DE10222075A1

DE10222075A1 - Identifizierungsverfahren zum Produktschutz

Info

Publication number: DE10222075A1
Application number: DE2002122075
Authority: DE
Inventors: Christel Adomat; Tilo Weis; Heiner Brinkmann; Ralf Reifferscheidt; Matthias Gabler
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2003-12-11
Also published as: AU2003239846A8; AU2003239846A1; WO2003097858A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Identifizierungsverfahren für ein Produkt, bestehend aus folgenden Schritten: DOLLAR A a) Auswahl mindestens eines Systems, umfassend mindestens die Komponenten A und B, von denen eine Komponente im Produkt bereits enthalten ist, oder diesem zugesetzt wird, DOLLAR A b) Identifizierung der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente mit Hilfe der anderen Komponente, DOLLAR A wobei die Komponente A mindestens ein Enzym und die Komponente B mindestens ein Substrat ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Identifizierungsverfahren für ein Produkt, bestehend aus folgenden Schritten:

a) Auswahl mindestens eines Systems, umfassend mindestens die Komponenten A und B, von denen eine Komponente im Produkt bereits enthalten ist, oder diesem zugesetzt wird,
b) Identifizierung der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente mit Hilfe der anderen Komponente,

Die zunehmende Nachahmung von Markenprodukten und die anschließende Vermarktung dieser Plagiate richtet erheblichen, wirtschaftlichen Schaden an und beeinträchtigt häufig aufgrund geringerer Qualität das Image des betroffenen Markenproduktes. Aus diesem Grund ist eine Markierung des Produktes, die eindeutig zur Identifizierung genutzt werden kann, aber kaum oder nur mit erheblichem Aufwand zu imitieren ist, gewünscht.
Solche Markierungen von Produkten zum Produktschutz sind bisher überwiegend auf die Markierung der Verpackung beschränkt. Dabei wird es nur als ganzes geschützt, wobei das eigentliche Produkt in der Verpackung an sich nicht identifiziert werden kann.
Zur direkten Markierung des Produktes selbst sind bereits biologische Markersysteme beschrieben.
In der WO 90/14441 wird ein Verfahren zum Produktschutz beschrieben, bei dem dem Produkt eine Nukleinsäuresequenz zugesetzt wird, die zur Identifikation gesammelt und detektiert wird. Bevorzugt beinhaltet das Verfahren die Amplifizierung der Nukleinsäuresequenz.
Die DE 199 34 573 beschreibt ein ähnliches Verfahren zur Markierung und Identifizierung von festen, flüssigen und gasförmigen Substanzen, wobei eine Nukleinsäuresequenz dem Produkt zugesetzt wird, die dann durch Hybridisierung mit einer komplementären Nukleinsäuresequenz nachgewiesen wird.
In beiden genannten Fällen ist die Identifizierung der zugesetzten Substanzen mit einem erheblichen, apparativen Aufwand verbunden, der einerseits fehleranfällig und andererseits zeitaufwendig ist, und somit eine schnelle Identifizierung des Produktes nicht erlaubt.
Die internationale Patentanmeldung WO 89/07272 beschreibt ein Verfahren zur Markierung einer Substanz, bei dem geringste Konzentrationen einer Markersubstanz zum Substrat zugesetzt werden, die dann durch die Bildung eines immunologisch gebundenen Paares mit einem komplementären Bindungspartner nachgewiesen werden kann. Beispielsweise wird dort N-Acetyl-L-Lysin-Aflatoxin B durch eine Immunoaffinitätschromatographie aufkonzentriert und nachgewiesen.
Der Zusatz von fluoreszierenden und/oder lumineszierenden Verbindungen allein ist zwar durch entsprechende Beleuchtung einfach nachzuweisen, aber relativ unspezifisch, solange keine gerätetechnisch aufwendige, wellenlängenabhängige Identifizierung erfolgt.
Die Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein alternatives Verfahren zur Identifizierung von Produkten bereitzustellen, das einerseits kaum oder nur schwer nachzuahmen, andererseits aber einfach und kostengünstig nachzuweisen ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Identifizierungsverfahren für ein Produkt, bestehend aus folgenden Schritten:

In Schritt a) des Identifizierungsverfahrens muß ein Nachweissystem ausgewählt werden, das mindestens die Komponenten A und B umfaßt, wobei die Komponente A mindestens ein Enzym und Komponente B mindestens ein Substrat für mindestens ein Enzym der Komponente A ist.
Eine der Komponenten A oder B ist bereits in dem Produkt enthalten oder wird dem Produkt zugesetzt. Ist bereits eine der Komponenten A oder B im Produkt enthalten, kann auch diese Komponente zur Identifizierung herangezogen werden. Dazu muß dann entsprechend die jeweils andere Komponente ausgewählt werden. Dies hat den Vorteil, dass kein weiterer Zusatz von Komponente A oder B zum Produkt stattfinden muß. So können durch eine andere Markierungsmethode entstehende Veränderungen in den Produkteigenschaften oder den Herstellungskosten vermieden werden.
In Schritt b) wird die Anwesenheit der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente mit Hilfe der anderen Komponente des Systems detektiert und so das Produkt identifiziert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Identifizierungsverfahren für ein Produkt, bestehend aus folgenden Schritten:

a) Auswahl mindestens eines Systems, umfassend mindestens die Komponenten A, B und C, von denen mindestens eine Komponente im Produkt bereits enthalten ist, oder diesem zugesetzt wird,
b) Identifizierung der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente mit Hilfe der anderen Komponente(n),

