DE69312498T2

DE69312498T2 - Verfahren zur markierung einer flüssigkeit

Info

Publication number: DE69312498T2
Application number: DE69312498T
Authority: DE
Inventors: John Edward Lisvane Cardiff Minton; James Howard Lisvane Cardiff Slater
Original assignee: Individual
Current assignee: Cypher Science Ltd
Priority date: 1992-08-26
Filing date: 1993-08-26
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2013-08-27
Also published as: GB9218131D0; SG47622A1; ATE155885T1; CA2143339A1; ES2107193T3; EP0657028B1; AU690076B2; HK1001738A1; EP0657028A1; WO1994004918A1; DE69312498D1; DK0657028T3; US5643728A; GR3025156T3; CA2143339C; AU4970893A

Description

Die Erfindung betrifft das Markieren von Materialien und inssondere ein Verfahren zur Markierung einer Flüssigkeit und zum anschließenden Nachweisen, daß die Flüssigkeit markiert worden ist.
Es besteht ein weitverbreitetes Bedürfnis dafür, in der Lage zu sein, den von einem gegebenen Material genommenen Weg nachzuverfolgen, wenn es sich von einer Stelle zu einer anderen bewegt. Allgemein gesehen, gibt es zwei große Kategorien von Materialbewegung:
(i) Die Bewegung von Materialien als Folge natürlicher Vorgänge, die in der Biosphäre auftreten, beispielsweise das Fließen von Wasser in unterirdischen Strömungen, die Bewegung von Sedimenten usw.
(ii) Die Bewegung von Materialien, die vom Menschen hergestellt worden sind, das heißt, Produkten, die nicht in der natürlichen Umgebung vorkommen oder die natürliche Materialien sind, die als Folge von menschlichen Aktivitäten transportiert werden. Die ersteren umfassen jegliches vom Menschen hergestellte Material, und die letzteren sind Korn und andere Nahrungsmittel, Erze und Erdölprodukte, wie Rohöl.
In sämtlichen derartigen Situationen kann es Gründe dafür geben, warum es erforderlich ist, spezifische Verfahren zur Verfolgung dieser Bewegungen zu entwickeln. Es kann sein, daß unmittelbare Beobachtung nicht möglich ist, beispielsweise wenn man den Weg eines unterirdischen Stromes verfolgen will. Es kann sein, daß es erforderlich ist, die Bewegung von Materialien ohne direkte Kenntnis der Transporteure zu verfolgen, oder - aus rechtlichen Gründen - zu beweisen, daß das Erscheinen eines Materials an einem bestimmten Punkt in der Biosphäre auf dasselbe Material zurückgeführt werden kann, das von einem bekannten Ausgangspunkt stammt.
Beispielsweise ist es unzweckmäßig und unter bestimmten Umständen illegal, daß Erdölmaterialien aus Aufbewahrungsstellen oder aus Transportbehältern entweichen und die natürliche Umgebung verunreinigen. Erdölvorratsbehälter, beispielsweise an Erdölabfüllstationen, sind gewöhnlich unterirdisch gelagert. Wenn einer dieser Behälter ein Leck bekommt, wird der Verlust von Material schließlich dadurch entdeckt, daß man entweder das zugeführte Material und das dem Vorratsbehälter entnommene Material hinsichtlich seiner Menge überprüft oder daß man an einer Stelle neben dem Vorratsbehälter auftretendes Leckmaterial feststellt. Da die Behälter unterirdisch lagern, ist eine Sichtprüfung normalerweise nicht möglich, und es ist ein kostspieliges Verfahren, nacheinander Behälter auszugraben und zu bestimmen, welcher Behälter die Ursache für die Leckage ist. Das normale Verfahren würde darin bestehen, ein Protokoll abzufassen, gemäß dem ein bekanntes Markierungsmittel, beispielsweise ein Farbstoff, den Behältern zugesetzt wird, um durch Verfolgen der Bewegung des Farbstoffes zu ermitteln, welcher Behälter die Ursache für die Leckage ist. Danach können billigere Maßnahmen getroffen werden, um den identifizierten leckenden Behälter zu reparieren. Ein Merkmal dieses Vorgehens besteht darin, die Markierungsstoffe, die jedem Behälter zugesetzt werden, um festzustellen, welcher Behälter leckt, unterschiedlich sein müssen, das heißt, wenn sechs Behälter vorhanden sind, sechs unterschiedliche Farbstoffe verwendet werden müssen, von denen jeder durch eine Eigenschaft, die genau und spezifisch bestimmt werden kann, erkennbar sein muß. Je größer die Zahl an einzelnen Bestandteilen in einem bestimmten System ist, um so größer ist die Zahl an spezifischen Stoffen, die dazu verwendet werden müssen, um die erforderliche Unterscheidung zwischen den Wegen, die von den unterschiedlichen Leckflüssigkeiten aus den unterschiedlichen Behältern eingeschlagen werden, zu treffen.
Ein weiteres Beispiel betrifft die Identifizierung der Quelle einer Verunreinigung im Meer und in Wasserläufen, die durch Auftreten von Erdölmaterialien, insbesondere Öl, hervorgerufen werden. Der Umweltschaden, der durch versehentliches Einleiten von Öl sowie absichtliches Ablassen von Öl durch Schiffe verursacht wird, beispielsweise beim Auswaschen von Tanks, ist bedeutend und es besteht ein wachsender Bedarf daran, daß die Schuldigen ermittelt und für Reinigungsarbeiten verantwortlich gemacht werden. Eine der Schwierigkeiten, die mit der Identifizierung von Ölproben in großen Mengen wässriger Medien, wie beispielsweise Ölschlick im Meer, verbunden ist, besteht darin, daß Markierungsstoffe, die in das Öl eingeführt worden waren, dazu neigen, sich abzutrennen oder sich in der wassrigen Phase zu dispergieren, wodurch die Ansammlung und die Identifizierung des Markierungsstoffes besonders schwierig werden.
Ein weiteres Beispiel, das die Notwendigkeit zum Überwachen der Bewegung einer Flussigkeit von einer Stelle zu einer anderen erläutert, wird durch die Praxis der Zugabe von Zusatzstoffen, wie antistatischen Mitteln, Detergentien usw., zu Brennstoffölen, um die Leistung des Öls zu verbessern, geliefert. Es ist wichtig, daß Personen, die es mit derartigen Materialien zu tun haben, Klarheit darüber besitzen, ob sie behandelt worden sind, jedoch werden viele dieser Zusatzstoffe nur in solchen Mengen zugesetzt, die nicht ermittelt werden können, ohne daß man auf komplizierte und häufig kostspielige analytische Verfahren zurückgreifen muß, und in bestimmten Fällen ist es nicht leicht möglich, zu bestimmen, ob der Zusatzstoff überhaupt zugesetzt worden ist, weil seine Anwesenheit durch Verunreinigungen in dem Brennstofföl wirksam maskiert wird. Beispielsweise enthalten antistatische Mittel häufig Chromionen, deren Bestimmung verhältnismäßig einfach ist. Jedoch sind natürlich vorkommende chromgehalte in Öl häufig weit höher als diejenigen, die durch das antistatische Mittel eingeführt worden sind. Es wurde vorgeschlagen, das Öl zu färben, um die Anwesenheit dieser Zuatzstoffe anzuzueigen, jedoch ist die Menge an Farbstoff, die zugesetzt werden muß, um eine sichtbare Farbänderung in derartigen Materialien hervorzurufen, sowohl für den Erzeuger als auch für den Verbraucher nicht annehmbar, beispielsweise aus Kostengründen, wegen eines moglichen Leistungsverlustes, wegen einer möglichen Schädigung von Maschinen usw., und die Menge kann Schwellenwerte, die durch Standards festgesetzt worden sind, überschreiten.
Ein weiteres Beispiel wird durch die Ausnahme von Brennstoffölen für landwirtschaftliche Maschinen und seegängige Schiffe von der Mehrwertsteuer geliefert. Es ist bekannt, daß gewissenlose Personen diese Ausnahme ausnutzen, indem sie derartigen Treibstoff für Zwecke verwenden, für die es keine Ausnahmeregelung gibt, wie beispielsweise für Kraftfahrzeuge, so daß dadurch dem Fiskus Einnahmen entgehen.
Außerdem gibt es viele Gründe, weshalb Einzelpersonen, Gesellschaften, öffentliche Körperschaften und Regierungen den Wunsch haben, Materialien zu markieren, beispielsweise um den Fluß von Materialien in Verteilungs- und Verkaufsnetzen zu verfolgen, um in der Lage zu sein, das Schicksal dieses Materials und bzw. oder die Wirksamkeit eines bestimmten Verteilungsnetzes im Vergleich zu einem anderen zu ermitteln.
Es sind schon viele Nachforschungsverfahren bekannt, um Schwierigkeiten dieser Art zu lösen; sämtliche dieser Verfahren bedienen sich des Zusatzes eines charakteristischen Markierungsstoffes, wie beispielsweise von Farbstoffen oder radioaktiven Verbindungen, zu dem auf zuspürenden Material. Biologische Materalien, wie beispielsweise Bakteriophagen oder Bakterien, wurden ebenfalls verwendet, am bemerkenswertesten zur Verfolgung der Bewegung von Wasserkörpern in der naturlichen Umgebung. In diesen Fällen besitzen die lebenden Systeme eine Eigenschaft (beispielsweise einen bekannten Widerstandsfähigkeitskomplex gegenüber Arzneimitteln oder eine bestimmte Würzspezifizität), die normalerweise in der Natur nicht auftritt. Die zugesetzten Organismen können von dem Punkt ihrer Zugabe aus verfolgt werden, indem man je nach den Erfordernissen Proben nimmt, etwa in diesen Proben vorhandene Organismen isoliert und zeigt, daß die ursprünglich zugesetzten Organismen aus den Proben isoliert werden können.
Die Internationale Patentveröffentlichung WO-87/06383 offenbart ein Verfahren zum Markieren einer Sache oder Substanz, das eine Markierung mit einem Makromolekül, wie beispielsweise einer Nukleinsäure oder einem Polypeptid, umfaßt. Die Methode zieht ihren Vorteil aus der Möglichkeit, die Anwesenheit oder Abwesenheit von Molekülen, wie beispielsweise DNS oder eines Proteins per se durch einfache chemische analytische Verfahren festzustellen, die als "JA/NEIN"-Tests bezeichnet werden und die angeben, ob ein Makromolekül vorhanden ist oder nicht. Beispielsweise kann das Vorhandensein von DNS festgestellt werden, indem man unspezifische chemische Agentien verwendet, die sich an die DNS binden, wie beispielsweise Ethidiumbromid, Akridinorange oder Bis-benzimid (H33258, Höchst Farbstoff 33258). Beispielsweise kann Ethidiumbromid mit sichtbarem Licht der normalen Wellenlängen nicht ermittelt werden. Das Markieren kann daher erreicht werden, indem man DNS und Ethidiumbromid zusammen einsetzt. Die Anwesenheit von DNS (mit daran gebundenem Ethidiumbromid) kann nachfolgend durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht ermittelt werden. Es gibt keine Unterscheidbarkeit zwischen unterschiedlichen DNS-Molekülen aus unterschiedlichen Quellen, beispielsweise aus unterschiedlichen Organismen. Die Auflösung des Systems kann jedoch beträchtlich verbessert werden, indem man die Fähigkeit von Makromolekülen, wie beispielsweise Nukleinsäuren und Proteinen, ausnutzt, eindeutig durch ein zweites komplementäres Makromolekül erkannt zu werden, um einen spezifischen Markierungsstoff herzustellen. Demzufolge ist es möglich, die Authentizität eines Körpers oder einer Substanz zu bestimmen, indem man diesen Körper oder diese Substanz mit einer bestimmten ersten Makromolekularen Verbindung markiert, die in der Lage ist, an eine zweite, komplementäre makromolekulare Verbindung gebunden zu werden, und diese zweite Verbindung als Sonde verwendet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der ersten Verbindung zu bestimmen und auf diese Weise festzustellen, ob ein gegebener Körper oder eine gegebene Substanz der echte (markierte) Gegenstand ist.
