JP3436758B2 - 形質転換植物における遺伝子の発現 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は形質転換植物（transgenic plant）における
遺伝子発現の調節に関する。特に、本発明は、リグニン
化組織において且つ病原体による感染（pathogen attac
k）に応答して遺伝子の発現を制御するDNA配列の単離と
使用に関する。

植物遺伝子を単離し且つ操作することができることに
より、植物遺伝子の発現の調節に関連した機構を理解す
る道が開かれた。この知識は、遺伝子工学技術を開発す
る場合に、実際的問題例えば改良された性質と生産特性
とを示す遺伝子操作された作物植物における遺伝子の発
現にとって重要である。

植物中で外来遺伝子の発現を進める（drive）のに使
用されている植物DNA配列に関する文献に、多数の例が
報告されている。多くの場合、遺伝子のコード化領域に
対して5'の位置に近接する領域が遺伝子組立て体に使用
されている。これらの領域はプロモーター配列と呼ばれ
る。これらは植物DNAから誘導し得るし又は別の供給
源、例えばウイルスから誘導し得る。多くの場合に、塩
基500〜1000個までの配列が、外来遺伝子の制御された
発現を考慮する（allow for）のに十分であることが示
されている。例示された調節の種類としては、組織特異
性；外部因子例えば光、加熱処理、化学薬品、ホルモン
類による調節；及び発育調節が挙げられる。しかしなが
ら、1kbよりもはるかに長い配列が、形質転換植物にお
ける遺伝子の高水準の発現を可能にさせる有用な特徴を
有し得ることも明らかにされている。

これらの実験は、プロモーター配列と、外来構造遺伝
子例えば細菌遺伝子（bacterial gene）等との間の遺伝
子融合を使用して広く行われている。これは有用なプロ
モーター配列の同定をもたらしている。

本発明をもたらす研究において、本発明者らは維管束
植物におけるリグニンの生合成に関連する酵素を発現す
る遺伝子を同定した。本発明者らは、この遺伝子が、フ
ェニルプロパノイド代謝のリグニン分岐経路に特異的な
酵素の一つであるシンナミルアルコールデヒドロゲナー
ゼ（CAD）をコード化することを明らかにした。問題の
遺伝子は、本出願人の同時継続中の国際特許出願公開第
WO 93/05159号明細書の主題であるクローン類の中のcDN
AクローンpTCAD19によってコード化される。

CAD遺伝子によってコード化されている酵素は、シン
ナミルアルデヒドのシンナミルアルコール（これはリグ
ニン重合体の直接前駆物質である）への酸化反応を触媒
する。本発明者らはこの酵素をコード化する遺伝子をタ
バコ植物から単離した。

本発明者らは、CAD mRNAが植物の生育中にリグニン化
組織において認められる最も高い水準で発現されること
を明らかにした。これらのリグニン化組織においては、
CAD酵素は植物の木質部において高濃度で認め得る。

本発明の目的は、植物における外来遺伝子の発現を制
御するのに適したプロモーター配列を提供することにあ
る。

本発明によれば、植物細胞を形質転換するのに使用さ
れるDNA組立て体であって、上流側プロモーター配列と
下流側ターミネーター配列の制御下にある外因性コード
化配列を含有するDNA組立て体において、前記上流側プ
ロモーターがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺
伝子のプロモーターであって配列番号:1の最初の2765個
のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有するプロ
モーターであることを特徴とするDNA組立て体が提供さ
れる。

従って、本発明は前記のシンナミルアルコールデヒド
ロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、前記組織における新
規且つ外因性のタンパク質及び遺伝子の発現の制御に使
用することからなる。

クローンgNtCAD9−6.3SHがこの遺伝子のプロモーター
断片を含んでいる。このクローンは、スコットランド、
アバディーンAB2 1RY、マーチャドライブ23ストリート
（23 St.Machar Drive,Aberdeen AB2 1RY,Scotland）所
在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダス
トリアル・アンド・マリンバクテリア（the National C
ollections of Industrial and Marine Bacteria）（NC
IB）に1992年４月２日付けで寄託番号NCIB 40499として
寄託してある。

本発明者らはさらに、本発明の組立て体を用いて形質
転換させた新規な植物細胞及び植物を提供する。以下、
モデル植物としてタバコを使用して本発明を例証する。

本発明の組立て体は、繊管束植物、特に、しかしそれ
だけに限定されるものではない（not exclusively）
が、数ある中で例えばポプラ、ユーカリ樹、松及び他の
木質植物、並びに飼い葉類（forage）例えばフェスツカ
（festuca）、アルファルファ、トウモロコシ、モロコ
シ、ペネシツム（penesitum）における外因性遺伝子及
びタンパク質の発現に使用し得る。

