JP2002503081A - 形質転換植物における遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子プロモーター配列が酵素シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ(CAD)(該酵素はリグニンの生合成に関係する)をコード化する植物遺伝子から単離され、特定された。該プロモーターを使用してその制御下に置かれた外因性遺伝子の発現を制御し得る。前記CADプロモーターによって制御される遺伝子は傷付けられることによって誘導し得る。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換植物における遺伝子の発現 本発明は形質転換植物(transgenic plant)における遺伝子発現の調節に関する 。特に、本発明は、リグニン化組織において且つ病原体による感染(pathogen at tack)に応答して遺伝子の発現を制御するDNA配列の単離と使用に関する。 植物遺伝子を単離し且つ操作することができることにより、植物遺伝子の発現 の調節に関連した機構を理解する道が開かれた。この知識は、遺伝子工学技術を 開発する場合に、実際的問題例えば改良された性質と生産特性とを示す遺伝子操 作された作物植物における遺伝子の発現にとって重要である。 植物中で外来遺伝子の発現を進める(drive)のに使用されている植物DNA配列に 関する文献に、多数の例が報告されている。多くの場合、遺伝子のコード化領域 に対して5'の位置に近接する領域が遺伝子組立て体に使用されている。これらの 領域はプロモーター配列と呼ばれる。これらは植物DNAから誘導し得るし又は別 の供給源、例えばウイルスから誘導し得る。多くの場合に、塩基500〜1000個ま での配列が、外来遺伝子の制御された発現を考慮する(allow for)のに十分であ ることが示されている。例示された調節の種類としては、組織特異性；外部因子 例えば光、加熱処理、化学薬品、ホルモン類による調節；及び発育調節が挙げら れる。しかしながら、１kbよりもはるかに長い配列が、形質転換植物における遺 伝子の高水準の発現を可能にさせる有用な特徴を有し得ることも明らかにされて いる。 これらの実験は、プロモーター配列と、外来構造遺伝子例えば細菌遺伝子(bac terial gene)等との間の遺伝子融合を使用して広く行われている。これには有用 なプロモーター配列の同定をもたらしている。 本発明をもたらす研究において、本発明者らは維管束植物におけるリグニンの 生合成に関連する酵素を発現する遺伝子を同定した。本発明者らは、この遺伝子 が、フェニルプロパノイド代謝のリグニン分岐経路に特異的な酵素の一つである シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ(CAD)をコード化することを明らかにし た。問題の遺伝子は、本出願人の同時継続中の国際特許出願公開第WO 93/05159 号明細書の主題であるクローン類の中のcDNAクローンpTCAD19によってコード化 される。 CAD遺伝子によってコード化されている酵素は、シンナミルアルデヒドのシン ナミルアルコール（これはリグニン重合体の直接前駆物質である）への酸化反応 を触媒する。本発明者らはこの酵素をコード化する遺伝子をタバコ植物から単離 した。 本発明者らは、CAD mRNAが植物の生育中にリグニン化組織において認められる 最も高い水準で発現されることを明らかにした。これらのリグニン化組織におい ては、CAD酵素は植物の木質部において高濃度で認め得る。 本発明の目的は、植物における外来遺伝子の発現を制御するのに適したプロモ ーター配列を提供することにある。 本発明によれば、植物細胞を形質転換するのに使用されるDNA組立て体であっ て、上流側プロモーター配列と下流側ターミネーター配列の制御下にある外因性 コード化配列を含有するDNA組立て体において、前記上流側プロモーターがリグ ニン生合成経路の遺伝子のプロモーターであるか又は該遺伝子のプロモーターに 機能的相同性を有するものであることを特徴とするDNA組立てが提供される。 従って、本発明はシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーター又は リグニン生合成経路に関連した別の遺伝子のプロモーターの１つ又は複数を、前 記組織における新規且つ外因性のタンパク質及び遺伝子の発現の制御に使用する ことからなる。 前記プロモーターはCADプロモーターであるのが好ましい。 クローンgNtCAD9-6.3SHがこの遺伝子のプロモーター断片を含んでいる。この クローンは、スコットランド、アバディーンAB2 1RY、マーチャドライブ23スト リート(23 St．Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，Scotland)所在のザ・ナショ ナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリンバクテリア(t he National Collections of Industrial and Marine Bacteria)(NCIB)に1992年 ４月２日付けで寄託番号NCIB 40499として寄託してある。 本発明者らはさらに、本発明の組立て体を用いて形質転換させた新規な植物細 胞及び植物を提供する。以下、モデル植物としてタバコを使用して本発明を例証 する。 本発明の組立て体は、繊管束植物、特に、しかしそれだけに限定されるもので はない(not exclusively)が、数ある中で例えばポプラ、ユーカリ樹、松及び他 の木質植物、並びに飼い葉類(forage)例えばフェスツカ(festuca)、アルファル ファ、トウモロコシ、モロコシ、ペネシツム(penesitum)における外因性遺伝子 及びタンパク質の発現に使用し得る。 このプロモーターは、改質植物の所定の組織で発現されるばかりでなく、環境 的な信号及び内因性の信号、例えば傷、感染、エチレン産生、その他に応答して も誘導される。 本発明において使用するプロモーターは、遺伝子例えばメチルトランスフェラ ーゼ及びシンナミルCoAレダクターゼの遺伝子から誘導し得る。かかるプロモー ターは、CADの場合に行われているように、ゲノムライブラリーからcDNAプロー ブを使用することにより単離し得る。本発明者らは特にCAD遺伝子のプロモータ ーを使用するほうを好む。 下流側(3')ターミネーター配列もまたCAD遺伝子から誘導し得るし、又は該配 列は別の遺伝子からも誘導し得る。多くの可能性が文 献から利用し得る。前記ターミネーターの選択はどちらかといえばあまり重要で はない。 “外因性コード化配列(exogeneous encoding sequence)”という用語は、DNA の配列であって、植物細胞酵素例えばRNAポリメラーゼの作用の下で機能性RNA(f unctional RNA)に転写されるのに適合したDNAの配列、すなわち天然CAD遺伝子の プロモーター領域の後に続く別のDNAの配列を意味する。機能性RNAは、細胞の生 化学反応に影響を及ぼすRNAである：それは例えばリボソームによって蛋白質に 翻訳されるmRNAであってもよいし；又はアンチセンスRNAに対して相補的な（又 は関連した）mRNAの蛋白質への翻訳を阻害するアンチセンスRNAであってもよい 。原則として、任意の外来性遺伝子が本発明に使用し得る。 外因性コード化配列がタンパク質用のmRNAをコード化する場合には、このタン パク質は細菌起源のもの（例えば、細胞壁の修飾及び細胞壁の代謝に関連した酵 素）、真核生物起源のもの（例えば、薬学的に活性なポリペプチド）又は植物起 源のもの（例えば、フェノール化合物の合成、エチレン合成、糖代謝、細胞壁の 代謝に関連した酵素）、あるいはセンス又はアンチセンス配向の遺伝子又はその 部分であり得る。 種々様々な外因性コード化配列が文献から知られており、本発明はこれらの配 列及び報告されるべきさらに別の配列に適用し得る。機能性mRNAの他に、外因性 遺伝子は、植物細胞によって産生されるある種のmRNAの機能を妨げるRNA：例え ばアンチセンスRNAであって、スチルベン合成、フィトアレキシン合成並びにフ レーバー(flavour)及び色素合成のごとき遺伝子用のmRNAと相補的なアンチセン スRNAをコードし得る。 CAD遺伝子のプロモーターは外因性刺激に応答できることが特に重要である。 本発明のベクター及び組立て体の組み立てを、以下の実施例においてさらに詳 しく説明する。便宜上、塩基の長さが100〜2000個のプロモーター配列（遺伝子 のコード化配列の上流側‐すなわち、5'側‐）を使用するのに適していることが 一般的に認められるであろう。 本発明の特に好ましい態様は、植物における外因性遺伝子の発現において使用 されるプロモーターであって、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのプロモ ーターを含有するプロモーターある。 さらに詳しくは、本発明のプロモーターは、第２図に示されるヌクレオチド配 列を含有する。本発明は、前記配列の部分改変物(modifications)又は前記配列 のごく一部の使用であって、機能性を維持するために前記配列に対する十分な相 同性を保持しながら、その組織特異性又は外部刺激に対する応答性を高めるか又 は変化させる、前記配列の部分改変物又は前記配列のごく一部の使用を包含する 。 さらに、本発明は、本発明のプロモーター、コード化領域及び遺伝子ターミネ ーターを順序正しく含んでなる組換え遺伝子組立て体を提供する。 さらにまた、本発明は前記組立て体を含有する組換え植物ゲノムを提供する。 植物細胞は本発明のDNA組立て体を用いて、種々の既知の方法〔アグロバクテ リウム(Agrobacterium)Tiプラスミド法、電気穿孔法（エレクトロポレーション ）、マイクロインジェクション法、微小発射体砲撃法(microprojectile bombard ment)など〕に従って形質転換し得る。