Die Spezifizität von DNS gegenüber jeder Art und sogar jedem Stamm innerhalb einer Art zusammen mit der technischen Fähigkeit, spezifische DNS-Moleküle zu hybridisieren, liefert eine etwas verwickeltere Form der Markierung als ein einfacher "JA/NEIN"-Test. Für jeden Stamm eines Organismus sind die DNS- (oder RNS-) Moleküle spezifisch, wenngleich sich unterschiedliche Stämme derselben Art nur mittels geringer Variationen in den Basensequenzen unterscheiden. Es ist möglich, die DNS verschiedener Arten und verschiedener Stämme derselben Art zu erkennen, indem man die DNS mit markierten DNS-Sonden untersucht. Ein Körper oder eine Substanz kann mit einer "Signal-DNS" markiert werden, die eine Sequenz umfaßt, die in der Lage ist, mit einer spezifischen "Sonden-DNS" hybridisiert zu werden. Sowohl die Signal-DNS als auch die Sonden-DNS werden geheimgehalten (bleiben unerkannt). Wenn die Analyse des markierten Körpers oder der markierten Substanz mittels der Sonden-DNS die Signal- DNS aufdeckt, ist der Körper oder die Substanz echt. Falls nicht, ist der Körper oder die Substanz eine Nachahmung.
Diese Markierungstechnik wird hauptsächlich zum Markieren von Gegenständen, wie beispielsweise Luxusgütern wie Uhren, Parfum und Kleidungsstücken, Filmen und Aufnahmen; Banknoten; Kunstgegenständen; Dokumenten wie Pässen, sowie für Maschinen und deren Teile, beispielsweise für Automobile, vorgesehen, wenngleich auch Arzneimittel und andere Chemikalien, wie beispielsweise Düngemittel, Unkrautvertilgungsmittel und Schädlingsbekämpfungsmittel, auf diese Weise markiert werden können.
Das Markieren kann in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise kann die Signalverbindung unmittelbar in den Körper oder die Substanz während der Herstellung eingearbeitet werden, oder sie kann mittels eines Klebstoffes angebracht werden. Die Signalverbindung kann auch in ein Material, wie beispielsweise eine Anstrichfarbe oder Tinte eingebracht werden, die auf einen Körper oder eine Substanz aufgebracht wird.
Aus der Internationalen Patenveröffentlichung WO 90/14441 ist ein Verfahren zur Überwachung der Anwesenheit einer Substanz bekannt, bei dem die Substanz mit einer Nukleinsäuremarkierung versehen, die Substanz gesammelt und die Markierung erfaßt wird, indem man im allgemeinen die Nukleinsäure unter Verwendung der Technik der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist beispielsweise aus den USA- Patent 4,683,202 und 4,683,195 und den Europäischen Patentveröffentlichungen 258017 und 237362 bekannt und gestattet die enzymatische Amplifikation von spezifischen DNS-Sequenzen in vitro unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die die Gesamtheit oder einen Teil des als Markierung verwendeten DNS- Moleküls erkennen. Die Anwendung der PCR-Technik erlaubt es, das DNS-Molekül exponentiell zu amplifizieren; beispielsweise gestatten 25 vollständige Amplifikationszyklen, ein einzelnes DNS-Molekül 3,4 x 10&sup7; mal zu vervielfältigen.
Aus dieser Druckschrift ebenfalls bekannt ist ein Ausstattungs- Set, das dazu bestimmt ist, Substanzen zu markieren und zu überwachen, das ein Markierungsmittel in Form einer Nukleinsäure und ein dem Markierungsmittel gegenüber komplimentäres Polynukleotid umfaßt, das entweder eine Signal-Sonde, eine "Capture"-Sonde oder ein Primer für die PCR-Methode ist. Es wird auf die Ausstattungssets verwiesen, die "Signalmittel", wie beispielsweise Enzyme, Radioisotope und fluoreszierende Markierungen enthalten, jedoch werden keine weiteren Einzelheiten angegeben.
Substanzen, die mit einer Markierung versehen werden können, sollen luftverschmutzende Substanzen, organische Lösungsmittel (solche von chemischen Reinigungsanstalten, chemischen Fabriken, Lufthäfen und Tankstellen), Explosivstoffe (wie Plastikexplosivstoffe und Schießpulver) , Papierwaren (wie Zeitungen, Geld und Dokumente), pharmazeutische Produkte (wie Medikamente), Tinten, Parfums und Anstrichmittel sein.
Die Nukleinsäure kann frei sein, das heißt nackt, von polymeren Substanzen (wie Proteinen) oder lipophilen Zusammensetzungen (wie Liposomen) eingekapselt, an eine Komponente der markierten Substanz gebunden oder an einen festen Träger, der anschließend mit der zu markierenden Substanz vermischt wird, gebunden sein. Geeignete Trägermaterialien sollen Latex, Dextran und magnetische Perlen einschließen, jedoch sind ebenfalls keine weiteren Einzelheiten angegeben.
Unsere Internationale Patentveröffentlichung WO 91/7265 offenbart ein Verfahren zum Verfolgen der Herkunft und der Bewegung von Materialien, sowohl flüssigen als auch festen, das folgende Schritte umfaßt: Zusatz einer Mikrospur eines Zusatzmittels, das DNS-Moleküle enthält zu dem Material; Probenahme des erhaltenen Materials nach seiner Bewegung und Detektierung der Anwesenheit des Mikrospur-Zusatzmittels in der Probe.
Gemäß einem bevorzugten Blickpunkt der Erfindung ist das der Überwachung unterliegende Material ein flüssiger Kohlenwasserstoff, wie beispielsweie Öl, und der Mikrospurenzusatz ist derart ausgestaltet, daß er sich durch Auswaschen mit Wasser, beispielsweise nach einem Ölablassen auf See, nicht leicht von dem Kohlenwasserstoff trennen läßt. In Gemischen aus Wasser und Kohlenwasserstoffen bewegt sich jegliche in dem Kohlenwasserstoff vorhandene DNS leicht in die wässrige Phase. Die Verteilung von DNS unter diesen Bedingungen erfolgt so aufgrund der negativen Ladungen, die mit den Phosphodiestergruppen der DNS verbunden sind, und der Fähigkeit, mit Wassermolekülen Wasserstoffbindungen auszubilden, sowie der Unfähigkeit, dies in einer Kohlenwasserstoff-Umgebung zu tun. Verschiedene Verfahren werden vorgeschlagen, um sicherzustellen, daß die DNS in dem Kohlenwasserstoff verbleibt, anstatt sich in eine wässrige Phase hineinzuverteilen; ein derartiges Verfahren ist beispielsweise das Verknüpfen der DNS mit hydrophoben Perlen, typischerweise von einem Durchmesser von 1 bis 5 µm, die derart ausgestaltet sind, daß sie sich in Kohlenwasserstoffen, nicht aber in der wassrigen Phase lösen.
Unter Ausnutzung der jüngsten Fortschritte der Technik, wie beispielsweise der PCR-Technik, zur Detektion von DNS in außerordentlich niedrigen Konzentrationen werden in dem Mikrospurenzusatz nur geringe Mengen an DNS, typischerweise im Konzentrationsbereich von 1 x 10&supmin;¹¹ bis 1 x 10&supmin;&sup6;g DNS je ml Öl oder anderer Flüssigkeit verwendet. Beispielsweise wurde DNS des Plasmids pBR322 (2 x 10&supmin;&sup9;g), die deshalb gewählt wurde, weil DNS-Primer zur Amplifikation dieses Moleküls im Handel erhältlich sind, arabischem leichten Rohöl (100 µl) zugesetzt und mit diesem vermischt. Um daraufhin die DNS zu extrahieren, wurde dem Öl destilliertes Wasser (100 µl) zugesetzt und das Gemisch gründlich vermischt, um die pBR322-DNS aus dem Öl in die wässrige Phase zu extrahieren. Das Öl/Wasser-Gemisch wurde zentrifugiert (10000 xg während 5 min.) und die wässrige Phase (5 µl) entfernt und in ein Standardreaktinsgefäß für die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) mittels Taq-Polymerase und das entsprechende Reaktonsgemisch (100 ul) eingebracht, das KCl (50 mM), Tris- HCl-Puffer (10 mM; pH8,4); MgCl&sub2; (1,5 mM); Gelatine (100 µg/ml) zwei pBR322-DNS-Primer (0,25 µg); Desoxyribosenukleotidphosphate (200 µg von je DATP, DCTB, DGTP, DTTP) und Taq-Polymerase (2,5 Einheiten) enthielt. Nach automatischem Wiederholen der PCR wurde das Reaktionsgemisch (10 µl) auf Agarosegel (2 % Gewicht/Volumen) geladen und unter Standardbedingungen der Elektrophorese unterzogen. Das vervollständigte Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt, um die amplifizierte DNS sichtbar zu machen. In verschiedenen negativen Kontrollansätzen erschienen keine Banden.
Während DNS zur Verwendung als spezifische Markierungssubstanz besonders geeignet ist, kann es viele Fälle geben, bei denen nicht mehr erforderlich ist als ein einfacher "JA/NEIN"-Versuch des oben bechriebenen Typs, beispielsweise um zu zeigen, daß ein bestimmtes Brennstofföl mit einem bestimmten Zusatzstoff behandelt worden ist usw. In derartigen Fallen ist DNS ein weniger wirksamer Markierungsstoff, da die DNS entweder in untragbar großen Mengen vorhanden sein muß, damit sie durch nicht spezifische Versuche, wie beispielsweise durch Anfärben mit Ethidiumbromid, detektiert werden kann, oder es sind PCR-Techniken erforderlich, um die Menge an DNS auf einen Wert zu vermehren, der detektiert werden kann. Daher besteht ein fortdauernder Bedarf an einem genauen, zuverlassigen und hinsichtlich der kostenwirsamen Verfahren zur Markierung einer Flussigkeit, das in der Lage ist, einen "JA/NEIN"-Test zu liefern, und das nicht von der Anwendung komplizierter, zeitraubender analytischer Verfahren oder der Verwendung eines unannehmbar hohen Ausmaßes an Markierungssubstanz abhängig ist.
Bei vielen der immundiagnostischen Verfahren, die in klinischen Laboratorien durchgeführt werden, wird ein bioreaktives Molekül, typischerweise ein Antikörper, verwendet, das eine spezifische Bindungsaffinität für ein Zielmolekül, beispielsweise das Antigen, in bezug auf das der Antikörper gebildet worden ist, besitzt, um dieses Zielmolekül in einer gegebenen Testprobe zu identifizieren und bzw. oder es zu isolieren.