Unter einem die Enzymreaktion beschleunigenden Stoff sind im erfindungsgemäßen Zusammenhang solche Substanzen zu verstehen, die durch ihre Anwesenheit den Ablauf der Enzymreaktion fördern oder sogar erst ermöglichen.
Vorteilhafterweise erfolgt in Abwesenheit des die Enzymreaktion beschleunigenden Stoffes die Umsetzung des Substrats durch das Enzym insbesondere deutlich verlangsamt oder im wesentlichen nicht. Daher können die entsprechenden Komponenten A und B in Abwesenheit von Komponente C durchaus gemeinsam im Produkt eingesetzt werden. Mit Hilfe der Komponente C findet dann in Schritt b) die Identifizierung statt. Ebenso ist es möglich, dass die Komponente C im Produkt enthalten ist oder zugesetzt wird und die Komponenten A und B in Schritt b) zur Identifizierung der Komponente C eingesetzt werden. Die Spezifität des Nachweises wird durch das dreikomponentige System noch erhöht.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann als die Enzymreaktion beschleunigende Stoff insbesondere ein Cofaktor, Mediator und/oder Aktivator eingesetzt werden.
Cofaktoren sind solche Substanzen, die neben dem Enzym (ggf. dem Apoenzym, dem reinen Proteinanteil des Enzyms) und dem Substrat bzw. den Substraten für den Ablauf der enzymatischen Katalyse nötig sind. Sie werden u. a. auch als Coenzyme bezeichnet und unterscheiden sich von den Substraten dadurch, daß sie in einem kurzen Zyklus, meist in einem einzigen Reaktionsschritt, regeneriert werden. Viele Coenzyme treten daher in zwei oder mehr verschiedenen Formen auf und sind als Elektronenüberträger oder Überträger von Molekülgruppen wirksam. Als sogenannte Cosubstrate bringen einige Cofaktoren, wie z. B. das NAD, bestimmte Enzyme nach Umsetzung des Substrats wieder in den Ausgangszustand zurück, so dass der nächste katalytische Zyklus stattfinden kann. Cofaktoren sind häufig reversibel und nicht kovalent an das Enzym gebunden. Jedoch gibt es auch Cofaktoren, wie z. B. das Häm, die kovalent an das Enzym gebunden vorkommen können und dann oft als prosthetische Gruppe bezeichnet werden. Als Cofaktoren können beispielsweise eingesetzt werden: Kationen von Eisen, Kupfer, Zink, Kalzium, Mangan, Cobalt, Kalium oder Natrium, Biotin, Häm, FAD, FMN oder Thiaminpyrophosphat.
Als Mediatoren sind insbesondere solche Substanzen zu verstehen, die die katalytische Umsetzung des Substrats durch das Enzym vermitteln, in dem die Mediatoren selbst dem Enzym als Primärsubstrat dienen. Dabei wandelt das Enzym den Mediator in eine aktivierte Form um. Diese aktivierte Form des Mediators bewirkt anschließend die Umsetzung des Substrats, wobei der Mediator i. a. vollständig regeneriert wird. In der Nettoreaktion wird dabei also das Substrat durch das Enzym umgesetzt, während der Mediator unverändert bleibt.
Eine solche Reaktionskette ist häufig bei Redox-Enzymen zu beobachten. Der Mediator wird durch die Reaktion mit dem Enzym in einen aktivierten Zustand mit hohem Oxidations- bzw. Reduktionspotential versetzt. In der anschließenden Reaktion des Mediators mit dem Substrat wird das Substrat oxidiert bzw. reduziert.
Vorteilhafterweise findet die Reaktion zwischen Enzym und Substrat in Abwesenheit des Mediators nur in geringem Umfang oder insbesondere nicht statt.
Beispielsweise sind für Polyphenoloxidasen die Vermittlung der Enzymreaktion über die verschiedensten Mediatoren bekannt. Dazu zählen u. a. 1- Hydroxybenzotriazol (HBT), Violuonsäure, 2,2'Azino-bis-(3-Ethylbenzthiazolin-6- sulfonsäure (ABTS), 2-Nitroso-1-Naphthol-4-sulfonsäure (HNNS) oder Methylsyringat. Polyphenoloxidasen zeigen vorteilhafterweise bei der Reaktion mit geeignetem Substrat und Mediator Farbänderungen, die oft mit bloßem Auge und daher einfach und kostengünstig beobachtet werden können.
Neben den bereits erwähnten Cofaktoren sind unter Aktivatoren im erfindungsgemäßen Zusammenhang solche Stoffe zu verstehen, die durch ihre Anwesenheit die katalytische Umsetzung beschleunigen. Solche Aktivatoren können beispielsweise Metallionen, beispielsweise des Calciums, des Magnesiums, des Kupfers, des Nickels oder des Eisens, oder auch Komplexbildner sein.
Glutathion (L-γ-Glutamyl-L-Cysteinylglycin, Glutathion-SH) ist ein Tripeptid, das durch reversible Oxidation in das Disulfid übergeht und daher ein Puffersystem für den Redoxzustand darstellt. Beispielsweise werden Peroxide und Radikale unter Katalyse der selenhaltigen Glutathionperoxidase reduziert. Ebenso ist Glutathion ein Cofaktor der Glutathion-S-Transferase.
Ubichinone (Coenzyme Q) sind ebenfalls Cofaktoren, die als Elektronen- und Protonenüberträger dienen können. Man unterscheidet die Ubichinone je nach Zahl der in der Seitenkette verknüpften Isopreneinheiten oder nach Anzahl der C- Atome. Besonders bekannt ist das Coenzym Q10, das 10 Isopreneinheiten trägt.
NAD (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid) ist an vielen enzymatischen Redoxreaktionen beteiligt und dient, insbesondere im Zusammenhang mit Dehydrogenasen, als Wasserstoffüberträger. Die oxidierte Form wird als NAD⁺ bezeichnet, während die reduzierte Form als NADH bekannt ist. NAD⁺ kann beispielsweise als freie Säure, Lithium- oder Natriumsalz eingesetzt werden. NADH wird häufig als Dikalium-, Dinatrium-, Cyclohexylammonium- und Tris(hydroxymethyl)-Methylammonium-Salz eingesetzt.
NADP (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat) trägt an der 2'-Hydroxy-Gruppe des NAD eine zusätzliche Phosphorsäuregruppe. Dieser auch als Coenzym 2 bekannte Cofaktor ist ebenfalls an vielen enzymatischen Redoxreaktionen beteiligt und fungiert oft als Wasserstoffüberträger. Die oxidierte Form NADP⁺ ist als Kalium-, Natrium-, Dinatrium- und Tris-Salz im Handel erhältlich. Die reduzierte Form NADPH wird im Handel häufig als Tetrakalium-, Tetranatrium- und Tris-Salz angeboten.
FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid) spielt u. a. als prosthetische Gruppe zahlreicher Flavoenzyme, insbesondere Dehydrogenasen, Oxidasen oder Reduktasen, eine besondere Rolle als Wasserstoff- und Elektronenüberträger. Die reduzierte Form von FAD wird als FADH₂ bezeichnet. Häufig tritt FAD im Zusammenhang mit Spurenelemente wie Kupfer, Eisen oder Mangan auf.
FMN (Flavinmononukleotid oder Riboflavin-5'-Phosphat) ist beispielsweise in manchen Flavoenzymen anstelle von FAD als prosthetische Gruppe enthalten und fungiert ebenso wie dieses als Cofaktor der Wasserstoffübertragung.
Methylcobalamin ist das vom Vitamin B12 abgeleitete Coenzym der Methionin- Synthase, das die Übertragung von Methylgruppen katalysiert.
Coenzym A (CoA) spielt im Stoffwechsel eine wichtige Aufgabe als Überträger von Acyl-Gruppen, insbesondere von Acetyl-Gruppen. Ein wichtiger Methyl- Gruppendonor ist das S-Adenosylmethionin (S-Adenosin-5'-yl-methioninium, Ademethionin).
Tetrahydrofolsäure (N-[(6S)-5,6,7,8-Tetrahydropteroyl]-L-glutaminsäure) wird auch als Coenzym F bezeichnet und überträgt Ein-Kohlenstoff-Körper (C₁).
Liponsäure ([(R)-5-(1,2-Dithiolan-3-yl)valeriansäure, auch Thioctansäure genannt) ist als Coenzym z. B. des Pyruvat-Dehydrogenasekomplexes bekannt. Weiterhin bilden Liponsäure mit Dihydroliponsäure und entsprechend Liponamid mit Dihydroliponamid (R-6,8-Dimercaptooctansäure) wichtige Redoxpaare, die auch als biologische Antioxidantien wirken können.
