DE10038169A1 - Synthetisches Partikel zur Markierung einer Substanz - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Partikel zur Markierung einer Substanz, bestehend aus einer Mehrzahl von in fester Form vorliegenden Identifizierungsstoffen 10, 12 und mindestens einer die Identifizierungsstoffe 10, 12 umgebenden geschlossenen Umhüllung 16, wobei die Identifizierungsstoffe 10, 12 so ausgewählt sind, daß das synthetische Partikel 18 durch gleichzeitiges Identifizieren der Identifizierungsstoffe 10, 12 in ein und demselben Identifizierungsverfahren aufgrund nichtoptischer Eigenschaften der Identifizierungsstoffe 10, 12 identifizierbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Partikel zur Markie­ rung einer Substanz, eine Verwendung dieses Partikels, ein Verfahren zum Markieren einer Substanz sowie ein Verfahren zum Identifizieren einer markierten Substanz.

Im Stand der Technik sind Polystyrolpartikel bekannt, in die Fluorophore irreversibel eingebettet sind. Solche Polysty­ rolpartikel werden z. B. von der Firma estapor® hergestellt und von der Firma KMF Laborchemie Handels GmbH, Zum Siegblick 37-39, 53757 Sankt Augustin, Bundesrepublik Deutschland ver­ trieben. Die Polystyrolpartikel dienen zur Kalibrierung in der Durchflußzytometrie. Es gibt nur eine kleine Zahl von Fluorophoren, die zur Herstellung solcher Partikel geeignet sind. Die Zahl der mit diesen Partikeln möglichen Kodierungen ist sehr begrenzt.

Aus der WO 94/04918 ist ein Verfahren zur Markierung einer Flüssigkeit bekannt. Dabei werden der Flüssigkeit Partikel mit einem nicht nur aus einer Nukleinsäuremarkierung beste­ henden Signalmittel zugesetzt. Zur Identifizierung kann für jeden der Bestandteile des Signalmittels eine eigene Analyse erforderlich sein. Die Identifizierung ist aufwendig. Bei diesen Partikeln ist das Signalmittel mit der markierten Flüssigkeit in Kontakt. Es kann zu einer Wechselwirkung zwi­ schen der markierten Flüssigkeit und dem Signalmittel kommen. Das kann einen, insbesondere enzymatischen oder hydrolyti­ schen, Abbau des Signalmittels bewirken. Eine Identifizierung der Partikel ist dann nicht mehr möglich. Bei einer Markie­ rung von Öl ist die in den Partikeln als Signalmittel enthal­ tene Nukleinsäure nur durch in den Partikeln enthaltenes Was­ ser vor einer Wechselwirkung mit dem Öl geschützt. Wird den Partikeln das Wasser, z. B. durch Erwärmung, entzogen, macht die Wechselwirkung des Öls mit der Nukleinsäure deren Analyse unmöglich. Bei sich durch die Signalmittel unterscheidenden Partikeln kann es zwischen der markierten Flüssigkeit und den Partikeln zu unterschiedlichen Wechselwirkungen kommen. Ein Teil der Partikel kann dadurch z. B. leichter aggregieren als andere Partikel. In einer Lösung setzen sich aggregierte Par­ tikel ab und entgehen dadurch möglicherweise der Detektion.

Aus der DE 690 28 402 T2 ist ein Verfahren zur Markierung einer Substanz mit einer Nukleinsäure bekannt. Die Nuklein­ säure kann frei oder kovalent an einen festen Träger oder ei­ ne Komponente der Substanz gebunden sein. Die Nukleinsäure ist dabei für die markierte Substanz zugänglich. Das ist mit den bereits erwähnten Nachteilen verbunden. Statt kovalent an einen festen Träger oder eine Komponente der Substanz gebun­ den zu sein, kann die Nukleinsäure von einer polymeren Sub­ stanz oder einer lipophilen Zusammensetzungen eingekapselt sein. Liegt die Nukleinsäure in Lösung vor, ist das durch das Einkapseln entstandene Partikel relativ instabil. Es ist nicht in der Lage, starken in Lösungen vorkommenden Scher­ kräften zu widerstehen. Werden als polymere Substanzen Virus­ hüllproteine verwendet, ist die einkapselbare Nukleinsäure­ menge relativ gering und deren Identifizierung entsprechend aufwendig.

