DE69410024T2

DE69410024T2 - Knorpelschützende Arzneimittel

Info

Publication number: DE69410024T2
Application number: DE69410024T
Authority: DE
Inventors: Koichi Niimura; Kiyonori Umekawa; Koju Watanabe
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-06-27
Publication date: 1998-11-19
Anticipated expiration: 2014-06-28
Also published as: US5621009A; AU6734094A; EP0633021B1; DE69410024D1; KR950002753A; AU663998B2; CN1100631A; EP0633021A1; JP3490114B2; CA2126512A1; JPH0725759A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Mittel zum Schutz von Knorpel, d.h. ein chondroprotektives Mittel, genauer ein chondroprotektives Mittel, das eine Carbonsäureverbindung der unten genannten allgemeinen Formel (I) oder ein cis- oder trans-Isomer hiervon oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder einen Ester davon enthält.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Es gibt verschiedene Arten von Arthropatie, beispielsweise rheumatoide Arthritis, rheumatisches Fieber und Osteoarthritis. Viele Menschen leiden besonders unter rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis. Diese Erkrankungen wurden als die Hauptarten von Arthropatien untersucht. Es gibt eine angeborene und eine sekundäre Osteoarthritis und ferner eine primäre Osteoarthritis, die durch die Degeneration des Gelenkknorpels im Verlauf des Alterungsprozesses verursacht wird. In jüngerer Zeit trat zusammen mit der Zunahme der älteren Bevölkerung ebenfalls eine Zunahme von unter primärer Osteoarthritis leidenden Patienten auf.
Obgleich beträchtliche Unterschiede der Ursachen und Bedingungen zwischen rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis bestehen, wird die Gelenkfunktion schließlich durch die Zerstörung des Knorpels sowohl bei der rheumatoiden Arthritis als auch bei der Osteoarthritis behindert.
Die erste Wahl von Ärzten für die Behandlung von rheumatischen Erkrankungen, wie etwa rheumatoide Arthritis, rheumatisches Fieber, systemischer Lupus Erythematodes und Osteoarthritis sind analgetische und entzündungshemmende Mittel, beispielsweise Aspirin oder Indometacin. Ferner werden Goldverbindungen wie etwa Shiosol, Immunmodulatoren, Steroide oder D-Penicillamin als Arzneimittel zur Behandlung von rheumatoider Arthritis verwendet.
Die vorstehend genannten herkömmlichen analgetischen und entzündungshemmenden Mittel waren jedoch nicht gegen die Zerstörung des Gelenkknorpels wirksam und zeigten tatsächlich manchmal nachteilige Effekte bei Versuchen, die Chondrocyten verwendeten. Ferner wurde bei den vorstehend genannten Arzneimitteln bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis ebenfalls kein hemmender Effekt auf die Zerstörung des Gelenkknorpels beobachtet.
Es ist bekannt, daß Coffein-, Ferula-, Isoferula- oder 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure für die folgenden pharmazeutischen Anwendungen verwendet werden können:
Coffein- und Ferulasäuren zeigen eine antivirale Aktivität [ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-234319]. Coffeinsäure kann als Calciumantagonist [ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-243822], als Antiallergikum [ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokal) Nr. 59-155314] und ähnliches verwendet werden. Coffeinsäure und Methylcoffeinsäureester können zur Behandlung von Autoimmunstörungen verwendet werden (WO 91/17749). Ferner können Ferula- und Isoferulasäuren als Antitumormittel zur Verhinderung von Arzneimittelresistenzen in der Immunchemotherapie verwendet werden [ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 56-115716]. Ferner kann Ferulasäure als Mittel für mitigierende Hyperlipämie und Plättchenaggregation (US-Patent Nr. 4 842 859) verwendet werden. Darüber hinaus zeigen Ferulasäure und dessen Ester eine entzündungshemmende Wirkung (A.S. Chawla et al, Indian J. Exp. Biol., Vol 25, Nr. 3, Seiten 187 - 189, 1987). 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure kann als Absorbens für ultraviolette Strahlung in Kosmetika eingesetzt werden [ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 64-13018].
Die oben genannten Carbonsäuren, deren cis- und trans- Isomere sowie deren Salze und Ester waren jedoch bisher nicht als chondroprotektive Mittel bekannt.
Wuhan Daxue Yuebao, Ziran Kexueban (4), 1990, 93-97 und Acta Zool. Sin. 38(1), März 1992, 106-107 lehren, daß Ferulasäure bei Injektion von höheren Dosen Knorpelschäden verursachen kann, d.h. ein drastisches Abnehmen und eine anormale Verteilung des von den Knorpelzellen hergestellten Proteinproteoglycans.
Die vorliegenden Erfinder haben umfangreiche Forschungen angestellt, um ein chondroprotektives Mittel zur Unterdrückung der Zerstörung des Gelenkknorpels zu finden und haben im Ergebnis gefunden, daß bestimmte Carbonsäureverbindungen, deren cis- und trans-Isomere und deren pharmazeutisch verträglichen Salze und Ester die Abnahme von Proteoglycan, welches ein wesentlicher Bestandteil der Knorpelmatrix ist, in erheblichem Ausmaß hemmen und daher als chondroprotektive Mittel zur Verhinderung der Zerstörung von Gelenkknorpel nützlich sind.
Demgemäß besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein chondroprotektives Mittel bereitzustellen, welches als Wirkstoff einer bestimmten Carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel (I) oder deren cis- oder trans-Isomere oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Ester davon enthält.
Weitere Aufgaben und Wirkungen der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden Beschreibung deutlich werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel (I)
worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder ein cis- oder trans-Isomer davon, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder einen Ester davon mit einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (im folgenden die "erfindungsgemäße Verbindung" genannt) sind, zur Herstellung eines chondroprotektiven Mittels.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