Pyridoxal-5'-phosphat spielt bei Transaminierungs- und Decarboxylierungsreaktionen sowie anderen wichtigen Stoffwechselwegen eine wichtige Rolle.
Als weitere Cofaktoren können auch Nukleotidphosphate, wie z. B. Nukleotidtriphosphate, eingesetzt werden. Als Nukleotide sind hierbei insbesondere Adenosin, Cytosin, Uridin und Guanidin zu nennen. Besonders bevorzugt sind Adenosin-5'-triphosphat (ATP) sowie das entsprechende Di- und Monophosphat. Die Nukleotidphosphate agieren häufig als Phosphogruppenüberträger sowie als Energielieferanten für eine Vielzahl enzymatisch katalysierter Reaktionen.
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Cofaktor ausgewählt aus der Gruppe, gebildet aus Glutathion, Ubichinonen, NAD, NADP, Nukleotidphosphaten, FAD und FMN.
Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Cofaktor ausgewählt aus der Gruppe der nicht kovalent gebundenen Cofaktoren. Dies hat u. a. den Vorteil, daß der Cofaktor nicht (zusammen mit dem Enzym) im Produkt zugesetzt sein muß. Ein kovalent gebundener Cofaktor könnte durch entsprechende Bedingungen aus dem Enzym heraus gelöst werden. Insbesondere bei farbigen Cofaktoren, wie z. B. Häm, ist die Anwesenheit des Cofaktors im Produkt nicht immer erwünscht.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym gentechnisch so modifiziert, dass es eine veränderte, enzymatische Aktivität gegenüber dem Wildtyp aufweist.
Unter einem gentechnisch veränderten Enzym, das eine veränderte, enzymatische Aktivität aufweist, ist in diesem Zusammenhang insbesondere ein Enzym zu verstehen, das durch gentechnische Maßnahmen bzw. mit Hilfe gentechnischer Methoden so modifiziert ist, daß seine enzymatische Aktivität im Gegensatz zu dem als Wildtyp zu bezeichnenden Enzym verändert ist.
Als enzymatische Aktivität wird die katalytische Wirkung des Enzyms, d. h. die unter definierten Bedingungen meßbare Zunahme der Geschwindigkeit der Reaktion aufgrund der Anwesenheit des Enzyms als Differenz des Umsatzes der katalysierten und der unkatalysierten Reaktion in einem bestimmten Zeitraum verstanden. Als Meßgröße dient dabei ein Katal (kat), der Substratumsatz in mol pro Sekunde. Eine Veränderung in der Aktivität des Enzyms, beispielweise eine Aktivierung durch einen Aktivator, eine Inhibierung durch einen Inhibitor oder eine Veränderung der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von Cofaktoren oder einer Mutante gegenüber dem Wildtyp kann über diese Meßgröße ermittelt werden.
Als Wildtyp wird in diesem Sinne sowohl das in der Natur vorkommende native Enzym, das beispielsweise von Bakterien im Rahmen ihres Stoffwechsels produziert wird, als auch ein Enzym aufgefaßt, das die gleiche, enzymatische Aktivität und eine im wesentlichen gleiche Aminosäuresequenz wie das im Ursprungsorganismus vorkommende Enzym aufweist. Darunter können z. B. solche Enzyme zu verstehen sein, die zur einfacheren Aufreinigung, z. B. am C- oder N-Terminus modifiziert sind, ohne daß die Aktivität im Vergleich zu dem aus dem Ursprungsorganismus isolierbaren Enzym verändert ist.
Insbesondere nicht als Wildtyp sind solche Enzyme aufzufassen, bei denen eine Mutation, insbesondere eine Punktmutation (Variation einer Aminosäure), zu einer Erhöhung bzw. Verminderung der enzymatischen Aktivität führt.
Unter einer gentechnischen Modifikation oder Veränderung eines Enzyms ist im erfindungsgemäßen Sinn eine induzierte (zufällige oder zielgerichtete) Mutation, d. h. die Veränderung mindestens einer Aminosäure innerhalb der Aminosäuresequenz des Enzyms, zu verstehen. Die Induktion einer zufälligen Mutation kann beispielsweise durch Selektionsdruck oder ein bestimmtes Mutagen erfolgen.
Die gentechnische Modifikation oder Veränderung eines Enzyms findet häufig durch Austausch oder Deletion mindestens eines Nukleotids in der Gensequenz, die für das entsprechende Enzym codiert, statt. Danach wird das Enzym in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert.
Weitere Methoden zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Enzymen sind neben der Einführung von gezielten oder spontanen Mutationen die error-prone- PCR oder das Gene-shuffling.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym gentechnisch so verändert, daß es gegenüber einem Substrat eine veränderte spezifische Aktivität aufweist. Die spezifische Aktivität bezieht sich direkt auf die Bindung bzw. Reaktion eines Substrats mit einem Enzym und wird als Substratumsatz in mol pro Sekunde und Masse des Enzyms berechnet (kat/kg). Als Referenz zur Bestimmung der veränderten, spezifischen Aktivität dient der bereits beschriebene Wildtyp.
Besonders bevorzugt weist das gentechnisch veränderte Enzym eine höhere spezifische Aktivität gegenüber dem Substrat als der Wildtyp auf. Dies hat den Vorteil, daß eine geringere Menge des Enzyms ausreicht, um eine sichere Identifikation zu erreichen. Der Nachweis kann so kostengünstiger und effizienter durchgeführt werden.
Nach einer weiteren, besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Enzym gentechnisch so modifiziert, daß es in Gegenwart eines Inhibitors und/oder eines Aktivators im Vergleich zu einem nicht gentechnisch modifizierten Enzym (Wildtyp) eine veränderte, enzymatische Aktivität aufweist. Eine davon unabhängige Veränderung der spezifischen Aktivität des Enzyms ist dabei ebenfalls möglich.
Die Eigenschaft, daß sich das gentechnisch veränderte Enzym von einem Inhibitor bzw. einem Aktivator in einer im Vergleich zum Wildtyp veränderten Weise regulieren läßt, hat den Vorteil, daß die Authentizität des Enzyms noch einfacher nachgewiesen werden kann. Beispielsweise kann ein im Produkt enthaltenes oder diesem zugesetztes Enzym weniger stark durch einen Inhibitor gehemmt werden. In einem solchen Fall erfolgt trotz Zugabe eines Inhibitors bei der Identifizierung eine Bindung und ggf. Umsetzung des Substrats. Vergleichbare bzw. gefälschte Produkte ohne das Enzym mit dieser spezifischen Veränderungen könnten dann das Substrat nicht binden bzw. umsetzen. Dieser Unterschied trägt insbesondere zu einer effizienteren und eindeutigeren Identifizierung bei. Eine genaue Bestimmung der spezifischen Aktivität ist dann nicht nötig, da die Beobachtung, dass die katalysierte Reaktion trotz Inhibitor stattfindet, für einen kostengünstigen Schnelltest völlig ausreichend ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die im Produkt enthaltene oder ihm zugesetzte Komponente die Komponente A. Vorteile des Zusatzes von einem oder mehreren Enzymen zum Produkt ist, daß sie sowohl schwerer vollständig in ihrer Aminosäuresequenz zu identifizieren als auch schwerer nachzuahmen sind als ein Substrat. Besonders schwer ist es, gentechnisch veränderte Enzyme vollständig nachzuahmen, da die entsprechenden Methoden zur Herstellung eines durch seine Aminosäuresequenz definierten Enzyms in der Regel sehr Zeit- und kostenintensiv sind.