Weiterhin sind als Liposomen bezeichnete, von Phospholipid­ membranen umgebene Partikel bekannt, die eine innere wäßrige Phase aufweisen. Liposomen, deren wässerige Phasen gelöste Nukleinsäuren enthalten, werden in der Molekularbiologie zur Transfektion verwendet. Liposomen haben den Nachteil relativ instabil gegenüber Scherkräften in Lösungen zu sein.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein synthetisches Partikel zur Markierung einer Substanz angege­ ben werden, bei dem eine Wechselwirkung zwischen einem Iden­ tifizierungsstoff und der markierten Substanz bis zur Identi­ fizierung des Identifizierungsstoffs ausgeschlossen ist. Das Partikel soll gegenüber in Lösungen vorkommenden Scherkräften stabil sein. Durch das Partikel soll es möglich sein, eine große Zahl unterschiedlicher, einfach zu identifizierender Kodierungen bereitzustellen. Weiterhin soll eine Verwendung des synthetischen Partikels, ein Verfahren zum Markieren ei­ ner Substanz sowie ein Verfahren zum Identifizieren einer markierten Substanz angegeben werden.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 17, 21 und 22 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung er­ geben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 16, 18-20 und 23 bis 26.

Erfindungsgemäß ist ein synthetisches Partikel zur Markierung einer Substanz vorgesehen, bestehend aus einer Mehrzahl von in fester Form vorliegenden Identifizierungsstoffen und min­ destens einer die Identifizierungsstoffe umgebenden geschlos­ senen Umhüllung, wobei die Identifizierungsstoffe so ausge­ wählt sind, daß das synthetische Partikel durch gleichzeiti­ ges Identifizieren der Identifizierungsstoffe in ein und dem­ selben Identifizierungsverfahren aufgrund nichtoptischer Ei­ genschaften der Identifizierungsstoffe identifizierbar ist. Eine optische Eigenschaft ist z. B. eine bestimmte Fluores­ zenz. Es gibt nur eine begrenzte Zahl von Identifizierungs­ stoffen, die durch ihre optischen Eigenschaften eindeutig identifizierbar sind. Durch Identifizierungsstoffe, die auf­ grund nichtoptischer Eigenschaften identifizierbar sind, können wesentlich mehr Kodierungen bereitgestellt werden. Durch die Kombination einer Mehrzahl solcher Identifizierungsstoffe kann eine noch größere Zahl unterschiedlicher Kodierungen be­ reitgestellt werden.

Die geschlossene Umhüllung verhindert, daß die mit dem syn­ thetischen Partikel markierte Substanz oder ein das syntheti­ sche Partikel umgebender Stoff mit dem Identifizierungsstoff bis zu dessen Identifizierung wechselwirken kann. Der Identi­ fizierungsstoff wird davor geschützt, abgebaut oder so verän­ dert zu werden, daß eine spätere Identifizierung nicht mehr möglich ist. Synthetische Partikel mit unterschiedlichen Identifizierungsstoffen und gleicher Umhüllung verhalten sich gegenüber der markierten Substanz gleich. Die Umhüllung rea­ giert nicht oder nur langsam mit der markierten Substanz. Ei­ ne langsam mit der Substanz reagierende Umhüllung hat den Vorteil, daß die synthetischen Partikel in der Zeit nach der vorgesehenen Identifizierung abgebaut werden können, so daß keine Partikel zurückbleiben. Die Umhüllung wird in der Regel zum Identifizieren der Identifizierungsstoffe geöffnet. Das Öffnen der Umhüllung kann beispielsweise durch Auflösen der Umhüllung mittels eines Lösungsmittels erfolgen. Auch ein physikalisches Öffnen der Umhüllung, z. B. durch Erwärmen oder mittels eines Laserstrahls, ist möglich.

