CN112876580B - 一种腐殖酸去除剂、其制备方法及应用 - Google Patents

一种腐殖酸去除剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腐殖酸去除剂、其制备方法及应用，涉及土壤修复技术领域。腐殖酸去除剂是通过在改性葡聚糖上负载金属离子制备而得；其中，改性葡聚糖为乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖，金属离子选自碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子中的至少一种。制备得到对腐殖酸去除效果非常好的腐殖酸去除剂，能够有效去除土壤中的腐殖酸，且为免离心土壤样本DNA的提取提供了可能性。本发明实施例中提供的腐殖酸去除剂可以在土壤核酸提取过程中得到应用，以获得高质量的土壤基因组DNA，且提出过程无需离心，操作简便易行。

Description

一种腐殖酸去除剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及土壤修复技术领域，且特别涉及一种腐殖酸去除剂、其制备方法及应用。
背景技术
土壤微生物是土壤生态系统的重要组份之一，几乎所有的土壤过程都直接或间接地与土壤微生物有关。当前土壤微生物宏基因组是土壤微生物研究的有力手段，该方法灵敏度高，准确性。使用该方法的前提是获得到一定浓度的高质量的土壤基因组DNA，而土壤DNA提取难度之一在于去除土壤中腐殖酸的影响，特别是对于富营养土壤样本。
目前，土壤DNA的提取过程中去除腐殖酸的方法较多，如生理盐酸洗涤样本，通过溶解去除的方法；如矿物质吸附法，可以使用粉末碳酸钙、二氧化钛或聚乙烯吡咯烷酮进行吸附，也可以使用新生氢氧化铝进行吸附。
虽然去除腐殖酸的方法多种多样，但去除效果都不够理想。同时所有去除过程均需要离心过程，比较繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种腐殖酸去除剂及其制备方法，旨在提升对腐殖酸的去除效果。
本发明的另一目的在于提供上述腐殖酸去除剂在土壤核酸提取过程中的应用。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了一种腐殖酸去除剂，其通过在改性葡聚糖上负载金属离子制备而得；
其中，改性葡聚糖为乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖，金属离子选自碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子中的至少一种。
本发明还提出一种腐殖酸去除剂的制备方法，在改性葡聚糖上负载所述金属离子。
本发明还提出上述腐殖酸去除剂在土壤核酸提取过程中的应用。
本发明实施例提供一种腐殖酸去除剂的有益效果是：其通过在乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖上负载碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子，制备得到对腐殖酸去除效果非常好的腐殖酸去除剂，能够有效去除土壤中的腐殖酸，且为免离心土壤样本DNA的提取提供了可能性。本发明实施例中提供的腐殖酸去除剂可以在土壤核酸提取过程中得到应用，以获得高质量的土壤基因组DNA，且提出过程无需离心，操作简便易行。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为提取土壤基因组DNA紫外吸收曲线图；
图2为提取到的不同土壤样本DNA及细菌16S rDNA PCR产物凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种腐殖酸去除剂、其制备方法及应用进行具体说明。
本发明实施例在制备得到乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖的基础上进行的，乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖是一种固相金属离子螯合剂，乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖的具体改性方法发明人也提交了专利申请，制备方法如下：葡聚糖在N，N-二甲基甲酰胺溶剂存在的条件下，葡聚糖糖环羟基与乙二胺四乙酸酐进行单酯化反应，然后进一步水解残留的酸酐基团，形成金属结合部位，从而得到改性葡聚糖。
现提供乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖的较为具体的制备方法：
