DE69333671T2 - Verfahren zur herstellung von polypeptide durch bakterielle fermentation - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Produktion von Polypeptiden durch bakterielle Fermentation. Genauer gesagt betrifft die Erfindung das in letzter Zeit aufgetauchte Problem der Instabilität von gelöstem Sauerstoff, das sich vor allem in in großem Umfang durchgeführten bakteriellen Fermentationen zeigt.
  • Beschreibung verwandter Gebiete
  • Die Produktion großer Mengen relativ reiner, biologisch aktiver Polypeptide und Proteine ist für die Herstellung von für Menschen und Tiere vorgesehenen pharmazeutischen Formulierungen, Enzymen und anderen Sonderchemikalien wirtschaftlich von Bedeutung. Für die Produktion zahlreicher Proteine sind mittlerweile DNA-Rekombinationstechniken die Verfahren der Wahl, da große Mengen exogener Proteine in Bakterien und anderen Wirtszellen frei von anderen kontaminierenden Proteinen exprimiert werden können. Die Expression von Proteinen durch DNA-Rekombinationstechniken für die Produktion von Zellen oder Zellteilen, die als Biokatalysatoren fungieren, ist auch eine wichtige Anwendung.
  • Die Produktion von rekombinantem Protein umfasst das Transfizieren von Wirtszellen mit für das Potein kodierender DNA und das Züchten der Zellen unter Bedingungen, die die Expression des rekombinanten Proteins begünstigen. Der Protokaryot E. coli ist als Wirt vorzuziehen, da er rekombinante Proteine in hoher Ausbeute produzieren kann. Es gibt zahlreiche US-Patente über die allgemeine bakterielle Expression von für Proteine kodierender DNA, z.B. US-Patent 4.565.785 über ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein bakterielles Gen für ein extrazelluläres oder periplasmatisches Trägerprotein und ein nicht-bakterielles Gen umfasst; US-Patent 4.673.641 über die gemeinsame Produktion eines fremden Polypeptids mit einem Aggregat-bildenden Polypeptid; US-Patent 4.738.921 über einen Expressionsvektor mit einem trp-Promotor/Operator und trp-LE-Fusion mit einem Polypeptid wie z.B. IGF-I; US-Patent 4.795.706 über Expressionssteuersequenzen, die mit einem fremden Protein zu verwenden sind; und US-Patent 4.710.473 über spezifische zirkuläre DNA-Plasmide wie z.B. jene, die für IGF-I kodieren.
  • Die Elektronentransferkette bakterieller Organismen kann Elektronen von Substraten auf molekularen Sauerstoff übertragen. Die Cytochrome sind eine Gruppe eisenhältiger Elektronen-übertragender Proteine auf der Elektronentransportkette, die hintereinander wirken, um Elektronen von Flavoproteinen auf molekularen Sauerstoff zu übertragen. Das endständige Cytochrom der Elektronentransportkette wird als Cytochrom-Oxidase bezeichnet.
  • Wenn ein Abschnitt eines bakteriellen Fermenters eine niedrige Konzentration an gelöstem Sauerstoff („dissolved O2"; DO2) aufweist, wird der bakterielle Organismus für die Produktion des Cytochrom-d-Oxidase-Komplexes induziert. Fu et al., Mol. Gen. Genetics 226: 209–213 (1991). Dieser Komplex besitzt eine höhere Affinität für Sauerstoff als der normalerweise verwendete Cytochrom-o-Oxidase-Komplex. Anraku und Gennis, TIBS 12, 262–266 (1987). Somit ermöglicht es der Cytochrom-d-Komplex – falls er vorhanden ist – dem Organismus, mit aerober Atmung unter Bedingungen niedriger Sauerstoffkonzentration fortzufahren.
  • Ubichinon ist der Elektronentransport-Mediator der Elektronentransportkette, der normalerweise von Bakterien während starken aeroben Wachstums verwendet wird. Unter Bedingungen jedoch, die man ungefähr als Annäherung der stationären Phase definiert (Poole und Ingledew, „Pathways of Electrons to Oxygen", in Neidhardt FC et al. (Hg.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Bd. 1 (American Society for Microbiology, Washington, DC., USA 1987), S. 180), wird die Produktion eines alternativen Elektronentransport-Mediators, Menachinon, induziert. In den meisten Fermentationen mit hoher Zelldichte erfolgt ein Großteil des Verfahrens mit Zellen, die sich in einem Zustand befinden, der ungefähr an die stationäre Phase herankommt bzw. sich dieser nähert. Dies kann durch Begrenzung der Kohlenstoff/Energie-Quelle zur Vermeidung von Sauerstoffschwund, durch Maßnahmen zur Induktion von Produktbildung oder durch die Gegenwart des Produkts hervorgerufen werden.
  • Der Cytochrom-d-Oxidase-Komplex besitzt eine höhere Affinität für Menachinon als für Ubichinon (Anraku und Gennis, s.o.) und verwendet vermutlich Menachinon als wesentlichen Elektronentransport-Mediator, wenn Menachinon vorhanden ist. Ungünstigerweise wachsen Organismen, die Menachinon als ihren Elektronentransport-Mediator verwenden, mit viel geringerer Wirksamkeit. Die aerobe Wachstumsausbeute von Organismen ohne Ubichinon macht etwa 30% jener des Organismus des Wildtyps aus. Wallace und Young, Biochim. Biophys. Acta 461, 84–100 (1977). Beispiele für mikrobielle Organismen mit mutierten Elektronentransport-Mediatoren wie z.B. Cytochrom-d-Oxidase oderCytochrom-o-Oxidase sind in folgenden Publikationen angeführt: Oden et al., Gene 96, 29–36 (1990); Oden und Gennis, J. Bacteriol. 173, 6174–6183 (1991); Kelly et al., J. Bacteriol. 172, 6010–6019 (1990); luchi et al., J. Bacteriol. 172, 6020–6025 (1990); Soberon et al., J. Bacteriol. 172, 1676–1680 (1990); Poole et al., J. Gen. Microbiol. 135, 1865–1874 (1989); Fang et al., J. Biol. Chem. 264, 8026–8032 (1989); James et al., FEMS Microbiol. Lett. 58, 277–281 (1989); Green et al., J. Biol. Chem. 263, 13138–13143 (1988); Soberon et al., J. Bacteriol. 171, 465–472 (1989); Sharma et al., Indian J. Microbiol. 27, 26–31 (1987); Yang, Arch. Microbiol. 144, 228–232 (1986); Matsushita und Kaback, Biochemistry 25, 2321–2327 (1986); Tamura-Lis und Webster, Arch. Biochem. Biophys. 244, 285–291 (1986); Au et al., J. Bacteriol. 161, 123–127 (1985); Mclnerney et al., Eur. J. Biochem. 141, 447–452 (1984); Lorence et al., J. Bacteriol. 157, 115–121 (1984); Kranz et al., J. Bacteriol. 156, 115–121 (1983); Green und Gennis, J. Bacteriol. 154, 1269–1275 (1983); Bryan und Kwan, Antimicrob. Agents Chemother. 19, 958–964 (1981); Willison et al., FEMS Microbiol. Lett. 10, 249–255 (1981); Willison und Haddock, FEMS Microbiol. Lett. 10, 53–57 (1981); Hoffman et al., Eur. J. Biochem. 105, 177–185 (1980); Hoffman et al., Eur. J. Biochem. 100, 19–27 (1979); Haddock und Schairer, Eur. J. Biochem. 35, 34–45 (1973); Haltia et al., EMBO J. 8, 3571–3579 (1989); Dikshit et al., Arch. Biochem. Biophys. 293, 241–245 (1992); Lemieux et al., J. Biol. Chem. 267, 2105–2113 (1992); Minagawa et al., J. Biol. Chem. 267, 2096–2104 (1992); Dassa et al., Mol. Gen. Genet. 229, 341–352 (1991); Williams et al., Biochem. J. 276, 555–557 (1991); Puustinen et al., Biochemistry 30, 3936–3942 (1991); Denis et al., J. Biol. Chem. 265, 18095–18097 (1990); Chepuri et al., Biochim. Biophys. Acta 1018, 124– 127 (1990); Andersson und Roth, J. Bacteriol. 171, 6734–6739 (1989); Puustinen et al., FEBS Lett. 249, 163–167 (1989); Daldal, J. Bacteriol. 170, 2388 – 2391 (1988); Poole und Williams, FEBS Lett. 231, 243–246 (1988); Georgiou et al., J. Bacteriol. 169, 2107–2113 (1987); O'Brian und Maier, J. Bacteriol. 161, 507–514 (1985); Green et al., J. Biol. Chem. 259, 7994–7997 (1984); Au et al., J. Bacteriol. 157, 122–125 (1984); Matsushita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4889–4993 (1983); Sasarman, Rev. Can. Biol. 31, 317–319 (1972); Van der Oost et al., EMBO J. 11, 3209–3217 (1992); Deutch, 92nd General Meeting of the American Society for Microbiology, New Orleans, LA, USA, 26.–30. Mai 1992, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 92, 272 (1992); Mogi et al., Biophys. J. 61, A284 (1992); Tron und Lemesle-Meunier, Curr. Genet. 18, 413–420 (1990); Shioi et al., J. Bacteriol. 179, 5507–5511 (1988); Oden und Gennis, J. Cell. Biol. 107, 624A (1988); Webster und Georgiou, Fed. Proc. 44, Abstract 678 (1985); Terriere et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 111, 830–839 (1983); Green und Gennis, Fed. Proc. 41, Abstract 3652 (1982); Tamura-Lis und Webster, Fed. Proc. 41, Abstract 2799 (1982); Green et al., Fed. Proc. 40, 1669 (1981); Willison und John, J. Gen. Microbiol. 115, 443–450 (1979); und Hashimoto und Hino, J. Sci. Hiroshima Univ. Ser. B Div. 2 (Bot) 15, 103–114 (1975).
  • Fermenteren zum Kultivieren von Bakterien werden normalerweise gerührt, um Sauerstoff von der Gasphase in die Flüssigphase (d.h. das Medium) zu übertragen und um zweitens einheitliche Konzentrationen von Mediumkomponenten, z.B. DO2, im gesamten Fermentertank aufrechtzuerhalten. Die vorliegende Erfindung beruht auf der unerwarteten Entdeckung, dass zwar während der Kultivierung im kleinen Maßstab zur Erreichung von DNA-Expression in Bakterien das Fermentationsmedium eine relativ stabile DO2-Konzentration aufweist, dass aber bei großtechnischen bakteriellen Fermentationen plötzliche und dramatische, im Wesentlichen unkontrollierbare Veränderungen der DO2-Konzentration des Mediums auftreten können. Diese Ereignisse verhindern einen erfolgreichen und reproduzierbaren Ablauf von großtechnischen Fermentationen, wodurch sie für die Produktion von hochqualitativem Protein oder anderer Produkte nicht in Frage kommen. Wenn Kulturen unter Glucose-Beschränkungen oder anderen Beschränkungen von Kohlenstoff/Energie-Quellen gezüchtet werden, kann die Zufuhrsteuerung der Kohlenstoff/ Energie-Quelle solcherart programmiert sein, dass unter den meisten Umständen adäquate DO2-Konzentrationen gegeben sind; in großen Reaktoren jedoch reicht – wie die Anmelder feststellten – diese Regulierung nicht aus, um plötzlich auftretenden biologischen Ereignissen gegensteuern zu können.
  • Demzufolge ist es ein Ziel der Erfindung, ein wirksames und zuverlässiges Verfahren zur Vermeidung des Problems von DO2-Instabilität bereitzustellen, das man bei bakteriellen Fermentationen in letzter Zeit beobachten konnte.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen erfolgreichen und reproduzierbaren Ablauf bakterieller Fermentationen zu erreichen, insbesondere von in großem Maßstab durchgeführten bakteriellen Fermentationen, um hochqualitative Polypeptide in einem verbesserten, auf FDA-Genehmigung abzielenden GMP-Verfahren zu produzieren und/oder die Polypeptide in höherer Ausbeute zu erzeugen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Neigung einer Kultur zur DO2-Instabiltät während einer bakteriellen Fermentation.
  • Diese und andere Ziele sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass die plötzlichen Veränderungen des DO2-Gehalts biologischen Ursprungs sind und mit dem Wechsel des Organismus zwischen unterschiedlichen Atemwegen zu tun haben. Betrachtet man diese Ereignisse eingehend, kommt man zum Schluss, dass sie durch genau geplante Gestaltung und Funktionsweise des Fermentationsgefäßes und/oder Fermentationsverfahrens verhindert werden können.
  • Eine Lösung besteht darin, sicherzustellen, dass der Bereich maximaler Sauerstoffabgabe an die flüssige Phase, d.h. der Gefäßboden, auch der Bereich maximalen Glucose-Eintritts ist. Somit ist der Fermenter solcherart konstruiert, dass der Glucose-Einlass am Boden des Gefäßes vorgesehen ist.
  • In einer alternativen Fermenterkonfiguration können die Stellen und Raten des Glucose-Eintritts im gesamten Gefäß verteilt sein, um etwa der Rate der Sauerstoffverfügbarkeit in den verschiedenen Gefäßbereichen zu entsprechen.
  • Für Fed-Batch-Fermentationen, in denen das ansteigende Kulturlösungsvolumen die geometrische Beziehung zwischen den Impellerrührern und dem Flüssigkeitsvolumen oft signifikant verändert, und in größeren Fermenteren, d.h. jenen mit zumindest etwa 1.000 Litern Fassungsvermögen, vorzugsweise etwa 1.000 bis 100.000 Litern Fassungsvermögen, sieht die bevorzugte Lösung des hierin angesprochenen Problems vor, den Wirtsorganismus zu mutieren, um dadurch seine Fähigkeit einzuschränken, zwischen Cytochrom-o-Oxidase und Cyctochrom-d-Oxidase zu wechseln; dies ermöglicht eine möglichst effiziente Nutzung des Fermentationsgefäßes.
  • Genauer gesagt bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids von Interesse aus einer Fermentation bakterieller Wirtszellen, die für das Polypeptid kodierende Nucleinsäure umfassen, welches Verfahren das Durchführen der Fermentation unter Verwendung von bakteriellen Wirtszellen mit einer beeinträchtigten Fähigkeit, zwischen Cytochrom-o-Oxidase und Cytochrom-d-Oxidase zu wechseln, umfasst.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt die Konfiguration eines 10-l-Fermenters, der ausgebildet ist, großtechnische DO2-Instabilitäten zu imitieren.
  • 2 zeigt die Abstammungslinie des Protease-defizienten E.-coli-W3110-Wirtsstamms mit der Bezeichnung 27C7.
  • Die 3A und 3B stellen die Systeme zur Mutation der tonA- bzw. phoA-Gene in E.-coli-Stamm W3110 dar.
  • 4 gibt Detailinformationen über die Konstruktion zur Eliminierung des tonA-Gens aus W3110.
  • 5 zeigt die Konstruktion von Plasmid pLS32, einem Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLS32Tsc, das ein für IGF-I kodierendes Gen enthält.
  • 6 zeigt die Konstruktion von pAPlamB, einem weiteren Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLS32Tsc und der Herstellung eines zusätzlichen Zwischenplasmids, pLamBIGF.
  • 7 stellt die Konstruktion von pLS32lamB dar, einem weiteren Zwischenplasmid bei der Konstruktion von pLS32Tsc.
  • 8 zeigt die Konstruktion von pLS33lamB, einem weiteren Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLS32Tsc.
  • 9 stellt die Konstruktion von pLS33Tsc dar, einem weiteren Zwischenprodukt bei der Herstellung von pLS32Tsc und von pBKIGF-2, das ein Zwischenplasmid bei der Herstellung eines weiteren Expressionsvektors ist, der in den weiter unten folgenden Beispielen verwendet wird, nämlich pBKIGF-2B.
  • 10 veranschaulicht die Konstruktion von pLS32Tsc aus pLS33Tsc und pLS3lamB.
  • 11 zeigt die Nucleotidsequenz der Expressionskassette und die Aminosäuresequenz, die durch die lamB-Signalsequenz und das IGF-I-Gen in Plasmid pLS32Tsc (Seq.-ID Nr. 11 bzw. 12) kodiert ist.
  • 12 ist eine schematische Darstellung des 1.000-l-Fermenters, in dem DO2-Instabilitätsprobleme auftreten.
  • 13 stellt die Glucose-Pumprate in g/min (13A) und den DO2-Prozentsatz (13B) im Verhältnis zur Zeit während einer 1.000-l-Fermentation von mit pLS32Tsc transformiertem Stamm 27C7 dar.
