JPH06501392A - 形質転換した植物における遺伝子の発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 形質転換した植物における遺伝子の発現本発明は形質転換した植物（ｔｒａｎｓ ｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ）における遺伝子の発現に関する。特に、本発明は形質 転換した植物における外来遺伝子（ｆｏｒｅｊｇｎ　ｇｅｎｅ）の、高い水準で の発現を可能にするＤＮＡ配列の単離及びその用途に関する。

植物遺伝子を単離しかつ操作することが可能になったことにより、植物遺伝子の 発現の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関係する機構を理解する道が開かれた。

この知識は、遺伝子操作された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　＊ａｎｉｐｕｌａｔ ｅｄ）作物植物における遺伝子の発現のごとき問題に適用される、遺伝子工学技 術の開発において特に重要である。現在、植物中の外来遺伝子の発現を誘導する ために使用されている植物ＤＮＡ配列についての文献中には、多数の例が存在す る。多くの場合、遺伝子のコード領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）に対して ５°の位置に近接する領域が、遺伝子の構築体（ｇｅｎｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）において使用されている。これらの領域はプロモーター配列と呼ばれている。

これらは植物ＤＮＡから：或いは他の供給源、例えば、ウィルスから誘導され得 る。多くの場合において、５００〜８００塩基までの配列が外来遺伝子の調節さ れた発現を行わせるのに十分であることが示されている。この調節には、組織特 異性：光、熱処理、化学薬品及びホルモンのごとき外部因子による調節；及び発 育的調節（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が包含さてい る。

これらの実験はプロモーター配列と、バクテリアプロモーター遺伝子のごとき外 来遺伝子の間での遺伝子融合を使用して行われている。

調節は観察されているが、これは二つの要因によって阻害されている： Ｉ、内因性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｇｅｎｅ）と比較した場合の、ト ランスゲン（ｔ　ｒａｎｓｇｅｎｅ）について観察される低い水準での発現。多 くの場合に、トランスゲンの発現は、同一のプロモーターが内因性遺伝子を作動 させる場合に達成される発現の約１〜１０％である。このことから、遺伝子に対 して内部的である（ｉｎｔｅｒｎａｌ　）配列も効果的な発現に対して重要であ ることか示唆される。このことは、５“及び３′領域並びにコード領域を包含す る完全遺伝子（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｅ）をプロット形質転換実験（ｂｌｏ ｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）に使用した実験に よって証明されている。達成され得る発現の水準に対する、導入されたトランス ゲンを包囲する配列の影響は、通常、”位置効果”（′″ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｅ ｆＴｅｃｔ−）と呼ばれている。実際的な目的については、植物中に導入された 遺伝子構築体が、内因性遺伝子の発現水準と同等な発現水準を与えることか望ま しい。実際には、プロモーターは、その誘導パターン（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｐ ａｔｔｅｒｎ）　、例えば、その組織特異性又は一時的な（ｔｅｍｐｏｒａｌ　 ）発現パターンのために、遺伝子構築体について選択され得る。しかしながら、 トランスゲンの発現の水準は４通常、臨界的である；所望のプロモーターか高い かつ十分な水準の発現を行わせることができない場合、このプロモーターは有用 ではないてあろう。

２異なる形質転換植物系列の間での、トランスゲンの発現の水準に存在する大き な変動。この変動か生ずる理由は明らかではない・これは“位置効果”の別の表 現であるかもしれない。これらの発現水準は２オーダーまでという大きさで異な り得る。従って、所望の発現水準を示す形質転換細胞を同定するのに、多数の形 質転換細胞を分析することが必要であり得る。

これらの二つの要因は、実際的な植物遺伝子工学操作（ｇｅｎｅｔｉｃｐ＋ａｎ ｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）において既知のプロモーター構築体を使用すること を非常に高価なかつ時間を要するものにせしめている。

本発明の目的は、植物細胞を形質転換するのに使用した場合に、挿入遺伝子の発 現を高い水準でかつ信頼性のあるものにする、新規な植物遺伝子構築体を提供す ることにある。

本発明によれば、上流側プロモーター配列と下流側ターミネータ−配列の制御下 にある外来性遺伝子を含有する、植物細胞を形質転換するのに使用するためのＤ ＮＡｔＪＩ築体において、上流側プロモーター配列が、トマトのポリガラクツロ ナーゼ遺伝子の上流側にあるＤＮＡ制御配列とｔ目間の（ｈｏｍｏ　ｌ　ｏｇｏ ｕｓ　）、約５キロベース以上のＤＮＡ配列であることを特徴とするＤＮＡ構築 体が提供される。下流側ターミネータ−は、トマトのポリガラクッロナーゼ遺伝 子の下流側にある、約１６キロベースのＤＮＡ制御配列と相同のＤＮＡ配列であ ることが好ましい。本発明のよれば、更に、かかるＤＮＡ構築体を使用して形質 転換した植物細胞及びかかる植物細胞を含有するか又はかかる植物細胞からなる 植物か提供される。