在50mL两口瓶中加入G-25 0.5g、乙二胺四乙酸酐0.75g、N、N二甲基甲酰胺13.5mL，加入磁子，插入温度计，安装回流管并进行固定，在磁力搅拌恒温浴内加热，设置温度85℃，反应12小时终止反应。取出反应物，抽滤并使用15mL 7％碳酸氢钠溶液处理反应产物，对残留的酸酐基团进行水解处理40分钟，后续接续乙醇洗涤过程(当进行滴定法测定接枝效果时，应在乙醇洗涤前做酸化处理)。无水乙醇洗涤5次，65℃干燥挥发去残留乙醇后，测定接枝效率。
本发明实施例提供了一种腐殖酸去除剂的制备方法，其在改性葡聚糖上负载金属离子；其中，改性葡聚糖为乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖，金属离子选自碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子中的至少一种。
发明人创造地，在乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖上引入碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子，并且发现负载金属离子之后能够显著提升对土壤中腐殖酸的去除效果，最大限度地保证了所提取核酸的纯度。
需要说明的是，类稀土离子是指钪离子(3+)和钇离子(3+)。
进一步地，碱土金属离子选自Ca2+和Ba2+中的至少一种，优选为Ba2+，负载Ba2+对腐殖酸的去除效果要更为理想。
进一步地，稀土离子选自La3+、Nd3+、Sm3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+和Lu3+中的至少一种，类稀土离子选自Sc3+和Y3+中的至少一种；优选地，稀土离子为La3+。判断改性葡聚糖负载离子的适合性除考虑去除效果之外还主要考虑两个方面，一方面是金属盐溶液在缓冲溶液中的稳定性(是否容易水解)，另一方面是原材料的成本。就去除效果而言，Gd3+和Lu3+离子的去除效果更好，综合考虑效果与成本选择La3+最为理想。
在一些实施例中，先将改性葡聚糖进行溶胀之后，再与金属离子形成的负载液接触进行流动负载。通过溶胀之后再进行负载，能够进一步提升负载量。
在实际操作过程中，可以将改性葡聚糖经过水溶胀之后装入萃取柱内，用缓冲溶液平衡之后，与金属离子形成的负载液接触进行流动负载。通过缓冲溶液控制pH，以实现金属离子的负载，缓冲溶液的pH值为6-8，优选为6.5-7.0，可以为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在大致中性的条件下才能完成金属离子的负载，若pH值过酸或者过碱均不能达到很好地负载效果。
在一些实施例中，可以采用Tris-HCl缓冲溶液进行pH值的调节，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-100mM，更优选为20-50mM。Tris-HCl缓冲液能够将负载过程中的pH值更好地控制在近似中性的条件下，提升金属离子的负载量。Tris-HCl缓冲溶液的浓度是常规理解的浓度，其配置过程参照现有技术，在此不做过多赘述。
在一些实施例中，流动负载是将负载液通入萃取柱中平衡至少3个柱体积，然后静置至少3h，以使金属离子充分负载在改性葡聚糖上。
可选地，萃取柱为针筒形固相萃取柱，负载液的体积为萃取柱柱床体积的3-5倍。针筒形固相萃取柱能够进一步提升负载液和改性葡聚糖的接触效果，提升金属离子的负载量。针筒形固相萃取柱下端以孔径为20微米的聚四氟乙烯筛板封闭，上表面覆盖一层滤纸。
进一步地，碱土金属离子是采用其碳酸盐制备负载液，且负载液中碱土金属离子的浓度为1-100mM，优选为10-50mM；稀土离子和类稀土离子是采用其对应的金属氧化物制备负载液，且负载液中稀土离子或类稀土离子的浓度为0.5-50mM，优选为1-10mM。通过进一步控制金属离子在负载液中的浓度，以保证金属离子的负载量，获得对腐殖酸去除效果更为优异的去除剂。若负载液中金属离子的浓度过小，则会显著降低金属离子的负载量；若负载液中金属离子的浓度过大，稀土金属离子和类稀土离子会发生水解，溶液变浑浊，降低金属离子的利用度。
由于碱土金属离子相对不容易水解，其可以采用缓冲液进行稀释制备负载液，而稀土离子和类稀土离子由于容易水解，不适合于采用缓冲液进行稀释。因此，碱土金属离子和稀土或类稀土离子制备负载液的方式略有不同，具体如下：
碱土金属离子：将碱土金属离子对应的碳酸盐与盐酸混合溶解之后，调节pH值为5-6，然后与Tris-HCl缓冲溶液混合稀释得到负载液。在实际操作过程中，可以采用蠕动泵并调节合适流速(流速可以为1～5mL/min)，将负载液通入针筒型固相萃取柱管内，平衡3个柱体积以上，关闭固相萃取柱下部阀门，同时关闭蠕动泵。