  • 14 zeigt den DO2-Prozentsatz (ausgefüllte Rauten) und die Glucose-Pumprate (leere Kreise) im Verhältnis zur Zeit während einer 1.000-l-Fermentation von mit pLS32Tsc transformiertem Stamm 27C7, worin die Glucose-Zufuhrrate manuell gesteuert wird.
  • 15 ist eine schematische Darstellung des 1.000-l-Fermenters, der modifiziert ist, um DO2-Instabilität untersuchen zu können.
  • 16 zeigt eine Analyse der DO2-Instabilität im Verhältnis zur Zeit im 1.000-l-Fermenter von mit pLS32Tsc transformiertem Stamm 27C7, worin die obere und untere Glucose-Zufuhr zum Einsatz kommen. Der DO2-Prozentsatz im unteren Teil des Gefäßes ist durch Quadrate dargestellt, der DO2-Prozentsatz im oberen Teil des Gefäßes ist durch Kreise dargestellt, und die Glucose-Pumprate/3 (g/min) ist durch eine durchgehende Linie dargestellt.
  • 17 ist eine Restriktionskarte für Plasmid p200, das zur Produktion von pLamBIGF verwendet wird, einem Zwischenplasmid bei der Herstellung von pLBIGFTsc (dient zur Erzeugung von pBKIGF-2).
  • 18 stellt die Nucleotidsequenz des EcoRI-EcoRI-Fragments (von Positionen 1149 bis 1633) von p200 dar, umfassend die MF-α-I-Präpro- und IGF-I-Gensequenzen (Seq.-ID Nr. 13).
  • 19 zeigt die Konstruktion von pLamBIGF aus drei Plasmidfragmenten und einem Stück synthetischer DNA (Seq.-ID Nr. 14 und 15). pLamBIGF ist ein Zwischenplasmid bei der Produktion von pLBIGFTsc (dient zur Herstellung von pBKIGF-2).
  • 20 stellt die Konstruktion des Zwischenplasmid pLBIGFTsc aus pLamBIGF dar.
  • 21 zeigt die Konstruktion des Zwischenplasmids pRanTsc, das bei der Produktion von pBKIGF-2 verwendet wird.
  • 22 veranschaulicht die Konstruktion von pBKIGF-2 aus pLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tsc und pRanTsc.
  • 23 zeigt die Konstruktion von pBKIGF-2A, das zur Herstellung von pBKIGF-2B verwendet wird, aus pLBIGFTsc, pBKIGF-2 und einem Stück synthetischer DNA (Seq.-ID Nr. 16 und 17).
  • 24 stellt die Konstruktion von pLamBRan, das zur Herstellung von pBKIGF-2B verwendet wird, aus pLS33LamB, pRANTES und einem Stück synthetischer DNA (Seq.-ID Nr. 18 und 19) dar.
  • 25 zeigt die Konstruktion des Expressionsvektors pBKIGF-2B aus pBKIGF-2, pBKIGF-2A, pLamBRan und einem Stück synthetischer DNA (Seq.-ID Nr. 20 und 21).
  • 26 veranschaulicht den DO2-Prozentsatz (26A) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (26B) im Verhältnis zur Zeit im in 1 gezeigten 10-l-Fermenter, wobei ein aus Stamm 27C7 abgeleiteter Organismus mit der Bezeichnung 37D6 verwendet wird (transformiert mit dem Expressionsvektor pBKIGF-2B).
  • 27 zeigt den DO2-Prozentsatz (27A), den Redox-Sonden-Ausgang (mV) (27B) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (27C) im Verhältnis zur Zeit im modifizierten 10-l-Fermenter, wobei ein untransformierter Wirt W3110tonA mit der Bezeichnung 1A2 verwendet wird.
  • 28 zeigt den DO2-Prozentsatz (28A), den Redox-Sonden-Ausgang (mV) (28B) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (28C) im Verhältnis zur Zeit im modifzierten 10-l-Fermenter, wobei eine untransformierte Cytochrom-o-Oxidase-Deletionsmutante des Wirts W3110tonA verwendet wird.
  • 29 veranschaulicht den DO2-Prozentsatz (29A), den Redox-Sonden-Ausgang (mV) (29B) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (29C) im Verhältnis zur Zeit im modifizierten 10-l-Fermenter, wobei eine untransformierte Cytochrom-d-Oxidase-Deletionsmutante des Wirts W3110tonA verwendet wird.
  • 30 zeigt den DO2-Prozentsatz (30A), den Redox-Sonden-Ausgang (mV) (30B) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (30C) im Verhältnis zur Zeit im modifizierten 10-l-Fermenter, wobei ein als 40B4 bezeichneter Kanamycin-sensitiver IGF-I-Produktionsorganismus (transformiert mit pBKIGF-2B) verwendet wird.
  • 31 stellt den DO2-Prozentsatz (31A), den Redox-Sonden-Ausgang (mV) (31B) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (31C) im Verhältnis zur Zeit im modifizierten 10-l-Fermenter dar, wobei eine Cytochrom-d-Oxidase-Deletionsmutante von Stamm 40B4 (transformiert mit pBKIGF-2B) verwendet wird.
  • 32 zeigt den DO2-Prozentsatz (32A), den Redox-Sonden-Ausgang (mV) (32B) und die Glucose-Pumprate (ml/min) (32C) im Verhältnis zur Zeit im modifizierten 10-l-Fermenter, wobei eine Cytochrom-o-Oxidase-Deletionsmutante von Stamm 40B4 (transformiert mit pBKIGF-2B) verwendet wird.
  • 33 veranschaulicht 10-l-Fermentationsergebnisse und vergleicht das Wachstum (Zelldichte bei A550, Kreise) und die gesamte IGF-I-Produktion/10 (mg/l, Quadrate) für eine Cytochrom-o-Oxidase-Deletionsmutante von Stamm 40B4 (leere Quadrate oder Kreise) und Stamm 40B4 als isogener Vergleich (ausgefüllte Quadrate oder Kreise), wobei sowohl die Mutante als auch der Vergleich mit pBKIGF-2B transformiert sind.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • A. Definitionen
  • Der Ausdruck „Polypeptid von Interesse" bezieht sich hierin allgemein auf Peptide und Proteine mit mehr als etwa 10 Aminosäuren. Die Polypeptide können homolog zur bakteriellen Wirtszelle oder, vorzugsweise, heterolog zur Wirtszelle sein, z.B. Hefe-Polypeptide oder, noch bevorzugter, Säugetier-Polypeptide. Beispiele für bakterielle Polypeptide sind alkalische Phosphatase und β-Lactamase. Beispiele für Säugetier-Polypeptide sind Moleküle wie etwa Renin, ein Wachstumshormon, z.B. Human-Wachstumshormon, des-N-Methionyl-Human-Wachstumshormon und Rinder-Wachstumshormon; Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor; Parathormon; Schilddrüsen-stimulierendes Hormon; Thyroxin; Lipoproteine; α1-Antitrypsin; InsulinA-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; Follikel-stimulierendes Hormon; Calcitonin; luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren wie z.B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von Willebrands-Faktor; Anti-Gerinnungsfaktoren wie z.B. Protein C; atrialer natriuretischer Faktor; Lungentensid; ein Plasminogenaktivator, z.B. Urokinase, menschlicher Harn oder Gewebe-Typ-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; hämopoetischer Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-α und -β; Enkephalinase; ein Serumalbumin wie etwa Human-Serumalbumin; Anti-Müller-Hormon; Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; Mäuse-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; ein mikrobielles Protein wie z.B. β-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor; Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Thrombopoietin; Protein A oder D; rheumatoide Faktoren; ein neurotropher Faktor wie z.B. aus Knochen abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6) oder ein Nervenwachstumsfaktor wie z.B. NGF-β; aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblasten-Wachstumsfaktor wie z.B. aFGF und bFGF; epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); transformierender Wachstumsfaktor (TGF) wie z.B. TGF-α und TGF-β, z.B. TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I und IGF-II); Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsproteine; CD-Proteine wie z.B. CD-3, CD-4, CD- 8 und CD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP); Somatotropine; ein Interferon wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (IL), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zellen-Rezeptoren; Obeflächenmembran-Proteine; Zerfall-Beschleunigungsfaktor; virales Antigen wie z.B. ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Adressine; Regulationsproteine; Antikörper; und Fragmente beliebiger der oben angeführten Polypeptide.
  • Die bevorzugten Polypeptide von Interesse sind jene, die in bakteriellen Zellen mit einem Minimum an Proteolyse und einem Maximum an richtig umgefaltetem oder aktivem Material problemlos produziert werden können; sie müssen, um ihrem beabsichtigten Verwendungszweck zugeführt zu werden, nicht glycosyliert sein. Beispiele für solche Säugetier-Polypeptide sind IGF-I, Wachstumshormon, DNase, Relaxin, Wachstumshormon-Freisetzungsfaktor, Insulin, Urokinase, Immunotoxine und Antigene. Besonders bevorzugte Säugetier-Polypeptide sind IGF-I und Wachstumshormon.
  • „IGF-I" bezieht sich hierin auf Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor aus jeder beliebigen Spezies, z.B. Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden und vorzugsweise Menschen, in nativer Sequenz oder in Variantenform und rekombinant produziert. In einem bevorzugten Verfahren wird IGF-I kloniert und seine DNA exprimiert, z.B. durch das in EP 128.733 (veröffentlicht am 19. Dezember 1984) beschriebene Verfahren.
  • Der Ausdruck „Kohlenstoff/Energie-Quelle" bezieht sich hierin auf eine Quelle von Kohlenstoff und Energie für die Zellen. Beispiele für eine derartige Quelle sind Glycerin, Succinat, Lactat und Zucker wie etwa Glucose, Lactose, Saccharose und Fructose. Die Auswahl der jeweils zu verwendenden Kohlenstoff/Energie-Quelle hängt hauptsächlich vom jeweiligen Bakterium ab. Die bevorzugte Kohlenstoff/Energie-Quelle für die E.-coli-Fermentation ist Glucose.
  • Der Ausdruck „Elektronentransportkette" oder „Atmungskette" bezieht sich auf die Kette, die aus einer Reihe an „Elektronenträgern" in Bakterien besteht, die zur Übertragung von Elektronen von Substratmolekülen auf molekularen Sauerstoff fähig sind. Sie sind somit am aeroben Atmungsweg der Bakterien und an der Förderung von Sauerstofftransfer innerhalb der Bakterien beteiligt. Diese Elektronenträger sind u.a. NADH-Dehydrogenase, ein Chinon wie etwa Unbichinon und Menachinon und eine Komponente des Cytochrom-o-Oxidase-Komplexes oder Cytochrom-d-Oxidase-Komplexes.
  • Ein bakterieller Organismus mit einer „beeinträchtigten" oder „inaktivierten" Elektronentransportkette bezieht sich auf Bakterien, die solcherart mutiert sind, dass sie zumindest einen – aber nicht alle – Elektronenträger, die die Elektronentransportketten ausmachen, inaktivieren. Diese Mutation kann mittels Deletion der genetischen Komponente, die einen Elektronenträger darstellt, oder alternativ dazu durch Modifikationen in den Nucleotiden der genetischen Komponente, so dass sie nicht mehr wie oben definiert funktioniert, erfolgen. Wenn beispielsweise die genetische Komponente Cytochrom-o- oder -d-Oxidase ist, kann der Organismus das Cytochrom-o-Oxidase-Genprodukt produzieren, aber nicht das Cytochrom-d-Oxidase-Genprodukt, oder das Cytochrom-d-Oxidase-Genprodukt, aber nicht das Cytochrom-o-Oxidase-Genprodukt. Der bevorzugte bakterielle Organismus besitzt ein inaktivertes Cytochrom-d- oder -o-Oxidase-Gen, noch bevorzugter ein inaktivertes Cytochrom-o-Oxidase-Gen, und am bevorzugtesten fehlt ihm dieses Gen.
  • Die „großtechnisch" durchgeführte Fermentation bezieht sich auf die Fermentation in einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen, d.h. Arbeitsvolumen, von zumindest etwa 1.000 Litern aufweist, wobei ausreichend Kopfraum gegeben ist. Die Fermentation „in kleinem Umfang" bezieht sich allgemein auf die Fermentation in einem Fermenter, der ein Fassungsvermögen von höchstens etwa 100 Litern, vorzugsweise von höchstens etwa 10 Litern, aufweist.
  • B. Durchführungsarten der Erfindung
  • Für die Zwecke der Erfindung enthält ein modifizierter Wirtsstamm eine oder mehrere Nucleotidmutationen innerhalb seiner Elektronentransportketten, vorzugsweise sein Cytochrom-o-Oxidase- oder Cytochrom-d-Oxidase-Komplex-Gen, so dass ein oder mehrere – aber nicht alle – Elektronenträgergene in den Elektronentransportketten inaktiviert sind. Der Stamm ist vorzugsweise ein E.-coli-Stamm. Solche Stammvarianten werden günstigerweise erzeugt, indem zweckmäßige Nucleotid-Veränderungen in der Bakterienstamm-DNA vorgenommen werden. Zu Stammvarianten zählen u.a. Deletionen von – oder Insertionen oder Substitutionen von – Nucleotiden innerhalb der Nucleinsäuresequenz des nativen Elektronentransportketten-Gens, die ausreichen, um das Gen daran zu hindern, den vom Stamm durchgeführten Wechsel von einer aeroben Atmungskette zur anderen unter DO2-Instabilität begünstigenden Bedingungen zuzulassen. Solche Gene lassen sich durch Verfahren problemlos identifizieren, die in nachstehend angeführtem Beispiel III angeführt sind. Jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution ist möglich, um zum endgültigen Stamm zu gelangen, sofern dieser die erwünschten Eigenschaften besitzt.
  • Für die Konstruktion von Varianten bakterieller Stämme hängen die optimalen Eigenschaften hauptsächlich von der Beschaffenheit der Mutation ab. Die Mutationsstelle(n) kann bzw. können individuell oder in Reihe modifiziert werden, z.B. durch (1) Substituieren zunächst mit Nucleotiden, die für ausgewählte konservative Aminosäuren kodieren, und dann mit radikaleren ausgewählten Aminosäuren (in Abhängigkeit von den erzielten Ergebnissen), (2) Deletieren der Ziel-Nucleotide oder (3) Insertieren von Nucleotiden, die für Aminosäuren der gleichen oder einer anderen Klasse nächst der lokalisierten Stelle kodieren, oder durch Kombinationen von Optionen 1–3.
  • Das bevorzugte Verfahren der Nucleotid-Modifikation sind Sequenzdeletionen von oder innerhalb der Domäne des Elektronenträger-Gens. Diese Deletionen umfassen im Allgemeinen zumindest 2 Nucleotide bis etwa 5,8 kb oder mehr (je nach dem bzw. den gerade deletierten Gen(en)); typischerweise sind sie zusammenhängend.
  • Die Länge des Cytochrom-o-Oxidase-Gens in E. coli beträgt 5,8 kb. Chepuri et al., J. Biol. Chem. 265, 11185–11192 (1990). Zusammenhängende Deletionen erfolgen typischerweise in einer geraden Anzahl von Resten, doch Einzeldeletionen oder eine ungerade Anzahl an Deletionen sind gemäß der Erfindung ebenfalls möglich.
  • Nucleinsäuresequenz-Insertionen sind Intrasequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Nucleotide innerhalb des Elektronenträger-Gens; sie reichen im Allgemeinen von etwa 1–5 Nucleotiden, am bevorzugtesten von 1–3. Insertionen erfolgen vorzugsweise in einer geraden Anzahl von Resten, doch dies ist nicht erforderlich.
  • Eine dritte Gruppe von Stammvarianten sind hierin Nucleinsäure-Substitutionsvarianten. Bei diesen Varianten ist zumindest eine Nucleinsäure innerhalb des Elektronenträger-Gens des nativen bakteriellen Moleküls entfernt und ein anderer Rest an ihrer Stelle insertiert. Substanzielle Modifikationen der Aktivität des Elektronenträger-Genprodukts erfolgen durch Auswahl von Substitutionen, die sich in folgenden Wirkungen signifikant unterscheiden: (a) Beibehaltung der Struktur des Ketten-Rückgrats im Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) Beibehaltung der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) Beibehaltung des Hauptteils der Seitenkette. Natürlich vorkommende Reste werden je nach gemeinsamen Seitenketten-Eigenschaften in Gruppen unterteilt:
    • (1) hydrophob: Norleucin, cys, met, ala, val, leu, tyr, phe, trp, ile;
    • (2) neutral hydrophil: ser, thr;
    • (3) sauer: asp, glu;
    • (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg; und
    • (5) Reste, die Kettenorientierung beeinflussen: gly, pro.