”外来性遺伝子”（”ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｇｅｎｅ”）という用語はＲＮＡ ポリメラーゼのごとき植物細胞酵素の作用の下で機能性ＲＮ＾（ｆｕｎｃｔｉｏ ｎａｌＲＮＡ）に転写されるのに適する一連のＤＮＡを意味する。機能性ＲＮＡ は細胞の生化学に影響するＲＮＡである。これは例えばリポソームにより蛋白質 に翻訳されるｍＲＮＡ　；又はアンチセンスＲＮＡに対して相補的なｍＲＮＡの 蛋白質への翻訳を抑制するアンチセンスＲＮ＾であり得る。

原則的には、全ての種類の外来性遺伝子が本発明で有用である。外トキシンのご とき殺虫性蛋白質（ｉｎｓｅｃｔｔｃｉｄａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする 遺伝子；又は例えば、グリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）又はＡＬＳ経路を 阻害する除草剤に対する除草剤耐性を付与する遺伝子であり得る。

非常に広範囲の機能性外来性遺伝子が文献から知られており、本発明はこれらの 遺伝子及び他の遺伝子に適用し得る。機能性遺伝子の池に、外来性遺伝子は他の 種類の機能性Ｉ？Ｎ＾、例えば、植物細胞によって産生される任意の種類のｗＲ ＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡ　・例えば、ポリガラクツロナーゼのごとき 果実熟成遺伝子（ｆｒｕｉｔｒｉｐｅｎｉｎｇ　ｇｅｎｅ）からの５ＲＮＡと相 補的なアンチセンスＲＮＡをコードし得る。ある種の遺伝子の完全な長さのｗＲ ＮＡ（ｆｕｌｌ−１ｅｒ＋ｇｔｈ　ｗＲＮＡ）の発現又は翻訳を、この遺伝子の 一部と同一の配列を有する切頭ＲＮＡ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＲＮＡ）（”セン スＲＮＡ”）の発現により阻害し得ることも認められた。本発明はかかる“セン スＲＮ＾”を生成させ、それによって、ダウンレギュレート（ｄｏｗｎｒｅｇｕ ｌａｔｅ）するのに使用し得る。

本発明の植物細胞は種々の既知の方法［アグロバクテリウムＴｉプラスミド（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｉ　ｐｌａｓｍｉｄ）、エレクトロポレーション 、マイクロインジェクション等コに従って、本発明のＤＮＡ構築体を使用して形 質転換し得る。ついで、適当な場合には、形質転換された細胞を全植物中で再生 （ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ）させ、この植物中で新しい核物質をゲノム中に安定に 組込み得る。この方法により形質転換されたモノコツト（ＩＩｌｏｎｏｃｏｔ） 及びジコット（ｄｉｃｏｔ）植物を得ることができるが、後者の方がより容易に 再生される。

本発明を導くための研究において、本発明者はポリガラクツロナーゼ（ＰＣ）遺 伝子の上流側の配列か、トマト植物における外来遺伝子の規則的な（ｒｅｇυ１ ａ「）発現を高い水準で可能にすることを認めた。

本発明者は以前にＥＭＢＬ３バクテリオファージ中に確立されたゲノムライブラ リーから単離されたトマトＤＮＡの重複クローンの単離を開示した。本発明者は トマトにおける外来遺伝子の果実特異性及び熟成特異性発現（ｒｒｕｉｔ−ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｒｔｐｅｎｉｎｇ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ）を与える１、４５　ＫＧプロモーターフラグメントの単離についても開 示した（Ｂｔｒｄ等、Ｐｌａｎｔ　Ｍａｔ、Ｂｉｏｌ、　１１，６５１−６８２ 頁、１９８８）　、今般、本発明者は一連の追加的なベクターを構築した。その 一つはトマトの果実における、外来遺伝子の高い水準の発現を与えた。得られた 発現の水準は、内因性ＰＣ遺伝子について得られる発現の水準と同程度である。