In der allgemeinen Formel (I) sind R¹ und R² vorzugsweise ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, oder n-Butylgruppen.
Entsprechend der Konfiguration der Phenyl- und Carbonylgruppe, die an beiden Enden der Doppelbindung in der erfindungsgemäßen Verbindung gebunden sind, existiert eine cis-Form und eine Trans-Form. Jede dieser cis- und trans-Formen können für das chondroprotektive Mittel der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Als pharmazeutisch verträgliche Salze können Salze wie Alkalimetalle (wie Natrium oder Kalium), Salze mit Erdalkalimetallen (wie Calcium oder Magnesium), Aluminiumsalze, Ammoniumsalze, Salze mit verschiedenen Aminverbindungen (wie primäre, sekundäre oder tertiäre Amine) oder ähnliche genannt werden.
Die Ester können solche mit aromatischen oder aliphatischen Alkoholen sein, vorzugsweise solche mit aliphatischen Alkoholen, noch bevorzugter solche mit aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Noch bevorzugtere Beispiele sind Methyl-, Ethyl-, n- Propyl-, iso-Propyl-, n-Butyl-, iso-Butyl-, tert.-Butyl-, n- oder iso-Pentylester.
Beispiele für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 zeigt nur die trans- Formen, auf die sich die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränkt. Tabelle 1
Me: Methyl, Et: Ethyl, npr: n-Propyl, nbu: n-Butyl
Viele der in Tabelle 1 beschriebenen Carbonsäureverbindungen sind kommerziell erhältlich. Coffeinsäure ist beispielsweise von Tokyo Kasei Kogyo Co. und Ferulaund Isoferulasäure sind von Sigma Chemical Co. erhältlich. 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure kann ferner durch Umsetzen von 3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd und Malonsäure in Gegenwart einer Base wie Pyridin (siehe Beispiel 1 unten) hergestellt werden.
Die pharmazeutisch verträglichen Salze der freien Carbonsäuren der allgemeinen Formel (I) können durch Umsetzen von Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, oder Ammoniumhydroxyden oder -carbonaten mit einer equimolaren Menge der freien Carbonsäure in einem Lösungsmittel wie Wasser hergestellt werden.
Der Ester der freien Carbonsäure der Formel (I) kann durch Umsetzen von Alkoholverbindungen mit der oben genannten freien Carbonsäure anhand einer der folgenden Verfahren hergestellt werden:
(1) Umsetzen eines Alkohols und der Carbonsäure in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart eines Säurekatalysators, beispielsweise einer anorganischen Säure wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure oder einer organischen Säure wie Essig- oder p-Toluolsulfonsäure,
(2) Umsetzen eines Alkohols.und der Carbonsäure in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid, N,N'-Carbonyldi-2-methylimidazol, Diphenylketen-n-cyclohexylimin, Alkoxyactylen, Ethylpolyphosphat, Thionylchlorid oder Oxalylchlorid in einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid, Aceton, Dioxan, Acetonitril, Chloroform, Ethylenchlorid, Tetrahydrofuran oder Pyridin üblicherweise bei Unterkühlung oder bei Raumtemperatur,
(3) Umsetzen eines Carbonsäureanhydrids und eines Alkohols in der Gegenwart eines basischen Materials wie Triethylamin, Pyridin oder Methylethylpyridin oder
(4) Umsetzen eines Carbonsäurehalogenids, beispielsweise eines Acylhalogenids wie Chloride oder Bromide und eines Alkohols in einem Lösungsmittel, das eine basische Verbindung wie Triethylamin, Pyridin oder Methylethylpyridin oder in einem basischen Lösungsmittel wie Pyridin.
Wie sich aus dem unten aufgezeigten Toxizitätsergebnissen ergibt, handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Substanz um eine extrem sichere Verbindung.