  • Vorzugsweise sind die Stammvarianten hierin jene mit einem E.-coli-W3110tonA-Hintergrund, worin das komplette Gen des Elektonenträgermoleküls deletiert ist, am bevorzugtesten worin das komplette Gen für den Cytochrom-o-Oxidase-Komplex entfernt wurde.
  • Genvarianten, die in ein bakteriellen Wirt des Wildtyps eingeführt werden, können mithilfe einer Vielzahl auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren gebildet werden. Dazu zählen u.a. Transposon-Mutagenese, wenn die Mutagenese in vivo erfolgt, oder In-vitro-Herstellung, z.B. durch Oligonucleotid-mediierte (oder ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning-Mutagenese, zufallsbestimmte Mutagenese, PCR-Mutagenese oder Kassetten-Mutagenese einer vorher erzeugten Variante oder einer Nicht-Varianten-Version des Elektronenträger-Gens.
  • Transposon-Mutagenese, ein bevorzugtes Verfahren, umfasst typischerweise Transduktionen mit dem Phagen P1kc (abgeleitet aus P1), wie dies z.B. durch Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, NY, USA, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)) beschrieben ist. Sie kann auch Transposon-Genetik umfassen, wie dies z.B. von Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116, 125–159 (1977), beschrieben ist.
  • Oligonucleotid-mediierte Mutagenese stellt ein bevorzugtes In-vitro-Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten des Elektronenträger-Gens dar, obwohl auch andere Verfahren in Betracht kommen. Diese Technik ist auf dem Gebiet allgemein bekannt und wird z.B. von Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982), beschrieben. Zusammenfassend gesagt wird die Elektronenträger-DNA durch Hybridisieren eines Oligonucleotids, das für die erwünschte Mutation kodiert, an ein DNA-Templat (eine DNA-Matrize) verändert, wobei das Templat bzw. die Matrize die Einzelstrang-Form eines Bakteriophagen oder Plasmids ist, das die unmodifizierte oder native DNA-Sequenz des Elektronenträger-Gens enthält. Nach der Hybridisierung wird DNA-Polymerase dazu verwendet, einen gesamten zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren (inkorporiert somit den Oligonucleotid-Primer), und kodiert für die ausgewählte Änderung in der Elektronenträger-DNA.
  • Im Allgemeinen werden Oligonucleotide einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid besitzt 12–15 Nucleotide, die auf beiden Seiten des bzw. der für die Mutation kodierenden Nucleotids/e komplett komplementär zur Matrize sind. Dies stellt sicher, dass das Oligonucleotid richtig an das einzelsträngige DNA-Matrizenmolekül hybridisiert. Die Oligonucleotide werden unter An wendung auf dem Gebiet bekannter Techniken problemlos synthetisiert, wie dies z.B. von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978), beschrieben ist.
  • Die DNA-Matrize kann durch jene Vektoren, die aus Bakteriophage-M13-Vektoren stammen (die im Handel erhältlichen M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind hierfür geeignet), oder durch jene Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung aufweisen, erzeugt werden; siehe Viera et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987). Somit kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren insertiert werden, um eine einzelsträngige Matrize zu bilden. Die Produktion der einzelstrangigen Matrize ist in den Kapiteln 4.21–4.41 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)), beschrieben.
  • Alternativ dazu kann eine einzelsträngige DNA-Matrize durch Denaturieren von doppelsträngiger Plasmid-DNA oder anderer DNA unter Anwendung von Standardtechniken hergestellt werden.
  • Ein nützliches Verfahren zur Identifikation bestimmter Nucleotide oder Regionen des Elektronenträger-Gens, die bevorzugte Stellen für die Mutagenese sind, wird als „Alanin-Scanning-Mutagenese" bezeichnet; siehe Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989). Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z.B. geladene Reste wie etwa arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure ersetzt (am bevorzugtesten Alanin oder Polyalanin), um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der wässrigen Umgebung in oder außerhalb der Zelle hervorzurufen. Jene Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, werden dann durch Einführen weiterer oder anderer Varianten an oder für die Substitutionsstellen „verfeinert". Während somit die Stelle zum Einführen einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt ist, muss die Art der Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, erfolgt Alanin-Scanning- oder zufallsbestimmte Mutagenese im Zielcodon oder in der Zielregion, und die exprimierten Elektronenträger-Varianten werden hinsichtlich der optimalen Kombination der erwünschten Aktivität gescreent.
  • Für die Modifikation der nativen DNA-Sequenz ist ein weiteres Verfahren die Kombination von Oligonucleotid-gerichteter Mutagenese und zufallsbestimmter Mutagenese, wie es von Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 (1987), beschrieben ist. In diesem Verfahren findet die Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese statt, um bestimmte Codons des Elektronträger-Gens des Wildtyps zu randomisieren, damit die Kodierung für alle möglichen Reste erfolgt. Es wird ein Pool von Oligonucleotiden mit komplementärer Sequenz (etwa 10–15 Basen), die das Codon der Wahl flankieren, verwendet. Das Codon der Wahl wird mit den Nucleotiden NNS ersetzt, wobei N jedes beliebige Nucleotid ist und S G oder C ist, um einen Pool von Oligonucleotiden zu ergeben, die für alle möglichen Aminosäuren in 32 Codons kodieren.
  • In diesem bevorzugten Verfahren wird ein pBR322-abgeleitetes Plasmid mit einem einzelsträngigen Replikationsursprung als einzelsträngige Plasmidmatrize in einem E.-coli-dut-ung-Stamm wie z.B. CJ236 erzeugt (Kunkel et al., s.o.). Diese zwei Mutationen im Stamm bewirken die Inkorporation einer oder mehrerer Uracil-Nucleotide in die einzelsträngige DNA anstelle von Thymin. Die Zufalls-Oligonucleotide werden anelliert, mit E.-coli-Phage-T7-DNA-Polymerase aufgefüllt, ligiert und in einen E.-coli-Stamm des Wildtyps wie z.B. W3110 transformiert. Der Stamm des Wildtyps korrigiert die Uracil-Fehlinkorporation unter Verwendung der synthetischen Strangmutante als Matrize, um etwa 90% Mutanten zu produzieren.
  • Mutanten-DNA kann in unterschiedlicher Weise erzeugt werden. Wenn die Aminosäuren in der Polypeptidkette in engem Abstand voneinander positioniert sind, können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonucleotids mutiert werden, das für alle der erwünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Wenn jedoch die Aminosäuren in einem gewissen Abstand voneinander angeordnet sind (um mehr als etwa 10 Aminosäuren getrennt), ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonucleotid zu bilden, das für alle erwünschten Veränderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren zur Anwendung kommen.
  • Im ersten Verfahren wird ein getrenntes Oligonucleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Matrizen-DNA anelliert, und der zweite DNA-Strang, der aus der Matrize synthetisiert ist, kodiert für alle erwünschten Aminosäuresubstitutionen. Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehrere Mutagenese-Runden, um die erwünschte Mutante zu produzieren. Die erste Runde erfolgt so, wie dies für die Einzelmutanten beschrieben ist: DNA des Wildtyps wird für die Matrize verwendet, ein für die erste(n) erwünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierendes Oligonucleotid wird an diese Matrize anelliert, und dann wird das Heteroduplex-DNA-Molekül gebildet. Die zweite Mutagenese-Runde verwendet die in der ersten Mutagenese-Runde produzierte mutierte DNA als Matrize. Somit enthält die Matrize bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n) erwünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierende Oligonucleotid wird dann an diese Matrize anelliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für Mutationen sowohl aus der ersten als auch aus der zweiten Mutagense-Runde. Die resultierende DNA kann dann als Matrize in einer dritten Mutagenese-Runde verwendet werden usw.
  • Die PCR-Mutagenese, ein auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekanntes Verfahren, eignet sich auch zur Herstellung von Nucleotidvarianten des Elektronenträger-Gens. Die PCR-Technik bezieht sich allgemein auf das Verfahren von Erlich, Hg., PCR Technology (Stockton Press, NY, USA (1989)), Kapitel von R. Higuchi, S. 61–70.
  • Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten – die Kassetten-Mutagenese – basiert auf der von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschriebenen Technik. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende Elektronenträger-DNA umfasst. Die Codon(s) in der zu mutierenden Elektronenträger-DNA wird bzw. werden identifiziert. Es muss eine einzigartige Restriktions-Endonuclease-Stelle auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) vorliegen. Wenn keine derartigen Restriktionsstellen existieren, können sie unter Anwendung des oben beschriebenen Oligonucleotid-mediierten Mutagense-Verfahrens erzeugt werden, um sie an den geeigneten Positionen in der Elektronenträger-DNA einzuführen. Nach dem Einführen der Restriktionsstellen in das Plasmid wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die DNA-Sequenz zwischen den Restriktionsstellen kodiert, aber die erwünschte(n) Mutation(en) enthält, wird mittels Standardverfahren synthetisiert.
  • Die zwei Stränge werden getrennt voneinander synthetisiert und dann unter Anwendung von Standardverfahren aneinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid bezeichnet man als Kassette. Diese Kassette ist ausgebildet, 3'- und 5'-Enden aufzuweisen, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt an das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte Elektronenträger-DNA-Sequenz.
  • Nucleinsäuremutanten können auch unter Anwendung beliebiger Verfahren chemisch synthetisiert und zusammengesetzt werden, bevor die Expression in einer Wirtszelle stattfindet; siehe z.B. Caruthers, US-Patent 4.500.707; Balland et al., Biochimie 67, 725–736 (1985); Edge et al., Nature 292, 756–762 (1982).
  • Man kann nicht davon ausgehen, dass bestimmte Deletionen und Insertionen – und insbesondere Substitutionen – radikale Veränderungen der Eigenschaften des Elektronenträgermoleküls nach sich ziehen. Wenn es schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion im Vorhinein vorherzusagen, kann man – wie dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung offenkundig ist – die Wirkung durch Routine-Screeningtests bewerten.
  • Beispielsweise kann eine DNA-Variante typischerweise durch Transposon-Mutagenese oder zufallsbestimmte und/oder stellenspezifische Mutagenese der nativen, für Elektronenträger kodierenden Nucleinsäure sowie Transfektion oder Integration der Elektronengträger-Genvariante in die Chromosomen eines bakteriellen Wirts bzw. durch zufallsbestimmte Mutagenese eines das native Elektronenträger-Gen enthaltenden Wirts hergestellt werden. Die Nucleinsäurvariante kann dann in einem geeigneten Screeningtest hinsichtlich der erwünschten Eigenschaft gescreent werden. Beispielsweise werden in einer Ausführungsform die Cytochrom-d-Oxidase-Deletionsmutanten-Stämme mittels spektroskopischer Analyse isolierter zytoplasmatischer Membranen oder durch das Unvermögen, DO2-Instabilitäten zu induzieren, auf Cytochrom-d-Oxidase-Komplex-Aktivität getestet (siehe Beispiel III). Stamm-Mutanten mit erhöhter DO2-Stabilität werden ausgewählt.
  • Wenn die für die Elektronenträgervariante kodierende Nucleinsäure außerhalb der bakteriellen Wirtszelle produziert wird, die schlussendlich das Polypeptid von Interesse erzeugt, wird die Nucleinsäure unter Anwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens in die zweckmäßige bakterielle Zelle eingeführt, z.B. mittels Transfektion und Transformation durch einen Vektor, der die Elektronenträger-DNA-Variante enthält; und vorzugsweise mittels Integration in das Chromosom der bakteriellen Zellen unter Anwendung jedes in Frage kommenden Verfahrens auf dem der Erfindung. Ein Beispiel für die Insertion des Elektronenträger-Gens in das Wirtsgenom sieht die Verwendung von E.-coli-Spezies als Wirt vor. In diesem Fall ist im Transformationsvektor eine DNA-Sequenz enthalten, die zu einer in genomischer E.-coli-DNA vorgefundenen Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von E. coli mit diesem Vektor führt zu homologer Rekombination mit dem Genom und zur Insertion der Elektronenträger-Genvariante in das Chromosom. Dem Wirt fehlt es hierbei entweder am korrespondierenden nativen Elektronenträger-Gen, oder sein natives Elektronenträger-Gen wird nach der Integration durch die korrespondierende Genvariante ersetzt.
  • Beispiele für Bakterienmutanten, die auf eingeschränkte Elektronentransportketten Aktivität gescreent werden können, um zu ermitteln, ob sie sich zur Verwendung in der Erfindung eignen, sind in folgenden Publikationen angeführt: Oden et al., s.o.; Oden und Gennis, J. Bacteriol., s.o.; Kelly et al., s.o.; luchi et al., s.o.; Soberon et al. (1990), s.o.; Poole et al., s.o.; Fang et al., s.o.; James et al., s.o.; Green et al., J. Biol. Chem. 263, s.o.; Soberon et al. (1989), s.o.; Sharma et al., s.o.; Yang, s.o.; Matsushita und Keback, s.o.; Tamura-Lis und Webster, Arch. Biochem. Biophys., s.o.; Green und Gennis, J. Bacteriol., s.o.; Bryan und Kwan, s.o.; Willison et al., s.o.; Willison und Haddock, s.o.; Hoffman et al. (1990), s.o.; Hoffman et al. (1979), s.o.; Haddock und Sheirer, s.o.; Haltia et al., s.o.; Dikshit et al., s.o.; Lemieux et al., s.o.; Minagawa et al., s.o.; Dasse et al., s.o.; Williams et al., s.o.; Puustinen et al., Biochemistry, s.o.; Denis et al., s.o.; Chepuri et al., Biochim. Biophys. Acta, s.o.; Andersson und Roth, s.o.; Puustinen et al., FEBS Lett., s.o.; Daldal, s.o.; Poole und Williams, s.o.; Georgiou et al., s.o.; O'Brian und Maier, s.o.; Green et al., J. Biol. Chem. 259, s.o.; Au et al., J. Bacteriol. 157, s.o.; Matsushita et al., s.o.; Sasarman, s.o.; Van der Oost et al., s.o.; Deutch, s.o.; Mogi et al., s.o.; Tron und Lemesle-Meunier, s.o.; Shioi et al., s.o.; Oden und Gennis, J. Cell. Biol., s.o.; Webster und Georgiou, s.o.; Terriere et al., s.o.; Green und Gennis, Fed. Proc. 41, s.o.; Tamura-Lis und Webster, Fed. Proc. 41, s.o.; Green et al., Fed. Proc. 40, s.o.; Willison und John, s.o.; und Hashimoto und Hino, s.o.
  • Die das mutierte Elektronenträger-Gen tragenden bakteriellen Zellen können inhärent auch das Polypeptid von Interesse aufweisen. Beispielsweise ist alkalische Phosphatase ein Protein, das zu E. coli homolog ist und ohne weitere Transfektion der Zelle mit Vektor-DNA induziert werden kann. Für heterologe Polypeptide wie etwa IGF-I und Wachstumshormon wird die heterologe Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) günstigerweise in einen replizierbaren Vektor zwecks Expression im bakteriellen Kulturmedium unter der Steuerung eines geeigneten Promotors für Bakterien insertiert. Es stehen zu diesem Zweck zahlreiche Vektoren zur Verfügung, wobei die Auswahl des geeigneten Vektors hauptsächlich von der Größe der in den Vektor zu insertierenden Nucleinsäure und von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle abhängt. Jeder Vektor enthält je nach seiner Funktion (Amplifikation oder Expression von DNA) und der jeweiligen Wirtszelle, mit der er kompatibel ist, verschiedene Komponenten. Zu den Vektorkomponenten für die bakterielle Transformation zählen im Allgemeinen u.a. eine Signalsequenz, ein Replikationsursprung, ein oder mehrere Marker-Gene und ein Promotor.
  • Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuersequenzen enthalten, die aus mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies stammen, in Verbindung mit bakteriellen Wirten verwendet. Der Vektor trägt üblicherweise eine Replikationsstelle sowie Markiersequenzen, die für phänotypische Selektion in transformierten Zellen sorgen können. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322, einem Plasmid aus einer E.-coli-Spezies, transformiert (siehe z.B. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit eine praktische Möglichkeit dar, transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR322-Plasmid bzw. ein anderes mikrobielles Plasmid oder ein anderer mikrobieller Phage enthält im Allgemeinen auch Promotoren (bzw. ist modifiziert, um sie zu enthalten), die vom mikrobiellen Organismus zur Expression selektierbarer Marker-Gene verwendet werden können.