Das bioreaktive Molekül wird häufig an die Oberfläche einer Mikroperle gekuppelt, um die gesamte Oberfläche, die für das Auffangen des Zielmoleküls zur Verfügung steht, zu erhöhen und die Abtrennung von gebundenen Zielmolekülen aus einer Lösung von freien Molekülen zu erleichtern, da sie leicht immobilisiert werden können, beispielweise auf einem Filter. Derartige Perlen sind typischerweise aus Polymerisat-Material gebildet und besitzen im allgemeinen einen Durchmesser im Bereich von 0,05 bis 100 µm. Die Perlen können mit einer Markierung, beispielsweise einer fluoreszierenden oder einer radioaktiven usw. versehen sein, um Signalmittel zu liefern. Andere Perlen sind magnetisch, um ihre Abtrennung von der Testprobe zu unterstützen; beispielsweise kann ein Magnet verwendet werden, um die Perlen in einen Bereich des Testgefäßes zu ziehen, aus dem sie physikalisch abgetrennt werden können. Magnetische Perlen können hergestellt werden, indem man Partikeln eines magnetischen Materials, wie beispielsweise von Magnetit (Fe&sub3;O&sub4;) in das Polymerisat-Material, das zur Bildung der Partikel verwendet wird, eindispergiert.
Derartige Mikroperlen werden auf verschiedenen Gebieten der Biochemie und Medizin in großem Ausmaß verwendet, beispielsweise zur Isolierung von Zellen und Zielmolekülen aus Vollblut, Gewebeextrakten, Gewebekulturen, Enzymen, Verdauungsprodukten und festen Geweben; beim Tissue-Typing; zur Isolierung von PCR- oder Klenow-DNS-Fragmenten; als Trager für pharmazeutische Präparate; für die Trennung von Krebszellen von gesunden Zellen; für die zur Verfügungstellung eines fertig hergestellten Templats für das Genom-Walking und für die selektive Anreicherung und bzw. oder Isolierung von reinen und lebensfähigen Mikroorganismen oder kleineren Zielverbindungen, wie löslichen Antigenen, wie beispielsweise in der Britischen Patentveröffentlichung 2017125, und den folgenden USA-Patentschriften offenbart: US-Patente Nr. 4035316, 4105589, 4138383, 4186120, 4224198, 4259223, 4267234, 4326008, 4369226, 4410370, 4510244, 4530956, 4550017, 4552812, 4563510, 4622362, 4654267, 4654300, 4663277, 4678814, 4689307, 4783336, 4828984, 4962023, 5028545 und 5081020 sowie den Europäischen Patentveröffentlichungen Nr. 91453, 10986 und 106873.
Mikroperlen, die fluoreszierende Markierungen tragen, werden gewöhnlich dazu verwendet, um Apparaturen zu eichen, zu kalibrieren und zu berichtigen, wie beispielsweise Fluoreszenzmikroskope und Durchflußcytometer, wie beispielsweise in den folgenden USA- Patentschriften offenbart: Nr. 4224359, 4714682, 4767206, 4774189, 4857451, 4868126, 4918004, 5073497, 5073498, 5084394 und 5093234.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, eine alternative Methode für die Markierung von Flüssigkeiten bereitzustellen.
Gemäß einem Blickpunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Markierung einer Flüssigkeit und zum anschließenden Nachweisen, daß die Flüssigkeit markiert worden ist, bereitgestellt, wobei man:
die Flüssigkeit mit einem Zusatzstoff, der aus einer Vielzahl von Teilchen besteht, in einer Menge versetzt, die nicht größer ist als ein Gewichtsteil der Teilchen je 10&sup6; Gewichtsteile/Flüssigkeit, wobei die Teilchen zur Erleichterung ihres Nachweises Signalmittel enthalten und für das unbewaffnete Auge in der Flüssigkeit nicht sichtbar sind,
einen Teil der den Zusatzstoff enthaltenden Flüssigkeit als Probe nimmt und
die Anwesenheit von Teilchen in der Probe nachweist, mit der Maßgabe, daß die Signalmittel nicht ausschließlich aus einer Markierung aus einem Nukleinsäure bestehen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich jeder Hinweis auf die Teilchen, die "in der Flüssigkeit für das unbewaffnete Auge nicht sichtbar sind", auf die Einzelteilchen, die, wenn sie in der Flüssigkeit dispergiert sind, nicht sichtbar sind, ohne daß man optische Hilfsmittel, wie beispielsweise Mikroskope, zu Hilfe nimmt.
Der Ausdruck "flüssig" muß hinreichend breit verstanden werden, damit Viskose und halbfeste Materialien, wie beipielsweise Teere, Bitumenharze, Anstrichfarben, Sirupe usw. mit umfaßt werden. Er muß auch so verstanden werden, daß flüssige Materialien, die anschließend in fester oder halbfester Form aufbewahrt, transportiert oder verwendet werden, wie beispielsweise Tinten, Anstrichfarben usw., mit umfaßt werden.
Die Proben brauchen nicht von dem Hauptkörper der Flussigkeit gezogen zu werden, sondern sie können aus der Umgebung stammen, beispielsweise aus dem Meer im Falle des Ablassens von Öl, und die Proben brauchen auch nicht in Form einer Flüssigkeit vorliegen; wenn beispielsweise ein Abfallmaterial illegal in das Erdreich abgelassen worden ist, so können Erdproben selbst nach Ablauf einer längeren Zeit gewonnen und analyisiert werden.
Der Ausdruck "Kohlenwasserstoff" ist breit aufzufassen, so daß er sich auf jede organische Verbindung bezieht, die als Hauptkomponenten Kohlenstoff und Wasserstoff aufweist; er umfaßt dadurch nicht nur Verbindungen, die allein aus Kohlenstoff und Wasserstoff bestehen, einschließlich sowohl aliphatischer als auch aromatischer und gesättigter sowie ungesättigter Verbindungen, sondern auch Verbindungen, die Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Selen, Vanadium usw. enthalten, wie beispielsweise Alkohole, Äther und dergleichen.
Der Ausdruck "Öl" soll so verstanden werden, daß er alle wasserunlöslichen, flüssigen Öle beschreibt, einschließlich solcher, die von Erdöl, Kohle, Schiefer usw. durch Destillation, Cracken oder chemische Behandlung erhalten worden sind sowie nicht flüchtige (oder fette) Öle, die von Tieren und Pflanzen erhalten worden sind, wie beispielsweise Olivenöl, Palmöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl, Waltran usw.
Die Methode gemäß der Erfindung liefert ein genaues, verläßliches und im Hinblick auf die Kosten effektives Verfahren zur Markierung einer Flüssigkeit, das als einfacher "JA/NEIN"-Test oder gewünschten Falls als genauerer Test zur Verfolgung des Ursprungs und bzw. oder der Bewegung von Flüssigkeiten von einer Stelle zur anderen angewandt werden kann. Das Verfahren kann dazu verwendet werden, praktisch jede beliebige Flüssigkeit zu markieren, wenngleich für die meisten Zwecke sein Anwendungsbereich auf wertvollere Flussigkeiten beschränkt werden wird, wie beispielsweise Rohöl, Brennstofföle, wie Petroleum, Dieselöl, Parafin, Flugzeugtreibstoffe usw. Außer für Kohlenwasserstoffe ist die vorliegende Erfindung nutzlich für die Markierung von Flüssigkeiten, wie Parfums, Tinten, Anstrichfarben, Arzneimitteln und anderen Chemikalien, wie beispielsweise Düngemitteln, Unkrautvernichtungsmitteln, Schädlingsbekämpfungsmitteln und organischen Lösungsmitteln, Abfällen aus Fabriken, Raffinerien und Kraftwerken sowie radioaktivem Abfall usw.
Gemäß einem weiteren Blickpunkt der Erfindung wird eine Flüssigkeit bereitgestellt, die einen Zusatzstoff aus einer Vielzahl von Teilchen enthält, die in einer Menge von nicht über ein Gewichtsteilteilchen je 10 Gewichtsteile Flüssigkeit zugesetzt sind, wobei die Teilchen Signalmittel zur Erleichterung ihres Nachweises enthalten, und gegenüber dem unbewaffneten Auge in der Flüssigkeit nicht sichtbar sind, mit der Maßgabe, daß, wenn das Signalmittel eine Markierung in Form einer Nukleinsäure enthält, entweder die Teilchen außerdem ein zweites, unterschiedliches Signalmittel enthalten oder der Zusatzstoff auch Teilchen umfaßt, die Signalmittel aufweisen, die andere Markierungen als eine Nukleinsäure umfassen.
Die Auswahl von Teilchen zur Verwendung als Zusatzstoffe hängt in erster Linie von der Art der Flüssigkeit ab, die markiert wird. Beispielsweise sind unterschiedliche Überlegungen anzustellen, wenn man Rohöl oder wenn man Parfum markiert, sowohl hinsichtlich der Natur jedes Materials, wie beispielsweise der Viskosität (spezifisches Gewicht), Hydrophobizität, Opazität usw., als auch hinsichtlich der Art, auf die das Material behandelt, gelagert und transportiert wird, sowie hinsichtlich des Zweckes, dem das Material zugeführt wird. Es ist offensichtlich, daß es weit weniger Beschränkungen gibt hinsichtich dessen, was einer Ladung Rohöl zur Raff ination zugesetzt werden kann im Vergleich zu dem, was einem Parfum zugesetzt werden kann, und die Logistik bei der Markierung einer Ladung von 250.000 Tonnen Rohöl ist äußerst unterschiedlich von derjenigen zur Markierung von 250-ml-Flaschen Parfum. Beispielsweise ist es im ersten Fall wichtig, daß die Teilchen über die gesamte Menge gleichmäßig verteilt werden, wenn sie dazu verwendet werden sollen, den Schuldigen zu verfolgen, falls Öl abgelassen wird, während im letzten Falle die Flasche Parfum vor der Probenahme lediglich geschüttelt zu werden braucht, wenn man beispielsweise die Waren eines Straßenhändlers untersucht, der im Verdacht steht, mit gestohlener Ware hausieren zu gehen.
Die Dichte der Teilchen paßt vorteilhafterweise zum spezifischen Gewicht der Flüssigkeit, die markiert wird, um sicherzustellen, daß der Zusatzstoff, wenn er einmal der Flüssigkeit zugesetzt worden ist, durch die gesamte Flüssigkeit hindurch gleichmäßig verteilt bleibt. Jedoch wird bezüglich von Öl, das von Tankern transportiert wird, dem Absetzen in gewissem Ausmaß entgegengewirkt, indem man die Ladung pumpt und ausgießt. Eine gleichmäßige Verteilung ist eine wichtige Überlegung, wenn beispielsweise beabsichtigt ist, vor illegalen Aktivitäten abzuschrecken, wie beispielsweise Schwarzhandel oder das Waschen von Öltanks auf See usw., oder wenn die Flüssigkeit anschließend in kleinere Volumina aufgeteilt werden soll.
Die Teilchen müssen mit der Flüssigkeit vertraglich sein, beispielsweise müssen die Teilchen, wenn Öle oder andere hydrophobe Materialien markiert werden, hydrophoben (lipophilen) Charakter besitzen, um die Möglichkeit ihrer Abtrennung in das Meer bei einem Ablassen von Öl auf ein Minimum herabzudrücken. Die Teilchen lösen sich vorteilhafterweise nicht in der Flüssigkeit, sondern bilden eine sehr feinteilige Dispersion um ihre anschließende Abtrennung aus der Flüssigkeit zu ermöglichen.