Die Auswahl der Identifizierungsstoffe ermöglicht deren gleichzeitige Identifizierung in ein und demselben Identifi­ zierungsverfahren. Dabei werden die Identifizierungsstoffe gemeinsamen analysiert. Ein vorheriges Trennen der Identifi­ zierungsstoffe, um sie spezifischen Identifizierungsverfahren zuzuführen, ist nicht erforderlich. Dadurch ist gewährlei­ stet, daß die Kodierungen einfach zu identifizieren sind. Zur Identifizierung müssen die Identifizierungsstoffe in bezug auf das gewählte Identifizierungsverfahren ähnliche spezifi­ sche Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise müssen durch ih­ re Molekulargewichte zu identifizierende Identifizierungs­ stoffe so ausgewählt sein, daß ihre Molekulargewichte inner­ halb eines, mit dem gewählten Identifizierungsverfahren auf­ lösbaren Bereichs liegen. Das Verfahren kann eine massenspek­ troskopische Analyse sein, welche die gleichzeitige Bestim­ mung der Molekulargewichte aller Identifizierungsstoffe in einem Spektrum erlaubt.

Die feste Form der Identifizierungsstoffe gewährleistet eine hohe Stabilität der synthetischen Partikel, insbesondere ge­ genüber in Lösungen vorkommenden Scherkräften. Die feste Form kann durch die Identifizierungsstoffe selbst gewährleistet sein. Bestehen die Identifizierungsstoffe aus Nukleinsäuren, kann die feste Form z. B. durch Präzipitation mit Alkohol er­ reicht werden. Die Identifizierungsstoffe können auch an ei­ nem Hilfsstoff immobilisiert sein oder mit dem Hilfsstoff zu­ sammen ein Präzipitat bildet. Bei einem in fester Form vor­ liegenden Identifizierungsstoff kann eine höhere Stoffdichte erreicht werden als bei einem in Lösung vorliegenden Identi­ fizierungsstoff. Eine zur Identifizierung ausreichende Menge an Identifizierungsstoffen kann in einem Verhältnismäßig kleinen synthetischen Partikel untergebracht werden. Die fe­ ste Form ermöglicht die Herstellung der Partikel durch einfa­ ches Beschichten der Identifizierungsstoffe mit einem die Um­ hüllung bildenden Material.

Die Umhüllung kann Proteine, Peptide, Polyole, Polymere, Wachs, Lipide, Metall, Biotin, Streptavidin oder Avidin ent­ halten. Sie kann weiterhin Kopplungsgruppen, insbesondere Amino-, Thiol-, Tosyl-, Carboxyl-, Epoxy-, Carbonyl-, Alde­ hyd-, Antigen-, Antikörper-, Biotin-, Streptavidin- oder Avidin-Gruppen aufweisen. Diese Kopplungsgruppen ermöglichen das Binden von Molekülen an die Umhüllung. Insbesondere kann dadurch auch die zu markierende Substanz an die Umhüllung ge­ bunden werden.

Die Identifizierungsstoffe können aus einer Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus Metall, Metallionen, niedermolekularen Stoffen einschließlich Zucker-Resten, Alkohol-Resten, Ami­ nosäure-Resten, deren Analoga, modifizierten Aminosäure- Resten, Nukleotiden, deren Analoga, modifizierten Nukleotiden und/oder PNA (Peptide Nucleic Acid) oder einem Polymer aus mindestestens einem dieser niedermolekularen Stoffe. Vorzugs­ weise ist das Polymer aus 3 bis 600 Monomeren gebildet.

An der Außenseite der Umhüllung kann mindestens ein weiteres Molekül gebunden sein. Das weitere Molekül kann ein Protein, wie ein DNA-bindendes Protein oder ein Antikörper, eine Nu­ kleinsäure, Avidin, Streptavidin, Biotin, ein superparamagne­ tisches oder fluoreszierendes Teilchen oder ein Fluorophor sein. Das weitere Molekül ermöglicht ein Aussortieren des synthetischen Partikels aus der Substanz oder aus einer das synthetische Partikel enthaltenden Flüssigkeit. Weiterhin kann das Molekül eine Affinität zu einem in der Substanz ent­ haltenen Stoff aufweisen. Das Vorhandensein dieses Stoffs in der markierten Substanz kann durch Detektieren des an die Partikel gebundenen Stoffs nachgewiesen werden. Besonders vorteilhaft ist das bei einer Vielzahl verschiedener mit un­ terschiedlichen erfindungsgemäßen Partikeln markierten Reak­ tionsansätzen, z. B. bei einem High-Throughput-Screening- Verfahren. Durch Identifizieren der Partikel mit dem gebunde­ nen Stoff können diejenigen Reaktionsansätze identifiziert werden, in denen der Stoff vorhanden ist.