  • Die für das Polypeptid von Interesse kodierende DNA kann hierin nicht nur direkt, sondern auch als Fusion mit einem weiteren Polypeptid exprimiert werden, vorzugsweise mit einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Polypeptids. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann Teil der Polypeptid-DNA sein, die in den Vektor insertiert ist. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz sollte solcherart sein, dass sie von der Wirtszelle erkannt und verarbeitet wird (d.h. von einer Signal-Peptidase gespalten). Für bakterielle Wirtszellen, die die native Polypeptid-Signalsequenz nicht erkennen und verarbeiten, wird die Signalsequenz durch eine ausgewählte bakterielle Signalsequenz substituiert, z.B. aus der Gruppe, die aus der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern besteht.
  • Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz solcherart, dass sie die Replikation des Vektors unabhängig von der chromosomalen Wirt-DNA ermöglicht und Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen enthält. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl an Bakterien allgemein bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 eignet sich für die meisten gramnegativen Bakterien. Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten im Allgemeinen auch ein Selektions-Gen, das auch als selektierbarer bzw. auswählbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum transformierter Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium gezüchtet werden, notwendig ist. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektions-Gen enthält, überleben nicht im Kulturmedium. Typische Selektions-Gene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus Komplexmedien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase für Bacilli kodierende Gen. Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle zu stoppen. Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, produzieren ein Protein, das Medikamentenresistenz verleiht, und können solcherart den Selektionsprozess überleben.
  • Der Expressionsvektor zur Herstellung eines heterologen Polypeptids enthält auch einen Promotor, der vom bakteriellen Wirtsorganismus erkannt wird und operabel mit der für das Polypeptid von Interesse kodierenden Nucleinsäure verbunden ist. Mit bakteriellen Wirten zu verwendende Promotoren sind z.B. β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978), Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), und EP 36.776 ) und Hybridpromotoren wie etwa der tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Andere bekannte bakterielle Promotoren kommen aber ebenfalls in Frage. Ihre Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sie operabel mit für das Polypeptid von Interesse kodierender DNA ligieren können (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)); dies erfolgt unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, um allenfalls erforderliche Restriktionsstellen zu liefern. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch im Allgemeinen eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel mit der für das Polypeptid von Interesse kodierenden DNA verbunden ist. Der Promotor kann aus der bakteriellen Quellen-DNA durch Restriktionsenzym-Verdauung entfernt und in den die erwünschte DNA enthaltenden Vektor insertiert werden.
  • Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, sieht die Anwendung herkömmlicher Ligationstechniken vor. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der zur Erzeugung der erforderlichen Plasmide gewünschten Form religiert.
  • Für die Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische dazu verwendet, E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) oder andere Stämme zu transformieren, wobei erfolgreiche Transformanten durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz (wo erforderlich) ausgewählt werden. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktions- Endonuclease-Verdauung analysiert und/oder gemäß dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977), gemäß dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder gemäß dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
  • Die bakteriellen Wirtszellen, die zur Expression der für das Polypeptid von Interesse kodierenden Vektoren dienen, sind jene, die zumindest eine operable Elektronenträger-Komponente enthalten, die die Elektronentransportkette vermittelt, so dass der Atmungsweg der Zellen nicht zur Gänze beeinträchtigt ist. Im hierin erläuterten Verfahren ist ein für diesen Zweck geeigneter Stamm typischerweise einer, der so mutiert ist, dass einer – aber nicht alle – seiner nativen Elektronenträger inaktiviert ist. Vorzugsweise erfolgt diese Inaktivierung durch Ersetzen des nativen Elektronenträger-Gens mit einer Elektronenträger-Genvariante, die homolog zum nativen Elektronenträger-Gen ist, das sich normalerweise in den Wirtszellen befindet.
  • Alle Bakterien, einschließlich sowohl Archaebacteria und Eubacteria, besitzen im Allgemeinen mehr als eine terminale Oxidase (Anraku und Gennis, s.o.), so dass alle mit Ausnahme obligater Aerobier potentiell für DO2-Instabilitäten bei Kultivierung anfällig sind. Zweckdienliche Bakterien sind aerobe und fakultative anaerobe Bakterien, z.B. Archaebacteria oder Eubacteria, insbesondere Eubacteria, am bevorzugtesten Enterobacteriaceae. Beispiele für nützliche Bakterien sind Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla und Paracoccus. Geeignete E.-coli-Wirte sind E. coli W3110 (ATCC 27.325). E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B und E. coli X1776 (ATCC 31.537). Diese Beispiele sind lediglich veranschaulichend und nicht einschränkend. Zellmutanten beliebiger der oben angeführten Bakterien sind auch möglich. Es ist natürlich notwendig, die geeigneten Bakterien unter Berücksichtigung der Replizierbarkeit des Replikons in den Zellen eines Bakteriums auszuwählen. Beispielsweise können E.-coli-, Serratia- oder Salmonella-Spezies günstigerweise als Wirt verwendet werden, wenn allgemein bekannte Plasmide wie etwa pBR322, pBR325, pACYA177 oder pKN410 zur Bereitstellung des Replikons dienen.
  • E.-coli-Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Stammwirt, da er ein gemeinsamer Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert sein, um eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen zu bewirken; Beispiele für solche Wirte sind E.-coli-W3110-Stamm 1A2, der den kompletten Genotyp tonAΔ besitzt; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den kompletten Genotyp tonAΔ ptr3 besitzt; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den kompletten Genotyp tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kanr besitzt; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den kompletten Genotyp tonAΔptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kanr rbs7Δ ilvG besitzt; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer Nicht-Kanamycinresistenten degP-Deletionsmutation; und ein E.-coli-Stamm mit periplasmatischer Protease-Mutation (offenbart in US-Patent 4.946.783 vom 7. August 1990). Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren der Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die je nach verwendetem Promotor modifiziert sind. Die Transformation bedeutet die Einführung von DNA in einen Organismus, so dass die DNA replizierbar ist – entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integranten. Je nach der verwendeten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Anwendung von für solche Zellen geeigneten Standardtechniken. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid (beschrieben in Kapitel 1.82 von Sambrook et al., s.o.) wird im Allgemeinen für bakterielle Zellen gewählt, die beträchtliche Zellwandbarrieren aufweisen. Ein weiteres Verfahren zur Transformation sieht die Verwendung von Polyethylenglykol/DMSO vor (beschrieben in Chung und Miller, Nucleic Acids Res. 16, 3580 (1988)). Ein weiteres Verfahren ist die Anwendung der als Elektroporation bezeichneten Technik.
  • Bakterielle Zellen zur Produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids von Interesse werden in geeigneten Medien kultiviert, in denen der Promotor konstitutiv oder artifiziell induziert werden kann, wie dies allgemein z.B. in Sambrook et al., s.o., erläutert ist. Beispiele für geeignete Medien sind weiter unten im Beispielteil angeführt.
  • Notwendige Ergänzungen neben Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganischen Phosphatquellen können in zweckmäßigen Konzentrationen enthalten sein; sie werden alleine oder als Gemisch mit anderen Zusatzstoffen oder Ergänzungsmedium wie z.B. einer komplexen Stickstoffquelle zugegeben.
  • Wenn das Polypeptid alkalische Phosphatase ist, ist die Zusammensetzung der Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquelle des Nährstoffmediums vorzugsweise solcherart, dass während der Phase intensiver Polypeptid-Akkumulation der Glucoseanteil des Mediums etwa 0%, der Phosphatgehalt mehr als etwa 0,5 mM und weniger als etwa 5 mM und die Stickstoffkonzentration höchstens etwa 30 μg/ml beträgt. Die Glucosezufuhr findet vorzugsweise während der Übergangsphase statt. Das Fermentationsmedium wird vorzugsweise intensivem Mischen unterworfen, wobei die Fermentation vorzugsweise bei etwa 25°C–40°C, noch bevorzugter bei etwa 37°C, stattfindet.
  • Die Gen-Expression kann direkt in einer Probe gemessen werden, z.B. durch konventionelles Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren. Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980). Es können verschiedene Marker verwendet werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere 32P. Andere Techniken kommen allerdings auch in Frage, z.B. unter Anwendung von Biotinmodifizierten Nucleotiden für die Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Stelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer Vielzahl an Markern markiert sein können, z.B. mit Radionucliden, Fluoreszenzmitteln, Enzymen o.dgl.
  • Das Polypeptid von Interesse wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus dem Periplasma oder Kulturmedium gewonnen, obwohl es auch aus Wirtszelllysaten im Falle direkter Expression ohne Sekretionssignal gewonnen werden kann. Alternativ dazu können die Zellen oder Abschnitte davon als Biokatalysatoren oder für andere Funktionen ohne umfangreiche Reinigung verwendet werden.
  • Es ist oft vorzuziehen, das Polypeptid von Interesse aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen in Bezug auf das Polypeptid von Interesse homogen sind. In einem ersten Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Die Membran und lösliche Proteinfraktionen können dann gegebenenfalls voneinander getrennt werden. Das Polypeptid kann dann aus der löslichen Proteinfraktion und der Membranfraktion des Kulturlysats gereinigt werden – dies hängt davon ab, ob das Polypeptid membrangebunden, löslich oder in aggregierter Form vorhanden ist. Das Polypeptid wird anschließend solubilisiert und gefaltet (falls erforderlich) und aus kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Vorgangsweisen Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren sind: Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolfällung; RP-HPLC; Chromatographie auf Silica oder einem Kationenaustauschharz wie etwa DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; und Gelfiltration z.B. mit Sephadex G-75.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine speziell konfigurierte Fermentationsvorrichtung verwendet, um die Neigung einer bestimmten bakteriellen Zellkultur zu DO2-Instabilität während des Verlaufs einer großtechnischen bakteriellen Fermentation zu ermitteln. Dieses Kontrollverfahren verwendet einen kleinen Fermenter. Der Fermenter ist solcherart konfiguriert, dass die DO2-Konzentration in der gesamten Zellkultur während der Fermentation nicht homogen ist. Diese Nicht-Homogenität kann in unterschiedlicher Weise erzielt werden. Eine bevorzugte Möglichkeit besteht darin, den Fermenter an seiner Spitze mit einem Einlass auszustatten, um Kohlenstoff/Energie-Quelle zuzuführen. Eine weitere Konfiguration sieht vor, den Fermenter nur mit zwei Impellern und nicht mit den üblichen drei auszustatten, so dass an der Fermenterspitze mangelhafte Vermischung stattfindet. Vorzugsweise sind sowohl der Einlass für die Kohlenstoff/Energie-Quelle als auch die zwei Impeller in der Fermentervorrichtung vorgesehen. Ein weiteres bevorzugtes Merkmal ist ein Fermenter mit nur einer Sonde für DO2, aber auch einer Redoxsonde zur Messung des Redoxpotentials. Diese Sonden sind vorzugsweise in unmittelbarer Nähe des untersten Impellers am Fermenter montiert.
  • Die bevorzugteste Ausführungsform für dieses Verfahren ist ein 10-l-Fermenter, der schematisch in 1 dargestellt ist. In dieser Abbildung ist das Gefäß 1 mit zwei Im pellern, einem unteren (3) und einem oberen (5) Impeller, versehen; vorzugsweise handelt es sich um Rushton-Impeller, die an einer vertikalen Welle 7 angebracht sind und normalerweise bei 150–1.000 U/min betrieben werden. Die zwei Impeller befinden sich deutlich (d.h. um zumindest ¼ des gesamten Kulturvolumens) unterhalb der Oberfläche 9 des Fermentationsmediums. Ein Gaseinlassmittel 11, vorzugsweise ein Ringluftverteiler oder rotierender Luftverteiler, wird zum Einführen von Luft in den Fermenterboden verwendet und vorzugsweise bei etwa 10 Standardlitern/min betrieben.
  • Eine DO2-Sonde 13 (vorzugsweise an der Kesselwand in der Nähe des unteren Impellers 3 montiert) misst die Konzentration von im Fermentationsmedium gelöstem (und daher für den Organismus zugänglichem) Sauerstoff am Kesselboden. Dieses Signal wird vor einem Kontroll- und Steuerungscomputer übermittelt, der die Zufuhrrate der Kohlenstoff/Energie-Quelle für die Bakterien (wie z.B. Glucose) in den Fermenter reguliert. Der Tank ist auch mit einer Redox-Sonde 15 ausgestattet, die vorzugsweise an der Tankwand auf gleicher Höhe wie die DO2-Sonde in der Nähe des unteren Impellers 3 montiert ist. Diese Redoxsonde misst das Redoxpotential des Mediums; dies geschieht durch ein Signal zur Weiterleitung des Ausgangssignals für das Redoxpotential. In dieser Konfiguration wird die Kohlenstoff/Energie-Quelle durch ein Flüssigkeitseinlassmittel 17 wie z.B. einen Schlauch in den oberen Bereich des Kessels eingeleitet. Der Zulauf in die den oberen Bereich des Kessels ist nicht dargestellt; sie dient dazu, NH4OH bedarfsgemäß zuzusetzen, um den pH-Wert der Kulturlösung zu regulieren. Ein weiterer Zulauf in den oberen Bereich des Kessels, der für die langsame Zufuhr komplexer Nährstoffe dient, ist ebenfalls nicht zu sehen.
  • Das Verfahren zur Bestimmung der Neigung einer bakteriellen Zellkultur zu DO2-Instabilität in großtechnischen Fermentern umfasst das Kultivieren von Bakterien, die die in einem Fermentationsmedium zu exprimierende erwünschte DNA enthalten, im oben beschriebenen Gefäß. Während des anfänglichen Kultivierungsschritts wird eine Kohlenstoff/Energie-Quelle für die Bakterien, z.B. Glucose, mit einer vorbestimmten Zufuhrrate in das Fermentationsmedium geleitet. In 1 würde diese Zufuhr durch das obere Einlassmittel 17 des Fermenters erfolgen. Luft wird dem Fermenterboden zugeführt. In 1 wird Luft durch das Bodeneinlassmittel 11 in das Fermentationsmedium befördert. Das Redoxpotential und die DO2-Konzentration des Fermentationsmediums werden während der Fermentation mittels der dafür vorgesehenen Sonden 13 bzw. 15 überwacht.
  • Wenn eine signifikante Zellmasse akkumuliert ist, d.h. wenn die Kultur über ausreichend Sauerstoff-Aufnahmekapazität verfügt, um die Sauerstoff-Übertragungsrate des Reaktors zu übersteigen, d.h. etwa 10–50 g/l Zellen (Trockengewicht), wird die Zufuhrrate der Kohlenstoff/Energie-Quelle gesteigert, um DO2 von seinem Sollwert auf einen niedrigeren Wert zu bringen. Diese Zunahme der Zufuhrrate ist vorzugsweise nur eine geringe Erhöhung, so dass DO2 langsam verringert wird. Eine signifikante Nicht-Linearität in der DO2-Abnahme (d.h. ein Übergang von einem graduellen zu einem raschen Abfall im Graphen der DO2-Konzentration über die Zeit) und/oder die Fähigkeit, DO2-Schwankungen bei der höheren, experimentell ermittelten, kritischen Glucose-Zufuhrrate hervorzurufen, weisen auf die Neigung der Kultur hin, DO2-Instabilitäten zu bewirken.
  • Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind keinesfalls einschränkend.
  • Beispiele
  • Einleitung
  • Es stellte sich heraus, dass der Organismus, wenn er zuvor hinsichtlich der Gegenwart von Menachinon und des Cytochrom-d-Oxidase-Komplexes induziert wurde, die Fähigkeit besitzt, niedrige Sauerstoffkonzentrationen einzufangen; dies erfolgt aber in unzureichendem Ausmaß. Wenn ausreichend Sauerstoff vorhanden ist, scheint dieser ineffiziente Weg nicht zu funktionieren.