In Waschmitteln und kosmetischen Zusammensetzungen beispielsweise sind häufig Enzyme zugesetzt, die innerhalb des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens als Komponente A eingesetzt werden können. Meist sind dies Enzyme, die für ihre speziellen Aufgaben durch gentechnische Methoden verändert und so optimiert worden sind. Beispielsweise seien hier für Wasch- und Reinigungsmitteln Proteasen, Amylasen, Oxidasen und Lipasen genannt.
Nach einer weiteren Ausführungsform ist die im Produkt enthaltene oder ihm zugesetzte Komponente die Komponente B. Insbesondere kann es bei Kosmetika günstig sein, das Substrat im Produkt einzusetzen, da einerseits die Substrate häufig ein geringeres, sensibilisierendes Potential als das entsprechende Enzym aufweisen (beispielsweise Saccharide) und andererseits bestimmte Enzyme nicht ohne weitere unerwünschte Nebenwirkungen angewendet werden können. So ist es häufig nicht günstig, Proteasen in Kosmetika, beispielsweise in Hautcremes, einzusetzen. Für eine entsprechende Identifizierung des Produkts kann es daher sinnvoller sein, das Substrat zum Produkt zuzusetzen, z. B. ein Peptid, dessen Identifizierung mit Hilfe einer Protease erfolgt.
Nach einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform werden als Komponente A mindestens zwei Enzyme eingesetzt. Dies hat den Vorteil, daß die Identifizierung des Produkts noch sicherer erfolgen kann, indem zwei verschiedene Enzyme zur Identifizierung genutzt werden. Dies hat den Vorteil, daß bei der Identifizierung u. a. mehrere Parameter gleichzeitig überprüft werden können, so daß eine besonders genaue und effiziente Identifizierung des Markenproduktes erfolgen kann.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden als Komponente B mindestens zwei Substrate eingesetzt. Dies hat den Vorteil, daß auch über eine Variation der Substratkombination eine höhere Authentizität gewährleistet werden kann. Beispielsweise können mehrere Substrate von einem Enzym unterschiedlich schnell gebunden und umgesetzt werden, so daß der Vergleich zwischen den Umsetzungsraten einen besonders hohen Grad an Authentizität sicherstellt. Das Verhältnis der Umsetzungsraten zueinander gibt dann ein sehr verläßliches Kriterium zur Überprüfung der Produktidentität. Ebenso können es verschiedene Substrate sein, die von mehreren unterschiedlichen Enzymen umgesetzt werden. Dies kann insbesondere dann von Vorteil sein, wenn es möglich ist, beide Umsetzungen durch die Durchführung eines einzigen Identifizierungsschrittes b) nachzuweisen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Komponente A ausgewählt aus der Gruppe der Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidasen, Reduktasen, Amylasen und Transferasen. Diese Enzyme werden u. a. beispielsweise in Wasch- und Reinigungsmitteln oder in Kosmetika eingesetzt, um die Produkteigenschaften zu verbessern. Daraus ergibt sich ein doppelter Nutzen. Einerseits verbessern die zugesetzten Enzyme die Produkteigenschaften; andererseits dienen sie zur einwandfreien Identifizierung des Produkts. Besonders bevorzugt sind in Waschmitteln- und Reinigungsmitteln dabei die Amylasen sowie die Proteasen. Proteasen weisen häufig unterschiedliche, enzymatische Aktivität in bezug auf verschieden aufgebaute Oligopeptide auf. Eine unterschiedliche Reaktion z. B. kann dann einfach zur Authentizitätsprüfung des Produkts verwendet werden.
Die Umsetzung, Bindung, Inhibierung oder Aktivierung der Reaktion von geeigneten Substraten (z. B. Catechol, Resorcin, 2,3,4-Trihydroxybenzaldehyd, 3,4-Dihydroxybenzoesäure, 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-Alanin oder 2,3,4- Trihydroxy-benzoesäure) durch die Polyphenoloxidase ergibt insbesondere gut sichtbare Farbreaktionen, die z. B. mit Hilfe eines entsprechenden Tüpfeltests und einer Farbskala oder mit einem Spektralphotometer einfach nachgewiesen werden können.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausführungsform ist die Komponente B ausgewählt aus der Gruppe der Peptide, Mehrfachzucker und Fettsäuren. Vorteilhafterweise sind Mehrfachzucker oder Fettsäuren relativ kostengünstig in der Herstellung, so daß ein entsprechendes Identifizierungsverfahren kostengünstig durchgeführt werden kann. Als Mehrfachzucker sind in diesem Zusammenhang insbesondere Oligo- und Polysaccharide aufzufassen. Bestimmte Mehrfachzucker werden beispielsweise von Cellulasen bzw. Amylasen umgesetzt, während Proteasen Peptide und Lipasen Fettsäuren binden und deren Umsetzung katalysieren. Die genannten Substrate werden insbesondere in Kosmetika wegen ihren weiteren, positiven Eigenschaften eingesetzt.
Nach einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Komponente B mindestens ein Peptid, insbesondere ein Oligopeptid. Als Oligopeptide bezeichnet man die Verknüpfung von mehreren Aminosäuren, üblicherweise von zwei bis etwa zehn, beispielsweise von vier Aminosäuren. Insbesondere bei Waschmitteln, die bereits Proteasen enthalten, kann die Identifizierung so einfach durch die Auswahl des oder der entsprechenden Oligopeptide stattfinden, da die Abbaugeschwindigkeit und/oder -wahrscheinlichkeiten zwischen den Oligopeptiden häufig stark von der verwendeten Protease abhängen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens kann als weitere Komponente zusätzlich mindestens ein Inhibitor zusammen mit einer der Komponenten eingesetzt werden. Der Einsatz eines Inhibitors zusammen mit einer der Komponenten A, B oder ggf. C führt vorteilhafterweise dazu, daß der Authentizitätsnachweis noch eindeutiger durchgeführt werden kann.
Wenn beispielsweise die Komponente A im Produkt eingesetzt wird, ist es vorteilhaft, den Inhibitor zusammen mit Komponente B bei der Nachweisreaktion einzusetzen, da sonst die Aktivität des Enzyms, beispielsweise in Wasch- und Reinigungsmitteln, herabgesetzt wird. Die gentechnisch veränderten Enzyme, die als Komponente A eingesetzt werden, können beispielsweise so modifiziert sein, daß sie eine erhöhte Resistenz gegenüber einem sonst spezifischen Inhibitor aufweisen. Beispielsweise zeigt die Protoporphyrinogenoxidase nach einer bestimmten, gentechnischen Veränderung eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Inhibitor Oxifluorofen (2-Chloro-4-trifluoromethylphenyl-3-ethoxy-4-nitrophenylether). Der Vorteil einer solchen Veränderung liegt darin, daß so das gentechnisch veränderte Enzym sehr gut von anderen gleichwirkenden Enzymen unterschieden werden kann.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung findet die Identifizierung der Komponente B in Schritt b) durch deren Umsetzung Bindung, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion mit der Komponente A ggf. in Anwesenheit mindestens einer Komponente C statt. Beispielsweise kann durch die Inhibierung der durch Komponente A katalysierten Reaktion ebenfalls die Identifizierung von Komponente B stattfinden. Weiterhin können durch die Umsetzung von Substraten mit dem Enzym Absorptionsmaxima der Substrate verschoben werden, so daß die Reaktion einfach mit dem bloßen Auge oder einem Spektralphotometer verfolgt werden kann. Auch kann die Bindung der Komponente A an eine immobilisierte Komponente B durch Veränderung des Brechungsindex nachweisbar sein.