Die Teilchen können jede Größe oder Form haben, die für den beabsichtigten Zweck geeignet sind, beispielsweise können sie fest oder hohl, von regelmäßiger oder unregelmßiger Form usw. sein, wenngleich sie für die meisten Zwecke vorzugsweise eine homogene Population von praktisch identischer Größe, Form, Dichte usw. bilden, so daß das Verhalten der Teilchen in der Flüssigkeit vorhergesagt werden kann.
Die Teilchen werden der Flüssigkeit in einer Menge von nicht über 1 Gewichtsteilteilchen je 10&sup6; Gewichtsteile Flüssigkeit zugesetzt, wenngleich es sich von selbst versteht, daß es manchmal erforderlich ist, die Teilchen in größeren Mengen zuzusetzen, beispielsweise im Falle eines Konzentrats, wobei man eine nachfolgende Verdünnung vorweg berücksichtigt. Die Teilchen werden vorzugsweise in einer Menge von nicht über 1 Gewichtsteil je 10&sup8; Gewichtsteile Flüssigkeit, insbesondere in einer Menge von nicht über 1 Gewichtsteilteilchen je 10¹&sup0; Gewichtsteile Flüssigkeit zugesetzt. Die Teilchen werden typischerweise der Flüssigkeit in einer Menge von etwa 1 Gewichtsteilteilchen je 10¹&sup0; Gewichtsteile Flüssigkeit bis etwa 1 Gewichtsteilteilchen je 10¹² Gewichtsteile Flussigkeit zugesetzt.
Die Teilchen können aus jedem geeigneten nicht lebenden oder nicht lebensfähigen, zuvor aus lebensfähiger Materie bestehendem Material hergestellt sein, wie beispielsweise aus: polymeren Materialien (gleichgültig, ob synthetisch oder natürlich vorkommend), keramischen Materialien, Gläsern und dergleichen, mit der allgemeinen Maßgabe, daß die Teilchen inert sind, d. h. mit der zu markierenden Flüssigkeit nicht reagieren. Polymere Materialien sind bevorzugt, und Beispiele für geeignte polymere Materialien sind: Polyethersulfone; Polyimide, wie Polyimidamide und Polyether-imide; Polysulfone; Celluloseester, wie Ethyl-cellulose, Cellulose-acetat, Cellulose-acetat-hydrogenphthalat, Cellulose-acetat-butyrat, Cellulose-acetat-propionat, Cellulose-triacetat usw.; Polyvinylharze, wie Poly(vinylacetat), Poly(vinyl-chlorid), Poly(vinyl-pyridin), Poly(vinyl-Alkohol) usw.; Polyacetale, wie Poly(vinyl-butyral), Poly(vinyl-formal) usw.; Polyester, wie Poly(ethylenterephthalat), Poly(ethylennaphthalat) usw.; fluorierte Polymere, wie Poly(vinylidenfluorid), Poly(tetrafluorethylen), Poly(tetrafluorethylen-hexafluorpropylen) usw; Polyacrylate, wie Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, polymethylmethacrylsäure usw.; Latex und andere Kautschuke oder Gummis; Polycarbonate; Polyolelefine, wie Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol usw.; Polyamide, wie Nylon, sowie Dextran, Stärke und andere Polysaccharide.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die Teilchen Mikroperlen oder Mikrokugeln. Beispielshafte Mikroperlen/Mikrokugeln sind von Dynal (U.K.) Ltd., Wirral, Merseyside, Großbritannien unter den Handelsnamen DYNABEADS und DYNASPHERES im Handel erhältlich. Die Herstellung dieser Perlen ist in beispielsweise den Europäischen Patentveröffentlichungen 91453, 10986 und 106873 sowie den US-Patentschriften 4186120, 4530956, 4563510 und 4654267 offenbart.
Die Teilchen sind vorzugsweise in einer Menge von durchschnittlich nicht mehr als 1000 je ml Flüssigkeit, vorzugsweise in einer Menge von nicht mehr als 100 je ml Flüssigkeit und insbesondere von 1 bis 100 je ml Flüssigkeit vorhanden, wobei eine typische Menge etwa 10 Teilchen je ml beträgt.
Die Teilchen können jede beliebige Größe haben, die für den beabsichtigten Zweck geeignet ist, mit der Maßgabe, daß einzelne Teilchen (in der Flüssigkeit) dem unbewaffneten Auge gegenüber nicht sichtbar sein dürfen. Im allgemeinen sind für die meisten Zwecke Teilchen mit einer mittleren Größe von nicht über etwa 5 um geeignet. Die Teilchen besitzen vorzugsweise eine mittlere Größe von 0,01 bis 5 µm, vorzugsweise von 0,05 bis 1 µm, wobei eine typische Größe etwa 0,25 oder 0,5 µm ist.
Die Teilchen können vorteilhafterweise von einer solchen Größe sein, daß sie in der Flüssigkeit der Braunschen Bewegung unterliegen. Diese Erscheinung kann dazu verwendet werden, die Bildung einer praktisch gleichmäßigen Verteilung von Teilchen über die ganze Flüssigkeit hinweg zu unterstützen.
Die Signalmittel zur Erleichterung des Nachweises der Teilchen in der Flüssigkeit können die verschiedensten Formen besitzen, vorzugsweise sind sie jedoch von der Art, daß sie die Person, die die Flüssigkeit untersucht, in die Lage versetzen, die Anwesenheit oder Abwesenheit der Teilchen verhältnismäßig rasch zu bestimmen, vorzugsweise innerhalb einiger Minuten und mit Sicherheit innerhalb einiger Stunden. Das Nachweisverfahren umfaßt vorzugsweise nicht die Anwendung komplizierter analytischer Verfahren und Techniken, wenngleich einiges experimentelles Arbeiten unvermeidlich ist. Das Testverfahren ist vorzugsweise derart, daß es an Ort und Stelle durchgeführt werden kann, d. h. an Bord eines Marinetankers, an der Lagerstelle eines Vorratstanks usw., ohne daß Proben in ein Labor geschickt werden müssen.
Die folgende Aufzählung dient lediglich als Beispiel und darf nicht als erschöpfend betrachtet werden:
(1) Die Teilchen können magnetisch sein. Eine Probe einer Flüssigkeit, von der man vermutet, daß sie magnetische Teilchen enthält, kann beispielsweise analysiert werden, indem man eine magnetische Sonde verwendet, um die Teilchen aus der Flüssigkeit zu extrahieren. Die isolierten Teilchen können dann weiter analysiert werden. Alternativ kann ein Magnet dazu verwendet werden, die Perlen in einen Bereich des zu untersuchenden Gefäßes zu ziehen, aus dem sie physikalisch abgetrennt werden können. Geeignete magnetische Perlen sind im Handel von Dynal (U.K.) Ltd., Wirral, Merseyside, Großbritannien unter dem Handelsnamen DETACHABEAD erhältlich und aus beispielsweise der US-Patentschrift 4654267 bekannt. Eine Vorrichtung zur Abtrennung von magnetischen Mikrokugeln ist ebenfalls von Dynal Ltd. unter den Handelsbezeichnungen MCP-1, MCP-6 und MCP-E erhältlich.
(2) Die Teilchen können eine bekannte Größen- oder Formverteilung besitzen, um zu gestatten, daß eine bestimmte Charge dadurch identifiziert wird, daß man die Häufigkeit von Teilchen einer bestimmten Größe oder Form im Verhältnis zu den anderen bestimmt. Die Teilchengröße (Volumen) kann nach dem Coulter- Prinzip bestimmt werden, das auf der Veränderung des elektrischen Widerstandes zufolge jedes Teilchens beruht und dazu verwendet werden kann, Teilchen gleicher Größe oder von überlappenden Größenbereichen zu unterscheiden, vorausgesetzt, die Teilchen besitzen unterschiedliche Widerstandseigenschaften. Markierungen, die signifikante Unterschiede im elektrischen Widerstand liefern, beispielsweise Metallteilchen, wie Gold, können dazu verwendet werden, ein derartiges Signal zu liefern. Somit können Bestimmungen auf der Grundlage von Teilchen unter Verwendung eines Coulter-Zählers durchgeführt werden, ohne daß man die Teilchen vor der Untersuchung trennen muß.
(3) Die Teilchen können gefärbt sein, beispielsweise durch Dispergieren geeigneter Pigmente in die Perlen während ihrer Herstellung, wenngleich dies im allgemeinen nur für größere Teilchen praktisch ist. Der Zusatzstoff kann Teilchen einer einzigen Farbe oder einer Reihe von Farben umfassen, wobei die Verteilung der unterschiedlich gefärbten Teilchen so gewählt wird, daß eine bestimmte Charge identifiziert werden kann, indem man die Häufigkeit der unterschiedlichen gefärbten Perlen in einer gegebenen Probe bestimmt.
Gemäß einem bevorzugten Blickpunkt der Erfindung werden die Teilchen dazu verwendet, um im Bereich der Teilchen das anzureichem, was sonst sehr geringe Mengen einer Signalmarkierung sein würde, d. h. Mengen, die im Falle, daß sie gleichmäßig über die gesamte Flüssigkeit dispergiert wären, eine Konzentration an Markierung ergeben würden, die zu niedrig wäre, als daß sie leicht nachgewiesen werden könnte. Dieser Blickpunkt der Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Punkte (4) bis (6) beschrieben.
(4) Die Teilchen können mit einer fluoreszierenden, lumineszierenden oder phosphoreszierenden Markierung versehen werden. "floureszenz" beschreibt die Emission von Licht einer unterschiedlichen (normalerweise größeren) Wellenlänge durch eine Substanz nach der Exposition gegenüber einer anregenden Strahlung. "Lumineszenz" beschreibt die Emission von Licht unter dem Einfluß verschiedener physikalischer Agentien, beispielsweise chemischer Agentien (Chemielumineszenz) usw. "Phosphoreszenz" beschreibt die Emission von Licht (normalerweise nach einer definierten Zwischenzeit) durch eine Substanz nach deren Exposition gegenüber Wärme, Licht oder elektrischer Ladung. Es versteht sich, daß diese Ausdrücke sich gegenseitig nicht ausschließen und es zwischen derartigen Markierungen einige Überlappungen gibt.
Die bevorzugten Signalmittel zur Verwendung bei dem Verfahren gemäß der Erfindung sind fluoreszierende Substanzen, insbesondere fluoreszierende Farbstoffe, beispielsweie derart, wie sie normalerweise bei der fluorometrischen Durchflußcytometrie verwendet werden. Geeignete fluoreszierende Farbstoffe sind beispielsweise:
Allophycocyanin, Phycocyanin, Phycoerythrin, Rhodamin, Oxazin, Cumarin, Fluoroescein-derivat, wie z. B. Fluorescein-isothiocyanat und Carboxyfluoroscein-diacetat, sowie Texasrot, Acridingelb/-orange, Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Bis-benzamid (im Handel von Hoechst unter der Bezeichnung H33258 erhältlich) usw. Eine Probe einer Flüssigkeit, bei der ein Gehalt an Teilchen, die eine fluoreszierende Markierung tragen, vermutet wird, kann leicht und rasch unter Verwendung von beispielsweise einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Durchflußcytometer analysiert werden. Der Zusatzstoff kann zwei (oder mehr) Arten von Teilchen enthalten, wobei jede Art eine unterschiedlich gefärbte Markierung trägt. Qualitative Unterschiede in den Signalen von den Markierungen, beispielsweise der Fluoreszenzwellenlänge, unterscheiden die entsprechenden Teilchenpopulationen. Die Verteilung der Teilchenarten kann derart gewählt werden, daß es möglich ist, durch Untersuchung der Frequenz jeder Markierung in einer gegebenen Probe eine bestimmte Charge von Flüssigkeit zu identifizieren.