このプロモーターは、改質植物の所定の組織で発現さ
れるばかりでなく、環境的な信号及び内因性の信号、例
えば傷、感染、エチレン産生、その他に応答しても誘導
される。

下流側（3'）ターミネーター配列もまたCAD遺伝子か
ら誘導し得るし、又は該配列は別の遺伝子からも誘導し
得る。多くの可能性が文献から利用し得る。前記ターミ
ネーターの選択はどちらかといえばあまり重要ではな
い。

“外因性コード化配列（exogeneous encoding sequen
ce）”という用語は、DNAの配列であって、植物細胞酵
素例えばRNAポリメラーゼの作用の下で機能性RNA（func
tional RNA）に転写されるのに適合したDNAの配列、す
なわち天然CAD遺伝子のプロモーター領域の後に続く別
のDNAの配列を意味する。機能性RNAは、細胞の生化学反
応に影響を及ぼすRNAである：それは例えばリボソーム
によって蛋白質に翻訳されるmRNAであってもよいし；又
はアンチセンスRNAに対して相補的な（又は関連した）m
RNAの蛋白質への翻訳を阻害するアンチセンスRNAであっ
てもよい。原則として、任意の外来性遺伝子が本発明に
使用し得る。

外因性コード化配列がタンパク質用のmRNAをコード化
する場合には、このタンパク質は細菌起源のもの（例え
ば、細胞壁の修飾及び細胞壁の代謝に関連した酵素）、
真核生物起源のもの（例えば、薬学的に活性なポリペプ
チド）又は植物起源のもの（例えば、フェノール化合物
の合成、エチレン合成、糖代謝、細胞壁の代謝に関連し
た酵素）、あるいはセンス又はアンチセンス配向の遺伝
子又はその部分であり得る。

種々様々な外因性コード化配列が文献から知られてお
り、本発明はこれらの配列及び報告されるべきさらに別
の配列に適用し得る。機能性mRNAの他に、外因性遺伝子
は、植物細胞によって産生されるある種のmRNAの機能を
妨げるRNA:例えばアンチセンスRNAであって、スチルベ
ン合成、フィトアレキシン合成並びにフレーバー（flav
our）及び色素合成のごとき遺伝子用のmRNAと相補的な
アンチセンスRNAをコードし得る。

CAD遺伝子のプロモーターは外因性刺激に応答できる
ことが特に重要である。

本発明のベクター及び組立て体の組み立てを、以下の
実施例においてさらに詳しく説明する。便宜上、塩基の
長さが100〜2000個のプロモーター配列（遺伝子のコー
ド化配列の上流側−すなわち、5'側−）を使用するのに
適していることが一般的に認められるであろう。

本発明の特に好ましい態様は、植物における外因性遺
伝子の発現において使用されるプロモーターであって、
シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター
を含有するプロモーターある。

さらに詳しくは、本発明のプロモーターは、第２図に
示されるヌクレオチド配列を含有する。本発明は、前記
配列の部分改変物（modifications）又は前記配列のご
く一部の使用であって、機能性を維持するために前記配
列に対する十分な相同性を保持しながら、その組織特異
性又は外部刺激に対する応答性を高めるか又は変化させ
る、前記配列の部分改変物又は前記配列のごく一部の使
用を包含する。

さらに、本発明は、本発明のプロモーター、コード化
領域及び遺伝子ターミネーターを順序正しく含んでなる
組換え遺伝子組立て体を提供する。

さらにまた、本発明は前記組立て体を含有する組換え
植物ゲノムを提供する。

植物細胞は本発明のDNA組立て体を用いて、種々の既
知の方法〔アグロバクテリウム（Agrobacterium）Tiプ
ラスミド法、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、
マイクロインジェクション法、微小発射体砲撃法（micr
oprojectile bombardment）など〕に従って形質転換し
得る。次いで、形質転換細胞を、新しい核物質がゲノム
中に安定的に組み込まれる完全な植物（whole plant）
中で再生させ得る。形質転換された単子葉植物と双子葉
植物の両方がこの方法により得ることができる。前記の
用いた形質転換法及び再生法は本発明にとって特に適切
なものではなく、文献から入手し得る方法から簡単に選
択し得る。

本発明による遺伝子改質植物の例としては、トマト、
果物例えばマンゴ、桃、リンゴ、梨、イチゴ、バナナ及
びメロン；並びに圃場作物例えばトウモロコシ、ヒマワ
リ、砂糖ダイコン、カノラ（canola）、並びに小粒穀類
例えば小麦、大麦及び稲、観賞用植物例えばカーネーシ
ョン、ペチュニア、バラ、キク等が挙げられる。