Nach einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens wird das Produkt in Schritt b) durch die Identifizierung von mindestens zwei verschiedenen Komponenten B durch deren Umsetzung, Bindung, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion mit mindestens einer Komponente A ggf. in Anwesenheit mindestens einer Komponente C statt. Beispielsweise kann eine Protease gegenüber verschiedenen Oligopeptiden unterschiedliche Aktivitäten aufweisen. Das Verhältnis der pro Zeiteinheit umgesetzten Substrate zueinander erlaubt eine viel genauere und dabei noch kostengünstigere Authentizitätsprüfung als die Analyse nur einer Komponente B. Vorteilhafterweise macht die Bestimmung des Verhältnisses der Aktivitäten die Bestimmung der spezifischen Aktivität des Enzyms (kat/kg) überflüssig, welche sonst i. a. mit der Isolierung des Enzyms (zur Bestimmung seiner Masse) aus dem Produkt verbunden ist. Diese Methode hat weiterhin den Vorteil, daß durch die Bestimmung des Verhältnisses von mindestens zwei Umsetzungsreaktionen die Identifizierung des Markenproduktes durch größere Sicherheit des Testergebnisses verbessert wird.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausführungsform ruft die Umsetzung, Bindung, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion der Komponente B durch die Komponente A ggf. in Anwesenheit mindestens einer Komponente C in Schritt b) eine Farbreaktion, ein Fluoreszenzsignal oder dessen Änderung, einen anderen spektroskopisch meßbaren Effekt, eine elektrochemische Potentialänderung, eine detektierbare Veränderung der Größe einer der Komponenten (z. B. die Spaltung eines Peptids in kleinere Bestandteile) oder einen Geruchseffekt hervor. Vorteil einer Farbreaktion ist es, daß ein positives Ergebnis beispielsweise durch eine deutliche sichtbare Farbänderung bereits mit bloßem Auge erkannt werden kann. Ein Fluoreszenzsignal läßt sich mit Hilfe einer UV-Lampe einfach nachweisen. Als weitere, spektroskopisch meßbare Effekte sind u. a. apparativ aufwendige Verfahren, wie NMR-, IR-, MS- oder GC-MS- Spektroskopie zu fassen. Elektrochemische Potentialänderungen können durch einfache Sensoren problemlos ohne apparativen Aufwand nachgewiesen werden. Elektronische Nasen, die Veränderungen von Gerüchen aufspüren können, sind ebenfalls geeignet, um einen Geruchseffekt, beispielsweise die Freisetzung eines Duftstoffes, zu detektieren.
Nach einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform der Erfindung trägt die Komponente B eine Markergruppe. Diese Markergruppe dient dazu, die Umsetzung der Komponente B durch die Komponente A bzw. deren Bindung besser bzw. einfacher detektierbarer zu machen. Als Marker können beispielsweise Farbstoffe, chromophore Gruppen, Chromogene, Fluoreszenzfarbstoffe oder Isotope (insbesondere Radioisotope) eingesetzt werden. Als Chromogene sind im Rahmen der Erfindung solche Gruppen zu verstehen, die zwar chromophore Gruppen enthalten, aber nicht im sichtbaren Wellenbereich absorbieren. Durch die Enzymreaktion können aus diesen Gruppen durch Einführung von Auxochromen Farbstoffe entstehen. Als Auxochrome geeignet sind beispielsweise Substituenten mit freien Elektronenpaaren, wie z. B. -NR₂, -OR,-COOH oder -SO₃H, geeignet. Die Radioaktivität eignet sich vor allen Dingen dann als Marker, wenn die Komponente A im Produkt eingesetzt wird und in spezifischen Fällen andere Möglichkeiten der Identifizierung nicht ausreichend sind. Als Marker sind im Sinne der Erfindung insbesondere solche Gruppen zu verstehen, deren Anwesenheit durch ihre Eigenschaft bzw. Eigenschaften bzw. die Veränderung dieser Eigenschaften vereinfacht nachgewiesen werden kann. Beispielsweise geeignet ist auch p-Nitroanilid oder 5-Bromo-4-Chloro-3- Indolylphosphat/Nitroblau-Tetrazoleum (BCIP/NBT) als Substrat einer gentechnisch veränderten, alkalischen Phosphatase.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird mindestens eine Eigenschaft der Markergruppe in Schritt b) durch die Umsetzung, Bindung, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion der Komponente A mit der Komponente B ggf. in Anwesenheit von Komponente C verändert. Darunter ist beispielsweise eine Verschiebung des Absorptionsmaximums insbesondere im sichtbaren bzw. ultravioletten Bereich, eine Erhöhung (bzw. Verringerung) oder Verschiebung der Fluoreszenz, eine Erhöhung (bzw. Verringerung) oder Verschiebung des Extinktionskoeffizienten oder eine sonstige, detektierbare Eigenschaft zu verstehen.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Veränderung der Eigenschaft der Markergruppe in einer Farbreaktion, einem Fluoreszenzsignal, einem anderen spektroskopisch meßbaren Effekt, einer elektrochemischen Potentialänderung oder einem Geruchseffekt. Die Identifizierung mittels eines Farbumschlags als Ergebnis einer solchen Eigenschaftsveränderung führt besonders schnell und einfach zu der entsprechenden Identifizierung. Dabei kann die im Produkt enthaltene Komponente mit der/den anderen Komponente(n) vermischt werden, wobei eine Farbreaktion die Identität des Produktes als farbliche Veränderung sichtbar macht. Bei nicht offensichtlichen Farbänderungen läßt sich eine entsprechende Verschiebung des Extinktionskoeffizienten ebenfalls mittels eines Analysegerätes detektieren. Solche Geräte, insbesondere solche für den UV/VIS-Bereich, können ortsunabhängig eingesetzt werden.
Eine weitere Möglichkeit zur Produktmarkierung bietet die enzymatisch gesteuerte Geruchsfreisetzung durch Umsetzung von Markergruppe bzw. Substrat. Elektronische Scanner, die solche Geruchseffekte detektieren können, können hergestellt und auf die zu beobachtende Reaktion hin zu optimieren.
Zusätzlich ergibt sich aus der Individualität der Kombination von Komponente A und B sowie ggf. der Komponente C die Möglichkeit, weitere Informationen über das zu schützende Produkt zu kodieren. So können beispielsweise unterschiedliche Chargen eines Produktes mit unterschiedlichen Komponenten, beispielsweise verschiedenen Enzymen oder Enzymgemischen, ausgerüstet werden. Bei der Prüfung auf Authentizität ist damit nicht nur der Hersteller, sondern auch die Charge direkt am Produkt zu ermitteln.
Als Fluoreszenzfarbstoffe können beispielsweise die folgenden, chromogenen Substanzen an die Substrate gebunden werden: 2,2'-Azino-(3-Ethyl-Benzthiazolin- 6-Sulfonsäure) (ABTS), o-Phenylendiamin (OPD), 3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), Naphthylisocyanat, 1-OPTA (o-Phthalsäureanhydrid), N-4-(2- benzimidazolyl)phenylmaleimid (BIPM), 2-Hydroxy-3-Naphtholsäure, 4-Methyl-7- Hydroxycumann, o-Dianesidin, 5-Aminosalicylsäure (5AS) oder beispielsweise Fluorescein, Monobromobiman (insbesondere für Thiolgruppen) oder Rhodamin 640. Terminale Aminogruppen können beispielsweise mit Fluorescamin, 2- Methoxy-2,4-Diphenyl-3(2H)-Furanon (MPDF) oder Dansylchlorid; Carbonsäuren können beispielsweise mit 4-Bromomethyl-7-Methoxycumann (BrMmC) oder 4- Bromomethyl-7-Acetoxycumarin (BrMaC) umgesetzt und so mit Fluoreszenzsonden markiert werden.