このことは従来得られた発現水準に対する主要な改善を表すものである。

本発明を図面を参照して更に説明をする。図１はＤＮＡベクターｐＣＢ１３のダ イアグラムである；図２はＤＮＡベクターＩ）ＣＢ１７のダイアグラムである； 図３はＤＮＡベクターｐｃＢ１９のダイアグラムである。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例１ ６５１−６８２（１９８ｇ＞　）中のＰＧ　Ｃボリガラクッロナーゼ（ｐｏｌｙ ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ）　）プロモーター領域を、ゲノミッククローンｇ ＴＯＭ２３　［スコツトランド、アバディーン所在のザ・ナショナル・コレクシ ョンズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリンバクテリア（ｔｈｅ　Ｎａｔ ｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｆｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍ ａｒｊｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｊａ）に１９８Ｂ年１２月５日付けで寄託されている 、ＮＣＩＭＢ寄託番号１２３７３　）由来の３．５ＫＧの断片を付加させること によって伸長させた。ゲノミッククローンｇＴＯＭ２３中のλＥＭＢＬ３の左腕 （ｌｅｆｔ　ａｒｓ）に隣接した７ＪＫＢのｓａ＋Ｉ／Ｂａ１ＨＩ断片を、クロ ーニングベクターｐｕｃｇの！３ａｌ　Ｉ　／Ｂａ５Ｈ［切断部位中にクローン 化してプラスミドｐＧＴＯＭ２３．７．３を得た。プラスミドｐＧＴＯＭ２３． ７．３由来の３．５ｋｂのＨｉｎｄｕ切断断片を単離し、クローニングベクター ｐＣＢ　１のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位中にクローン化した。上記の３゜５ｋｂの 旧ｎｄｍ挿入断片の正しい配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有するプラスミド は、４．９ｋｂのＳａ　Ｉ　Ｔ　／　ＢａｒＩＨＩ切断断片を含有していた。か がるクローンをｐｃＢ１３と命名した（図１参照）。

Ｂ、　ｐｃＢ１７の構築 トマトＰＧ遺伝子の３°末端由来のｔ、ｅｋｂの領域を、プラスミドｐＣＢ　ｌ 中のツバリンシンターゼポリアデニル化配列［Ｂｉｒｄらの論文、Ｐｌａｎゲノ ミッククローンｇＴＯＭ２３中のλＥＭ１３Ｌ３の右腕に隣接した５　、　１ｌ ｋｂのＳａｌ　Ｉ　／ＢａｍＨＩ切断断片を、クローニングベクターｐｌＪｃ８ のＳａｌ　Ｉ／ＢａｒａＨ１切断部位中にクローン化してプラスミドｐＧＴＯＭ ２３　、５　、８を得た。ｐＧＴＯＭ２３　、５　、　ＩＩ由来の１．６ｋｂの ＢｇＩ切断断片を単離し、クローニングベクターｐＬｌｃ１９のＢａ１ｏＨ１部 位中にクローン化した。上記の１．６ｋｂのＢｇ■挿入断片の正しい配向を有す るプラスミドは、５５０ｂｐのＸｂａ　Ｉ　／ＢｓｔＥＩＩ断片を含有していた 。かかるクローンをＡ３／１と命名した。

２．２ｋｂの旧ｎｄｌｌｌ　／ＰＶＵ　Ｉ切断断片を、クローニングベクターｐ ＣＢＩから断片として単離した。この断片は、１．４５ｋｂのＰＣプロモーター 断片とクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子とを 含有していた。この断片をＢ１ｎ１９　［Ｂｅｖａｎの論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃｔｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２．８７１１−８７２１（１９８４）　： ｌ中にクローン化した。Ｂ１ｎ１９はあらかじめＳａｌ　Ｉて切断し、次いて得 られた付着末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで埋め、次後にＨｉｎｄＩＩＩて消 化しである。上記の２．２ｋｂの１１ｉｎｄＩｎ／Ｐｖｕ　Ｔ切断断片を有する プラスミドは、２．２ｋｂのＨｉｎｄｍ／Ｘｂａ　Ｉ切断断片を含有していた。

これらのクローンのうちの］っをＸｂａ　ＩとＫｐｎｒて消化し、クローンＡ３ ７１由来の１　、６ｋｂのＸｂａ　Ｉ　／Ｋｐｎ工切断断片と連結させた。形質 転換させた後に、正しい挿入断片を有するクローンをｐＣＢＩ７と命名した（図 ２参照）。

クローンｐｃＢ１７の正しい構築は、ＣＡＴ遺伝子とＰＧ　３“断片の間の境界 におけるプラスミドＤ〜Ａのヌクレオチド配列分析によって調べた。Ｂ１ｎ１９ ポリリンカーの予期しない領域か、この連結点に残っていることが認められた。

この領域はプラスミドの正し、い機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ）を妨害しそ うにないものであると判断された。この領域中のＩ）ＣＢ１７の配列は、下記の 配列である。

Ｘｂａ工 ＣＡＴ　Ｂｉｎ　＋９ポリリンカー　ＰＧ３’Ｃ，ｐｃＢ１９の構築 プラスミドｐｃＢ１７中のＰＣプロモーター領域を、ゲノミッククローンｇＴＯ Ｍ２３　（ＮＣＩＭＢ寄託番号１２３７３＞由来の３　、５ｋｂの断片を付加さ せることによって伸長させた。このｐＧＴＯＭ２３．７．８由来の３．５ｋｂの ＨｉｎｄＩＩ［断片を、プラスミドｐｃＢ１７中のＨｉｎｄｕ切断部位切断部口 中ン化させた。