本発明によって産生される植物は組換え組立て体を２
個以上含有していてもよい。シンナミルアルコールデヒ
ドロゲナーゼプロモーターを含んだ組立て体の１種又は
それ以上のほかに、前記植物は種々様々な別の組換え組
立て体、例えば植物の生育、構造及び防御に種々の影響
を及ぼす組立て体を含み得る。特に、リグニンの構造、
組成、並びに品質及び量、セルロース及びヘミセルロー
スの構造及び量に影響を及ぼす組立て体、並びに植物防
御遺伝子が本発明に包含される。

前記のCAD遺伝子プロモーターは外因性の刺激に反応
できることが特に重要である。従って、外因性の刺激例
えばウイルス、カビ菌、細菌（バクテリア）並びにエチ
レン及び他の化学薬品を適用することによって、CAD遺
伝子プロモーターの制御下で植物中で外因性コード化配
列を活性化することができる。この方法は、植物中にお
ける新規な特性（character）の発現を外部から（exoge
neously）制御することを必要とし得る場合に具体的用
途を見出し得る。

以下に、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝
子及び関連配列をコード化するタバコゲノムライブラリ
ーからのゲノムクローンの単離を説明する。タバコに見
出だされる密接に関連した複数のCAD遺伝子の内の一つ
を発現するゲノムクローンを、単離し、DNA配列決定分
析によって特定した。前記クローンgTCAD9は、わずか２
組の誤対合（mismatch）を伴ったクローンpTCAD14と同
じエキソン配列をもった遺伝子の全部に相当する（repr
esent）。実施例に記載のゲノムクローンは、コード化
領域と、CAD遺伝子の完全な転写開始領域との全部を含
む。サブクローンgNtCAD9−6.4SHは、この遺伝子の約28
00bpのプロモーター断片を含んでいる。

本発明を添付図面を参照してさらに説明する。添付図
面において、 第１図は、gNtCAD9の制限地図とCAD遺伝子の構造の概
略図を表わし； 第２図は、CADプロモーターとCAD構造遺伝子とのヌク
レオチド配列を表わし、その大部分はgNtCAD9の6.4kbの
Sal I−Hind III制限断片に含まれる（配列番号:1）。

第３図は、植物形質転換ベクターpNtCAD9Prom−GUS1
の組み立ての概略を表わす。

実施例１ 1.1CAD遺伝子の単離 タバコのゲノムライブラリー（N.tabacum cv NK326）
をClontech社から購入した。このライブラリーは、λEM
BL3中にクローン化されたMbo I部分消化ゲノムDNAを含
有する。このライブラリーをpTCAD14 cDNAインサートを
用いて選別し、陽性ファージを、連続して４回プラーク
精製することにより精製した。

制限断片の地図作成及びこれらのクローンのDNA配列
分析により、４個のクローン全部がCAD遺伝子のオーバ
ーラップ（overlapping）クローンであり、関係してい
ることが示された。クローン２とクローン９のみがプロ
モーター配列を含んでおり、クローン９のみを詳細に特
定した。このクローンの制限地図を第１図に示す。

1.2CAD遺伝子プロモーター配列の特定 gNtCAD9から6.4kbのSal I−Hind III制限断片を単離
し、2765bpの5'−フランキング（プロモーター）配列と
コード化配列の大部分とを含むヌクレオチド配列を決定
した（第２図）。プライマー伸長実験は転写開始点をヌ
クレオチド位置2766に置く。

クローンgNtCAD9上に含まれるタバコCAD遺伝子につい
て、約6.8kbの全配列データが得られた。これは以下に
よって確認された：すなわち、 （Ａ）上流側Sal I末端（boader）から2766の位置に地
図化された転写開始部位（ここを位置＋１と呼ぶ）は、
ATG出発コドンを＋110に置いていること； （Ｂ）４つのイントロンの位置と正確な大きさが イントロン（Ｉ）位置＋198、大きさ149bp; イントロン（II）位置＋312、大きさ1290bp; イントロン（III）位置＋540、大きさ563bp; イントロン（IV）位置 980、大きさ632bp; であること、イントロンの位置と大きさはADH遺伝子に
おけるものと異なっていること； （Ｃ）３個のヌクレオチドがcDNA cNtCAD14に誤対合
し、これらはすべて推論された（deduced）タンパク質
についてサイレント（silent）であること；これらはcD
NAとゲノムライブラリーの間の培養の相違に起因し得る
こと； によって確認された。