  • Eine Untersuchung der Stöchiometrie des Zellwachstums zeigt die Folgen der unzureichenden, durch Menachinon unterstützten Nutzung von Sauerstoff. Die C-H-O-N Zusammensetzung von E. coli ist etwa C4,18H7,36N1O2,03. Die das aerobe Wachstum beschreibende Gleichung kann wie folgt lauten: a C5H16O6 + b O2 + c NH3 = d C4,18H7,36H1O2,03 + e CO2 + f H2O
  • Unter Anwendung dieser Gleichung können die Mol an pro Mol Glucose verbrauchtem Sauerstoff als Funktion der Wachstumsausbeute geschätzt werden, wie dies die nachfolgende Tabelle zeigt:
  • Figure 00310001
  • Wenn eine E.-coli-Kultur, die den Cytochrom-d-Oxidase-Komplex und Menachinon exprimierte, auf einen Bereich niedriger DO2-Konzentration stößt, kann das Cytochrom-o-Oxidase-System mit seiner geringeren Affinität für Sauerstoff die aerobe Atmung nicht mehr unterstützen. Somit muss der Cytochrom-d-Oxidase-vermittelte Atmungsweg verwendet werden. Der Wechsel auf den ineffizienten Atmungsweg reduziert die ATP-Versorgung und bewirkt eine niedrigere Wachstumsausbeute. In der Folge nimmt der pro mol zugeführter Glucose verbrauchte Sauerstoff zu. Da sich das Gefäß bereits in einem Zustand befindet, der lokale Regionen niedriger DO2-Konzentrationen zulässt, weitet der gesteigerte Sauerstoffverbrauch den Bereich niedriger DO2-Konzentration aus, sofern die Glucose-Versorgung konstant bleibt. Dies bewirkt, dass mehr Zellen auf den ineffizienten Weg überwechseln, und erhöht die lokale und gesamte Sauerstoffnachfrage.
  • Somit besteht eine Tendenz zu schneller, selbst-propagierender Verlagerung zu höheren Atmungsraten und niedrigen DO2-Konzentrationen im gesamten Tank. Diese Entwicklung hört nur dann auf, wenn es ausreichend Restsauerstoff-Übertragungskapazität gibt (durch Zunahme der Sauerstoff-Triebkraft bei sinkender DO2-Konzentration), um die höhere Rate der Sauerstoffnutzung, die mit der ineffizienten Atmung einhergeht, zu unterstützen. Da es wünschenswert ist, die maximale Sauerstoff-Übertragungskapazität des Fermenters voll auszunutzen, reicht jede über schüssige Kapazität, die im normalen Betrieb zur Verfügung steht, wahrscheinlich nicht aus, und die DO2-Konzentration im gesamten Gefäß wird in Richtung 0 gesenkt.
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Mitteln vor, die notwendig sind, um diese Tendenz des Effizienzverlusts während des Betriebs infolge dieser selbstpropagierenden Verlagerung zu überwinden.
  • Aufschlussreiche Daten wurden durch Modifizieren des großen Fermenters erhalten, welche Modifikationen darauf abzielten, den DO2-Wert sowohl im unteren als auch im oberen Bereich des Gefäßes zu überwachen. Ein modifizierter 10-l-Fermenter diente dann dazu, die DO2-Instabilitäten im großen Fermenter zu replizieren. Mutationen in den Cytochrom-Oxidase-Komplexen dienten dazu, den Wechsel zwischen Atmungswegen als biologischen Ursprung der DO2-Instabilitäten zu bestätigen. Die mutierten Wirte wurden auch hinsichtlich ihrer Eignung zur Produktion heterologer rekombinanter Proteine bewertet. Überraschenderweise erwies sich die Cytochrom-o-Oxidase-Mutante gegenüber der Cytochrom-d-Oxidase-Mutante als überlegen und erzeugte gleiche Mengen des Produkts wie der unmutierte isogene Vergleichswirt im unmodifizierten 10-l-Fermenter.
  • Beispiel I
  • Identifikation des DO2-Instabilitätsproblems im 1.000-l-Fermenter
  • i. Konstruktion von Wirtszellstamm 27C7
  • Der Wirt, der zur Produktion von rekombinantem Human-IGF-I in der in diesem Beispiel beschriebenen Fermentation verwendet wurde, war ein Derivat von E. coli W3110 mit der Bezeichnung 27C7. Der komplette Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41 kanr. Die Abstammung des Wirts 27C7 ist in 2 schematisch dargestellt und nachstehend erläutert. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt.
  • Stamm 27C7 wurde in mehreren Schritten unter Anwendung von Techniken konstruiert, die Transduktionen mit aus P1 abgeleitetem Phagen P1kc (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, NY, USA, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)) und Transposon-Genetik (Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116, 125–159 (1977)) vorsahen. Der verwendete Ausgangswirt war E. coli K12 W3110, der ein K12-Stamm ist, der F-, λ- ist (Bachmann, Bact. Rev. 36, 525–557 (1972); Bachmann, „Derivatives and Genotypes of Some Mutant Derivatives of Escherichia coli K-12", S. 1190–1219, in F. C. Niedhardt et al., Hg., Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Bd. 2, American Society for Microbiology, Washington, DC, USA (1987)).
  • Zunächst wurde ein tonA-Gen (fhuA) (Kadner et al., J. Bact. 143, 256–264 (1980), Bachmann, Microbiol: Rev. 47, 180–230 (1983), Bachman, „Linkage Map of Escherichia coli K-12", 7. Auflage, S. 807–876, in F. C. Niedhardt et al.; Hg., „Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology", Bd. 2, American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1987) aus W3110 deletiert, und zwar durch die Insertion und anschließende ungenaue Exzision eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen. Diese Konstruktion ist schematisch in 3B und 4 dargestellt.
  • Im ersten Schritt dieses Verfahrens wurde E. coli W3110 mit λ::Tn10 transduziert, um einen Tn10-Hop-Pool von E. coli W3110 zu erzeugen (Kleckner et al., J. Mol. Biol., s.o.).
  • Der E.-coli-W3110::Tn10-Hop-Pool wurde in L-Kulturlösung bei 37°C bis zu einer Zelldichte von etwa 1 × 109/ml gezüchtet. Insgesamt 0,5 ml Kultur wurden zentrifugiert und das Pellet in 0,2 ml eines λphi80-Lysats mit 7,0 × 109 pfu resuspendiert. Man ließ den Phagen 30 Minuten lang bei 37°C adsorbieren. Die Suspension wurde dann auf mit Tetracyclin (15 μg/ml) ergänzten EMB-Platten ausgebreitet. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Kolonien in 3 ml L-Kulturlösung gepoolt, über Nacht bei 37°C gezüchtet, zwei Mal gewaschen und in L-Kulturlösung resus pendiert. Ein Bakteriophage-P1kc-Lysat wurde auf dieser Kultur gebildet (Miller, J. H., Experiments in Molecular Biology, s.o., S. 304).
  • E. coli AT982 (NR. 4546, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, CT, USA) wurde durch dieses P1kc-Lysat zu Tetracyclin-Resistenz transduziert. Die Transduktanten wurden auf L-Kulturlösung-Platten (ergänzt mit Tetracyclin (15 μg/ml) und 40 μg/ml Diaminopimelinsäure (dap)) ausgewählt. Die resultierenden Transduktanten wurden hinsichtlich Tetracyclin-Resistenz und die Regeneration des dap-Gens (dap+, tetR) gescreent. Transduktanten mit dem dap+-tetR-Genotyp wurden dann auf λphi80-Resistenz getestet.
  • P1kc-Lysate wurden dann auf mehreren dap+-tetR-λphi80-resistenten Stämmen gebildet. Die Lysate wurden dazu verwendet, E. coli W3110 zu Tetracyclin-Resistenz zu transduzieren. Die Transduktanten wurden hinsichtlich λphi80-Resistenz gescreent und ausgewählt.
  • Tetracyclin-sensitive Isolate wurden aus den W3110-tonA::Tn10-λphi80R-Transduktanten ausgewählt (Maloy und Nunn, J. Bacteriol. 145, 1110 (1981)). Diese Isolate wurden nach Einzelkolonie-Reinigung auf λphi80-Resistenz und Tetracyclin-Sensitivität überprüft.
  • DNA wurde aus mehreren Tetracyclin-sensitiven λphi80-resistenten Mutanten isoliert und mit SstII verdaut. Die mit Sst-II verdaute DNA wurde mittels Southern-Blotting unter Verwendung von radioaktiv markierter und mit SstII verdauter λ::Tn10-DNA als Sonde charakterisiert, um zu bestimmen, ob Tn10 exzidiert worden war (Davis et al., Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, USA, 1980)). Eines der Tetracyclin-sensitiven Isolate hatte, wie aufgezeigt wurde, 2 der Tn10-Hybridisierungsbanden verloren – im Vergleich zur Hybridisierung zwischen DNA aus λ::Tn10 und dem elterlichen W3110-tonA::Tn10λphi80R. Eine dritte Hybridisierungsbande wies veränderte Mobilität auf, was ein Indikator dafür ist, dass eine durch die ungenaue Exzision von Tn10 hervorgerufene Deletion stattgefunden hatte.
  • SDS-Gel-Elektrophorese von Außenmembran-Präparaten aus dem Stamm mit einer ungenauen Tn10-Exzision zeigte, dass die Bande, von der man annahm, dass sie das Protein ist, für das tonA kodiert, eine andere elektrophoretische Mobilität als das Protein des Wildtyps aufwies, für das das tonA-Gen kodiert. Das resultierende Protein war als λphi80-Phage-Rezeptorprotein nicht-funktionell. Ein zweiter unabhängiger Stamm, der ebenfalls ungenaue Exzision von Tn10 unterworfen worden war, wies auf dem SDS-Gel kein Protein auf, für das TonA kodiert.
  • Keiner dieser Stämme zeigte Reversion zu Tetracyclin-Resistenz oder λphi80-Anfälligkeit – ein Indikator dafür, dass eine ungenaue Exzision der Gesamtheit oder eines Teils des Tn10-Transposons gemeinsam mit einer partiellen oder kompletten Deletion des tonA-Gens vorlag. Somit wurde das Protein, für das das tonA-Gen kodiert (Molekulargewicht 78.000) aus der Außenmembran eliminiert, wodurch der W3110-tonA-Stamm gegenüber mehreren Bakteriophagen resistent wurde. Der als 1A2 bezeichnete resultierende Stamm ist gegenüber den Bakteriophagen T1 und φ80 resistent.
  • Das ptr3-Gen (Cheng et al., J. Bacteriol. 140, 125–130 (1979)) wurde wie folgt in Stamm 1A2 eingesetzt. Zunächst wurde die thyA8-Mutation in 1A2 isoliert, indem hinsichtlich Trimethoprim-Resistenz gescreent wurde, um Stamm 9E1 zu bilden. Dann wurde der argA81:an10-Locus von 9D9 (erhalten von B. Bachman, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, CT, USA) mittels Transduktion mit Phagen P1kc in 9E1 transportiert, um 9E3 zu bilden. Der ptr3-Locus befindet sich zwischen thyA8 und argA81. Die Transduktion mit P1-Phagen (gezüchtet auf einer ptr3-Mutante (9D7, J. Bact. 140, 125 (1979)) führte zur Einführung der ptr3-Mutation gleichzeitig mit der Umwandlung von thyA8 und argA81::Tn10 in Loci des Wildtyps. Diesem als 9E4 bezeichneten Stamm fehlt es an der periplasmatischen Protease III. Die Schlussfolgerung, dass die ptr3-Mutation in 9E4 enthalten ist, wird durch die stark verbesserte IGF-I-Akkumulation im resultierenden Stamm unterstützt.
  • Anschließend wurden zwei weitere Deletionsmutationen, phoAΔE15 (Sarthy et al., J. Bacteriol. 145, 288–292 (1981)) und Δ(argF-lac)169 (Schweizer und Boos, Mol. Gen. Genet. 192, 293–294 (1983)) gleichzeitig in 9E4 übertragen; dies erfolgte durch genetische Verknüpfung mit einem Kanamycin-Resistenz-Transposon, das in ein biosynthetisches Prolin-Gen insertiert war (proC::Tn5). Dieses war in 6D3, zur Verfügung gestellt von Prof. Barry Wanner, Purdue University, enthalten. Diese Konstruktion ist schematisch in 3B dargestellt.
  • Das Transposon wurde durch Selektion hinsichtlich eines prototrophen (pro+) Isolats auf Glucose-Minimalagar-Platten nach P1-Transduktion mit 1A2 eliminiert. Das Einführen der phoA-Mutation eliminiert die Expression alkalischer Phosphatase und wurde als Transduktanten erkannt, die weiße Kolonien auf Glucose-Minimalagar-Platten mit 0,2 mM Phosphat und 20 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat bilden. Ebenso bewirkt die Δ(argF-lac)169-Mutation den Verlust des Enzyms β-Galactosidase, einem lac-Phänotyp, und führt zu Zellen, die weiße Kolonien auf MacConkey-1%-Lactose-Agarplatten bilden. Der resultierende Stamm wurde als 27A7 bezeichnet.
  • Die ompT-Deletion (Earhart et al., FEBS Microbiol. Lett 6, 277–280 (1979)) wurde durch P1-Cotransduktion in 27A7 eingeführt. Es ist zu beachten, dass sich diese ompT-Deletion in den benachbarten ent-Gen-Cluster erstreckt, der für die Befestigungsproteine für Colicine B und D kodiert. Zunächst wurde eine verbundene Tn10-Insertion im purE-Gen neben der ompT-Deletion unter Anwendung herkömmlicher Transduktionstechniken insertiert (Zwischenprodukte 3E9, ein ähnlicher Stamm ist von Dr. Carol Gros, University of Wisconsin, erhältlich), 16B2, 25C9 (J. Bacter. 153, 1104–1106 (1983)) und 25D3). Dann wurde purE::Tn10 in 27A7 transduziert. Schließlich wurde dieser Stamm zu Purin-Prototrophie transduziert, um das Transposon zu entfernen. Die Beibehaltung des ompTΔ-Genotyps wurde durch Colicin-B-Resistenz im resultierenden Stamm bestätigt, der als 27C6 bezeichnet wurde. Diesem Stamm fehlt die Außenmembran-Protease VII.
  • Schließlich wurde eine zusätzliche periplasmatische Protease-Mutation, degP41kanr (Strauch et al., J. Bacteriol. 171, 2689–2696 (1989); Harvard Medical School) unter Anwendung herkömmlicher Techniken in Stamm 27C6 transduziert. Diese Mutation wurde in vitro konstruiert, indem ein Abschnitt des degP-Gens mit dem Kanamycin- Gen ersetzt wurde. Es handelte sich dabei nicht um ein Transposon, doch dies ermöglicht die Auswahl der Deletion unter Anwendung von Kanamycin-Resistenz.
  • Dieser Stamm, 27C7, besitzt die folgenden Eigenschaften: Er ist Phage-resistent, es fehlen ihm 3 Proteasen, er kann nicht auf Lactose wachsen, und er kann keine alkalische Phosphatase nach Schwund von Phosphat im Medium produzieren – die gleichen Bedingungen, die die Herstellung von rhIGF-I induzieren.
  • ii. Beschreibung/Konstruktion von IGF-I-Expressionsplasmid pLS32Tsc
  • Das zum Transformieren von Stamm 27C7 verwendete Sekretionsplasmid pLS32Tsc enthält das IGF-I-Gen. Die transkriptionalen und translationalen Sequenzen, die zur Expression des IGF-I-Gens in E. coli erforderlich sind, werden durch den alkalischen Phosphatase-Promotor und die trp-Shine-Dalgarno-Sequenz bereitgestellt. Der transkriptionale λ-t0-Terminator grenzt an das IGF-I-Terminationscodon an. Die Sekretion des Proteins aus dem Zytoplasma wird durch die lamB-Signalsequenz oder alternativ dazu durch die STII-Signalsequenz gesteuert. Ein Großteil von rhIGF-I befindet sich im periplasmatischen Zellraum. Plasmid pLS32Tsc verleiht dem transformierten Wirt Tetracyclin-Resistenz.
  • Das Plasmid pLS32Tsc wurde in mehreren Schritten unter Verwendung von pLS32, pAPlamB, pLS32lamB, pLS33lamB und pLS33Tsc als Zwischenpiasmide konstruiert.
  • Schritt 1: pLS32
  • Das Plasmid pLS32 resultiert aus der Fusion der IGF-I-Kodiersequenz mit jener der wärmestabilen Enterotoxin-II- (STII-) Signalsequenz und wurde durch Ligieren von 4 DNA-Fragmenten (siehe 5) hergestellt. Das erste davon war der Vektor pTF2A12 (Paborsky et al., Biochemistry 28, 8072–8077 (1989)), aus dem das kleine NsiI-BamHI-Fragment mit dem Gewebefaktor-Gen entfernt worden war. Die STII-Signalsequenz wird von Picken et al., Infect. Immun. 42, 269–275 (1983), beschrieben.
