DE69332332T2

DE69332332T2 - Expression von genen in transgenen pflanzen

Info

Publication number: DE69332332T2
Application number: DE69332332T
Authority: DE
Inventors: Herbert Walter
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1992-05-29
Filing date: 1993-05-27
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2013-05-28
Also published as: US5633439A; DE69332332D1; BR9306445A; ATE224954T1; WO1993024638A1; EP0643774A1; AU672410B2; CA2136618A1; CA2136618C; GB9211416D0; AU4334593A; EP0643774B1; JP3436758B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Regulierung der Genexpression in transgenen Pflanzen. Insbesondere betrifft sie die Isolierung und Verwendung von DNA-Sequenzen, die die Expression von Cinnamylalkoholdehydrogenase steuern.
Die Fähigkeit zur Isolierung und Manipulierung von Pflanzengenen hat den Weg zur Erlangung des Verstehens über die Mechanismen eröffnet, die an der Regulierung der Pflanzengenexpression beteiligt sind. Dieses Wissen ist wichtig für die Ausnutzung der Gentechnik für praktische Probleme, wie die Expression von Genen in genetisch manipulierten Nutzpflanzen, die verbesserte Qualitäts- und Produktionseigenschaften aufweisen.
Viele Beispiele wurden in der Literatur über pflanzliche DNA- Sequenzen angegeben, die verwendet wurden, um die Expression von Fremdgenen in Pflanzen anzutreiben. In den meisten Fällen wurden in Genkonstrukten die Regionen verwendet, die unmittelbar 5' zu den codierenden Regionen von Genen stehen. Diese Regionen werden als Promotorsequenzen bezeichnet. Sie können aus pflanzlicher DNA stammen; oder aus anderen Quellen, z. B. Viren. Es wurde gezeigt, daß Sequenzen mit bis zu 500 bis 1000 Basen in den meisten Fällen ausreichend sind, um die regulierte Expression von Fremdgenen zu erlauben. Die exemplarisch angegebenen Regulationstypen schließen Gewebespezifität, Regulation durch äußere Faktoren, wie Licht, Wärmebehandlung, Chemikalien, Hormone, und Entwicklungsregulation ein. Jedoch wurde ebenfalls gezeigt, daß Sequenzen, die viel länger als 1 kb sind, nützliche Merkmale aufweisen können, die hohe Stärken der Genexpression in transgenen Pflanzen zulassen.
Diese Experiment wurden weithin unter Verwendung von Genfusionen zwischen den Promotorsequenzen und Fremdstrukturgenen, wie bakteriellen Genen, etc., durchgeführt. Dies hat zur Identifizierung nützlicher Promotorsequenzen geführt.
In der Arbeit, die zur vorliegenden Erfindung führte, haben wir ein Gen identifiziert, das ein an der Biosynthese von Lignin in Gefäßpflanzen beteiligtes Enzym exprimiert. Wir haben gezeigt, daß dieses Gen Cinnamylalkoholdehydrogenase (CAD) codiert, die eines der Enzyme ist, die spezifisch für den Ligninzweig der Phenylpropanoid-Stoffwechselreaktion sind. Das betreffende Gen wird neben anderen durch den cDNA-Klon pTCAD19 codiert, die Gegenstand unserer veröffentlichten, gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung WO 93/05159 sind.
Das durch das CAD-Gen codierte Enzym katalysiert die Oxidation von Cinnamylaldehyden zu Cinnamylalkoholen, die die direkten Vorstufen des Lignin-Polymers sind. Wir haben das Gen, das dieses Enzym codiert, aus Tabak isoliert.
Wir haben gezeigt, daß CAD-mRNA durch die pflanzliche Entwicklung hindurch mit den höchsten Stärken exprimiert wird, die in verholzenden Geweben gefunden werden. In diesen Geweben kann das CAD-Enzym in hoher Konzentration im Xylem von Pflanzen gefunden werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Konstrukt zur Verwendung in der Transformation von Pflanzenzellen bereitgestellt, das eine exogene codierende Sequenz unter der Kontrolle von stromaufwärts liegenden Promotor- und stromabwärts liegenden Terminatorsequenzen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der stromaufwärts gelegene Promotor ein Cinnamylalkoholdehydrogenase-Genpromotor mit einer Nukleotidsequenz ist, die die ersten 2765 Basenpaare von SEQ ID NO: 1 umfaßt (Fig. 2).