1.3GUSリポーター遺伝子に対するCADプロモーターの融
合 位置＋84のXba I制限部位を使用してgNtCAD9からCAD
プロモーターを単離し、pBI 101.4中のGUSリポーター遺
伝子に対してプロモーター配列とリーダー配列の2849bp
の転写融合（transcriptional fusion）を行った。プロ
モーター断片を、該プロモーター中の第２のXba I部位
のために（due to）、Xba I部分消化した後に単離し
た。正しい融合及び融合端が制限分析とDNA配列決定に
より確認された。

1.4植物形質転換ベクター−pCAD−gusの組み立て 6.4kbのSal I−Hind III制限断片を含んでいるプラス
ミドサブクローンgNtCAD9−6.4SH Sal Iで消化し、次い
でXba Iで部分消化して2853bpのSal I−Xba I制限断片
を得た。該断片は利用し得るCADプロモーター配列の全
部と87bpのリーダー配列とを含んでいる。このプロモー
ターを、二つの部分からなる植物形質転換ベクターpBI1
01.4のプロモーターを含んでいないGASカセットの適当
に切断したポリンカーに5'−3'の向きで挿入した（第３
図）。正しい挿入を融合両端のDNA配列決定により確認
した。

実施例２ 形質転換植物の産生 ベクターpNtCAD9Prom−GUS1（実施例1.4で得たもの）
をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacter
ium tumefaciens）LBA 4404（植物生物工学者が広く入
手し得る微生物）に伝達させ（transferred）、タバコ
植物を形質転換させるのに使用した。前記融合組立て体
をアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA 4404中に
導入した。タバコ（Tobacco cv.SR1）の葉の円板を、前
記組み立て体を含んでいるアグロバクテリウムと共に一
緒に培養することにより形質転換した。形質転換した新
芽（shoots）を根付かせ、標準的方法によりさらに増殖
させた。タバコの葉の円板の形質転換は確立された方法
に従った。形質転換植物を、抗生物質カナマイシンを含
有する培地上で生育する能力によって同定した。植物を
再生させ、成熟期まで生長させた。

組織特異的且つ発生上の発現と、CAD遺伝子プロモー
ターによって決定されたようなβ−グルクロニダーゼ
（GUS）の外部刺激に応答する発現とが、茎、根、葉、
種子、花、花粉の分析、及び傷に対する応答の分析並び
にGUS酵素活性に関するエチレン処理により証明され
た。

実施例３ 形質転換タバコにおけるCADプロモーター−GU融合の発
現 形質転換体20個から再生させた11個をさらに詳しく分
析した。定量分析（蛍光分析法）によれば、GUS活性は
根において最も高く、次いで茎と葉である。Ｘ−glucに
よる組織化学的染色は、茎及び葉の維管束系において、
優先的には発育する木質部（そこではリグニン化が起こ
らないことが知られている）において強い発現を示す。
木髄又は表皮組織においては活性は検出できなかった。
しかしながら、葉と茎の毛（stem hair）（毛状物）は
それらの発育のある段階においてかなりのGUS発現を示
した。一つの例は腋芽の周囲の領域であり、そこでは毛
状物の強い染色が認められた。茎が傷付けられると、傷
付けられたプラグ（plug）の発育中に、しかし傷付けら
れた後の10〜20日間は、プロモーターの局部的誘導が認
められた。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物細胞を形質転換するのに使用されるDN
   A組立て体であって、上流側プロモーター配列と下流側
   ターミネーター配列の制御下にある外因性コード化配列
   を含有するDNA組立て体において、前記上流側プロモー
   ターがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の
   プロモーターであって配列番号:1の最初の2765個のヌク
   レオチドからなるヌクレオチド配列を有するプロモータ
   ーであることを特徴とするDNA組立て体。
2. 【請求項２】単離されたシンナミルアルコールデヒドロ
   ゲナーゼ遺伝子プロモーターであって配列番号:1の最初
   の2765個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有
   するシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロ
   モーター。
3. 【請求項３】スコットランド、アバディーンAB2 1RY、
   マーチャドライブ23ストリート所在のザ・ナショナル・
   コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ
   リンバクテリア（NCIB）に1992年４月２日付けで寄託番
   号NCIB 40499として寄託してあるgNtCAD9−6.3SHと命令
   されたクローン中に存在する配列番号:1の最初の2765個
   のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有するシン
   ナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ
   ー。
4. 【請求項４】請求項１記載の組立て体を用いて形質転換
   された植物細胞。
5. 【請求項５】請求項１記載の組立て体を用いて形質転換
   されたタバコ植物。