Teilchen, die in der Lage sind, Licht nach einer Bestrahlung durch anregende Strahlung zu emittieren, können unter Verwendung von beispielsweise einem Photomultiplier verstärkt werden. Diese Technik ist besonders dann nützlich, wenn das durch die Teilchen emittierte Licht eine andere Wellenlänge aufweist als die anregende Strahlung, wie dies bei den phosphoreszierenden Markierungen der Fall ist. Als Bestrahlungsquelle kann ein Laser verwendet werden. Alternativ kann polarisiertes Licht verwendet werden.
Herkömmliche Durchflußcytometer verwenden Lichtstreuung, um jedes Teilchen nachzuweisen, und, da das Lichtstreuungssignal proportional der Teilchengröße ist, können Teilchen unterschiedlicher Größe ebenfalls voneinander unterschieden werden, vorausgesetzt, daß die Größenbereiche der entsprechenden Populationen sich nicht überlappen. Im allgemeinen kann die Konzentration an Teilchen in einer unbekannten Probe durch Messen der Fluoreszenzintensität der Teilchen und Ablesen der entsprechenden Konzentration von einer Standardkurve bestimmt werden (wenn die Teilchenkonzentration eine Funktion der Fluoreszenzintensität ist). Die Teilchen jeder Population sind vorzugsweise von gleicher Größe sowie von gleichen Oberflächeneigenschaften, da dies zu weniger Abweichungen in der Fluoreszenz je Teilchen führt. Die oben beschriebenen DYNOBEADS und DYNOSPHERES sind vollständige Kugeln mit einer relativen Standardabweichung (CV) bei der Lichtstreuungsmessung von etwa 1 %. Eine Anzahl derartiger Teilchenarten kann daher vermischt und immer noch leicht als nicht überlappende Populationen in einem Durchflußzellen-Lichtstreuungs-Histogramm identifiziert werden. Auf diese Weise kann das Ablesen von auf Teilchen beruhenden Assays durch Durchflußcytometrie durchgeführt werden, ohne daß man die Teilchen vor der Ablesung trennen muß.
Andere Markierungen, die ein photometrisches Signal liefern, einschließlich kolloide Goldteilchen usw. können ebenfalls verwendet werden.
(5) Ein Enzym kann an die Teilchen angeknüpft werden. Geeignete Enzyme und Assay-Verfahren sind bekannt, jedoch verwendbare Beispiele sind: alkalische Phosphatase oder eine andere Transferase, Katalase, β-Galaktosidase, Meerrettich-Peroxidase und Luciferase. Eine Probe einer Flüssigkeit von der angenommen wird, daß sie Teilchen enthalten, die ein Enzym tragen, kann durch Zugabe dieser Probe oder falls die Flüssigkeit, wie beispielsweise Öl, eine direkte Zugabe der Probe nicht erlaubt, da die meisten Enzymreaktionen auf wässriger Grundlage ablaufen, durch Zugabe der isolierten Teilchen, zu einem Reaktionsgemisch, das das geeignete Substrat und Enzymcofaktoren, die notwendig sind, enthält, sowie durch Messen des Verfolgen der Umsetzung, die durch das Enzym katalysiert wird, beispielsweise durch das Erscheinen eines Reaktionsproduktes oder der Entfernung des Enzymsubstrats, analysiert werden.
Beispielsweise kann unter Bezugnahme auf die oben als Beispiele angegebenen Enzyme Luciferase durch die Emission von Licht nachgewiesen werden, die durch die Zersetzung von ATP zu ADP + P verursacht wird.
β-Galaktosidase kann spektrophotometrisch unter Verwendung von "X-gal" (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galaktosid) nachgewiesen werden, daß ein farbloses chromogenes Substrat ist, das durch β-Galaktosidase unter Freisetzung eines blauen Indolylderivats gespalten wird. Die Verwendung von β-Galaktosidase und X-gal ist in der Bakteriologie wohl bekannt.
Jegliches Enzym, wie beispielsweise Alkoholoxydase, Aldehydoxidase, Aminosäureoxidase, Askorbatoxidase, Galaktoseoxidase, Glykollatoxidase, Glukoseoxidase, Hexoseoxidase, Laktatoxidase, Malatoxidase, NADH-Oxidase, Oxalatoxidase, Pyruvatoxidase, Tryptophanoxidase, Uratoxidase und Xanthinoxidase, das unmittelbar oder mittelbar Sauerstoff verbraucht oder erfordert, kann durch Messen der Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme oder -entwicklung nachgewiesen werden. Beispielsweise katalysiert Glukoseoxidase den Verbrauch von Sauerstoff gemäß der Menge an vorhandener Glukose, wie durch die folgende Gleichung angegeben wird:
C&sub6;H&sub1;&sub2;O&sub6;.H&sub2;O + O&sub2; T C&sub6;H&sub1;&sub2;O&sub7; + H&sub2;o&sub2;
Die resultierende Abnahme an Sauerstoff kann mit einer Sauerstoffelektrode gemessen werden. Redoxfarben, die unmittelbar oder mittelbar durch eine Enzym/Glukose-Reaktion gekuppelt sind, könnten ebenfalls zur Schaffung einer kolorimetrischen Änderung verwendet werden.
Das Enzym kann als Nebenprodukt Wasserstoffperoxid erzeugen, das mit Hilfe einer wasserstoffperoxidempfindlichen Elektorde, beispielsweise einer polarographischen H&sub2;O&sub2;-Anode, ermittelt werden kann. Zum Nachweis von Wasserstoffperoxidmengen, die durch die Enzymreaktion erzeugt worden sind, kann eine kolorimetrische Methode angewandt werden; beispielsweise kann die Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid durch ein System gemessen werden, das ein chromogenes Reagenz oder chromogene Reagenzien umfaßt, das bzw. die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eine Farbänderung erleiden kann, bzw. können.
Ein bekanntes Verfahren für eine derartige Messung erfolgt mittels vierwertigen Titans und sowie von Xylenolorange, die mit Wasserstoffperoxid unter Ausbildung einer stabilen roten Färbung reagieren (Taurenes & Nordschow, American Journal of Clinical Pathology, Band 49, Seite 613, 1968). Die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid wird durch die Intensität der Färbung gemessen. Alternativ kann ein Enzym, wie Katalase, das mit Wasserstoffperoxid gemäß der Gleichung:
2H&sub2;O&sub2; T 2H&sub2;O + O&sub2;
reagiert, durch Messung der Menge an entwickeltem Sauerstoff oder der Entfernung des Wasserstoffperoxids ermittelt werden. Die Umsetzung kann auch durch Messung der Elektronen verfolgt werden, die während der Enzymreaktion entfernt und auf einen gefärbten Farbstoff übergeführt werden; so entfernt Milchsäuredehydrogenase Elektronen von Milchsäure, die dann zur Überführung auf einen gefärbten Farbstoff zur Verfügung stehen. Alternativ können Elektronen während der Enzymreaktion unmittelbar auf einen geeigneten "Biosensor überführt werden, der proportional zur Enzymaktivität ein elektronisches Signal erzeugt. Geeignete Biosensoren sind in der Biochemie wohlbekannt und stellen einen viel einfacheren Weg der Messung der Enzymaktivität als kolorimetrische Methoden dar.
Eine pCO&sub2;-Elektrode kann dazu verwendet werden, um das Kohlendioxid zu messen, das durch die Einwirkung von Decarboxylasen, wie beispielsweise Acetoacetat-decarboxylase, Arginin-decarboxylase, Aspartat-decarboxylase, Glutamat-decarboxylase, Lysindecarboxylase und Pyruvat-decarboxylase, entwickelt worden ist.
(6) Das Signalmittel kann eine radioaktive Markierung umfassen. Ein Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie Teilchen mit einer radioaktiven Markierung enthalten, kann unter Verwendung eines Geiger-Müller-Zählrohres oder eines Scintillationszählers analysiert werden oder dadurch, daß man einen dünnen Film der Flüssigkeit auf ein geeignetes Substrat aufbringt und die Beschichtung mit einem photographischen Film überdeckt, wobei die radioaktive Markierung eine Vernebelung des Filmes in denjenigen Bereichen verursacht, die unmittelbar an die Teilchen angrenzen. Die radioaktive Markierung muß in einer Menge zugesetzt werden, die größer ist als die natürlich vorkommende Radioaktivität der Flüssigkeit. Geeignete radioaktive Markierungen sind in der Biochemie wohlbekannt, beispielsweise ³²P ³&sup5;S und ¹²&sup5;I.
Das Anbringen von radioaktiven Markierungen, Enzymen und dergleichen an Partikeln ist im Zusammenhang mit immundiagnostischen Ausstattungs-Sets usw. bekannt und wird hier nicht beschrieben.
Es kann sein, daß die Teilchen vor einer Untersuchung von der Flüssigkeit abgetrennt werden müssen, was von der Natur der Flüssigkeit und der Art der verwendeten Signalmittel abhängt. Dies trifft insbesondere für enzymatische Markierungen zu, die normalerweise auf wässrigen Systemen beruhen. Die Abtrennung der Teilchen kann mit Hilfe einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren, Filtrieren, die Verwendung eines Magnets zur Abtrennung von magnetischen Teilchen, durch Säulenchromatographie usw. Alternativ können die Teilchen mit einem Molekül beschichtet werden, das eine starke Bindungsaffinität für ein anderes Molekül aufweist. Die Teilchen können entfernt oder konzentriert werden, indem man sie durch eine Säule passieren läßt, die dieses andere Molekül enthält, das an eine feste Trägermatrix gebunden ist, oder die Probe kann über ein Substrat gewaschen werden, beispielsweise ein Mikroskop-Objektträger, in dem das andere Molekül verankert worden ist. Geeignete Paare von Bindungsmolekülen sind beispielsweise: Antigen und spezifische Antikörper; Hormon und Hormonrezeptor; Hapten und Antihapten; Polynukleotid und komplementäres Nukleotid; Polynukleotid und Polynukleotid-Bindungsprotein; Biotin und entweder Avidin oder Streptavidin, insbesondere Streptavidin; Enzym und Enzym-Cofaktor; und Lectin und spezifisches Kohlenhydrat.
Die Verwendung von Streptavidin und Biotin ist besonders bevorzugt, da Streptavidin eine sehr hohe Bindungskonstante (fast irreversibel) aufweist. Teilchen, die einerseits Avidin oder Streptavidin und andererseits Biotin enthalten, können nach einem Verfahren, wie beispielsweise der Säulenchromatographie, konzentriert werden, wodurch es ermöglicht wird, daß verdünntere Dispersionen des Zusatzstoffes verwendet oder einfachere Methoden für den Nachweis der von den Teilchen getragenen Markierung angewandt werden können.