Der Klon gNtCAD9-6.3SH enthält das Promotorfragment dieses Gens. Dieser Klon wurde in den National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, am 2.4.1992 unter der Eingangs-Nr. NCIB 40499 hinterlegt.
Wir stellen ferner neue Pflanzenzellen und mit den erfindungsgemäßen Konstrukten transformierte Pflanzen bereit. Wir erläutern die Erfindung nachfolgend unter Verwendung von Tabak als eine Modell-Pflanzenart.
Die Konstrukte können in der Expression exogener Gene und Proteine in Gefäßgeweben verwendet werden, insbesondere, aber nicht ausschließlich, wie Pappel, Eukalyptus, Kiefer und andere Holzpflanzen, sowie Futterpflanzen, wie Festuca, Luzerne, Mais, Hirse, Penesitum, u. a.
Dieser Promotor wird nicht nur in modifizierten Pflanzen in einem gegebenen Gewebe exprimiert werden, sondern wird ebenfalls als Reaktion auf Umwelt- und endogene Signale, wie Verwundung, Infektion, Ethylen-Produktion und andere, induziert werden.
Der Promotor zur Verwendung in der Erfindung stammt aus dem CAD-Gen.
Die stromabwärts (3') gelegenen Terminatorsequenzen können ebenfalls aus dem CAD-Gen abgeleitet werden, oder sie können aus anderen Genen abgeleitet werden. Viele Möglichkeiten sind aus der Literatur erhältlich, wobei die Auswahl des Terminators von relativ geringerer Bedeutung ist.
Mit dem Begriff "exogene codierende Sequenz" bezeichnen wir eine Sequenz der DNA, anders als jene, die der Promotorregion im natürlichen CAD-Gen folgt, die dazu angepaßt ist, unter der Wirkung von Pflanzenzell- Enzymen wie RNA-Polymerase zu funktioneller RNA transkribiert zu werden. Funktionelle RNA ist RNA, die die Biochemie der Zelle beeinflußt: sie kann z. B. mRNA sein, die durch Ribosomen zu Protein translatiert wird; oder antisense-RNA, die die Translation von dazu komplementärer (oder in anderer Weise in Beziehung stehender) mRNA zu Protein hemmt. Im Prinzip kann jede exogene codierende Sequenz in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Wenn die exogene codierende Sequenz für mRNA für ein Protein codiert, kann dieses Protein bakteriellen Ursprungs (wie Enzyme, die an der Zellwandmodifikation und dem Zellwandstoffwechsel beteiligt sind), eukaryotischen Ursprungs (wie pharmazeutisch aktive Polypeptide oder pflanzlichen Ursprungs sein (wie Enzyme, die an der Synthese von phenolischen Verbindungen, an der Ethylen-Synthese, am Zuckerstoffwechsel, am Zellwandstoffwechsel beteiligt sind), oder Gene oder Teile davon in sense- oder antisense-Orientierung.
Eine große Vielzahl exogener codierender Sequenzen ist aus der Literatur bekannt, und die vorliegende Erfindung ist auf diese sowie auf viele andere, noch anzugebende anwendbar. Wie funktionelle mRNA kann das exogene Gen für RNA codieren, die in die Funktion jeder Art von mRNA eingreift, die durch die Pflanzenzelle erzeugt wird: z. B. zu mRNA komplementäre antisense-RNA für Gene wie die Stilbensynthese, Phytoalexinsynthese und Aroma- und Pigmentsynthese.
Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit des CAD-Genpromotors, auf exogene Reize zu reagieren.
Die Konstruktion von Vektoren und Konstrukten der vorliegenden Erfindung wird im Detail in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Der Zweckmäßigkeit halber wird es allgemein als geeignet gefunden, Promotorsequenzen (stromaufwärts - d. h. 5' - der codierenden Sequenz des Gens) mit einer Länge zwischen 100 und 2000 Basen zu verwenden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Promotor zur Verwendung in der Expression exogener Gene in Pflanzen, der den Promotor von Cinnamylalkoholdehydrogenase umfaßt.