(1) Akute Toxizität von Coffeinsäure

Der LDLO-Wert (geringste tödliche Dosis) bei intraperitonealer Verabreichung in Ratten, liegt bei 1500 mg/kg (Toxicology and Applied Pharmacology, Band 36, S.227, 1976).

(2) Akute Toxizität von Ferula-, Isoferula- und 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure

Jede der oben genannten Säuren wurde ddY männlichen Mäusen (fünf Mäuse pro Gruppe) mit einer Dosis von 400 mg/kg verabreicht und die Mäuse eine Woche lang nach der Verabreichung beobachtet. Die zu testenden Substanzen wurden nach Dispersion in einer wässrigen Lösung aus 0,3 % CMC (Carboxymetehylcellulose) und 0,05 % Tween 80 (Polyoxylethylensorbitanmonooleat; Tokyo Kasei Kogyo Co.) oral verabreicht. Keines der Tiere verendete und des wurden keine Unregelmäßigkeiten in den Körpergewichten oder allgemeinen Bedingungen bei jeder der zu testenden Substanzen beobachtet.
Die gleichen Ergebnisse erhielt man bei Verabreichung von Natriumferulasäureester, Methylferulasäureester, Ethylferulasäureester, Propylferulat oder Butylferulat.
Die LD&sub5;&sub0;-Werte von Methylferulasäureester und Isopropylferulat bei intraperitonealer Verabreichung in Mäusen betragen jeweils 1188,5 mg/kg und 1059,2 mg/kg (A.S. Chawla et al., Indian J. Exp. Biol., Band 25, Nr. 3, 5. 187-189, 1987).
Als pharmakologischen Effekt zeigt die erfindungsgemäße Substanz die Funktion der Hemmung der Zerstörung der Chondrocytenmatrix in Chondrocytenkulturen (aus dem Knorpel von Kaninchenschultern und Kniegelenken erhalten) (siehe nachfolgendes Beispiel 2). Obwohl die erfindungsgemäße Esterverbindung nicht immer einen derartigen pharmakologischen Effekt in vitro aufweist, wurde die durch Granuloma induzierte Hemmung der Knorpelzerstörung in Tierversuchen beim Mouse-Air-Pouch- Model beobachtet.
Entsprechend ist die erfindungsgemäße Substanz als ein chondroprotektives Mittel zur Behandlung von verschiedenen Arten von Arthropatien, die die Knorpelzerstörung von Gelenken begleiten, nützlich. Beispiele derartiger Arthropatien sind rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Periarthritis Humeroscapularis, Schulter-Arm-Hals-Syndrom, Lumbago usw.
Das die erfindungsgemäße Substanz als einen aktiven Inhaltsstoff enthaltende chondroprotektive Mittel kann in Form jeder herkömmlichen Formulierung vorliegen. Das chondroprotektive Mittel kann die erfindungsgemäße Substanz allein oder eine Mischung der erfindungsgemäßen Substanz mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Das chondroprotektive Mittel kann den aktiven Inhaltsstoff in einer Menge von 0,01 bis 100 Gew.%, vorzugsweise 0,1 bis 70 Gew.% enthalten.
Das chondroprotektive Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann oral oder auf anderen Wegen verabreicht werden.
Die Dosis des chondroprotektiven Mittels gemäß vorliegender Erfindung variiert je nach Patient (tierisch oder menschlich), Alter, individuellen Unterschieden, Erkrankungszustand und dergleichen. Allgemein gesprochen liegt jedoch bei Behandlung eines Menschen die Dosis der oralen Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz im Bereich von 0,1 bis 550 mg/kg (Körpergewicht) pro Tag, vorzugsweise 0,5 bis 200 mg/kg (Körpergewicht), die gewöhnlich in 1 bis 4 Dosierungen pro Tag aufgeteilt ist, obgleich eine Dosis außerhalb des vorstehend genannten Bereiches gelegentlich verabreicht werden kann.