Als detektierbare Marker werden darüber hinaus häufig fluoreszierende Gruppen, z. B. Cy-2, Cy3 (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA) oder Cy-5 (Amersham Life Sciences, s. o.), FITC (Fluoresceinisothiocyanat), CT (5,(6)- Carboxytetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (Tetramethylrhodamin-5,6-isothiocyanat (Molecular Probes Inc., s. o.) oder FLUOS (5,(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)). Alternativ werden chemolumineszierende Gruppen oder radioaktive Markierungen, z. B. ³⁵S, ³²P, ³³P, ¹²⁵J, verwendet. Ist die Komponente A ein enzymatisch aktives Molekül, beispielsweise eine alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Peroxidase, Meerettichperoxidase, β-D-Galaktosidase oder Glukoseoxidase, sind für jedes dieser Enzyme eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrats entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Enzyme	Chromogene
1. Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase	4-Methylumbelliferylphosphat () Bis(4-Methylumbelliferylphosphat), () 3-O-Methylfluorescein, Flavon-3-Disphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase	Tyraminhydrochlorid (), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (), p-Hydroxyphenethylalkohol (), 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-Sulfonsäure) (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (), 3,3'-Dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase	H₂O₂ + Diammoniumbenzidin H₂O₂ + Tetramethylbenzidin
4. β-D-Galaktosidase	o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid
5. Glukoseoxidase	ABTS, Glukose und Thiazolylblau