稀土离子或类稀土离子：将稀土离子或类稀土离子对应的金属氧化物与盐酸混合溶解之后，浓缩至湿盐状态，再与水混合溶液形成储备液，在流动负载时将储备液与Tris-HCl缓冲溶液预混形成负载液。在需要流动负载时再与Tris-HCl缓冲溶液混合，防止发生水解。在实际操作过程中，可以使用双通道蠕动泵将储备液和Tris-HCl缓冲溶液分别进液至10-50mL的预混器内进行混合，之后再进入装有改性树脂的柱体内，剩余操作过程与碱土金属离子类似。
在一些实施例中，在流动负载之后进行清洗，以去除游离金属离子，得到更为纯净的去除剂。
可选地，清洗是采用质量分数为0.03-0.05％的异噻唑啉酮缓冲溶液，异噻唑啉酮缓冲溶液是由异噻唑啉酮和Tris-HCl缓冲溶液混合而得；异噻唑啉酮缓冲溶液流过萃取柱的量为至少5个柱体积，以将产品上未负载的金属离子充分去除。
本发明实施例还提供一种腐殖酸去除剂，其通过上述腐殖酸去除剂的制备方法制备而得，对腐殖酸去除效果非常好，能够有效去除土壤中的腐殖酸，且为免离心土壤样本DNA的提取提供了可能性。
本发明实施例中提供的腐殖酸去除剂可以在土壤核酸提取过程中得到应用，以获得高质量的土壤基因组DNA，且提出过程无需离心，操作简便易行。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，包括：取3mL充分溶胀的改性葡聚糖树脂，装入固相萃取管(管径为1.3cm，长度为6.4cm)内。蠕动泵吸取pH为6.0的40mM Tris-HCl缓冲溶液，对柱体进行平衡，流速控制在1-2mL/min。待流出液体体积13mL后，停止蠕动泵。取500mM的氯化钙溶液5mL，然后加入上述缓冲溶液45mL，混匀。用蠕动泵泵入柱体内，待流出液体积达到16mL后，关闭柱体下端阀门并关闭蠕动泵，静置3.5小时后。用含有0.03％异噻唑啉酮缓冲溶液(由异噻唑啉酮和Tris-HCl缓冲溶液混合而得)洗去柱体内游离金属离子，流出液体积为20mL。然后悬起修饰后的改性树脂，移入瓶内密封保存或使用。
实施例2
本实施例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，包括：取10mL充分溶胀的改性葡聚糖树脂，装入固相萃取管内(管径为1.5cm，长度为8cm)。蠕动泵吸取pH8.0的10mM Tris-HCl缓冲溶液，对柱体进行平衡，流速控制在1-2mL/min。待流出液体体积55mL后，停止蠕动泵。取500mM的氯化钡溶液10mL，然后加入上述缓冲溶液40mL，混匀。用蠕动泵泵入柱体内，待流出液体积达到38mL后，关闭柱体下端阀门并关闭蠕动泵。静置3.0小时后，用含有0.05％异噻唑啉酮缓冲溶液洗去柱体内游离金属离子，流出液体积为53mL。然后悬起修饰后的改性树脂，移入瓶内密封保存或使用。
实施例3
本实施例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，包括：取15mL充分溶胀的改性葡聚糖树脂，装入固相萃取管内(管径为1.5cm，长度为10cm)。蠕动泵吸取pH6.0的100mM Tris-HCl缓冲溶液，对柱体进行平衡，流速控制在1-2mL/min，待流出液体体积80mL后，停止蠕动泵。取100mM的氯化镥溶液0.3mL，然后加入30mL水中。稀释后的氯化镥溶液与缓冲溶液等流速进入预混器内，然后再加注入柱体内，待柱体流出液体积达到50mL后，关闭柱体下端阀门并关闭蠕动泵。静置3.0小时后，用含有0.04％异噻唑啉酮缓冲溶液洗去柱体内游离金属离子，流出液体积为81mL。然后悬起修饰后的改性树脂，移入瓶内密封保存或使用。
实施例4
本实施例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，包括：取75mL充分溶胀的改性葡聚糖树脂，装入固相萃取管内(管径为3.5cm，长度为15cm)。蠕动泵吸取pH6.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液，对柱体进行平衡，流速控制在1.5-3mL/min待流出液体体积400mL后，停止蠕动泵。取100mM的氯化钆溶液20mL，然后加入200mL水中。稀释后的氯化钆溶液与缓冲溶液等流速进入预混器内，然后再加注入柱体内，待柱体流出液体积达到300mL后，关闭柱体下端阀门并关闭蠕动泵。静置3.0小时后，用含有0.04％异噻唑啉酮缓冲溶液洗去柱体内游离金属离子，流出液体积为400mL。然后悬起修饰后的改性树脂，移入瓶内密封保存或使用。
实施例5
本实施例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，包括：取150mL充分溶胀的改性葡聚糖树脂，装入固相萃取管内(管径为4cm，长度为20cm层析柱)。蠕动泵吸取pH7.0的30mMTris-HCl缓冲溶液，对柱体进行平衡，流速控制在3-5mL/min待流出液体体积580mL后，停止蠕动泵。取100mM的氯化镧溶液与缓冲溶液等流速进入预混器内，然后再加注入柱体内，待柱体流出液体积达到500mL后，关闭柱体下端阀门并关闭蠕动泵。静置3.0小时后，用含有0.03％异噻唑啉酮缓冲溶液洗去柱体内游离金属离子，流出液体积为762mL。然后悬起修饰后的改性树脂，移入瓶内密封保存或使用。