次いで、形質転換細胞を、新しい核物質 がゲノム中に安定的に組み込まれる完全な植物(whole plant)中で再生させ得る 。形質転換された単子葉植物と双子葉植物の両方がこの方法により得ることがで きる。前記の用いた形質転換法及び再生法は本発明 にとって特に適切なものではなく、文献から入手し得る方法から簡単に選択し得 る。 本発明による遺伝子改質植物の例としては、トマト、果物例えばマンゴ、桃、 リンゴ、梨、イチゴ、バナナ及びメロン；並びに圃場作物例えばトウモロコシ、 ヒマワリ、砂糖ダイコン、カノラ(canola)、並びに小粒穀類例えば小麦、大麦及 び稲、観賞用植物例えばカーネーション、ペチュニア、バラ、キク等が挙げられ る。 本発明の方法によって産生される植物は組換え組立て体を２個以上含有してい てもよい。シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを含んだ組立て 体の１種又はそれ以上のほかに、前記植物は種々様々な別の組換え組立て体、例 えば植物の生育、構造及び防御に種々の影響を及ぼす組立て体を含み得る。特に 、リグニンの構造、組成、並びに品質及び量、セルロース及びヘミセルロースの 構造及び量に影響を及ぼす組立て体、並びに植物防御遺伝子が本発明に包含され る。 前記のCAD遺伝子プロモーターは外因性の刺激に反応できることが特に重要で ある。従って、本発明の別の態様は、CADプロモーターの制御下で植物中で内因 性コード化配列を活性化する方法であって、外因性の刺激例えばウイルス、カビ 菌、細菌（バクテリア）並びにエチレン及び他の化学薬品を適用することからな る、CAD遺伝子プロモーターの制御下で植物中で内因性コード化配列を活性化す る方法である。この方法は、植物中における新規な特性(character)の発現を外 部から(exogeneously)制御することを必要とし得る場合に具体的用途を見出し得 る。 以下に、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及び関連配列をコード 化するタバコゲノムライブラリーからのゲノムクローンの単離を説明する。タバ コに見出だされる密接に関連した複数のCAD遺伝子の内の一つを発現するゲノム クローンを、単離し、DNA配 列決定分析によって特定した。前記クローンgTCAD9は、わずか２組の誤対合(mis match)を伴ったクローンpTCAD14と同じエキソン配列をもった遺伝子の全部に相 当する(represent)。実施例に記載のゲノムクローンは、コード化領域と、CAD遺 伝子の完全な転写開始領域との全部を含む。サブクローンgNtCAD9-6.4SHは、こ の遺伝子の約2800bpのプロモーター断片を含んでいる。 本発明を添付図面を参照してさらに説明する。添付図面において、 第１図は、gNtCAD9の制限地図とCAD遺伝子の構造の概略図を表わし； 第２図は、CADプロモーターとCAD構造遺伝子とのヌクレオチド配列を表わし、 その大部分はgNtCAD9の6.4kbのSalＩ−HindIII制限断片に含まれる（配列番号： １）。 第３図は、植物形質転換ベクターpNtCAD9Prom-GUS1の組み立ての概略を表わす 。 実施例１ 1.1 CAD 遺伝子の単離 タバコのゲノムライブラリー(N.tabacum cv NK326)をClontech社から購入した 。このライブラリーは、λEMBL3中にクローン化されたMboＩ部分消化ゲノムDNA を含有する。このライブラリーをpTCAD14 cDNAインサートを用いて選別し、陽性 ファージを、連続して４回プラーク精製することにより精製した。 制限断片の地図作成及びこれらのクローンのDNA配列分析により、４個のクロ ーン全部がCAD遺伝子のオーバーラップ(overlapping)クローンであり、関係して いることが示された。クローン２とクローン９のみがプロモーター配列を含んで おり、クローン９のみを詳細に特定した。このクローンの制限地図を第１図に示 す。1.2 CAD 遺伝子プロモーター配列の特定 gNtCAD9から6.4kbのSalＩ−HindIII制限断片を単離し、2765bpの 5'-フランキング（プロモーター）配列とコード化配列の大部分とを含むヌクレ オチド配列を決定した（第２図）。プライマー伸長実験は転写開始点をヌクレオ チド位置2766に置く。 クローンgNtCAD9上に含まれるタバコCAD遺伝子について、約6.8kbの全配列デ ータが得られた。これは以下によって確認された：すなわち、 (A)上流側SalＩ末端(boader)から2766の位置に地図化された転写開始部位（こ こを位置＋１と呼ぶ）は、ATG出発コドンを＋110に置いていること； (B)4つのイントロンの位置と正確な大きさが イントロン（Ｉ）位置＋198、大きさ149bp； イントロン（II）位置＋312、大きさ1290bp； イントロン（III）位置＋540、大きさ563bp； イントロン（IV）位置 980、大きさ632bp； であること、イントロンの位置と大きさはADH遺伝子におけるものと異なってい ること； (C)3個のヌクレオチドがcDNA cNtCAD14に誤対合し、これらはすべて推論され た(deduced)タンパク質についてサイレント(silent)であること；これらはcDNA とゲノムライブラリーの間の培養の相違に起因し得ること； よって確認された。 