* Fluoreszenz

Gemäß einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem zu schützenden Produkt um Wasch- und/oder Reinigungsmittel, kosmetische Mittel oder Klebstoffe. Nicht nur Luxusgüter, sondern auch Konsumgüter sind mehr und mehr von Produktpiraterie betroffen. Daher ist es notwendig, einfache und preisgünstige Identifizierungsverfahren einzusetzen, um die Authentizität des entsprechenden Produktes zu beweisen. Vorteilhafterweise befinden sich in Kosmetika bzw. Wasch- und/oder Reinigungsmitteln bereits Enzyme, insbesondere solche, die gentechnisch verändert sind und daher ohne umfangreiche Modifikationen bzw. direkt als Komponenten des Nachweissystems eingesetzt werden können. Daraus ergibt sich eine entsprechend kostengünstige Möglichkeit zum Produktschutz, ohne dem Produkt weitere Inhaltsstoffe zuzusetzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Identifizierung der markierten Substanz nach dem erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahren, das die im Produkt nicht enthaltene(n) Komponente(n) und optional weitere Substanzen enthält, die in Schritt b) zur Identifizierung im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente benötigt werden. Beispielsweise kann es sich dabei um ein oder mehrere Substrate (Komponente B) und ggf. die Komponente C handeln, durch deren Zusatz die im Produkt enthaltenen Komponente A identifiziert wird. Die in diesem Kit weiterhin optional eingesetzten Substanzen können beispielsweise Inhibitoren oder sowie Puffersysteme zur pH-Regulation, Salze oder der Lösungen zum Einstellen der Ionenstärke oder auch Marker sein, die eine Umsetzung der Komponente B mit der Komponente A ggf. in Anwesenheit der Komponente C anzeigen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zur Identifizierung eines Produkts, das die Komponenten A und B sowie ggf. Komponente C beinhaltet. Darüber hinaus können optional weitere Substanzen enthalten sein, die für die Identifizierung der im Produkt einzusetzenden Komponente notwendig sind. Dieses Kit kann dann dazu genutzt werden, ein Produkt mit einer der im Kit enthaltenen Komponenten zu versetzen und dann mit der/den anderen Komponente(n) die Anwesenheit der zugesetzten Komponente im Produkt nachzuweisen.
Das folgende Beispiel soll die Erfindung verdeutlichen, ohne sie darauf zu beschränken.

Beispiel 1

Bestimmung der substratspezifischen Aktivitäten von Proteasen

Von den zu testenden Proteasen (Savinase, Alkalase; EC 3.4.21.62) wird jeweils eine Stammlösung von 1 mg/ml in 50% (w/v) 1,2-Propandiol/destilliertem Wasser angesetzt. Die weitere Verdünnung der Proben erfolgt mit Tris/HCl-Puffer (Sigma). Substratlösungen von zwei verschiedene Substraten (Tetrapeptid A: Alanin- Alanin-Prolin-Phenylalanin-p-Nitroanilid und Tetrapeptid B: Alanin-Alanin-Prolin- Leucin-p-Nitroanilid) werden durch Lösen von 70 mg Tetrapeptid in 1 ml DMSO angesetzt. Der 0,1 M Tris/HCl-Puffer pH 8,6 wird auf 25°C vorgewärmt. Es werden in verschiedene Halbmikroküvetten folgende Lösungen pipettiert und anschließend gemischt:
Nach dem Mischen wird die Absorption des Reaktionsansatzes am Photospektrometer bei 410 nm verfolgt. Die Berechnung der Protease-Aktivität in der Lösung (C = kat/I) erfolgt nach folgender Formel:

mit ΔE/s: Extinktionsänderung pro Sekunde
V_Küv: Volumen der Lösung in der Küvette
F_V: Verdünnungsfaktor der Enzymlösung
ε₄₁₀: molarer, dekadischer Extinktionskoeffizient bei 410 nm = 8480 M^-1.cm^-1
d: Lichtweg durch die Küvette = 1 cm
V_Pip: einpipettiertes Volumen der Enzymlösung
Die spezifische Aktivität (kat/kg) wird auf die Masse des eingesetzten Enzyms bezogen.
Für die verschiedenen Substrate Tetrapeptid A und Tetrapeptid B wurden folgende, spezifische Protease-Aktivitäten der verschiedenen Proteasen nach der angegebenen Methode bestimmt.
Savinase 12,0 T (Novozyme, Granulat):
Tetrapeptid A: 0,12 kat/kg;
Tetrapeptid B: 0,018 kat/kg
Alkalase 2,0 T (Novozyme, Granulat):
Tetrapeptid A: 0,65 kat/kg;
Tetrapeptid B: 0,48 kat/kg