(7) Diese oberflächengebundenen Moleküle können auch aus eigener Kraft als Mittel zur Erleichterung des Nachweises der Teilchen verwendet werden. Beispielsweise kann unter Anwendung von ähnlichen Techniken wie denen, die bei indirekten (oder Sandwich-)Immunoasseys angewandt werden, ein Reagenz, das einen Bestandteil jedes Paares von spezifischen Bindungsmolekülen, der eine Markierung trägt, enthält, beispielsweise ein Enzym, eine fluoreszierende Markierung, eine radioaktive Markierung usw., der Probe, von der vermutet wird, daß sie Teilchen enthält, zugesetzt werden. Jegliche vorhandene Teilchen werden dann isoliert und gewaschen, um nicht gebundenes Reagenz zu entfernen, und die Anwesenheit der Markierung wird, wie oben beschrieben, festgestellt. Alternativ kann eine Sonde, die mit einem Paar spezifischer Bindungsmoleküle überzogen ist, dazu verwendet werden, Teilchen, die mit dem komplementären Molekül überzogen sind, aus der Flüssigkeit zu extrahieren. Nötigenfalls kann die Sonde und können die Perlen unter dem Mikroskop untersucht werden.
(8) Der Zusatzstoff kann zwei (oder mehr) unterschiedliche Arten von Teilchen enthalten, von denen jedes eine Markierung enthält, die sich von der bzw. den anderen unterscheidet, beispielsweise die Kombination einer fluoreszierenden und einer radioaktiven Markierung. Die Anzahl der Teilchen jedes Typs, die in der Probe vorhanden sind, kann durch Vergleich der erzielten Ergebnisse mit im Labor hergestellten Standardkurven abgeschätzt werden. So ist es möglich, durch Messen der Häufigkeit jeder Markierung in einer gegebenen Probe eine bestimmte Charge zu identifizieren.
(9) Die Teilchen können aus einem Material gebildet werden, das eine gegenüber der zu markierenden Flüssigkeit unterschiedliche Wärmeleitfähigkeit aufweist, so daß sie unterschiedliche Wärmemengen im Vergleich zu der umgebenden Flüssigkeit emittieren. Derartige Teilchen können sichtbar gemacht werden, indem man Infrarotbild-Analysetechniken anwendet. Der Zusatzstoff kann zwei (oder mehr) Arten von Teilchen enthalten, die stark unterschiedliche Wärmeleitfähigkeiten besitzen. Qualitative Unterschiede in der Wärme, die durch die Teilchen emittiert wird, unterscheiden die entsprechenden Teilchenpopulationen. Die Verteilung der Teilchenarten kann derart gewählt werden, daß es möglich ist, durch Untersuchen der Häufigkeit jedes Teilchens in einer gegebenen Probe eine bestimmte Charge Flüssgikeit zu identifizieren.
(10) Eine mikroskopische Analyse einer Flüssigkeitsprobe, von der man annimmmt, daß sie Teilchen enthält, kann unter Verwendung sämtlicher bekannter Mikrosopiertechniken durchgeführt werden, wie beispielsweise der Lichtmikroskopie, der Phasenkontrastmikroskopie, der Elektronenmikroskopie usw. Die Phasenkontrastmikroskopie, die aus der Bakteriologie wohlbekannt ist, liefert im allgemeinen eine bessere Sichtbarmachung von nicht markierten Teilchen.
Die oben beschriebenen Signalmittel sind in erster Linie für "JA/NEIN"-Tests vorgesehen, d. h., um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Teilchen in einer Flüssigkeit anzugeben, wenngleich durch Verwendung einer gemischten Population von Teilchen es möglich ist, einen Grad der Spezifität in das Protokoll einzuführen. Um jedoch einen Test zu liefern, der den Ursprung einer bestimmten Probe anzeigt, beispielsweise um die Behörden in die Lage zu versetzen, die für eine Ölverschmutzung verantwortliche Partei zu identifizieren, kann es bevorzugt sein, die Teilchen mit einer spezifischen Markierung zu versehen, typischerweise einem Makromolekül, wie beispielsweise einer Nukleinsäure oder einem Polypeptid, vorzugsweise dem ersteren, um die PCR-Technik ausnutzen zu können.
Die zweite (spezifische) Markierung kann an denselben Teilchen wie die unspezifische Markierung oder an anderen Teilchen vorhanden sein, die dieselbe Größe und bzw. oder Form der anderen Teilchen haben können.
Die Markierung von Substanzen mit Nukleinsäure ist bekannt, beispielsweise aus den Internationalen Patentveröffentlichungen WO87/06383 und WO90/14441 sowie der eigenen Internationalen Patentveröffentlichung WO91/17265 (auf die ausdrücklich hingewiesen wird). Das Markieren von Substanzen mit Polypeptiden und Proteinen ist ebenfalls bekannt, beispielsweise aus den US-Patentschriften 4,359,363 und 4,441,943. Im ersten Fall wird die Nukleotid-Basensequenz dazu verwendet, um ein Mittel zur Kodierung von Information zu lieferen, während im letztgenannten Fall die Sequenz der Aminosäuren die Information kodiert.
Nukleinsäuren können eine unbeschränkte Informationsmenge liefern, und zwar wegen der variablen Sequenz von Basen (Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin (Uracil im Falle von RNS, das das Thymin ersetzt)), die innerhalb des Moleküls vorhanden sind. Für die Häufigkeit einer gegebenen Basensequenz können Wahrscheinlichkeiten errechnet werden, und solange hinreichende Basen verwendet werden, d. h. ein hinreichend großes DNS-Molekül als Markierungsmittel verwendet wird, kann für alle praktischen Zwecke eine spezifische Mikrospur definiert werden. Durch Verwendung von Kombinationen von universellen Sequenzen (als Industriestandards akzeptiert) durch unterschiedliche Mengen an spezifischen Sequenzen ist es möglich, die Art von generischem Produkt, den Ursprung des Produktes (Hersteller spezifischer Sequenzen), und die Charge des Produktes zu identifizieren und sogar eine Identifizierung für eine Handelseinheit bereitzustellen.
Sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Nukleinsäuren sind zur Verwendung als Markierungsmittel geeignet. Sie können einzel- oder doppelsträngig sein. Der Ausdruck "natürlich vorkommend" bezieht sich auf DNS-(oder RNS-)Moleküle, die in der Natur vorkommen. Ein Beispiel für ein natürlich vorkommendes DNS-Molekul ist pBR322, für das eine bekannte Sequenz (durch DNS-Sequenzierungsverfahren) bestimmt worden ist. Der Ausdruck "synthetisch" wird auf DNS (oder RNS) angewandt, die im Laboratorium unter Verwendung von routinemäßigen Syntheseverfahren synthetisiert wird, die wohlbekannt sind.
Synthetische DNS kann aus den fünf natürlich vorkommenden Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil sowie aus nicht natürlich vorkommenden Basen, wie beispielsweise Inosin-Basen, und davon abgeleiteten Nukleotiden, wie beispielsweise 7-Deazo- 2'desoxyguanosin, Alkylphosphonat-oligodesosxynukleotiden, Thiophosphat-oligodesoxynukleiotiden und a-anomeren Oligodesoxynukleotiden, hergestellt werden. Unter bestimmten Umständen können Markierungsmittel, die nicht natürlich vorkommende Basen umfassen, gegenüber denen, die lediglich natürlich vorkommende Basen enthalten, Vorteile aufweisen, beispielsweise hinsichtlich der Stabilität usw., weil es weniger wahrscheinlich ist, daß sie durch die Aktivität von Nuklease, durch chemisch aktive Substanzen oder durch Umweltbedingungen, wie Hitze oder UV-Bestrahlung, abgebaut werden. Die Verwendung von Markierungsmitteln, die nicht natürlich vorkommende Basen enthalten, wird lediglich durch ihre Fähigkeit beschränkt, wirksam durch die ausgewählten Nachweismittel detektiert werden zu können. Für Markierungsmethoden unter Verwendung der bevorzugten PCR-Technik muß das Markierungsmittel in der Lage sein, mit PCR-Primern Duplexe zu bilden und als Matrize für die Polymerasen, die bei dem PCR-Verfahren verwendet werden, zu dienen.
Die bevorzugte Molekularstruktur des aus Nukleinsäure bestehenden Markierungsmittels variiert mit den Mitteln, die zur Detektierung der Nukleinsäure verwendet werden. Typischerweise sind mindestens 20 Nukleotidbasen erforderlich, um eine angemessene Spezifität für jedes Markierungsmittel sicherzustellen, so daß eine zufällige Verunreinigung nicht zu falschen Ergebnissen führt. Je länger die Sequenz ist, umso höher ist der potentielle Informationsgehalt des Markierungsmittels, umso wahrscheinlicher jedoch ist es auch, daß die Zersetzung zu einem Problem wird. Typischerweise werden Fragmente von unter 1 Kilobase bevorzugt.
Wegen der Grenzen der Empfindlichkeit für die Detektion von Nukleinsäure besteht ein offensichtlicher Vorteil in der Anwendung von Methoden zur Amplifikation des gewonnenen Markierungsmittels, wie beispielsweise des PCR-Verfahrens, das aus den USA-Patenten 4,683,202 und 4,683,195 sowie den Europäischen Patentveröffentlichungen 258017 und 237362 bekannt ist. Das PCR-Verfahren kann dazu verwendet werden, Markierungsmittel aus sowohl einzel- als auch doppelsträngiger DNS sowie aus RNS zu amplifizieren, und ermöglicht die Verwendung von extrem niedrigen Mengen an Markierungsmittel, typischerweise in der Größenordnung von 1 x 10&supmin;¹¹ bis 1 x 10&supmin;&sup6; g je ml Flussigkeit.
Die PCR-Amplifikation kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden; beispielsweise sind inverse und asymmetrische PCR wohlbekannte Variationen dieser Technik. Bei einer anderen Abwandlung könne Promotoren für die RNS-Transskription in Primer eingebracht werden, die, wenn sie durch PCR extendiert und repliziert worden sind, anschließend dazu verwendet werden können, um RNS-Kopien der Zielsequenz zu erzeugen. Diese RNS-Kopien können ihrerseits in DNS revers transskribiert werden, die anschließend durch PCR amplifiziert werden kann. Wie bei allen PCR-Verfahren können die Reaktionszyklen so oft wie gewünscht wiederholt werden.
Für die PCR-Amplifikation wird ein doppelsträngiges Markierungsmittel bevorzugt, wenngleich ein einzelsträngiges Markierungsmittel nach dem ersten Zyklus der Amplifikation doppelsträngig wird, weil es weniger leicht dem Abbau, beispielsweise durch Aktivität von Nuklease, unterliegt. Das Markierungsmittel besitzt vorzugsweise eine Mindestlänge von etwa 50 bis 70 Basen. Dies erlaubt die Hybridisierung von zwei Primern, die typischerweise je etwa 20 Basen lang sind und die, wenn sie mit dem Markierungsmittel hybridisiert sind, durch einen internen Bereich mit einer Länge von 10 bis 30 Basen getrennt werden. Dieser interne Bereich ist der veränderbare Bereich, der dafür verantwortlich ist, daß jedes Markierungsmittel sein eigenes einzigartiges, charakteristisches Signal erhält. Wenn dieser Bereich 10 Basen lang ist, können mit den vier Basen, die für DNS/RNS zur Verfügung stehen, etwa 1,048 x 10&sup6; spezifische Markierungsmittel synthetisiert werden. Wenn dieser Bereich 30 Basen lang ist, können etwa 1,15 x 10¹&sup8; spezifische Markierungsmittel synthetisiert werden.