上記の３　、５ｋｂの旧ｎｄＡＹＥ挿入断片の正しい配向を有するプラスミドは ４．９ｋｂのＳａ　ＩＩ　／ＢａＩＩＩＩ切断断片を含有していた。かかるクロ ーンをｐＣＢ１９と命名した（図３参照）。これは本発明の構築体である。

実施例２ 形質転換植物の発生 ベクターｐｃＢ１３、ｐｃＢ１？及びｐｃＢ１９を接頭かん腫病菌（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＩ３Ａ　４４（１４（植物生物 工学者か広く入手し得る微生物）に伝達させ（ｔｒａｎｓｆ’ｅｒｒｅｄ）　、 ）マド植物を形質転換させるのに使用した。トマトの茎節の形質転換は標準的方 法〔例えば、Ｂｊｒｄらの論文、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、１１．６５Ｌ−６６２（１９８ｇ）］に従った。

形質転換植物は、抗生物質カナマイシンを含有する培地上で生育する能力によっ て同定した。植物を再生させ、成熟期まで生長させた。

熟成果実を、ＣＡＴ遺伝子の発現について分析した（Ｂｉｒｃｌらの論文、Ｐｌ ａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１．６５１−６６２（１９８ ８））。

表１に、前記ＰＧブコモーターＣＢｉｒｄらの論文、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１１．６５１−６６２（１９８８）］を用いて形質転換 させた植物と、本発明の新規ベクターを用いて形質転換させた植物とを比較した 結果を示す。

表１ 形質転換植物中のＣＡＴ発現 ベクター　プロモーター　３°末端　ＣＡＴ　（単位７１１ｇ蛋白質）ｐｃＢ　 １　１．４５ｋｂ　ｎｏｓ　Ｏ，１３８ｐｃＢＬ３　５ｋｂ　ｎｏｓ　０ ｐｃ８１７　１．４５ｋｂ　１．８ｋｂ　ＰＧ　Ｏ，８５ｐｃＢ１９　５ｋｂ　 Ｌ、８ｋｂ　ＰＧ　１４５ＢＣＡＴ及びＰＣ■ＲＮＡの測定により、ＣＡＴ蛋白 質発現のレベルはＰＧ発現と同じ程度の大きさであることが示された。

−コ 、　＋＋＋＋　＋　ＰＣＴ／Ｇ１１ｌ　９１１０１９５６フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、 　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，ＤＥ、　 ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ ，ＳＤ、ＳＯ，ＵＳ （７２）発明者　グリアーソン、ドナルドイギリス国、ラフバロ・エルイー１２ ・９エスジエイ、シエプスヘッド、ティラー・コート、６ （７２）発明者　スカツチ、ヴオルフガング、ヴアルターイギリス国、バークシ ャー・アールシイ１１・６テイゼツト、クラウソーン、ヒースレーク・パーク、 グリーンフインチ・クロス、１４

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．上流側プロモーター配列と下流側ターミネーター配列の制御下にある外来性 遺伝子を含有する、植物細胞を形質転換するのに使用するためのＤＮＡ構築体に おいて、上流側プロモーター配列が、トマトのポリガラクツロナーゼ遺伝子の上 流側にあるＤＮＡ制御配列と相同の、約５キロベース以上のＤＮＡ配列であるこ とを特徴とするＤＮＡ構築体。
2. ２．下流側ターミネーター配列は、トマトのポリガラクツロナーゼ遺伝子の下流 側にある、約１．６キロベースのＤＮＡ制御配列と相同である、請求の範囲１に 記載のＤＮＡ構築体。
3. ３．外来性遺伝子は殺虫性蛋白質をコードする、請求の範囲１又は２のいずれか に記載のＤＮＡ構築体。
4. ４．外来性遺伝子はアンチセンスＲＮＡを産生する、請求の範囲１又は２のいず れかに記載のＤＮＡ構築体。
5. ５．外来性遺伝子からＲＮＡを転写するのに適した且つ請求の範囲１〜４のいず れかに記載のＤＮＡ構築体を含有する植物細胞。
6. ６．転写されるＲＮＡは、後に植物細胞により蛋白質に翻訳されるｍＲＮＡであ る、請求の範囲５に記載の植物細胞。
7. ７．転写されるＲＮＡが、植物細胞により産生される蛋白質の産生を抑制する請 求の範囲５に記載の植物細胞。
8. ８．転写されるＲＮＡが、産生が抑制される蛋白質のｍＲＮＡに対してアンチセ ンスである、請求の範囲７に記載の植物細胞。
9. ９．請求の範囲５〜８のいずれかに記載の植物細胞からなる植物；及びその種子 および後代。