1.3 GUS リポーター遺伝子に対するCADプロモーターの融合 位置＋84のXbaＩ制限部位を使用してgNtCAD9からCADプロモーターを単離し、p BI 101.4中のGUSリポーター遺伝子に対してプロモーター配列とリーダー配列の2 849bpの転写融合(transcriptional fusion)を行った。プロモーター断片を、該 プロモーター中の第２のXbaＩ部位のために(due to)、XbaＩ部分消化した後に単 離した。正しい融合及び融合端が制限分析とDNA配列決定により確認された。1.4 植物形質転換ベクター−pCAD-gusの組み立て 6.4kbのSalＩ−HindIII制限断片を含んでいるプラスミドサブクローンgNtCAD9 -6.4SH SalＩで消化し、次いでXbaＩで部分消化して2853bpのSalＩ−XbaＩ制限 断片を得た。該断片は利用し得るCADプロモーター配列の全部と87bpのリーダー 配列とを含んでいる。このプロモーターを、二つの部分からなる植物形質転換ベ クターpBI101.4のプロモーターを含んでいないGASカセットの適当に切断したポ リンカーに5'-3'の向きで挿入した（第３図）。正しい挿入を融合両端のDNA配列 決定により確認した。 実施例２ 形質転換植物の産生 ベクターpNtCAD9Prom-GUS1（実施例1.4で得たもの）をアグロバクテリウム・ ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LBA 4404(植物生物工学者が広 く入手し得る微生物)に伝達させ(transferred)、タバコ植物を形質転換させるの に使用した。前記融合組立て体をアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA 44 04中に導入した。タバコ(Tobacco cv．SR1)の葉の円板を、前記組み立て体を含 んでいるアグロバクテリウムと共に一緒に培養することにより形質転換した。形 質転換した新芽(shoots)を根付かせ、標準的方法によりさらに増殖させた。タバ コの葉の円板の形質転換は確立された方法に従った。形質転換植物を、抗生物質 カナマイシンを含有する培地上で生育する能力によって同定した。植物を再生さ せ、成熟期まで生長させた。 組織特異的且つ発生上の発現と、CAD遺伝子プロモーターによって決定された ようなβ−グルクロニダーゼ(GUS)の外部刺激に応答する発現とが、茎、根、葉 、種子、花、花粉の分析、及び傷に対する応答の分析並びにGUS酵素活性に関す るエチレン処理により証明された。実施例３ 形質転換タバコにおけるCADプロモーター−GU融合の発現 形質転換体20個から再生させた11個をさらに詳しく分析した。定量分析（蛍光 分析法）によれば、GUS活性は根において最も高く、次いで茎と葉である。X-glu cによる組織化学的染色は、茎及び葉の維管束系において、優先的には発育する 木質部（そこではリグニン化が起こらないことが知られている）において強い発 現を示す。木髄又は表皮組織においては活性は検出できなかった。しかしながら 、葉と茎の毛(stemhair)(毛状物)はそれらの発育のある段階においてかなりのGU S発現を示した。一つの例は腋芽の周囲の領域であり、そこでは毛状物の強い染 色が認められた。茎が傷付けられると、傷付けられたプラグ(plug)の発育中に、 しかし傷付けられた後の10〜20日間は、プロモーターの局部的誘導が認められた 。

【手続補正書】 【提出日】平成１２年３月３日（２０００．３．３） 【補正内容】 (1) 請求の範囲を別紙の通り補正する。 (2) 明細書第１頁第27行の「これには」を「これは」と補正する。 (3) 同書第２頁第22〜24行の「リグニン生合成…………DNA組立て」を「シンナ ミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターであって配列番号：１の 最初の2765個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有するブロモーターで あることを特徴とするDNA組立て体」と補正する。 (4) 同書第２頁第25行の「本発明は」の次に「前記の」を挿入する。 (5) 同書第２頁第25行の「シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ」の次に「遺 伝子」を挿入する。 (6) 同書第２頁第26〜27行の「又はリグニン生合成に関連した別のプロモーター の１つ又は複数を」を削除する。 (7) 同書第３頁第１行の「前記プロモーターはCADプロモーターであるのが好ま しい。」