Das Folgende ist ein Überblick über Markierungsmittel:
1. Die als Markierungsmittel eingesetzte DNS kann eine synthetische, doppelsträngige DNS-Sequenz von 70 bis 90 Basenpaaren (BP) aufweisen.
2. Die Bereiche AB und CD sind für alle Markierungsmittel konstant und weisen vorbestimmte Sequenzen auf, die geeignete komplementäre Primer erkennen zur Verwendung:
(i) bei der PCR-Amplifikation und
(ii) beim DNS-Sequenzieren von mittels PCR-amplifizierter DNS.
3. Der Bereich BC ist der variable Bereich der Mikrospuren- DNS, der für das einzigartige, charakteristische Signal verantwortlich ist.
4. Eines oder beide Enden des Markierungsmittels kann mit Biotin markiert sein, um zu gestatten, daß das Markierungsmittel an Teilchen, beispielsweise Mikroperlen, die mit Streptavidin überzogen sind, gekuppelt werden kann.
Die Sequenz eines bevorzugten Markierungsmittels ist wie folgt:
(5') GGC CTA GAA GAA GGT TGA AGC TCC GGG GTA ACG CCA GGG TTT TAC AGT GGT GTT GCC CAA GCC TCC AGC AGC TGT GTA TGC CCA TCT CAT CCA ACC TCT T(3')
Die Basen 1-25 vom 5'-Ende aus (d. h. GGC CTA GAA GAA GGT TGA AGC TCC G) stammen vom Primer G-18, der von Oligo's Etc. Inc. vertrieben wird. Dies ist einer der Primer, die bei der PCR- Amplifikation verwendet werden sollen.
Die Basen 26-43 (d. h. GG GTA ACG CCA GGG TTT T) vom 5'-Ende aus sind der Sequenzierungsprimer S-27 von Oligo's Etc. Inc. Dies ist die Sequenz, die für das Sequenzieren des Zufallsstücks des Oligonukleotids verwendet werden soll.
Die Basen 44-75 (d. h. AC AGT GGT GTT GCC CAA GCC TCC AGC AGC TGT) sind eine leicht modifzierte Sequenz, die nach Zufallsgesichtspunkten von dem STS-Gen ausgewählt worden sind, das in Ballabio et al., Nature 393 220 (1990) beschrieben ist. Dies ist die Zufallssequenz, die eine spezifische Markierung mit kalkulierbaren Wahrscheinlichkeiten dafür ergibt, daß es lediglich diese Sequenz ist. Modifikationen sind möglich, beispielsweise kann die Position 50 G anstelle von C sein; die Position 56 C anstelle von G sein und die Position 75 T anstelle von G sein.
Die Basen 76-100 vom 5'-Ende aus stammen von dem Komplement des Primers G-19, im Handel von Oligo's Etc. Inc. erhältlich. Dies ist der zweite Primer, der es ermöglicht, daß der komplementäre Strang durch PCR amplifiziert wird.
Biotin-CPG wird während der Synthese des Oligonukleotids mit dem 3' Ende verknüpft, und dies ergibt den Verankerungspunkt, an dem das Oligonukleotid an die mit Streptavidin oder Neutralide überzogenen Teilchen gebunden werden kann.
Beim Detektieren von Nukleinsäure durch PCR ist die vorherige Kenntnis der Sequenz des Markierungsmittels erforderlich, um geeignete Primer zu liefern. Diese Kenntnis bietet ein wertvolles Ausmaß an Sicherheit für diejenigen, die es wünschen, denn ohne die Primer, die in jemandes Besitz bleiben können, sind die Markierungsmittel praktisch nicht detektierbar.
Zur Detektierung von Markierungsmitteln kann man übliche Nukleinsäuren-Hybridisierungs-Assays oder die Nukleinsäure- Sequenzierung anwenden. Übliche Nukleinsäure-Hybridisierungs- Assays umfassen Einzelphasen- und Mischphasen-Assays, wie beispielsweise Sandwich-Assays, und erfordern die vorherige Kenntnis der Sequenz, die zu detektieren ist, um die geeigneten komplementären Polynukleotide zum Fangen oder für Signalzwecke zu beschaffen.
Alternativ können die Nukleinsäuren, die aus den Proben gewonnen worden sind, unter Anwendung herkömmlicher Sequenzierungstechniken sequenziert werden. Im Handel erhältliche Ausstattungs-Sets sind für diesen Zweck geeignet. Die grundlegende Sequenzierungstechnik ist von Seminalmethoden abgeleitet, beispielsweise dem Verfahren von Maxam und Gilbert für die DNS-Sequenzierung, beschrieben in "Methods in Enzymology, Band 65, Seiten 497 bis 559)". Das Sequenzieren ist ein schwierigeres Verfahren, jedoch bietet es eine größere Zuverlässigkeit als die Nukleinsäure- Hybridisierungs-Assays. Dies ist der Möglichkeit zuzuschreiben, daß eine Verunreinigung durch von außen zugeführte Nukleinsäure mit hinreichender Komplementärität, daß sie mit den ausgewählten Sonden hybridisiert und falsch positive Ergebnisse liefert, auftritt.
Auf der Grundlage des oben beschriebenen Überblicks über die Markierungsmittel ist die folgende Erörterung auf die besonderen Schwierigkeiten gerichtet, die mit dem Markieren von hydrophoben Flüssigkeiten, wie beispielsweise Öl und anderen Kohlenwasserstoffen, unter Verwendung von Teilchen verbunden sind, die zusätzlich zu den beschriebenen Signalmitteln (entweder auf denselben oder auf unterschiedlichen Teilchen) ein spezifisches DNS-Markierungsmittel aufweisen. Die Teilchen besitzen vorzugsweise eine fluoreszierende Markierung, um ihre Detektion und bzw. oder Isolierung unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskopes oder eine Durchflußcytometers zu ermöglichen.
Wegen der hydrophoben Natur der Flüssigkeit müssen die Teilchen aus einem Material bestehen, das in der Flüssigkeit stabil dispergiert werden kann, ohne daß es sich in die wässrige Phase verteilt, und das inert ist, d. h. mit der Flüssigkeit nicht reagiert. Besonders bevorzugt sind Perlen, die aus Polyacrelaten, wie beispielsweise Poly(akrylsäure) und Poly(methacrylsäure), gebildet sind.
Die Perlen besitzen vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von nicht über 5 um, wobei eine typische Größe zwischen 0,1 und 1 um liegt. Die Dichte der Perlen ist vorzugsweise an das spezifische Gewicht des Öls angepaßt, um ein Absetzen oder eine Ausfällung (Aufrahmen) und eine ungleichmäßige Verteilung der Markierung zu verhindern. An die ausgewählten hydrophoben Perlen kann DNS auf eine Reihe von Weisen gebunden werden. Perlen, wie paramagnetische, mit Carboxylgruppen modifizierte Polystyrol-Perlen (Polysciences, Norhtampton, UK) oder paramagnetische, mit Tosylgruppen aktivierte Polystyrol-Perlen (Dynal, (U.K.) Ltd.), können ebenfalls in diesem Zusammenhang verwendet werden. Die DNS kann covalent durch Bindung der freien Aminogruppe vom 5'- Ende an eine geeignete Zielgruppe, wie beispielsweise die Carboxylgruppe des mit Carboxylgruppen modifizierten Polystyrols, gebunden werden. Derartige Techniken sind Routinesache. (Lund et al., Nucleic Acid Research, Band 16, Seite 10861, 1980). Nach dem Anknüpfen der DNS können die markierten Perlen in Wasser gewaschen und an Luft getrocknet werden. Die überschussigen Carboxylgruppen auf den Perlen, die nicht an ein Markierungsmolekül gebunden worden sind, können mit Oktylamin, das in eiriem wässrigen Lösungsmittel wie Dimethylformamid, gelöst ist, unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Vernetzungsmittel überkappt werden. Alternativ kann das Markierungsmittel mit Biotin markiert werden, und die Perlen können mit Streptavidin überzogen werden. Überschüssiges Streptavidin auf den Perlen, das nicht an ein Markierungsmolekül gebunden worden ist, kann mit freiem Biotin überkappt werden.
Wenn lediglich einige DNS-Moleküle, die jedoch für eine nachfolgende PCR-Amplifikation, Sequenzanalyse und Dekodierung ausreichen, zugesetzt und an die Perlen gebunden werden, ist der Anteil an hydrophiler Oberfläche (zufolge der DNS) im Vergleich zu der gesamten hydrophoben Oberfläche (zufolge der Zusammensetzung der Perle) normalerweise nicht ausreichend, als daß der Komplex aus DNS und Perle in die wässrige Phase hinein verteilt werden könnte. Die Perlen bleiben in dem Kohlenwasserstoff, bis ein Verfahren angewandt wird, um die Perle mit ihrem anhaftenden Markierungsmittel aus dem Kohlenwasserstoff zu entfernen.
Die Perlen mit dem Markierungsmittel können in Lösungsmitteln, wie beispielsweise Chloroform, Äther, Petroläther oder Toluol, gelöst werden, und die Lösung kann ihrerseits in dem zu markkierenden Öl gelöst werden, was eine gleichmäßige Verteilung der Perlen und daher des Markierungsmittels in dem Öl sicherstellt. Die Perlen können zur Bewertung der Markierung abgetrennt werden, indem man Magnete verwendet, um die Perlen in einen Bereich zu ziehen, aus dem sie physikalisch abgetrennt werden können, oder sie können einfach durch Zentrifugieren abgetrennt werden.
Um sicherzustellen, daß die Perlen mit der anhaftenden DNS nicht aus dem Kohlenwasserstoff durch Waschen mit Waser entfernt werden können, können die negativen Ladungen, die mit den Phosphodiester-Strukturen des DNS-Moleküls verbunden sind, durch Methylierung dieser Gruppen entfernt werden. Methylierung eines Bereichs des DNS-Moleküls stellt sicher, daß dieser Teil des Moleküls hydrophob wird, wodurch sichergestellt wird, daß das DNS-Molekül innerhalb der Kohlenwasserstoffphase verbleibt und nicht in die wässrige Phase überführt wird. Dies kann selbst dann erzielt werden, wenn ein Teil des DNS-Moleküls seine negative Ladung beibehält, d. h. im unmethylierten Zustand vorhanden ist. Die Methylierung des DNS-Moleküls kann durch Synthese mit Nukleosiden erzielt werden, die mit Methylphophonaten synthetisiert worden sind.
Jedes Verfahren, das die Loslichmachung der DNS-Moleküle in Kohlenwasserstoffen anstatt in einer wässrigen Phase begünstigt, könnte als Alternative zur Methylierung verwendet werden, beispielsweise das Markieren der Nukleosidbasen der DNS mit Biotin oder einem hydrophoben Hapten, wie beispielsweise Fluoreszein, Dinitrophenol oder Tri-iodthyronin. Alternativ könnten Sulphonukleotide, die Thiophosphate enthalten, in das Markierungsmittel eingefügt und anschließend mit thiolspezifischen Modifizierungsmitteln, wie beispielsweise Iodethanol, derivatisiert werden.
"MPC-1", "MPC-6", "MPC-E", "DYNABEADS", "DYNASPHERES" und "DETACHABEAD" sind sämtlich eingetragene Warenzeichen von DYNAL AS, Oslo, Norwegen.