  • Das zweite Fragment war ein 55 bp großer synthetischer Doppelstrang, der für die ersten 18 Aminosäuren von reifem IGF-I kodiert. Dieser Doppelstrang besitzt die folgende Sequenz:
  • Figure 00380001
  • Das dritte Stück in der Ligation war ein 154 bp großes BstEII-HindiII-Fragment aus pK1ZZIGF-1, das für die verbleibenden Aminsoäuren 19–70 von IGF-I kodiert. pK1ZZIGF-I ist ein Kanamycin-resistentes Plasmid, das einen lac-Promotor enthält, der an einem Protein-A-Promotor befestigt ist, der an einem Protein-A-Signal befestigt ist, das an zwei Konsens-Z-Regionen aus Protein A befestigt ist, die IgG binden und Proteine sekretieren, fusioniert mittels zweier 2 Codons, die für eine Asn-Gly-Grenzfläche kodieren, mit einem synthetischen IGF-I-Gen, ferner umfassend eine F-Region, um für eine hohe Anzahl an Kopien zu sorgen. Dieses Plasmid ähnelt pZZIGF-I (siehe 6; beschrieben in EP 230-869, veröffentlich am 5. August 1987), worin das Ampicillin-Gen durch ein Kanamycin-Gen ersetzt ist.
  • Das letzte Fragment war ein 291-bp-HindIII-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pLS8. Dieses letzte Fragment ist einfach die Kodiersequenz für den Start des Tetracyclin-Gens von pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 43, 77–90 (1978)), worin eine HindIII-Restriktionsstelle unmittelbar stromauf vom Methionin-Startcodon konstruiert war.
  • Das resultierende Plasmid, pLS32, bewirkt wirksame Expression und Sekretion von rhIGF-I an das Medium. Die folgenden beiden Konstruktionsschritte erfolgten, um die STII-Signalsequenz mit der lamB-Signalsequenz zu ersetzen, wodurch die Produktausbeute verbessert wurde.
  • Schritt 2: pAPlamB
  • Das Plasmid pAPlamB wurde – wie aus 6 ersichtlich – durch Ligieren zweier DNA-Fragmente konstruiert, was zur Positionierung der lamB-Signalkodiersequenz stromab vom AP-Promotor und der trp-Shine-Dalgarno-Sequenz führt. Die Ligation umfasste den Vektor pRA1, aus dem ein kleines XbaI-BglII-Fragment entfernt worden war. Dieses Plasmid ist ein Derivat von phGH1 (Chang et al., Gene 55, 189–196 (1987)), welches Plasmid den AP-Promotor, das STII-Signal und für hGH kodierende DNA enthält. pRA1 unterscheidet sich insofern von phGH1, als es DNA enthält, die für Relaxin-A-Kette (deren Sequenz ist in US-Patent 4.758.516 beschrieben) und nicht für hGH kodiert, und eine günstige BglII-Restriktionsstelle stromab vom Promotor und der Ribosomen-Bindungsstelle enthält. Das zweite Stück in der Ligation war eine 80 bp große synthetische Doppelstrang-DNA mit der nachstehend angeführten Sequenz, die für die lamB-Signalsequenz kodiert; siehe Clement und Hofnung, Cell 27, 507–514 (1981):
  • Figure 00390001
  • Schritt 3: pLS32lamB
  • Das Plasmid pLS32lamB führt zur Fusion der lamB-Signalsequenz mit der IGF-I-Kodierregion und wurde – wie aus 7 ersichtlich – durch die Ligation von 3 DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS32, in dem das kleine XbaI-BstEII-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein 75 bp großes XbaI-EaeI-Fragment aus pAPlamB (kodiert für die lamB-Signalsequenz). Das dritte war ein 55 bp großer synthetischer DNA-Doppelstrang, der für die ersten 18 Aminosäuren von reifem IGF-I kodiert und die folgende Sequenz aufweist:
  • Figure 00400001
  • Die folgenden Schritte setzen den transkriptionalen Terminator in das Plasmid ein. Diese Plasmidveränderungen führten zu einer verbesserten Produktausbeute.
  • Schritt 4: pLS33lamB
  • Das Plasmid pLS33lamB ist ein Zwischenprodukt in der Herstellung von pLS32Tsc und wurde – wie aus 8 ersichtlich – durch Ligieren von 3 DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS32, in dem das kleine XbaI-BstEII-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein 75 bp großes XbaI-EaeI-Fragment aus pAPlamB (kodiert für die lamB-Signalsequenz). Das dritte war ein synthetischer 46-bp-DNA-Doppelstrang mit der folgenden Sequenz:
  • Figure 00400002
  • Die obige Sequenz kodiert für Aminosäuren 4–18 von reifem IGF-I.
  • Schritt 5: pLS33Tsc
  • Das Plasmid pLS33Tsc führt zur Ersetzung des λ-t0-Transkriptionsterminators unmittelbar stromab von der IGF-I-Kodiersequenz. 3 DNA-Fragmente wurden – wie aus 9 ersichtlich – ligiert, um dieses Plasmid zu konstruieren. Das erste Stück war der Vektor pLS18, in dem das kleine XbaI-BamHI-Fragment entfernt worden war. pLS18 ist ein Derivat von phGH1 (Chang et al., s.o.), das DNA enthält, die für Human-DNase kodiert (siehe WO 90/07572, veröffentlicht am 12. Juli 1990) und nicht hGH. phGH1 könnte dazu dienen, das gleiche Fragment zu erzeugen. Der zweite Teil der Ligation war ein 288-bp-XbaI-HindII-Fragment aus pLS33lamB, worin die HindIII-Restriktionsstelle durch Behandlung mit DNA-Polymerase I (Klenow) gekürzt wurde. Der dritte Teil der Ligation war ein 412 bp großes StuI-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pDH108-4. Dieses Fragment enthält den λ-t0-Transkriptionsterminator (Scholtissek und Grosse, Nuc. Acids Res. 15, 3185 (1987)) und Basenpaare 2–375 von pBR322 (Sutcliffe, s.o.), worin die Basenpaare 2–375 stromab oder 3' vom transkriptionalen Terminator liegen. Die Sequenz der Terminatorregion dieses Fragments ist wie folgt:
  • Figure 00410001
  • Schritt 6: pLS32Tsc
  • Das endgültige Plasmid pLS32Tsc wurde – wie aus 10 ersichtlich – durch Ligieren von 2 DNA-Fragmenten konstruiert. Das erste davon war der Vektor pLS33Tsc, aus dem das kleine EcoRI-BstEII-Fragment entfernt worden war. Das zweite war ein 550 bp großes EcoRI-BstEII-Fragment aus pLS32lamB, umfassend den AP-Promotor, trp-Shine-Dalgarno und die Kodiersequenz für die lamB-Signalsequenz, die mit den ersten 18 Aminosäuren von IGF-I fusioniert ist. Das resultierende Plasmid wurde durch Restriktions-Endonuclease-Verdauung analysiert. Der gesamte Promotor und die Kodiersequenz wurden durch DNA-Sequenzieren bestätigt, wobei die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 11) und die Aminosäuresequenz der lamB- und IGF-I-Proteinfusion (Seq.-ID Nr. 12) in 11 dargestellt sind.
  • iii. Fermentation und Gewinnung
  • A. Transformation
  • Kompetente E.-coli-27C7-Zellen wurden mit pLS32Tsc mittels Standard-Transformationstechniken transformiert. Transformanten wurden ausgewählt und auf LB-Platten mit 20 mg/l Tetracyclin gereinigt. Dieses Medium besaß die folgende Zusammensetzung: 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid und 20 mg/l Tetracyclin-HCl.
  • Eine transformierte Kolonie wurde dazu verwendet, die 20 mg/l Tetracyclin enthaltende sterile LB-Kulturlösung zu impfen. Die Kolbenkultur wurde bei 35°C–39°C inkubiert, bis die optische Dichte bei 550 nm etwa 1,0 erreichte. Steriles DMSO wurde der Kultur zugesetzt, um eine Endkonzentration von DMSO von 10 Vol.-% zu erzielen. Aliquoten von 1–2 ml wurden in sterile Fläschchen abgefüllt und bei –60°C oder weniger gelagert.
  • B. Fermentations-Inokulum
  • 10-l-Fermenter-Inokulum wurde hergestellt, indem zunächst ein 2-l-Schüttelkolben, der etwa 500 ml steriles LB-Medium mit Tetracyclin enthielt, mit dem frisch aufgetauten oben erwähnten 1- bis 2-ml-Kulturfläschchen geimpft wurde. Dieser Kolben wurde bei 35°C–39°C 8 Stunden lang inkubiert und in einen 10-l-Fermenter, der das in Abschnitt D des vorliegenden Beispielteils erwähnte Produktionsmedium enthielt, übertragen. Das 10-l-Fermenter-Inokulum wurde bei 35°C–39°C bei 50–200 U/min etwa 5–8 Stunden lang, d.h. Wachstum bis 25 OD, inkubiert. Das Impfgut wurde dann aseptisch auf das 1.000-l-Fermentationsgefäß von 12 übertragen.
  • C. Fermentationsvorrichtung
  • 12 ist eine schematische Darstellung des Fermentationssystems, das für die Produktion bakteriell abgeleiteter rekombinanter Produkte im 1.000-l-Maßstab herangezogen wird. Das Gefäß besitzt ein Gesamtvolumen von etwa 1.500 l und ein nominelles Arbeitsvolumen (mit Kopfraum) von 1.000 l. Das Gefäß ist mit 3 Rushton-Impellern ausgestattet, die an einer vertikalen Welle montiert sind, wobei der Spitzenantrieb normalerweise bei 150–300 U/min betrieben wird. Ein Ringluftverteiler dient zur Einleitung von Luft in den Fermenterboden mit etwa 1.000 Standardlitern/min. Eine an der Gefäßwand in der Nähe des unteren Impellers angebrachte DO2-Sonde misst die Konzentration von in der Flüssigkeit gelöstem (und daher für den Organismus zugänglichem) Sauerstoff. Dieses Signal wird an einen Kontroll- und Steuerungscomputer übermittelt, der dann die Glucose-Zufuhrrate in den Fermenter reguliert.
  • In dieser Konfiguration wird die Glucose in den oberen Teil des Gefäßes eingeführt, um die Sterilisation des Glucose-Zulaufs zu vereinfachen. Nicht zu sehen ist ein Zulauf in die Gefäßspitze, der dazu dient, bedarfsgemäß NH4OH zuzuführen, um den pH-Wert der Kulturlösung zu regeln. Ebenfalls nicht zu sehen ist ein weiterer Zulauf in die Gefäßspitze, der für eine langsame Zufuhr komplexer Nährstoffe verwendet werden kann.
  • D. Fermentationsverfahren
  • Das 1.000-l-Gefäß enthielt anfänglich 600–800 l Fermentationsmedium, das sich wie folgt zusammensetzt:
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Das Fermentationsverfahren erfolgte bei einem pH-Wert von 7,1–7,5 und einer Temperatur von 35°C–39°C. Die Rührrate wurde auf 150–300 U/min und die Lüftungsrate auf 0,7–1,5 Luftvolumina/Kulturvolumen/min eingestellt. Die Produktion von IGF-I trat nach dem Aufbrauchen des Phosphats im Medium ein.
  • Ein Computeralgorithmus bediente sich eines Anstiegs im DO2-Sonden-Wert, um zu ermitteln, wann die Anfangsladung Glucose aufgebraucht war, und führte dann eine 50% Glucose-Lösung zu, um den Organismus auf der Wachstumsrate in der Nähe seiner maximalen Wachstumsrate zu halten, bis der DO2-Wert auf 30% Luftsättigung gesunken war. Dann regulierte der Computer die Glucose-Zufuhr, um den DO2-Wert bei 30% zu halten; dies erfolgte mittels eines standardmäßigen proportionalen, integralen (PI) Steueralgorithmus.
  • Nach etwa 12-stündiger Inkubation war die Anfangsladung Phosphat aufgebraucht. Die Glucose-Zufuhrrate wurde durch den Computer gesenkt, da weniger Glucose für die Zellsynthese genutzt wurde, und daher legte eine niedrigere Glucose-Zufuhrrate die Sauerstoff-Verbrauchsrate fest, die der Sauerstoff-Übertragungsrate entsprach, und hielt den DO2-Wert bei 30%.
  • iv. Ergebnisse
  • 13 zeigt die Glucose-Pumprate (13A) und den abgelesenen DO2-Wert ( 13B) als Funktion der Zeit für die IGF-I produzierende 1.000-l-Fermentation dieses Beispiels. Nach 12 Stunden hatte der Computer den DO2-Wert auf 30% eingestellt, doch kurz danach war das Phosphat aufgebraucht, und die Glucose-Zufuhrrate begann durch Wirkung des Steueralgorithmus zu sinken. Man sieht jedoch, dass dieser Übergang zu starken Schwankungen in der DO2-Konzentration führte, die der Computer nicht regulieren konnte. Sogar nach der Senkung der Glucose-Zufuhrrate blieben die Instabiliäten bestehen. Nach etwa 16 Stunden wurde die Glucose-Zufuhrrate manueller Steuerung unterzogen, um sie konstant zu halten. Die DO2-Konzentration blieb etwa konstant und nahm sehr langsam ab, bis sie etwa 28% erreichte. Zu diesem Zeitpunkt fand eine plötzliche Abnahme der DO2-Konzentration statt.
  • Nach Untersuchung des gesamten Zeitablaufs schien ein gemeinsames Muster in den aufgezeichneten DO2-Werten vorzuliegen. Dieses ist im Detail in 14 zu sehen, in der man die ermittelten DO2-Werte und Glucose-Zufuhrraten (aufgezeichnet in 1-min-Intervallen) erkennt. Sogar mit konstanter Glucose-Zufuhrrate sank die DO2-Konzentration nach der langsamen Abnahme auf etwa 25% dramatisch. Innerhalb von 2 Minuten oder weniger fiel die DO2-Konzentration von 25% auf 0.
  • Der Fermenter und seine Zusatzausstattung wurden auf Fehlfunktionen untersucht, die für solche Phänomene verantwortlich sein könnten, doch man stellte keine derartigen Fehlfunktionen fest.
  • Beispiel II
  • Verwendung von 2 DO2-Sonden und alternative Zufuhrposition zur Untersuchung von DO2-Instabilitäten
  • 15 ist eine schematische Darstellung des 1.000-l-Fermenters, der modifiziert ist, um die DO2-Instabilitäten weiter untersuchen zu können. Eine DO2-Sonde war in der Nähe des oberen Gefäßbereichs montiert, so dass sie zum Zeitpunkt, an dem Phos phat aufgebraucht war, gerade in das Fermentationsmedium eintauchte. Der Glucose-Zulauf war solcherart modifiziert, dass der Glucose-Eintrittspunkt während der Fermentation vom oberen in den unteren Teil des Fermenters verschoben werden konnte.
  • Die Fermentation fand wie in Beispiel I statt, außer dass der DO2-Wert bei 40% gehalten wurde, um plötzliche DO2-Abfälle zu verhindern. Glucose wurde dem oberen Bereich des Gefäßes zugeführt. Nach dem Aufbrauchen von Phosphat ließ man die Glucose-Zufuhrrate den neuen Pseudo-Stationärzustand-Wert erreichen, und sie wurde auch wieder manueller Steuerung unterzogen. Um auf reproduzierbare Induzierbarkeit der DO2-Instabilität zu testen, wurde die Glucose-Zufuhrrate dann langsam in kleinen Schritten erhöht, bis der Wert der DO2-Sonde auf 0 sank. Die Glucose-Zufuhrrate wurde dann gesenkt, um einen positiven, regulierbaren DO2-Wert zu erzielen.
  • Um zu bestimmen, ob die Stelle der Glucose-Zugabe die DO2-Reaktion auf die Steigerungen der Glucose-Zufuhr beeinflusste, wurde eine zweite Experimentphase durchgeführt. Die Glucose-Zufuhrstelle war nun nicht mehr der obere, sondern der untere Bereich des Tanks, und der DO2-Wert wurde wieder bei 40% eingestellt. Die Glucose-Zufuhrrate wurde wiederum langsam inkremental erhöht, bis der DO2-Wert null erreichte. Die Glucose-Zufuhrrate wurde wieder gesenkt, so dass sich der DO2-Wert erholen konnte. Diese gesamte Abfolge wurde anschließend wiederholt.