Bevorzugt enthält das synthetische Partikel mindestens einen Hilfsstoff. Der Hilfsstoff kann mindestens ein Mitglied einer Gruppe enthalten, bestehend aus Fällungsmittel für den Iden­ tifizierungsstoff, Polyanion, künstliches oder natürliches Polymer, Fluorophor, Mikrokapsel, Nanokapsel, Mikropartikel, Nanopartikel, Peptid oder Protein, Polylysin oder ein Derivat davon, Protamin oder ein Derivat davon, Silica-, Polystyrol-, Polystyrol/Copolymer-, Polyvinylchlorid-, Polyethylen-, Ny­ lon-, Polymethacrylat-, Polyvinyltoluen-, Glas-Teilchen, Teilchen aus porösem Material, aus einem Protein, aus CPG (controlled pore glass), Stärke, Agarose, Polyacrylamid, Wang-, Rink-, Merrifield-Harz und Metallpartikel. Die Metall­ partikel können Goldpartikel oder Wolframpartikel sein. Be­ vorzugt handelt es sich bei dem Hilfsstoff um ein Peptid oder Protein, insbesondere mit einem Molekulargewicht im Bereich von 3900 bis 4300, welches mit mindestens einem der Identifi­ zierungsstoffe ein Partikel bilden kann. Die Bildung eines solchen Partikels mit einer Nukleinsäure- oder Nukleinsäure­ derivatsequenz ist in der DE 198 58 005 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt einbezogen ist.

Der Hilfsstoff kann Amino-, Thiol-, Tosyl-, Carboxyl-, Epoxy-, Carbonyl-, Aldehyd-, Antigen-, Biotin-, Streptavi­ din-, Avidin- oder fluorophore Gruppen aufweisen. Bevorzugt ist mindestens einer der Identifizierungsstoffe an der Innen­ seite der Umhüllung oder, insbesondere über eine der genann­ ten Gruppen, an den Hilfsstoff gebunden. Mindestens einer der Identifizierungsstoffe kann mittels der Kopplungsgruppen oder eines Crosslinkers an der Innenseite der Umhüllung gebunden sein.

Die Identifizierungsstoffe können aufgrund ihres Molekularge­ wichts, ihrer Sequenz, ihrer Sequenzlänge und/oder ihres jeweiligen Gewichts im Verhältnis zum Gewicht der im syntheti­ schen Partikel vorhandenen Identifizierungsstoffe identifi­ zierbar sein. Die Identifizierung des Molekulargewichts kann mittels Massenspektroskopie, insbesondere MALDI-TOF, erfol­ gen. Die Identifizierungsstoffe können dabei z. B. Peptide oder Metallionen sein, die sich durch ihr Verhalten in der Massenspektroskopie eindeutig unterscheiden lassen.

Der Durchmesser des synthetischen Partikels liegt vorzugswei­ se zwischen 1 mm und 0,2 µm, insbesondere zwischen 20 µm und 0,5 µm. Das synthetische Partikel kann fluoreszierend, super­ paramagnetisch, farbig, lichtstreuend oder elektrisch geladen sein. Unter einem superparamagnetischen Partikel wird ein Partikel verstanden, das sich nur in einem Magnetfeld magne­ tisch verhält.

