsäure-Analogon eine Verbindung der allgemeinen
Formel III, IV oder V umfaßt:
Formel V
worin:
L jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus Wasserstoff, Phenyl, heterocyclischen
Einheiten, natürlich vorkommenden Nucleobasen und nicht
natürlich vorkommenden Nucleobasen;
R&sup7; jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten natürlich
vorkommender α-Aminosäuren;
n ein ganze Zahl größer 1 ist;
k, 1 und m jeweils unabhängig null oder ein ganze Zahl
von 1 bis 5 sind;
p jeweils null oder 1 ist;
Rh OH, NH&sub2; oder -NHLysNH&sub2; ist; und
R¹ eine chelatbildende Einheit ist.
12. Verfahren zum Einengen einer Lösung eines Nucleinsäure-
Analogons nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11,
umfassend das Abfangen des Nucleinsäure-Analogons aus
einem ersten Volumen einer Lösung an einen festen
Träger, der daran gebundene, chelatierbare Metall-Ionen
aufweist, Entfernen des festen Trägers und der
abgefangenen Nucleinsäure aus der Lösung und Eluieren des
Nucleinsäure-Analogons vom festen Träger in eine
Flüssigkeitsmenge, so daß sich ein zweites Volumen
einer Lösung des Nucleinsäure-Analogons ergibt, das
kleiner ist als das erste Volumen der Lösung.
13. Markiertes Nucleinsäure-Analogon, umfassend ein
Nucleinsäure-Analogon nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis
11, das über die chelatbildende Einheit ein Metall-Ion
als Markierung an sich chelatiert aufweist oder eine
Markierungseinheit aufweist, die über ein Metall-Ion,
das durch die chelatbildende Einheit chelatiert ist,
daran gebunden ist.
14. Markiertes Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 13,
wobei das Metall-Ion eine Radiomarkierung oder eine
Fluoreszenzmarkierung ist.
15. Verfahren zum Abfangen einer Nucleinsäure an einer
festen Phase, umfassend die Schritte:
1. - Hybridisieren der Nucleinsäure an ein
Nucleinsäure-Analogon nach Anspruch 1, das eine
chelatbildende Einheit trägt,
- Chelatieren eines Metall-Ions an die
chelatbildende Einheit, und
- Abfangen des resultierenden Komplexes an der
festen Phase, die Gruppen trägt, welche das
Metall-Ion chelatieren können, oder
2. - Hybridisieren der Nucleinsäure an ein
Nucleinsäure-Analogon, das eine ein Metall-Ion
chelatierende Einheit trägt, und
- Abfangen des Komplexes an der festen Phase, die
Gruppen trägt, welche das Metall-Ion chelatieren
können, oder
3. - Hybridisieren der Nucleinsäure an ein
Nucleinsäure-Analogon, das eine chelatbildende
Einheit trägt, und
- Abfangen des Hybrids an der festen Phase, die
Metall-Ionen trägt, die von der chelatbildenden
Einheit chelatiert werden können, oder
4. - Hybridisieren der Nucleinsäure an ein
Nucleinsäure-Analogon, das eine chelatbildende
Einheit trägt, die ein an die feste Phase
gebundenes Metall-Ion chelatiert.
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