  • 16 zeigt die Ergebnisse aus den wiederholten Zyklen. Die Ergebnisse aus der ersten Zyklusreihe waren ähnlich, was auf reproduzierbare Induzierbarkeit der DO2-Instabilität schließen lässt. Zunächst wurde der DO2-Wert auf 40% eingestellt bzw. reguliert (in Einklang mit der unteren DO2-Sonde), wobei die Glucose-Zufuhr über die Fermenterspitze erfolgte. Die Glucose-Zufuhrrate wurde dann manuell gesteuert und um 8% erhöht.
  • In einem homogenen Reaktor würde diese Abfolge an Ereignissen eine 8%ige Zunahme der Sauerstoff-Aufnahmerate bewirken, was wiederum eine 8%ige Seigerung des Sauerstoffantriebs erfordern würde, um den erforderlichen Sauerstoff von der Gasphase in die Flüssigkeitsphase zu befördern. Da ein Überdruck von 1 bar auf den Fermenter angelegt wurde und da der hydrostatische Überstau einen geschätzten Druck von zusätzlichen 0,2 bar ausübt, legt eine einfache Berechnung nahe, dass eine 8%ige Zunahme der Sauerstoffkonzentrations-Antriebskraft durch eine Reduktion der DO2-Konzentration von 40% auf etwa 26% erreicht würde.
  • Der untere DO2-Wert nahm tatsächlich von 40% auf etwa 25% ab, wo man ein neues Gleichgewicht erwarten könnte. Doch an diesem Punkt sackte der untere DO2-Wert auf 0 ab. Dies war die gleiche Beobachtung wie im in Beispiel I beschriebenen Lauf. Während eines Großteils der Abfolge betrug der obere DO2-Sonden-Wert mehr als 20% weniger als der untere Sondenwert. Dies deutet auf signifikante Heterogenität der DO2-Konzentrationen im gesamten Fermentationskulturlösung-Volumen hin. Etwa 15 Minuten lang nach der Zunahme der Glucose-Zufuhrrate senkte sich der obere Sondenwert mit etwa der gleichen Rate wie der untere Sondenwert. Als der obere Sondenwert 0 erreichte, wurde die plötzliche Abnahme des unteren Sondenwerts ausgelöst.
  • Bei der Zufuhr von Glucose in den Gefäßboden legt die Übereinstimmung zwischen dem oberen und dem unteren Sondenwert viel weniger DO2-Heterogenität nahe. Wiederum wurde in Einklang mit der unteren DO2-Sonde der DO2-Wert bei 40% eingestellt bzw. reguliert und die Glucose-Zufuhrrate um 8% erhöht. Dieses Mal wurde ein neuer Stationärzustand etwa beim vorhergesagten DO2-Wert erreicht. Als die Glucose-Zufuhrrate um weitere 8% erhöht wurde, nahmen die DO2-Werte wieder ab und stabilisierten sich etwa beim vorhergesagten Wert. Stabiler Betrieb stellte sich offenkundig bei etwa 10% DO2 ein. Schließlich trieb eine weitere 5%ige Steigerung der Glucose-Zufuhrrate die DO2-Werte auf 0, wie man dies anhand der Berechnungen bezüglich der Sauerstoffnutzung und der Sauerstoffantriebskraft vorhersagen konnte.
  • Diese Ergebnisse legen nahe, dass die in 13 gezeigten DO2-Instabilitäten verhindert werden können, indem man im gesamten Gefäß homogene Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff vorsieht. Im vorliegenden Fermenter verbesserte die Zufuhr von Glucose in den unteren Teil des Fermenters die DO2-Homogenität deutlich. In größeren und/oder komplexeren Fermentern (z.B. Fermentern mit Kühlspulen) ist DO2-Homogenität viel schwieriger zu erreichen.
  • Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die DO2-Instabilitäten, die man während der Überwachung des DO2-Werts im unteren Teil des Fermenters beobachtet, mit dem Schwund der messbaren DO2-Konzentration im oberen Teil der Fermentationskulturlösung zusammenfallen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass entweder ein kompliziertes und sehr rasches hydrodynamisches Phänomen oder ein plötzliches biologisches Ereignis eintritt, das durch sehr niedrige DO2-Konzentrationen ausgelöst wird, die die gesamte Sauerstoff-Nutzungsrate erhöhten.
  • Beispiel III
  • Reproduktion von DO2-Instabilitäten in einem modifizierten 10-l-Fermenter
  • i. Fermenter
  • 1 ist eine schematische Darstellung des hierin verwendeten modifizierten 10-l-Fermenters. Normalerweise würde der Fermenter mit 3 Rushton-Impellern ausgestattet sein. In dieser modifizierten Konfiguration ist aber der obere Impeller entfernt, und der Fermenter wird mit einem relativ großen Flüssigkeitsvolumen betrieben. Dies erzeugt einen großen schlecht durchmischten Bereich im oberen Teil der Fermentationskulturlösung. Glucose wird in die Spitze des Fermenters 17 eingebracht, um die Großkonfiguration zu imitieren und weiter zur DO2-Heterogenität beizutragen. Schließlich wird eine Redoxsonde 15 zusätzlich zur normalen polarographischen DO2-Sonde 13 angebracht. Wie dies aus der Abbildung ersichtlich ist, liefert dies Informationen über die Kultur, wenn der DO2-Sonden-Wert 0 oder nahezu 0 beträgt.
  • ii. Wirtsorganismus
  • Der verwendete Wirtsorganismus war der gleiche wie in Beispiel I (27C7), außer dass er eine rbs7-Deletion (Ribose-Verwendung minus) und einen wiederhergestellten ilvG-Locus aufweist. Beide Marker wurden durch P1-Transduktion eingeführt. Der Organismus trägt den Namen 37D6.
  • iii. Beschreibung/Konstruktion von IGF-I-Expressionsplasmid pBKIGF2B
  • Im IGF-I-Expressionsplasmid pBKIGF-2B werden die transkriptionalen und translationalen Sequenzen, die für die Expression des IGF-I-Gens in E. coli erforderlich sind, vom alkalischen Phosphatase-Promotor und der trp-Shine-Dalgarno-Sequenz bereitgestellt. Der λ-t0-Transkriptionsterminator grenzt an das IGF-I-Terminationscodon an. Die Sekretion des Proteins aus dem Zytoplasma wird durch die lamB-Signalsequenz oder alternativ dazu durch die STII-Signalsequenz geleitet. Der Großteil an rhIGF-I befindet sich im periplasmatischen Zellraum. Plasmid pBKIGF-2B verleiht dem transformierten Wirt Tetracyclin-Resistenz.
  • Plasmid pBKIGF-2B wurde in mehreren Schritten unter Verwendung von pLS32Tsc, pLBIGFTsc, pLS33Tsc und pRanTsc als Zwischenplasmide konstruiert.
  • Schritt 1: pLS32Tsc
  • Dieses Plasmid wurde wie in Beispiel I konstruiert.
  • Schritt 2: pLBIGFTsc
  • Schritt a: pLamBIGF
  • Für den ersten Teil der Ligation wurde das EcoRI-PstI-Vektorfragment aus BR322 isoliert. Für den zweiten Teil der Ligation wurde ein 1244 bp großes PstI-NcoI-Fragment aus pAPLamB isoliert. Für den dritten Teil der Ligation wurde das 196 bp große HaeII-EcoRI-Fragment, umfassend das IGF-I-Gen mit Ausnahme des ersten 5'-Endes, aus Plasmid p200 isoliert. p200 ist ein aus pBR322 abgeleitetes Plasmid, das – in der 5'-3'-Reihenfolge – den Chelatin-Promotor, die MF-α-I-Präpro-Signalsequenz, für reifes IGF-I kodierende DNA und den 2-μ-Terminator aufweist. Es enthält den CoIE1-Replikationsursprung für Bakterien und den 2-μ-Ursprung für Hefe. Ein Restriktionsenzymplasmid-Diagramm von p200 ist in 17 zu sehen. Die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 13) des EcoRI- (beginnend an Position 1149) bis EcoRI- (beginnend an Position 1628) Fragments von p200, umfassend MF-α-I-Präpro und das IGF-I-Gen, ist in 18 zu sehen. Die HaeII-, PstI, BamHI- und SalI-Restriktionsstellen, die auch in der schematischen Darstellung von 17 zu sehen sind, sind in der Sequenz unterstrichen. Ein Stück synthetischer DNA, die die Signalsequenz mit dem IGF-I-Gen (NcoI bis HaeII) verbindet, wurde hergestellt und besaß die folgende Sequenz:
  • Figure 00500001
  • Die 3 Plasmidfragmente und die synthetische DNA wurden miteinander ligiert, um pLamBIGF (siehe 19) zu bilden.
  • Schritt b: pLBIGFTsc
  • Das XbaI-BamHI-Vektorfragment wurde aus pLS18 als erstes Ligationsfragment isoliert. Der zweite Teil der Ligation war ein 412 bp großes StuI-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pdH108-4 (siehe oben). Der dritte Teil der Ligation wurde durch einen EcoRI-Verdau von pLamBIGF erzeugt, gefolgt von der Behandlung mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment sowie XbaI-Verdau. Das resultierende 302-bp-Fragment wurde isoliert. Diese 3 Fragmente wurden ligiert, um pLBIGFTsc (siehe 20) zu bilden.
  • Schritt 3: pRanTsc
  • Das XbaI-BamHI-Vektorfragment aus pLS18 wurde als erstes Ligationsfragment isoliert. Der zweite Teil der Ligation war ein 412 bp großes StuI-BamHI-Fragment aus dem Plasmid pdH108-4 (siehe oben). Der dritte Teil der Ligation wurde aus pRANTES hergestellt. pRANTES ist ein pBR322-basiertes Plasmid, das ein Fragment eines XbaI-Linkers enthält, gefolgt vom STII-Signal, gefolgt von der für RANTES kodierenden cDNA (siehe Schall et al., J. Immunol. 141, 1018 (1988)), gefolgt vom BamHI-Linker. Das dritte Fragment entstand aus der Verdauung von pRANTES mit BamHI, gefolgt von der Behandlung mit DNA-Polymerase-Klenow-Fragment, gefolgt von einem XbaI-Verdau. Das resultierende 303-bp-Fragment wurde isoliert. Diese 3 Fragmente wurden ligiert, um pRanTsc (siehe 21) zu bilden.
  • Schritt 4: pBKIGF-2
  • Wie aus 22 ersichtlich, wurde das EcoRI-PstI-Fragment mit einer Größe von 540 bp, umfassend den alkalischen Phosphatase-Promotor, die lamB-Signalsequenz und für die ersten 15 Aminosäuren von IGF-I kodierende DNA, aus pLS32Tsc exzidiert. Das Pst-Bsp-1286I-Fragment (~70 bp), umfassend für Aminosäuren 16–38 von IGF-I kodierende DNA, wurde aus pLBIGFTsc exzidiert. Das Bsp1286I-HindIII-Fragment (~179 bp), umfassend für Aminosäuren 39–70 von IGF-I kodierende DNA, den λ-Terminator und den Tc-Promotor, wurde aus pLS33Tsc exzidiert. Schließlich wurde das ~4331 bp große EcoRI-HindIII-Vektorfragment (pBR322-basiert) aus pRanTsc exzidiert. Diese 4 Fragmente wurden ligiert, um pBKIGF-2 zu liefern, das den AP-Promotor, die lamB-Signalsequenz, die für das gesamte IGF-I-Protein kodierende DNA, den transkriptionalen Terminator, den Tc-Promotor und die Tetracyclin- und Ampicillin-Resistenzmarker enthält.
  • Schritt 5: pBKIGF-2A
  • pBKIGF-2 wurde mit PstI und ClaI verdaut und das ~245 bp große Fragment isoliert. Es enthält Aminosäuren 16–70 von IGF-I und den λ-T0-Terminator. pLBIGFTsc wurde mit NcoI und ClaI verdaut und das Vektorfragment isoliert. Dieses Vektor fragment enthält den AP-Promotor, das lamB-Signal und das Tetr-Gen. Diese 2 Fragmente wurden mit einem Stück synthetischer DNA ligiert, das das 5'-Ende von IGF-I-DNA aus NcoI-PstI mit synthetisch abgeleiteten Codons wie folgt ersetzt:
  • Figure 00520001
  • Das resultierende Plasmid trug die Bezeichnung pBKIGF-2A. Die Konstruktion ist aus 23 ersichtlich.
  • Schritt 6: pLamBRan
  • Dieses Plasmid entstand durch Verdauen von pLS33LamB mit NcoI und BamHI; das Vektorfragment wurde isoliert. pLS33LamB ist ein Plasmid aus pBR322, in das der AP-Promotor, das lamB-Signal und das IGF-I-Gen insertiert wurden. BamHI schneidet im Tc-Abschnitt des Plasmids, NcoI am 5'-Ende des IGF-I-Gens. Das zweite Fragment wurde durch Verdauen von pRANTES mit BsaJI und BamHI sowie Isolieren des resultierenden ~200-bp-Fragments erzeugt. Das dritte Fragment war ein Stück synthetischer DNA zur Verbindung des RANTES-Gens mit der Signalsequenz aus NcoI-BsaJI. Diese synthetische DNA besitz die folgende Sequenz:
  • Figure 00520002
  • Der resultierende Vektor trug den Namen pLamBRan, und seine Konstruktion ist aus 24 ersichtlich.
  • Schritt 7: pBKIGF-2B
  • Die Konstruktion dieses Plasmids ist aus 25 ersichtlich. pLamBRan wurde mit NcoI und SphI verdaut und das Vekorfragment, umfassend den Promotor und die Signalsequenz, isoliert. pBKIGF-2 wurde mit DdeI und SphI verdaut und das ~600 bp große Fragment isoliert; es enthielt den λ-Transkriptionsterminator und das 5'-Ende des Tetr-Gens. pBKIGF-2A wurde mit NcoI und Bsp1286I verdaut und das 110-bp-Fragment, das die für Aminosäuren 1–38 von IGF-I kodierende DNA enthält, isoliert. Diese 3 Fragmente wurden mit synthetischer DNA ligiert, die für Aminosäuren 39–70 von IGF-I kodiert, um pBKIGF-2B zu liefern. Dieser synthetische Linker besitzt die folgende Sequenz:
  • Figure 00530001
  • iv. Transformation und Fermentation
  • Der oben beschriebene Stamm 37D6 wurde mit pBKIGF-2B unter Anwendung herkömmlicher Transformationstechniken transformiert. Anschließend wurde er in gleicher Weise wie in Beispiel I gezüchtet, außer dass nach der Verwendung der 500 ml LB-Mediumkultur zwecks Impfens des 10-l-Fermenters die Fermentation wie im Falle des 1.000-l-Fermenters durchgeführt wurde. Außerdem wurden die Mineralsalze auf 60% der in der 1.000-l-Fermentation verwendeten Konzentration reduziert. Dies führte dazu, dass Phosphat etwa 2 Stunden früher im modifizierten 10-l-Fermenter aufgebraucht war als im 1.000-l-Fermenter.
  • Schließlich wurde eine komplexe Stickstoffzufuhr bei 40 OD (A550) gestartet, um eine langsam zugeführte Quelle von Aminosäuren und Phosphat nach dem Aufbrauchen der anfangs in den Fermenter geladenen Aminosäuren und Phosphat bereit zustellen. Diese Zufuhr bestand aus 290 ml 20% NZ Amin AS, vermischt mit 140 ml 20% Hefeetrakt, und die Zufuhrrate betrug 0,4 ml/min. Das Anfangsvolumen nach der Zugabe des Impfguts betrug etwa 8 l.
  • v. Ergebnisse
  • 26 zeigt die Ergebnisse eines Versuchs im modifizierten 10-l-Fermenter. Wie aus dieser Abbildung ersichtlich, wurde zwischen den Stunden 10 und 11 die Glucose-Zufuhrrate (26B) unter Computersteuerung gesenkt, um den eingestellten 30%-DO2-Wert beizubehalten. Dies legt nahe, dass Phosphat aufgebraucht war und weniger Glucose für die Zellmassenproduktion verwendet wurde. Nach etwa 11,5 Stunden wurde die Glucose-Zufuhrrate manueller Steuerung unterzogen. Die Glucose-Zufuhrrate wurde dann inkremental erhöht, bis der DO2-Wert auf 0 getrieben wurde.