In einer bevorzugten Ausgestaltung sind die in dem syntheti­ schen Partikel enthaltenen Identifizierungsstoffe aus einer vorgegebenen Gruppe eindeutig voneinander unterscheidbarer Identifizierungsstoffe ausgewählt. Bei der Identifizierung synthetischer Partikel mit Identifizierungsstoffen aus defi­ nierten Teilbereichen dieser Gruppe besteht so eine Möglich­ keit, das Identifizierungsverfahren zu kontrollieren: Wird kein Identifizierungsstoff aus einem der Teilbereiche oder aus sämtlichen Teilbereichen identifiziert, liegt ein Fehler im Identifizierungsverfahren vor.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfin­ dungsgemäßen synthetischen Partikels zur Markierung einer Substanz. Die Markierung kann durch Zusatz des Partikels zu der Substanz erfolgen. Das synthetische Partikel kann an die Substanz binden bzw. die Substanz kann an der Oberfläche des synthetischen Partikels gebunden werden. Das synthetische Partikel kann auch in der Substanz enthalten sein ohne damit wechselzuwirken. Die Substanz kann eine lebende Zelle sein. Vorzugsweise wird das synthetische Partikel in eine lebende Zelle eingebracht. Dadurch kann eine markierte Substanz in das Innere der Zelle gebracht oder die Zelle selbst markiert werden. Die in die Zelle eingebrachte Substanz kann dort eine Reaktion auslösen und später durch das Partikel identifiziert werden. Zum Einbringen des synthetischen Partikels in eine lebende Zelle ist es besonders bevorzugt, wenn der Hilfsstoff ein Metallpartikel ist, so daß das synthetische Partikel eine hohe Dichte aufweist. Dann können die synthetischen Partikel mittels einer sogenannten "Gene-Gun" auf Zellen geschossen werden. Ein Teil der Partikel dringt dabei in die Zellen ein.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Markieren ei­ ner Substanz mit einem synthetischen Partikel, wobei das syn­ thetische Partikel aus mindestens einem aufgrund nichtopti­ scher Eigenschaften identifizierbaren Identifizierungsstoff und mindestens einer den Identifizierungsstoff umgebenden ge­ schlossenen Umhüllung besteht, wobei die Substanz an der Au­ ßenseite der Umhüllung gebunden wird. Der Identifizierungs­ stoff kann in fester Form vorliegen. Der Einsatz von Parti­ keln mit jeweils nur einem Identifizierungsstoff ist von Vor­ teil, wenn verschiedene markierte Substanzen in einem einzi­ gen Verfahrensablauf gleichzeitig identifiziert werden sol­ len. Zur Identifizierung des Identifizierungsstoffs wird die Umhüllung geöffnet.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zum Iden­ tifizieren einer mit einem erfindungsgemäßen synthetischen Partikel markierten Substanz. Dabei wird die Umhüllung geöff­ net und das synthetische Partikel durch gleichzeitiges Iden­ tifizieren der Identifizierungsstoffe in ein und demselben Identifizierungsverfahren aufgrund nichtoptischer Eigenschaf­ ten der Identifizierungsstoffe identifiziert. Mindestens ei­ ner der Identifizierungsstoffe kann eine Nukleinsäure sein, welche vor dem Identifizieren, z. B. durch eine PCR, verviel­ fältigt wird. Mindestens einer der Identifizierungsstoffe kann aufgrund seines Molekulargewichts, seiner Sequenz, sei­ ner Sequenzlänge und/oder seines Gewichts im Verhältnis zum Gewicht der im synthetischen Partikel vorhandenen Identifi­ zierungsstoffe identifiziert werden. Das synthetische Parti­ kel kann fluoreszierend, superparamagnetisch, farbig, licht­ streuend oder elektrisch geladen sein und aufgrund einer die­ ser Eigenschaften zum Identifizieren aussortiert werden. Ein Aussortieren des synthetischen Partikels aus der Substanz kann mittels einer zur Durchflußzytometrie geeigneten Vor­ richtung erfolgen.

Nachfolgend wird die Erfindung durch die Zeichnung und anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Umhüllens von Identifizierungsstoffen,

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Aggregation von Identifizierungsstoffen mit einem Hilfs­ stoff,

Fig. 3 die schematische Darstellung der Umhüllung von mit einem Hilfsstoff aggregierten Identi­ fizierungsstoffen,

Fig. 4 eine schematische Darstellung eines erfin­ dungsgemäßen synthetischen Partikels mit Kopplungsgruppen und weiteren Molekülen an der Außenseite der Umhüllung,

Fig. 5 eine schematische Darstellung verschiedener Reaktionsansätze, in denen jeweils eine Sub­ stanz an der Oberfläche synthetischer Parti­ kel gebundenen wird,

Fig. 6a und 6b eine schematische Darstellung des Aussortie­ rens und Identifizierens eines synthetischen Partikels mittels Massenspektroskopie und

Fig. 7a und 7b eine schematische Darstellung der Kodierung und Identifizierung einer Zahl durch eine Kombination von Nukleinsäuren unterschiedli­ cher Länge.