BEISPIEL

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1: Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz

(1) Herstellung von 3-Ethyoxy-4-hydroxyzimtsäure

Malonsäure (1,56 g) und Pyridin (3,0 ml) wurden in einen länglichen Kolben (100 ml) gegeben. Weiterhin wurden 3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd (1,66 g) und Anilin (30 ul) hier zugegeben und das Gemisch bei 55ºC drei Stunden lang umgesetzt. Die Reaktionslösung wurde durch Zugabe von verdünnter Schwefelsäure angesäuert. Die durch Filtration erhaltenen Rohkristalle wurden mit Wasser gewaschen und anschließend getrocknet, wobei man die oben angegebene Verbindung (1,1 g, 56,1 %) als leicht gelbliche Kristalle erhielt.
Schmelzpunkt: 157 bis 158ºC
¹H-NMR (CDCL&sub3;, δppm): 1,40 (t, 3H, J = 6,87 Hz, CH&sub3;), 4,19 (q, 2H, J = 6,87 Hz, CH&sub2;), 6,36 (d, 1H, J = 16,04 Hz), 6,87 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,13 (dd, 1H, J = 8,2; 1,8 Hz), 7,31 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J = 16,04 Hz)
IR-Spektrum (cm&supmin;¹) : 3550s, 2980s, 2900s, 2830s, 2700m, 2600m, 2550m, 2510m, 1675s, 1625s, 1590s, 1515s, 1482m, 1435m, 1415m, 1330m, 1290s, 1260s, 1235s, 1195s, 1165s, 1121s, 1035s

(2) Herstellung von Methylferulasäureester

Ferulasäure (4,85 g) und anschließend Methylalkohol (50 ml), der Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden in einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und eine Stunde lang unter Rückfluß erhitzt. Die Abwesenheit von Ausgangsmaterial wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC: n-Hexane/Ethylacetat = 2/1) bestätigt, und anschließend das Lösungsmittel bei vermindertem Druck in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Zu dem Rest wurde Benzol gegeben und das Lösungsmittel wiederum mit einem Rotationsverdampfer abgezogen, um das Rohprodukt zu erhalten. Das dabei entstehende Rohprodukt wurde abgetrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie (Durchmesser = 5,5 x 7,0 cm; 60 g; n-Hexane/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wobei die oben genannte Verbindung erhalten wurde. Das Produkt wurde aus n-Hexan kristallisiert, wobei weiße Kristalle (5,09 g, 97,9 %) erhalten wurden.
Schmelzpunkt: 63 bis 64ºC
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δppm) : 3,79 (s, 3H, COOCH&sub3;), 3,90 (s, 3H, OCH&sub3;), 6,08 (sm 1H, OH), 6,28 (d, 1H, J = 15,6 Hz, H3), 6,91 (d, 1H, J = 8,25 Hz), 7,01 (d, 1H, J = 1,74 Hz), 7,04 (dd, 1H, J = 8,25; 1,74 Hz), 7,62 (d, 1H, J = 15,6 Hz, H4)