Claims

1. Verfahren zur Markierung einer Flüssigkeit und anschließenden Nachweisen, daß die Flüssigkeit markiert worden ist, wobei man:

die Flüssigkeit mit einem Zusatzstoff, der aus einer Vielzahl von Teilchen besteht, in einer Menge versetzt, die nicht größer ist als ein Gewichtsteil der Teilchen je 10&sup6; Gewichtsteile Flüssigkeit, wobei die Teilchen zur Erleichterung ihres Nachweises Signalmittel enthalten und für das unbewaffnete Auge in der Flüssigkeit nicht sichtbar sind, wobei der Zusatzstoff zwei oder mehr Arten von Teilchen, von denen jede unterschiedliche Signalmittel besitzt, oder Teilchen mit zwei oder mehr unterschiedlichen Signalmitteln aufweist, wobei ferner eines der Signalmittel Nukleinsäure enthält und das andere Signalmittel eine von einer Nukleinsäure verschiedene Markierung ist; einen Teil der den Zusatzstoff enthaltenden Flüssigkeit als Probe nimmt und die Anwesenheit von Teilchen in der Flüssigkeit nachweist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Teilchen in der Flüssigkeit in einer Menge von nicht über ein Gewichtsteil Teilchen je 10¹&sup0; Gewichtsteile Flüssigkeit vorhanden sind und die Teilchen eine mittlere Größe von nicht über als 1 µm aufweisen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Teilchen in der Flüssigkeit in einer Menge von etwa ein Gewichtsteil Teilchen je 10¹¹ Gewichtsteile Flüssigkeit bis etwa ein Gewichtsteil Teilchen je 10¹² Gewichtsteile Flüssigkeit vorhanden sind und die Teilchen eine mittlere Größe von 0,05 bis 1 µm aufweisen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei etwa 10 Teilchen je ml Flüssigkeit vorhanden sind.

5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Teilchen Mikroperlen oder Mikrokugeln darstellen.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das andere Signalmittel eine radioaktive Markierung ist und die Erfassung bzw. der Nachweis der Teilchen die Verwendung eines Geiger-Müller-Zählrohres oder eines Szintillationszählers oder die Schleierbildung auf einem fotografischen Film umfaßt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, wobei das andere Signalmittel ein Enzym ist und der Nachweis der Teilchen die messende Überwachung der durch das Enzym katalysierten Umsetzung umfaßt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 71 wobei das Enzym Acetoacetat- Decarboxylase, Alkoholdehydrogenase, Aldehyd-oxidase, Alkalinische Phosphatase oder eine andere Lyase, Aminosäure- Oxidase, Arginin-Decarboxylase, Aspartat- Decarboxylase, Ascorbat-Oxidase, Catalase, Galactose-Oxidase, β- Galactosidase, Glucose-Oxidase, Glutamat-Decarboxylase, Glycollat-Oxidase, Hexose-Oxidase, Meerrettich-Peroxidase, Isomerase, Milchsäure-Dehydrogenase, Lactat-Oxidase, Luciferase, Lysin- Decarboxylase, Malat-Oxidase, NADH-Oxidase, Oxalat-Oxidase, Pyreuvat- Decarboxylase, Pyruvat-Oxidase, Tryptohan-Oxidase, Urat-Oxidase oder Xanthin-Oxidase ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, wobei das andere Signalnittel eine fluoreszierende; luminesierende, phoshoreszierende oder andere Markierung ist, die in der Lage ist, ein photometrische Signal zu erzeugen.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die fluoreszierende Markierung Allophycocanin, Phycocyanin, Phycoerythrin, Bis- Benzamid, Cumarin, Fluorescein oder ein Derivat davon, Rhodamm oder ein anderer fluoreszierender Farbstoff, Ethidium Bromid und Propidium-Iodid ist und die Erfassung der Teilchen die Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops oder eines Durchflußzytometers umfaßt.

11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Teilchen magnetisch sind und die Erfassung bzw. der Nachweis der Teilchen eine Abtrennung und bzw. oder eine Anreicherung der Teilchen unter Verwendung eines Magnetes umfaßt.

12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zusatzstcff Teilchen von 2 oder mehreren unterschiedlichen Farben oder von mindestens zwei bestimmten Größen oder Formen umfaßt und das Verhältnis der unterschiedlich gefärbten Teilchen oder der Teilchen von unterschiedlicher Größe oder Form zueinander bekannt ist.

13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuremarkierung DNA ist und die Erfassung bzw. der Nachweis der Nukleinsäuremarkierung die Anwendung der Technik der Polymerase-Applifikation, der Hybridisierung und bzw. oder der Sequenzierung umfaßt.

14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Teilchen aus einem natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymerisat, einem keramischen Material oder Glas gebildet sind.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Teilchen aus Mitosylgruppen aktiviertem oder mit Karboxylgruppen modifiziertem Polystyrol bestehen.

16. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Teilchen mit einer ersten Molekülart beschichtet sind, die eine Bindungsaffinität für eine zweite Molekülart besitzt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die erste Molekülart aus einem Bestandteil der folgenden Paare ausgewählt ist: Antigen und spezifische Antikörper; Hormon- und Hormonrezeptor; Hapten und Antihapten; Polynukleotid und komplimentäres Polynukleotid; Polynukleotid und Polynukleotid- Bindungsprotein; Biotin und entweder Avidin oder Streptavidin; Enzym und Enzym-Kofaktor sowie Lektin und spezifisches Kohlenhydrat, und die zweite Molekülart der jeweils andere Bestandteil des Paares ist.

18. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Flüssigkeit ein Kohlenwasserstoff, eine Anstrichfarbe, eine Tinte, ein Parfüm, ein Arzneimittel, ein Düngemittel, ein Herbizid, ein Pestizid oder ein organisches Lösungsmittel ist.

19. Flüssigkeit, enthaltend einen Zusatzstoff, aus einer Vielzahl von Teilchen, die in einer Menge von nicht über l Gewichtsteil Teilchen je 10 &sup6; Qewichtsteile Flüssigkeit zugesetzt sind, wobei die Teilchen mindestens zwei Signalmittel zur Erleichterung ihres Nachweises enthalten und gegenüber dem unbewaffneten Auge in der Flüssigkeit nicht sichtbar sind, das erste Signalmittel eine Nukleinsäuremarkierung darstellt oder enthält und das zweite Signalmittel von einer Nukleinsäuremarkierung verschieden ist.

20. Flüssigkeit gemäß Anspruch 19, wobei der Zusatzstoff ein solcher ist, wie er in einem der Ansprüche 1-5 und 7-18 definiert ist.

21. Flüssigkeit gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in Form eines Kohlenwasserstoffes, einer Anstrichfarbe, einer Tinte, eines Parfüms, eines Arzneimittels, eines Düngemittels, eines Herbizides, eines Pestizides oder eines organischen Lösungsmittels.