Insbesondere umfaßt der Promotor der Erfindung die in Fig. 2 gezeigte Nukleotidsequenz.
Die Erfindung stellt ferner ein rekombinantes Genkonstrukt bereit, das in dieser Reihenfolge einen erfindungsgemäßen Promotor, eine codierende Region und einen Genterminator umfaßt.
Die Erfindung umfaßt ferner ein rekombinantes Pflanzengenom, das das Konstrukt enthält.
Pflanzenzellen können mit Konstrukten der Erfindung gemäß einer Vielzahl bekannter Verfahren transformiert werden (Agrobacterium-Ti- Plasmide, Elektroporation, Mikroinjektion, Mikroprojektilbombardierung, etc.). Die transformierten Zellen können dann zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, in denen das neue Kernmaterial stabil im Genom eingebaut ist. Sowohl transformierte einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen können auf diese Weise erhalten werden. Die eingesetzten Transformations- und Regenerationsverfahren sind nicht besonders wesentlich für diese Erfindung und können einfach aus den aus der Literatur erhältlichen ausgewählt werden.
Beispiele für erfindungsgemäße genetisch modifizierte Pflanzen schließen Tomaten, Früchte, wie Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen und Melonen; und Feldfrüchte, wie Mais, Sonnenblumen, Zuckerrübe, Raps, und kleinkörnige Getreide, wie Weizen, Gerste und Reis, Zierpflanzen, wie Nelken, Petunien, Rosen, Chrysanthemen, etc. ein.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Pflanzen können mehr als ein rekombinantes Konstrukt enthalten. Wie ein oder mehrere Konstrukte, die den Cinnamylalkoholdehydrogenase-Promotor enthalten, können sie ein große Vielzahl anderer rekombinanter Konstrukte enthalten, z. B. Konstrukte mit unterschiedlichen Wirkungen auf die pflanzliche Entwicklung, Struktur und Verteidigung. Insbesondere sind in dieser Erfindung Konstrukte eingeschlossen, die die Ligninstruktur/Zusammensetzung und -Qualität und -Menge, Cellulose- und Hemicellulosestruktur und -Menge und Pflanzenverteidigungsgene beeinflussen.
Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit des CAD-Genpromotors, auf exogene Reize zu reagieren. So ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren der Aktivierung exogener codierender Sequenzen in Pflanzen unter der Kontrolle des CAD-Promotors, welches die Anwendung exogener Reize, wie Viren, Pilze und Bakterien, sowie Ethylen und andere Chemikalien, umfaßt. Dies kann besondere Verwendung finden, wenn die Expression neuer Eigenschaften in der Pflanze exogen gesteuert werden muß.
Wir beschreiben jetzt die Isolierung genomischer Klone aus einer Tabak-Genombank, die das Cinnamylalkoholdehydrogenase-Gen und verwandte Sequenz codiert. Genomische Klone, die eines der in Tabak gefundenen nahe verwandten CAD-Gene darstellen, wurden durch DNA-Sequenzanalyse isoliert und charakterisiert. Der Klon gTCAD9 stellt das ganze Gen dar, wobei die Exon-Sequenz identisch zum Klon pTCAD14 mit nur zwei Abweichungen ist. Die in den Beispielen beschriebenen genomischen Klone decken die gesamte codierende Region und die vollständige Transkriptionsstartregion des CAD- Gens ab. Der Subklon gNTCAD9-6.4SH enthält ca. 2800 bp des Promotorfragments dieses Gens.
Die Erfindung wird ferner unter Verweis auf die folgenden Abbildungen beschrieben werden, worin gilt:
Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte von gNtCAD9 und ein Diagramm der Struktur des CAD-Gens;
Fig. 2 zeigt die Nukleotidsequenz des CAD-Promotors und das CAD- Strukturgen, von dem das meiste im 6,4 kb SalI-HindIII-Fragment von gNTCAD9 enthalten ist (SEQ ID NO: 1).
Fig. 3 umreißt ein Schema zur Konstruktion des Pflanzentransformationsdektors pNtCAD9Prom-GUS1.