(3) Herstellung von Ethylferulasäureester

Ferulasäure (4,85 g) und anschließend Ethylalkohol (50 ml), das Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden in einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und 2,5 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Abwesenheit vom Ausgangsmaterial wurde durch TLC (n-Hexane/Ethylacetat = 2/1) bestätigt und das Lösungsmittel anschließend mit einem Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck abgezogen. Zu dem Rest wurde Benzol gegeben, wonach das Lösungsmittel erneut mit einem Rotationsverdampfer abgezogen wurde, wobei das weinfarbene Rohprodukt (5,79 g) erhalten wurde. Das so erhaltene Rohprodukt wurde abgetrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie (Durchmesser = 5,5 x 7,0 cm; 60 g; n-Hexan/Ethylacetat - 3/1) gereinigt, wobei die oben genannte Verbindung (5,06 g; 91,2 %) erhalten wurde. Das Produkt wurde aus n-Hexan kristallisiert, wobei weiße Kristalle (4,743 g, 85,3 %) erhalten wurden.
Schmelzpunkt: 41 bis 43ºC
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δppm): 1,33 (t, 3H, COOCH&sub2;CH&sub3;), 3,91 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,25 (q, 2H, J = 7,33 Hz), 6,06 (s, 1H, OH), 6,28 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,02 (s, 1H), 7,06 (d, 1H, J = 8,25 Hz), 7,61 (d, 1H, J = 15,6 Hz)

(4) Herstellung von n-Propylferulasäureester

Ferulasäure (4,85 g) und anschließend n-Propylalkohol (50 ml), der Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden in einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Nachdem die Abwesenheit von Ausgangsmaterial durch Dünnschichtchromatographie (TLC: n-Hexan/Ethylacetat = 2/1) bestätigt wurde, wurde das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck abgezogen. Nach Zugabe von Benzol zu dem Rest, wurde das Lösungsmittel erneut mit einem Rotationsverdampfer abgezogen, wobei das Rohprodukt erhalten wurde. Das so erhaltene Rohprodukt wurde getrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie (Durchmesser = 5,5 x 7,0 cm; 60 g; n-Hexane/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wobei die oben angegebene Verbindung (5,48 g, 91,6 %) als farbloses Öl erhalten wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δppm) : 0,99 (t, 3H, J = 7,33 Hz), 1,72 (s, 2H, J = 7,33 Hz), 3,90 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,16 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 6,11 (s, 1H, OH), 6,30 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 8,25 Hz), 7,02 (s, 1H), 7,05 (dd, J = 8,23 Hz), 7,61 (d, 1H, J = 15,6 Hz)

(5) Herstellung von n-Butylferulasäureester

Ferulasäure (5 g) und n-Butylalkohol (50 ml), der Chlorwasserstoff (4 %) enthielt, wurden nacheinander in einen länglichen Kolben (200 ml) gegeben und unter Rückfluß zwei Stunden lang erhitzt. Nachdem die Abwesenheit von Ausgangsmaterial mit Dünnschichtchromatographie (TLC: n-Hexan/Ethylacetat = 2/1) bestätigt wurde, wurde das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck abgezogen. Nach Zugabe von Benzol zu dem Rest wurde das Lösungsmittel nochmals mit einem Rotationsverdampfer abgezogen, um das Rohprodukt zu erhalten. Das so erhaltene Rohprodukt wurde abgetrennt und mit Kieselgelsäulenchromatographie (Durchmesser = 5,5 x 8,5 cm; 70 g; n-Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, wobei die oben angegebene Verbindung (6,25 g, 99 %) als farbloses Öl erhalten wurde.
H-NMR (CDCl&sub3;, δppm): 0,96 (t, 3H, J = 7,33 Hz), 1,44 (seq, 2H, J 7,33 Hz), 1,68 (quint, 2H, J = 6,88 Hz), 3,91 (s, 3H), 4,21 (t, 2H, J = 6,88 Hz), 6,04 (s, 1H, OH), 6,29 (d, J 16,0 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 8,25 Hz), 7,02 (5, 1H), 7,05 (dd, J = 8,25 Hz)