  • In diesem Versuch lieferte die DO2-Sonde einen Wert von etwa 5%, wenn die tatsächliche DO2-Konzentration 0 war. Obwohl die Form der anfänglichen DO2-Abnahmekurve (26A) auf DO2-Instabilität hindeutete, war das Ergebnis nicht schlüssig. Daher wurde die Glucose-Pumprate (GPR) reduziert, um eine Erholung des DO2-Werts zu ermöglichen, und anschließend in kleineren Inkrementen erhöht. Als ein weiterer DO2-Einbruch nach etwa 13 Stunden eintrat, wurde die GPR wiederum gesenkt, um eine Erholung zu ermöglichen. Zu diesem Zeitpunkt bewirkte eine GPR-Zunahme von weniger als 4% das charakteristische Profil einer langsamen DO2-Abnahme, gefolgt von einer plötzlichen und viel stärker als vorhergesagten Abnahme der DO2-Konzentration.
  • Als die GPR wiederum zwecks Erholung gesenkt wurde, waren eine Reihe überraschender Ereignisse die Folge. Die DO2-Konzentration im Fermenter begann reproduzierbar und ohne äußeren Stimulus zu zyklieren. Die im Muster der DO2-Zyklen nach 14,2 h beobachtete Unregelmäßigkeit wurde durch eine kurze Unterbrechung der Glucose-Zufuhr hervorgerufen. Mit Ausnahme dieses singulären Ereignisses wurde nichts getan, um die Betriebsparameter der Fermentation zu verändern. Wie man sieht, waren die Zyklen hinsichtlich ihrer Amplitude recht konsistent und variier ten nur hinsichtlich ihrer Frequenz (sie lagen immer weiter auseinander, bis sie nach 17,3 Stunden aufhörten). 2 zusätzliche Reihen fast identischer Zyklen wurden durch Reduktion der Glucose-Zufuhrrate nach 20,25 und 22,2 Stunden stimuliert.
  • Diese Ergebnisse veranschaulichen eine dramatische Instabilität der DO2-Konzentration in diesem modifizierten 10-l-Fermenter. Die allgemeine Form der DO2-Abnahme-Abschnitts während des Zyklus ähnelt jener, die man im 1.000-l-Fermenter beobachtet. Dies legt nahe, dass der 10-l-Reaktor die zuerst im größeren Fermenter beobachteten Phänomene adäquat reproduziert. Die Geschwindigkeit und Regelmäßigkeit der im kleinen Reaktor beobachteten Zyklen lässt auf einen biologischen Ursprung schließen.
  • Beispiel IV
  • Erzeugung von DO2-Instabilitätert mit untransformiertem E. coli des Wildtyps
  • In den obigen Beispielen wurde der Organismus induziert, um Produkt zum Zeitpunkt der DO2-Instabilitäten zu produzieren. Der Wirtsorganismus war auch relativ stark mutiert. Um die allgemeine Geltung der DO2-Instabilitätsphänomene zu untersuchen, wurde ein untransformierter und relativ unmutierter Organismus im aus 1 gezeigten modifizierten 10-l-Fermenter getestet. Beim Organismus handelte es sich um E. coli W3110tonA, dessen Ableitung oben beschrieben ist und der die Bezeichnung 1A2 trägt. Dieser Organismus ist im Wesentlichen E. coli des Wildtyps – mit Ausnahme des Defekts im tonA-Locus, der die Bildung eines Zelloberflächenproteins verhindert, das zur Eisenaufnahme verwendet wird und zahlreichen Bakteriophagen als Befestigungsstelle dient. Der Organismus wurde unter den gleichen Bedingungen gezüchtet, die in Beispiel III beschrieben sind.
  • 27 zeigt die Ergebnisse der Anwendung der gleichen Arbeitsvorschrift, um DO2-Instabilitäten (siehe Beispiel III) auszulösen. In dieser Fermentation produzierte die DO2-Sonde wiederum ein Signal, das die DO2-Konzentration überschätzte. Ein Signal von 27–29% stellte eine DO2-Konzentration von 0 dar. Glücklicherweise wurde nach 11 Stunden dieses Experiment auch durch eine Redox-Sonde überwacht, wobei ihre ermittelten Werte in 27B aufgetragen sind. Beide Signale deuten auf sich wiederholende, reguläre Schwankungen der DO2-Konzentration hin. Somit hängt das Phänomen, das zur DO2-Instabilität führt, nicht von der Gegenwart eines Plasmids, der Bildung eines heterologen Produkts oder mehreren im Produktionswirt verwendeten Mutationen ab.
  • Beispiel V
  • Fehlen von DO2-Instabilität bei Organismen mit Defizienz hinsichtlich einer Cytochrom-Oxidase
  • Die obigen Beispiele lassen auf einen biologischen Ursprung der DO2-Instabilitäten schließen. Die in diesem Beispiel untersuchte Hypothese ist, ob dieses Phänomen mit dem Wechsel zwischen den zwei möglichen aeroben Atmungsketten zu tun hat – eine wird durch Cytochrom-o-Oxidase, die andere von Cytochrom-d-Oxidase vermittelt. Somit erfolgte eine Deletion in jedem der Cytochrom-Oxidase-Gene mittels konventioneller P1-Transduktion in den W3110tonA-Wirt 1A2, um zwei neue Organismen zu schaffen, E. coli W3110tonAΔcyokanr und E. coli W3110tonAΔcydkanr. Die Quellen der Mutationen waren die Organismen GV102 bzw. GO103 (Oden et al., Gene 96, 29–36 (1990)).
  • Die Organismen wurden im modifizierten 10-l-Fermenter von Beispiel III gezüchtet. 28 stellt die Ergebnisse der Versuche dar, DO2-Instabilitäten mit der Cytochrom-o-Oxidase-Deletionsmutante zu induzieren. Der Zeitraum beträgt in dieser 12 Stunden – im Vergleich zu den 4 Stunden, die erforderlich sind, um 12 DO2-Zyklen in 27 abzubilden. Die rasche Annäherung an 0 DO2 (für DO2-Instabilitäten typisch) konnte nicht induziert werden. Sowohl die Annäherung an 0 DO2 nach 14 Stunden als auch die Annäherung nach 18,5 Stunden waren langsam und wiesen in keiner Weise auf DO2-Instabilität hin. Die von der Redox-Sonde ermittelten Werte (28B) legten Ähnliches nahe.
  • 29 veranschaulicht die Ergebnisse, die man unter Anwendung der gleichen Arbeitsvorschrift mit der Cytochrom-d-Oxidase-Deletionsmutante erhält. In diesem Ex periment betrug der niedrigste DO2-Sonden-Wert etwa 17%. Die Tatsache, dass dies mit dem Zustand von aufgebrauchtem DO2 übereinstimmte, wurde nach 13,2 Stunden durch kurze Senkung der Rührrate bestätigt. Keine weitere Abnahme des ermittelten DO2-Werts konnte beobachtet werden, obwohl eine Reaktion im Redoxsonden-Ausgangssignal vorlag. Dieses Beispiel unterstreicht auch die Nützlichkeit der Redox-Sonde. In diesem Experiment mit dem mutierten Δcyd-Wirt sowie mit dem mutierten Δcyo-Wirt ist kein Hinweis auf DO2-Instabilität feststellbar.
  • Diese Ergebnisse bestätigen die Beteiligung der 2 Cytochrom-Oxidasen in den DO2-Instabilitäten, die man mit dem W3110tonA-E.-coli-Organismus beobachtet.
  • Beispiel VI
  • Fehlen von DO2-Instabilität bei Produktionsorganismen, denen eine der Cytochrom-Oxidasen fehlt
  • Als nächstes bestimmten die Anmelder, ob die gleichen Mutationen DO2-Instabilität in einem rekombinanten DNA-Produktionsorganismus verhindern würden. Der Wirtsorganismus 37D6 von Beispiel III wurde modifiziert, um 3 neue Wirtsorganismen zu produzieren.
  • In der ersten Veränderung wurde eine nicht-Kanamycin-resistente degP-Deletionsmutante in den Wirtsorganismus transduziert, um einen Kanamycin-sensitiven Wirt zu bilden, der ansonsten isogen wäre. Diese Mutation fand unter Verwendung von pKS16 als Anfangspiasmid statt, das die periplasmatische Protease-Mutation depP41kanr enthält, worin ein 2,3 kb großes PstI-PstI-Fragment aus dem ursprünglichen, degP umfassenden 8-kb-BamHI-BamHI-Fragment deletiert wurde, so dass das Gen degP-negativ ist (Strauch et al., s.o.). pKS16 wurde UV-Licht-Mutagenese unterzogen, wie dies in Jeffrey H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratories, 1972), Experiment 13 über UV-Licht-Mutagenese, S. 121, und den dort angeführten Quellen beschrieben ist. Nach der Mutagenese wurden Kolonien ausgewählt, die Kanamycin-Resistenz einbüßten. Die ausgewählte Nicht-Kanamycin-Resistenz-Mutation wurde durch herkömmliche Transduktionstechniken in das Chromosom von Stamm 37D6 bewegt, um den als 40B4 bezeichneten Kanmycin-sensitiven Wirt zu produzieren.
  • Die Kanamycin-verbundenen Δcyo- und Δcyd-Mutationen wurden dann in Wirt 40B4 transduziert, um zwei neue Organismen, 39H8 und 39H9, zu liefern. Diese Transduktionen erfolgten unter Anwendung von Standardtechniken. Stamm 39H8 ist isogen gegenüber 40B4 – außer dass die Cytochrom-o-Mutation vorliegt und er Kanamycin-resistent ist. Stamm 39H9 ist gegenüber 40B4 isogen – außer dass die Cytochrom-d-Mutation vorliegt und er Kanamycin-resistent ist. Alle 3 Organismen wurden dann mit dem IGF-I-Produktionsplasmid pBKIGF-2B transformiert.
  • 30 stellt die Ergebnisse des Testens hinsichtlich DO2-Instabilitäten mit dem transformierten 40B4-Produktionswirt im modifizierten 10-l-Fermenter von 1 dar. Es wurden deutliche DO2-Instabilitäten festgestellt. Wiederum waren die Zyklen dramatisch und regelmäßig. Die relativ hohen DO2-Werte zwischen 12,5 und 13,5 Stunden waren das Ergebnis der irrtümlich wieder eingesetzten Computersteuerung. Als die Glucose-Zufuhrrate bei Erreichen der kritischen Zufuhrrate wieder auf manuelle Steuerung geschaltet wurde, kehrten die Instabilitäten zu ihrem regelmäßigen Muster zurück.
  • Bei diesem Experiment war das Redoxsonden-Ausgangssignal besonders entlarvend. Sogar wenn das DO2-Sondensignal 0 war, zeigte die Redoxsonde Veränderungen des Redoxpotentials des Mediums. Beispielsweise bei etwa 17 Stunden erholte sich das Redoxpotential nicht. Dies legte nahe, dass die Glucose-Zufuhrrate verringert werden musste, damit die DO2-Zyklen wieder fortgesetzt werden konnten. Wenn die Glucose-Zufuhrrate verringert wurde, wurden die Zyklen tatsächlich fortgesetzt. In diesem Experiment war es unmöglich, das Redoxsonden-Ausgangssignal zwischen etwa –50 und –100 mV zu halten. Ohne auf eine Theorie beschränkt zu sein, würde dieses Unvermögen, Zwischen-Redoxpotentiale zu halten, scheinbar mit den radikalen Verschiebungen der Sauerstoffaufnahmeraten zusammenzuhängen.
  • 31 (Cytochrom-d-Oxidase-Deletionsmutante 39H9) und 32 (Cytochrom-o-Oxidase-Deletionsmutante 39H8) zeigen die Ergebnisse von Versuchen, DO2- Instabilitäten mit den Cytochrom-Oxidase-Deletionsmutanten im modifizierten 10-l-Fermenter von 1 zu induzieren. In keinem der beiden Fälle konnten DO2-Instabilitäten erzielt werden. Die eine offenkundige Diskontinuität im DO2-Profil in 31 war auf eine kurze Unterbrechung der Glucose-Zufuhr zurückzuführen. Bei beiden mutierten Wirten bestand augenscheinlich kein Problem, die Redox-Potentiale zu regulieren, die ein Sondenausgangssignal zwischen –50 und –100 mV erzeugten. Wie im Fall des untransformierten Wirts des Wildtyps verhinderte somit die Entfernung eines der Cytochrom-Oxidase-Gene die DO2-Instabilitäten. Diese Beobachtungen decken sich mit der Hypothese, dass der Wechsel zwischen den zwei aeroben Atmungswegen an der DO2-Instabiltität beteiligt ist.
  • Beispiel VII
  • Bewertung der IGF-I-Produktion durch die Cytochrom-o-Oxidase-Deletions-mutante
  • Um die Eignung der Cytochrom-Oxidase-mutierten Wirte für rekombinante DNA-Protein-Produktion zu bewerten, wurde die Cytochrom-o-Oxidase-Mutante untersucht. Da die Cytochrom-o-Oxidase normalerweise für starke aerobe Atmung verwendet wird, ging man davon aus, dass die Stammmutante mit der Cytochrom-d-Oxidase-Deletion der gesündere Wirt ist, doch dies konnte dann nicht beobachtet werden. Sie wuchs langsamer und konnte keine hohen Atmungsraten für eine ebenso lange Zeit aufrechterhalten wie die Cytochrom-o-Oxidase-Mutante. Somit wurde die Cytochrom-o-Oxidase-Deletionsmutante hinsichtlich ihrer Fähigkeit bewertet, Human-IGF-I zu exprimieren und zu akkumulieren.
  • 33 zeigt die IGF-I-Gesamtakkumulation und die Zelldichte, die man bei Vergleichsfermentationen der Cytochrom-o-Oxidase-Stammmutante 39H8 (transformiert mit pBKIGF-2B) und von Vergleichsstamm 40B4 (transformiert mit pBKIGF-2B) beobachtete; sie erfolgten wie in Beispiel I, außer dass sie in einem unmodifizierten 10-l-Fermenter stattfanden. Es wurden alle 3 Rushton-Impeller ebenso verwendet wie die vollen Konzentrationen von Mediumsalzen. Die Zufuhr von komplexem Stickstoff (siehe Beispiel III) erfolgte mit einer Rate von 0,2 ml/min.
  • Obwohl die endgültige Zelldichte für die Mutante geringfügig niedriger war als für den Vergleich, war die volumetrische Endausbeute von IGF-I im normalen 10-l-Fermenter identisch. Dies belegt die Eignung von Cytochrom-o-Oxidase-Wirten für die Produktion von rekombinantem Protein. Man geht davon aus, dass sich in größeren Fermentern wie z.B. Fermentern mit einem Fassungsvermögen von etwa 1.000, 10.000 oder 100.000 l die IGF-I-Ausbeute für die Mutante gegenüber dem Vergleich verbessern und/oder das Verfahren mehr den FDA-Anforderungen entsprechen würde, da es nicht mit dramatischen Schwankungen der DO2-Konzentration während der Fermentation einherginge.
  • Außerdem kann erwartet werden, dass andere Mutationen in den Cytochrom-o- oder Cytochrom-d-Oxidase-Atmungswegen oder Mutationen in anderen Atmungswegen als den Oxidase-Wegen die normale Produktion rekombinanter DNA-Produkte erlauben – und dies ohne Neigung zu DO2-Instabilitäten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001

Claims (12)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids von Interesse aus einer Fermentation von bakteriellen Wirtszellen, die für das Polypeptid kodierende Nucleinsäure umfassen, wobei das Verfahren das Durchführen der Fermentation unter Verwendung von bakteriellen Wirtszellen mit einer beeinträchtigen Fähigkeit, zwischen Cytochrom-o-Oxidase und Cytochrom-d-Oxidase zu wechseln, umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Beeinträchtigung der Fähigkeit, zwischen Cytochrom-o-Oxidase und Cytochrom-d-Oxidase zu wechseln, ein inaktiviertes Cytochrom-d-Oxidase- oder Cytochrom-o-Oxidasegenprodukt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die bakteriellen Wirtszellen ein inaktiviertes Cytochrom-o-Oxidasegen aufweisen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bakterienzellen E. coli sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die E.-coli-Zellen einen Mangel an endogener Protease aufweisen.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die E.-coli-Zellen in einem W3110-tonA-Hintergrund vorliegen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fermentation in einer Größenordnung von zumindest etwa 1.000 l stattfindet.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Fermentation in einer Größenordnung von etwa 1.000 l bis etwa 100.000 l stattfindet.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Elektronentransportkette der Bakterien durch Deletion inaktiviert wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszellen mit der für das Polypeptid kodierenden Nucleinsäure transformiert sind.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polypeptid ein Säugetierpolypeptid ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Säugetierpolypeptid IGF-I oder ein Wachstumshormon ist.
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