Beispiel 1

1. 1 Isolierung von CAD-Genen

Eine Tabak-Genombank (N. tabacum cv NK 326) wurde von Clontech erworben. Diese Bank enthält teilweise mit MboI digerierte genomische DNA, die in lambda-EMBL3 kloniert ist. Die Bank wurde mit dem pTCAD14-cDNA- Insert durchmustert, und positive Phagen wurden durch vier aufeinanderfolgende Zyklen von Plaque-Reinigung gereinigt. Vier positive Klons wurden isoliert.
Restriktionsfragmentkartierung und DNA-Sequenzanalyse dieser Klone zeigten, daß alle vier Klone überlappende Klone des CAD-Gens sind und verwandt sind. Nur die Klone 2 und 9 enthalten Promotorsequenzen, und nur Klon 9 wurde im Detail charakterisiert. Eine Restriktionskarte dieses Klons ist in Fig. 1 gezeigt.

1. 2 Charakterisierung der CAD-Genpromotorsequenz

Ein 6,4 kb SalI-HindIII-Fragment wurde aus gNTCAD9 isoliert, und die Nukleotidsequenz, die 2765 bp der 5'-flankierenden (Promotor-) Sequenzen und den Großteil der codierenden Sequenzen abdeckt, wurde bestimmt (Fig. 2). Primer-Extensionsexperimente legen den Transkriptionsstartpunkt an die Nukleotidposition 2766.
Die vollständigen Sequenzdaten von ca. 6,8 kb wurden aus einem auf Klon gNtCAD9 enthaltenen Tabak-CAD-Gen erhalten. Folgendes wird dadurch bestätigt:
(A) Transkriptionsstartstelle an Position 2766 von der stromaufwärts gelegenen SalI-Stelle kartiert, jetzt als Position + 1 bezeichnet, was das ATG-Startcodon auf + 110 setzt.
(B) Position und genaue Größe der vier Introns: (I) bei + 198, Größe 149 bp; (II) bei + 312, Größe 1290 bp; (III) bei + 540, Größe 563 bp; (IV) bei 980, Größe 632 bp. Die Intronposition und -größen unterscheiden sich von jenen in ADH-Genen.
(C) Drei Nukleotidabweichungen gegenüber cDNA cNtCAD14, die alle stumm gegenüber dem abgeleiteten Protein sind. Sie können Sortenunterschieden zwischen cDNA und Genombank zugeschrieben werden.

1. 3 Fusion von CAD-Promotor an das GUS-Reportergen

Eine XbaI-Stelle an Position +84 wurde zur Isolierung des CAD- Promotors aus gNtCAD9 und Schaffung einer transkriptionalen Fusion von 2849 bp des Promotors und Leitsequenzen an das GUS-Reportergen in pBI 101.4 verwendet. Das Promotorfragment wurde nach partieller XbaI-Digestion aufgrund einer zweiten XbaI-Stelle im Promotor isoliert. Korrekte Fusion und Fusionsgrenzen wurden durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt.