Beispiel 2: Effekt der Testverbindungen auf die Proteoglycanentleerung in Chondrocytenkulturen

(a) Herstellung der kultivierten Chondrocyten

Die Knorpel wurden steril aus Schulter- und Kniegelenken von Kaninchen (weiße Neuseelandkaninchen) (Körpergewicht von 1 bis 1,5 kg) . Die Knorpel wurden gründlich mit PBS (-) (frei von Ca , Mg ), Hanks-Lösung und 0,1 % EDTA-PBS (-) gewaschen und anschließend in kleine Segmente (1 mm x 1 mm x 1mm) geschnitten. Nach Zugabe von PBS (-), das 0,1 % EDTA enthielt, wurden die Segmente in einen Inkubator mit 37ºC 30 Minuten lang stehen gelassen. Anschließend wurden die Segmente mit einer Trypsinlösung (0,25 %) bei 37ºC eine Stunde lang behandelt, um das an den Knorpel anhaftende Bindegewebe zu entfernen. Nach dem Entfernen des Überstandes wurden die Knorpel 2 bis 2,5 Stunden lang in einem Ham F-12-Medium behandelt, das 10 % fetales Rinderserum (FBS) und 0,2 % Kollagenase enthielt. Anschließend wurde die Kollagenase-Lösung zentrifugiert (1500 upm) und die Restchondrocyten wurden zweimal mit Ham F-12-Medium (Chondrozytenkulturmedium), das 10 % FRS enthielt, gewaschen. Schließlich wurde die resultierende Suspension so eingestellt, daß die Chondrocyten in der Konzentration von 3 x 10&sup5; Zellen/ml in dem Chondrozytenkulturmedium suspendiert waren. Die Chondrocyten wurden in einer Menge von 1 ml pro Vertiefung auf Platten mit 24 Vertiefungen eingesetzt. Die Chondrocyten wurden nach vier Tagen konfluent. Der Versuch wurde innerhalb von zwei Wochen nach dem Erreichen des konfluenten Zustandes ausgeführt.

(b) Zugabe der zu testenden Verbindungen und der Proteoglycan entleerenden Mittel

Das Chondrocytenkulturmedium, das zur Kultivierung der Chondrocyten verwendet worden war, wurde aus jeder Vertiefung entfernt und 800 ul frisches serumfreies S-Clone-Medium, das 0,1 % menschliches Serumalbumin enthielt, wurde zugegeben. Ferner wurden 100 ul S-Clone- Medium, das die zu testenden Verbindungen enthielt (die Verbindung in der Konzentration des zehnfachen der Endkonzentration enthaltend; DMSO-Konzentration = 2,5 %) zugegeben. Die Chondrocyten wurden in Anwesenheit von Kohlendioxid (5 %) und Luft (95 %) zwei Stunden lang kultiviert. Anschließend wurde das Proteoglycan entleerende Mittel, PMA (Phorbol-Myristatacetat) (Endkonzentration = 0,1 uh/ml) oder Interleukin-1α (IL-1α) (Endkonzentration = 20 u/ml) zu dem Kulturmedium der Chondrocyten zugegeben.
Es lagen die folgenden zu testenden Verbindungen vor: Verbindungen der vorliegenden Erfindung: Coffeinsäure (CFA: Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.), Ferulasäure (FLA: Sigma Chemical Co.) und 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure (3-EtO-4-HO-CA: Verbindung hergestellt nach Beispiel 1(1).

Vergleichsubstanzen: Indometacin (Sigma Chemical Co.)