实施例6
本实施例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，与实施例1不同之处仅在于：将氯化钙替换为氯化钡。
对比例1
本对比例提供一种腐殖酸去除剂，其直接采用改性葡聚糖树脂。
结果显示：改性树脂未经负载金属离子，不具有去除腐殖酸的效果。由于本发明腐殖酸去除剂去除腐殖酸的原理是：改性树脂负载金属离子，金属离子作为偶联媒介，一头连着改性树脂，一头可以和腐殖酸中羧基连接，从而使腐殖酸从溶液中游离而出，达到去除的目的。
对比例2
本对比例提供一种腐殖酸去除剂，其直接采用实施例1中的氯化钙溶液。
结果显示：单独的氯化钙溶液不具备去除腐殖酸的效果。且中加入钙离子后，DNA也会从溶液中沉淀析出。
对比例3
本对比例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，与实施例1不同之处仅在于：采用pH为5.0的Tris-HCl缓冲溶液。低pH条件下，由于受到酸性的影响，负载金属离子的效果不好，金属离子负载量达不到pH6.0以上70％，树脂的利用度降低。
对比例4
本对比例提供一种腐殖酸去除剂的制备方法，与实施例1不同之处仅在于：采用pH为9.0的Tris-HCl缓冲溶液。提高缓冲溶液pH值后，树脂负载金属离子的量会略有增加，有利于提高样本中腐殖酸的去除效果；但考虑到树脂使用溶液酸碱性问题(一般核酸提取溶液pH在7～8之间)，树脂碱性高于使用溶液碱性后，会有少量金属离子释放到溶液中，对核酸造成污染。
试验例1
本试验例将实施例1中得到腐殖酸去除剂应用于土壤核酸提取过程中，并和没有使用腐殖酸去除剂的情况进行对比，结果如图1。
土壤基因组DNA的提取过程(1)样本裂解，取300-500mg土壤样本，加入600微升裂解液(组成如下：20mM pH8.0 Tris-HCl，3％十六烷基三甲基溴化铵，100mM氯化钾，400mM乙酸锂)，然后再加入Proteinase K 20微升(1mg/mL)，置于75摄氏度的水浴内裂解30分钟。(2)12000rpm离心2分钟，取上清。(3)上清中加入50-100微升腐殖酸去除剂，上下颠倒混匀，静置5-10分钟。直接吸取上清液，加入等体积的异丙醇，混匀，然后使用离心柱或磁珠捕获核酸。(4)经洗涤剂(20mM pH5.5 70％乙醇溶液)洗涤核酸，然后用75％乙醇洗去缓冲盐，挥去或离心除去残留乙醇。(5)用无酶水或TE(10mM pH8.0 Tris-HCl，0.5m MEDTA)洗脱核酸，得到土壤基因组DNA。
从图1可以看出，图中a为未使用腐殖酸去除剂处理提取的DNA，b为经过腐殖酸去除剂处理后提取到的DNA，从图中可以看出230nm处吸收值明显降低，260nm处与230nm处紫外吸收比值明显增大，由0.82变为1.51，说明使用腐殖酸去除剂处理得到的DNA的纯度明显提高。
图2为提取到不同土壤样本的DNA及细菌16S rDNA PCR产物凝胶电泳图，图2中a为土壤基因组DNA凝胶电泳图，b为细菌16S rDNA PCR产物凝胶电泳图。从图中可以看出：所提取DNA条带整齐，无明显降解，PCR实验活性较好。
试验例2
测试实施例1-6和对比例1-4中制备得到的腐殖酸去除剂对腐殖酸的去除效果，测试方法如下：加入12mL样本裂解液处理同一份土壤样本10g，离心后取上清。分别取600μL使用各例中制备的腐殖酸去除剂100μL处理上清液，然后按照试验例方法提取DNA，并用nanodrop微量紫外仪测定A260nm/A230nm比值，比值越大，腐殖酸去除效果越好。
Figure BDA0002972687590000121
对比例2的测试结果中上标1的说明：土壤样本经裂解、离心后的上清中加入对比例2中氯化钙溶液后，钙离子与DNA结合形成难溶盐。经磁珠吸附后，在洗脱液中难以溶解，nanodrop不能测定到260nm处吸收值(吸收值较低，接近于基线)，而230nm处存在其他杂质吸收，吸收值为0.11，因此导致比值较小，该数值无意义。
对比例4的测试结果中上标2的说明：(1)pH9时，只能用钙离子和钡离子对树脂进行负载，其他离子均发生水解，离子在溶液中发生沉淀问题；(2)提取后DNA浓度明显低于其他示例，可能是因树脂中部分离子解离，与溶液中DNA结合，难以在水中溶解，导致浓度降低。
综上，本发明提供的一种腐殖酸去除剂，其通过在乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖上负载碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子，制备得到对腐殖酸去除效果非常好的腐殖酸去除剂，能够有效去除土壤中的腐殖酸，且为免离心土壤样本DNA的提取提供了可能性。本发明实施例中提供的腐殖酸去除剂可以在土壤核酸提取过程中得到应用，以获得高质量的土壤基因组DNA，且提出过程无需离心，操作简便易行。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (20)