を削除する。 (8) 同書第３頁第21〜26行の「本発明………………好む。」を削除する。 (9) 同書第３頁第８行の「本発明の方法」を「本発明」と補正する。 (10)同書第６頁第17〜19行の「本発明…………方法であって、」を削除する。 (11)同書第６頁第20行の「からなる」を「によって」と補正する。 (12)同書第６頁第21行の「内因性」を「外因性」と補正する。 (13)同書第６頁第22行の「方法である。」を「ことができる。」と補正する。 (14)同書第８頁第21行の「よって」を「によって」と補正する。 請求の範囲 1. 植物細胞を形質転換するのに使用されるDNA組立て体であって、上流側プ ロモーター配列と下流側ターミネーター配列の制御下にある外因性コード化配列 を含有するDNA組立て体において、前記上流側プロモーターがシンナミルアルコ ールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターであって配列番号：１の最初の2765 個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を有するプロモーター であることを 特徴とするDNA組立て体。 2. 単離されたシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターで あって配列番号：１の最初の2765個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を 有する シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。 3. スコットランド、アバディーンAB2 1RY、マーチャドライブ23ストリート 所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ リンバクテリア(NCIB)に1992年４月２日付けで寄託番号NCIB 40499として寄託し てあるgNtCAD9-6.3SHと命名されたクローン中に存在するシンナミルアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。 4. 請求項１記載の組立て体を用いて形質転換された植物及び植物細胞。 5. 配列番号：１の最初の2765個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を 有するシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターであって 外因 性遺伝子の発現を進めるように配置されたシンナミルアルコールデヒドロゲナー ゼ遺伝子プロモーターを含有する組換え植物ゲノム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ， ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 植物細胞を形質転換するのに使用されるDNA組立て体であって、上流側プ ロモーター配列と下流側ターミネーター配列の制御下にある外因性コード化配列 を含有するDNA組立て体において、前記上流側プロモーターがリグニン生合成経 路の遺伝子のプロモーターであるか又はリグニン生合成経路の遺伝子のプロモー ターに機能的相同性を有するものであることを特徴とするDNA組立て体。 2. 前記プロモーターがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロ モーターである、請求項１記載の組立て体。 3. シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターであって、該 プロモーターの機能性を維持するか又は高めるために、第２図に図示されるヌク レオチド配列と、その図示される前記配列に対して十分な相同性を保持する該配 列の部分改変物とを有するシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモ ーター。 4. スコットランド、アバディーンAB2 1RY、マーチャドライブ23ストリート 所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マ リンバクテリア(NCIB)に1992年４月２日付けで寄託番号NCIB 40499として寄託し てあるgNtCAD9-6.3SHと呼ばれるクローン中に存在するシンナミルアルコールデ ヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター。 5. 請求項１又は請求項２に記載の組立て体を用いて形質転換された植物及び 植物細胞。 6. 外因性遺伝子の発現を進めるように配置されたシンナミルアルコールデヒ ドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含有する組換え植物ゲノム。