(c) Proteoglycanbestimmung

Die Proteoglycanentleerung wurde die Messung des Glycosaminoglycangehalts (Hauptbestandteil von Proteoglycan, im folgenden als GAG bezeichnet) nach dem Aufspalten der Chondrocytenmatrix mit Papain bestimmt.
Nach zwei Tagen wurde der Überstand der Chondrocytenkultur entfernt. Anschließend wurde 1 ml 0,03 % Papainlösung zu der verbleibenden Chondrocytenmatrixschicht zugegeben und eine Reaktion wurde bei 65ºC eine Stunde lang durchgeführt, um das GAG aus der Matrixschicht freizusetzen. Der Gehalt des GAG in der Papainlösung wurde durch das 1,9-Dimethylmethylenblauverfahren bestimmt (siehe R.W. Farndale, Biochim. Biophys. Acta., Bank 883, S.173-177, 1986). Der GAG- Gehalt in der Chondrocytenmatrix des Kontrolltests, bei dem das Proteoglycan entleerendes Mittel nicht zugegeben wurde, wurde als "100" dargestellt und die relative GAG- Menge für jeden Versuch mit Ausnahme des Kontrolltests durch die folgende Formel berechnet:
Relative GAG-Menge (%) = (B/A) x 100
worin A den GAG-Gehalt des Kontrolltests, bei dem das Proteoglycan entleerende Mittel nicht zugegeben wurde, darstellt und B den GAG-Gehalt darstellt, bei dem die Proteoglycan entleerenden Mittel alleine zugegeben wurden, oder den GAG-Gehalt, bei dem die Proteoglycan entleerenden Mittel und die zu testenden Verbindungen zugegeben wurden.
Der GAG-Gehalt der Kontrolltests variierte in einem Bereich von 28,0 bis 74,5 ug/ml in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt, an dem die Chondrocyten confluent wurden, bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Chondrocyten in dem vorstehend beschriebenen Versuch verwendet wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Der GAG- Gehalt ist der Wert des mittleren Wertes 1 Standardfehler (n = 3 bis 6). Für jede der zu testenden Verbindung wurde der Kontrolltest und der Proteoglycanentleerungstest, bei dem das Proteoglycan entleerende Mittel zugegeben wurde, durchgeführt und die Ergebnisse davon sind ebenfalls dargestellt. Die Signifikanz wurde durch Student's t-test unter Bezug auf den Proteoglycanentleerungstest durchgeführt, bei dem Proteoglycan entleerendes Mittel zugegeben wurde. Die Ergebnisse der Bestimmung sind wie folgt dargestellt:
*: P < 0,05;
**: P < 0,01;
Im Vergleich mit dem GAG-Gehalt in Kontrolltests, bei welchen das Proteoglycan entleerende Mittel nicht zugegeben wurde, induzierte die Zugabe der Proteoglycan entleerenden Mittel PMA einen, Verlust des GAG-Gehalts. Unter diesen Bedingungen hemmte oder reduzierte die erfindungsgemäße Verbindung deutlich den GAG-Gehalt und zeigte eine Funktion zur Hemmung oder Unterdrückung der Proteoglycanentleerung. Andererseits zeigte Indomethacin, ein herkömmliches analgetisches und entzündungshemmendes Mittel, nicht die Funktion zur Hemmung oder Unterdrückung der Proteoglycanentleerung, sondern verursachte eine deutliche Verstärkung der Proteoglycanentleerung. Tabelle 2

Beispiel 3: Effekt der Testverbindungen auf die Proteoglycanentleerung im Mouse Air Pouch Model