1.一种腐殖酸去除剂，其特征在于，其通过在改性葡聚糖上负载金属离子制备而得；
其中，所述改性葡聚糖为乙二胺四乙酸酐改性的葡聚糖，所述金属离子选自碱土金属离子、稀土离子或类稀土离子中的至少一种；所述碱土金属离子选自Ca2+和Ba2+中的至少一种，所述稀土离子选自La3+、Nd3+、Sm3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+和Lu3+中的至少一种，所述类稀土离子选自Sc3+和Y3+中的至少一种；
改性葡聚糖的制备方法包括：葡聚糖在N，N-二甲基甲酰胺溶剂存在的条件下，葡聚糖糖环羟基与乙二胺四乙酸酐进行单酯化反应，然后进一步水解残留的酸酐基团，形成金属结合部位，从而得到改性葡聚糖；
所述腐殖酸去除剂的制备方法包括将所述改性葡聚糖经过水溶胀之后装入萃取柱内，用缓冲溶液平衡之后，与所述金属离子形成的负载液接触进行流动负载；所述缓冲溶液的pH值为6-8。
2.根据权利要求1所述的腐殖酸去除剂，其特征在于，所述碱土金属离子为Ba2+。
3.根据权利要求1所述的腐殖酸去除剂，其特征在于，所述稀土离子为La3+。
4.一种权利要求1-3中任一项所述腐殖酸去除剂的制备方法，其特征在于，包括：将所述改性葡聚糖经过水溶胀之后装入萃取柱内，用缓冲溶液平衡之后，与所述金属离子形成的负载液接触进行流动负载；所述缓冲溶液的pH值为6-8。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述流动负载是将所述负载液通入所述萃取柱中平衡至少3个柱体积，然后静置至少3h。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述萃取柱为针筒形固相萃取柱。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述负载液的体积为所述萃取柱柱床体积的3-5倍。
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液的pH值为6.5-7.0。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，采用Tris-HCl缓冲溶液进行pH值的调节，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-100mM。
10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20-50mM。
11.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述碱土金属离子是采用其碳酸盐制备所述负载液，且所述负载液中所述碱土金属离子的浓度为1-100mM。
12.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述负载液中所述碱土金属离子的浓度为10-50mM。
13.根据权利要求12所述制备方法，其特征在于，将所述碱土金属离子对应的碳酸盐与盐酸混合溶解之后，调节pH值为5-6，然后与Tris-HCl缓冲溶液混合稀释。
14.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述稀土离子和所述类稀土离子是采用其对应的金属氧化物制备所述负载液，且所述负载液中所述稀土离子或所述类稀土离子的浓度为0.5-50mM。
15.根据权利要求14所述制备方法，其特征在于，所述负载液中所述稀土离子或所述类稀土离子的浓度为1-10mM。
16.根据权利要求15所述制备方法，其特征在于，将所述稀土离子或所述类稀土离子对应的金属氧化物与盐酸混合溶解之后，浓缩至湿盐状态，再与水混合溶液形成储备液，在流动负载时将所述储备液与Tris-HCl缓冲溶液预混形成所述负载液。
17.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，在流动负载之后进行清洗，以去除游离金属离子。
18.根据权利要求17所述制备方法，其特征在于，所述清洗是采用质量分数为0.03-0.05%的异噻唑啉酮缓冲溶液，所述异噻唑啉酮缓冲溶液是由异噻唑啉酮和Tris-HCl缓冲溶液混合而得。
19.根据权利要求18所述制备方法，其特征在于，所述异噻唑啉酮缓冲溶液流过所述萃取柱的量为至少5个柱体积。
20.权利要求1-3中任一项所述的腐殖酸去除剂或权利要求4-19中任一项所述的制备方法制备得到的腐殖酸去除剂在土壤核酸提取过程中的应用。
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