Beispiel 2

Nachweis über einen Farbumschlag

Bei Zugabe von 0,1 Gew.-% eines Mediators (Methylsyringat oder 1- Hydroxybenzotriazol) zu einer 2 Gew.-%igen Lösung von 3,4- Dihydroxybenzoesäure in Wasser mit Polyphenoloxidase (0,3 mkat/kg, Konzentrat, Denilite, Novozyme) konnte eine Farbveränderung der Reaktionslösung von farblos nach rotbraun beobachtet werden.

Claims

1. Identifizierungsverfahren für ein Produkt, bestehend aus folgenden Schritten:

a) Auswahl mindestens eines Systems, umfassend mindestens die Komponenten A und B, von denen eine Komponente im Produkt bereits enthalten ist, oder diesem zugesetzt wird,

b) Identifizierung der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente mit Hilfe der anderen Komponente,

wobei die Komponente A mindestens ein Enzym und die Komponente B mindestens ein Substrat ist.

2. Identifizierungsverfahren für ein Produkt, bestehend aus folgenden Schritten:

a) Auswahl mindestens eines Systems, umfassend mindestens die Komponenten A, B und C, von denen mindestens eine Komponente im Produkt bereits enthalten ist, oder diesem zugesetzt wird,

b) Identifizierung der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente mit Hilfe der anderen Komponente(n),

wobei die Komponente A mindestens ein Enzym, die Komponente B mindestens ein Substrat und die Komponente C mindestens ein die Enzymreaktion beschleunigender Stoff, insbesondere ein Mediator, Cofaktor und/oder Aktivator, ist.

3. Identifizierungsverfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente C mindestens ein Cofaktor ist, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe Glutathion, Nukleotidphosphate, Ubichinone, NAD, NADP, FAD und FMN.

4. Identifizierungsverfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Cofaktor als Komponente C ausgewählt ist aus der Gruppe der nicht kovalent gebundenen Cofaktoren.

5. Identifizierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym gentechnisch so modifiziert ist, daß es eine veränderte, enzymatische Aktivität aufweist.

6. Identifizierungsverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym gentechnisch so modifiziert ist, daß es gegenüber dem Substrat eine veränderte, insbesondere eine höhere, spezifische Aktivität aufweist.

7. Identifizierungsverfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in Gegenwart eines Inhibitors und/oder eines Aktivators im Vergleich zu einem nicht gentechnisch modifizierten Enzym eine veränderte, enzymatische Aktivität aufweist.

8. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die im Produkt enthaltene oder ihm zugesetzte Komponente die Komponente A ist.

9. Identifizierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die im Produkt enthaltene oder ihm zugesetzte Komponente die Komponente B ist.

10. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente A mindestens zwei Enzyme eingesetzt werden.

11. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Komponente B mindestens zwei Substrate eingesetzt werden.

12. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe der Proteasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidasen, Reduktasen, Amylasen und Transferasen, insbesondere der Proteasen und Peroxidasen.

13. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe der Fettsäuren, Mehrfachzucker oder Peptide, insbesondere der Oligopeptide.

14. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als weitere Komponente zusätzlich mindestens ein Inhibitor zusammen mit einer der Komponenten eingesetzt wird.

15. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung in Schritt b) durch die Umsetzung, Bindung, Reaktion, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion der Komponente B mit der Komponente A ggf. in Anwesenheit der Komponente C stattfindet.

16. Identifizierungsverfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung in Schritt b) durch die Umsetzung, Bindung, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion von mindestens zwei verschiedenen Komponenten B mit mindestens einer Komponente A ggf. in Anwesenheit der Komponente C stattfindet.

17. Identifizierungsverfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung, Bindung, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion von Komponente B mit Komponente A ggf. in Anwesenheit der Komponente C eine Farbreaktion, ein Fluoreszenzsignal, einen (anderen) spektroskopisch messbaren Effekt, eine elektrochemische Potentialänderung oder einen Geruchseffekt hervorruft.

18. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente B eine Markergruppe trägt.

19. Identifizierungsverfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Eigenschaft der Markergruppe in Schritt b), insbesondere durch die Umsetzung, Bindung, Reaktion, Inhibierung der Reaktion und/oder Aktivierung der Reaktion von Komponente B mit Komponente A, ggf. in Anwesenheit der Komponente C, verändert wird.

20. Identifizierungsverfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der Eigenschaft der Markergruppe zu einer Farbreaktion, einem Fluoreszenzsignal, einem anderen spektroskopisch messbaren Effekt, einer elektrochemischen Potentialänderung oder einem Geruchseffekt führt.

21. Identifizierungsverfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Produkt um Wasch- und/oder Reinigungsmittel, kosmetische Mittel oder Klebstoffe handelt.

22. Testkit zur Identifizierung eines Produkts nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es die im Produkt nicht enthaltenen oder zugesetzten Komponente(n) und optional weitere Substanzen enthält, die in Schritt b) zur Identifizierung der im Produkt enthaltenen oder zugesetzten Komponente(n) benötigt werden.

23. Testkit zur Identifizierung eines Produkts nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es die Komponenten A, B und ggf. Komponente C sowie optional weitere Substanzen enthält, wobei die Komponente A mindestens ein Enzym, die Komponente B mindestens ein Substrat und die Komponente C mindestens ein die Enzymreaktion beschleunigender Stoff, insbesondere ein Mediator, Cofaktor und/oder Aktivator, ist.