Das in diesem Beispiel verwendete Verfahren basierte auf dem in K.M.K. Bottomley et al., Br. J. Pharmacol., Bank 93, S.627-635 (1988) beschriebenen Verfahren.
Der Femurkopfknorpel (FHC; 40 bis 50 mg) wurde unter sterilen Bedingungen bei S.D. Ratten (5,5 Wochen alt, weiblich) entnommen, in ein Baumwolltuch (5 mm x 5 mm; etwa 3 mg) gewickelt und anschließend subcutan in die Rücken (in die am Vortag 5 ml Luft injiziert wurden) von BALB/c-Mäusen (sieben Wochen alt, weiblich) implantiert.
n-Propylferulasäureester [nPrFLA; hergestellt nach Beispiel 1(4)] wurden in einer wässrigen Lösung einer Mischung aus CMC und Tween 80 (Endkonzentration: CMC = 0,3 %, Tween 80 = 0,05 %) dispergiert und oral bei einer Dosis von 100 mg/kg, beginnend mit dem dritten Tag nach der Implantation bei einer Rate von fünfmal pro Woche verabreicht. Eine wässrige Lösung einer Mischung des CMC und Tween 80 wurde der Kontrgllgruppe oral verabreicht.
Die implantierten FHCS wurden am 21. Tag nach der Implantation herausgenommen und die FHC-Matrizen anschließend mit einer Papainlösung (4 u/ml Papain, 0,05M PBS, pH 6,5, 10 ml) digestiert. Nach der Digestation wurde der GAG-Gehalt in der Papainlösung mit der 1,9-Dimethylmethylenbaumethode (R.W. Farndale, siehe oben) bestimmt.
Bei der nicht behandelten Gruppe wurden die FHCs am dritten Tag nach der Implantation herausgenommen und der GAG-Gehalt gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Der GAG- Gehalt/FHC in Tabelle 3 ist der Wert des Mittelwertes + Standardfehler (n = 8 bis 10) des GAG-Gehalts pro FHC.
Die relative GAG-Menge (%) ist die relative Menge zu dem Zeitpunkt als der GAG-Gehalt/FHC der nicht behandelten Gruppe 100 beträgt.
Der Knorpelzerstörungsfaktor wurde aus den neu gebildeten Granuloma im Umfeld der implantierten FHCS bestimmt.
Danach wurde eine Verminderung von GAG in der Kontrollgruppe beobachtet. Auf der anderen Seite wurde eine Unterdrückung der GAG-Verminderung in der Gruppe beobachtet, bei der die erfindungsgemäße Substanz verabreicht wurde. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz zur Unterdrückung von Knorpelzerstörung wurde damit bestätigt.
Ferner zeigten Methylferulasäureester, Ethylferulasäureester und n-Butylferulasäureester ähnliche Effekte wie n-Propylferulasäureester. Tabelle 3

Beispiel 4: Formulierung von Granulat

Die folgenden Inhaltsstoffe wurden homogen gemischt:
Ferulasäure 20 Gewichtsteile
Lactose 68 Gewichtsteile
niedrigsubstituierte Hydroxypropylcellulose 10 Gewichtsteile
Hydroxypropylcellulose 2 Gewichtsteile
Die Mischung wurde unter Verwendung von 32 Gewichtsteilen eines Befeuchtungsmittels, Ethanol, geknetet. Anschließend wurde die geknetete Mischung durch Feuchtgranulation granuliert und getrocknet. Wie oben erläutert, hemmt die erfindungsgemäße Substanz stark die Proteoglycanentleerung aus der chondrocyten Matrix und zeigt eine Funktion zum Schutz von Knorpel. Ferner hat die erfindungsgemäße Substanz eine niedrige Toxizität. Entsprechend ist die erfindungsgemäße Substanz zur Behandlung von Arthropatie, wie etwa rheumatische Arthritis, Osteoarthritis, Periarthritis Humeroscapularis, Schulter-Arm-Hals-Syndrom, Lumbago usw. sehr nützlich.

Claims

1. Verwendung einer Carbonsäureverbindung der allgemeinen Formel (I):

worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind oder ein cis- oder trans-Isomer hiervon oder ein für pharmazeutische Zwecke verwendbares Salz hiervon, oder eines Esters hiervon mit einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zur Herstellung eines knorpelschützenden Arzneimittels.

2. Verwendung einer Carbonsäureverbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung 3,4-Dihydroxyzimtsäure, Ferulasäure, 3-Hydroxy-4-methoxyzimtsäure, 3-Ethoxy-4-hydroxyzimtsäure, Natriumferulasäureester, Methylferulasäureester, Ethylferulasäureester, n-Propylferulasäureester oder n-Butylferulasäureester ist.