1. 4. Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors - pCAD-gus

Der das 6,4 kb SalI-HindIII-Fragment enthaltende Plasmid-Subklon gNtCAD9-6.4SH wurde mit SalI digeriert und partiell mit XbalI digeriert, um ein 2853 bp SalI-XbaI-Fragment zu gewinnen, das die gesamte erhältliche CAD-Promotorsequenz und 87 bp der Leitsequenz enthält. Dieses Promotorfragment wurde in den angemessen geschnittenen Polylinker der promotorlosen GAS-Kassette des binären Pflanzentransformationsvektors pBI101.4 in 5'-3'- Orientierung inseriert (Fig. 3). Die korrekte Insertion wurde durch DNA- Sequenzierung der Fusionsgrenzen bestätigt.

Beispiel 2

Erzeugung transformierter Pflanzen

Der Vektor pNtCAD9Prom-GUS1 (aus Beispiel 1.4) wird auf Agrobacterium tumefaciens LBA4404 übertragen (ein weithin für Pflanzenbiotechnologen erhältlicher Mikroorganismus) und wurde zur Transformation von Tabakpflanzen verwendet. Das Fusionskonstrukt wurde in Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 eingeführt. Tabak cv. SR1-Blattscheiben wurden über Co-Kultivierung mit Agrobakterien, die das Konstrukt beherbergen, transformiert. Transgene Schößlinge wurden bewurzelt und weiter durch Standardverfahren vermehrt. Die Transformation von Tabak-Blattscheiben folgt anerkannten Methoden. Transformierte Pflanzen wurden durch ihre Fähigkeit zum Wachsen auf Medien identifiziert, die das Antibiotikum Kanamycin enthalten. Pflanzen wurden regeneriert und bis zur Reife herangezogen.
Die gewebespezifische und Entwicklungsexpression und die Expression als Reaktion auf externe Reize des β-Glucuronidase-(GUS)-Gens gemäß Bestimmung durch den CAD-Genpromotor wird durch Analyse von Stengeln, Wurzeln, Blättern, Samen, Blüten, Pollen und als Reaktion auf Verwunden und Ethylen-Behandlung auf GUS-Enzymaktivität gezeigt.

Beispiel 3

Expression von CAD-Promotor - GUS-Fusion in transgenem Tabak

Aus 20 regenerierten Transformanten wurden 11 im Detail analysiert. Quantitativ (fluorometrische Analyse) ist die GUS-Aktivität am höchsten in den Wurzeln, gefolgt von Stengeln und Blättern. Histochemisches Anfärben durch X-gluc zeigt eine starke Expression im Gefäßsystem der Stengel und Blätter, vorzugsweise im sich entwickelnden Xylem, wo die Verholzung bekanntermaßen auftritt. Keine Aktivität war im Mark oder Epidermisgewebe nachweisbar. Jedoch weisen Blatt- und Stengelhaare (Trichomen) eine beträchtliche GUS-Expression in bestimmten Stufen ihrer Entwicklung auf. Ein Beispiel ist die Region um Achselknospen herum, wo eine stärke Anfärbung der Trichomen beobachtet wurde. Beim Verwunden von Stengeln wurde eine lokale Induktion der Promotoraktivität während der Entwicklung eines Wundverschlusses beobachtet, aber nur 10 bis 20 Tage nach der Verwundung.

Claims

1. DNA-Konstrukt zur Verwendung in der Transformation von Pflanzenzellen, welches eine exogene codierende Sequenz unter der Kontrolle stromaufwärts gelegener Promotor- und stromabwärts gelegener Terminatorsequenzen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß der stromaufwärts gelegene Promotor ein Cinnamylalkoholdehydrogenase-Genpromotor mit einer Nukleotidsequenz ist, die die ersten 2765 Basenpaare von SEQ ID NO: 1. (Fig. 2) umfaßt.

2. Cinnamylalkoholdehydrogenase-Genpromotor, der im mit gNtCAD9-6.3SH bezeichneten Klon vorhanden ist, der in den National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, am 2. April 1992 unter der Eingangs-Nr. NCIB 40499 hinterlegt wurde.

3. Pflanzen und Pflanzenzellen, die mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 1 transformiert sind.