In Fig. 1 ist das Umhüllen der Identifizierungsstoffe 10, 12 durch die die Umhüllung bildenden Moleküle 14 schematisch dargestellt. Die die Umhüllung bildenden Moleküle 14 werden mit den Identifizierungsstoffen 10, 12 gemischt. Dabei bilden sich synthetische Partikel 18, bei denen die Identifizie­ rungsstoffe 10, 12 von der geschlossenen Umhüllung 16 umgeben sind. Verfahren zum Herstellen geschlossener Umhüllungen sind z. B. in den Patenten US 3,856,966, US 3,664,963, US 4,637,905, US 3,664,963 und US 4,089,800 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hiermit einbezogen wird.

In Fig. 2 ist die Aggregation der Identifizierungsstoffe 10, 12 mit dem Hilfsstoff 20 schematisch dargestellt. Bei den Identifizierungsstoffen 10, 12 kann es sich um Nukleinsäuren und bei dem Hilfsstoff um Protamin handeln. Durch das Inkon­ taktbringen der Identifizierungsstoffe 10, 12 mit dem Hilfsstoff 20 kommt es zur Aggregation. Die Identifizierungsstoffe 10, 12 fallen zusammen mit dem Hilfsstoff 20 als Partikel 22 aus.

Fig. 3 zeigt das Umhüllen eines Partikels 22, eines Partikels 24 mit an einem Hilfsstoff 20 oberflächlich gebundenen Iden­ tifizierungsstoffen 10, 12 und eines porösen Partikels 26 mit an einem porösen Hilfsstoff 20 gebundenen Identifizierungs­ stoffen 10, 12. An den Identifizierungsstoffen 10, 12 kann ein weiterer Stoff 25 gebunden sein. Die Partikel 22, 24, 26 werden mit den umhüllungsbildenden Molekülen 14 in Kontakt gebracht. Um die Partikel 22, 24, 26 wird eine geschlossene Umhüllung 16 gebildet.

Fig. 4 zeigt schematisch Oberflächenmodifikationen an der ge­ schlossenen Umhüllung 16 eines erfindungsgemäßen syntheti­ schen Partikels 18. Die Oberflächenmodifikationen können ein­ zeln oder in Kombination auf dem synthetischen Partikel 18 vorhanden sein. A bezeichnet eine Kopplungsgruppe. B, C, D, F, G, H und J bezeichnen an Kopplungsgruppen A gebundene wei­ tere Moleküle, wie Antikörper, Streptavidin/Avidin, Liganden, Rezeptoren, superparamagnetische oder fluoreszierende Parti­ kel, Fluorophore oder Nukleinsäuren.

Fig. 5 zeigt schematisch verschiedene Reaktionsansätze, in denen jeweils eine Substanz an der Oberfläche der erfindungs­ gemäßen synthetischen Partikel 18 gebundenen wird. Jede Sub­ stanz ist durch das synthetische Partikel 18 eindeutig iden­ tifizierbar. Aus jedem Reaktionsansatz werden synthetische Partikel 18 mit gebundenen Substanzen entnommen und in einem gemeinsamen Ansatz vereinigt. Die Substanzen können gemeinsam einer Reaktion, wie z. B. einer Antikörperbindung, unterworfen werden. Synthetische Partikel 18 mit an den Substanzen gebundenen Antikörpern können, z. B. aufgrund einer Fluoreszenzmar­ kierung der Antikörper, selektioniert werden. Die von den An­ tikörpern gebundenen Substanzen können durch die syntheti­ schen Partikel 18 identifiziert werden.

Fig. 6a zeigt schematisch das Aussortieren synthetischer Par­ tikel 18 aus dem gemeinsamen Ansatz mittels eines Fluores­ zenz-aktivierten Partikelsortierers. Die Identifizierungs­ stoffe in den synthetischen Partikeln 18 sind durch ihre Mas­ se charakterisiert. Fig. 6b zeigt schematisch die massenspek­ troskopische Identifizierung eines synthetischen Partikels 18. Das kann z. B. mittels MALDI-TOF erfolgen. Jeder Identifi­ zierungsstoff kodiert für eine Ziffer einer Dezimalstelle ei­ ner Zahl. Durch die Zahl ist es möglich, den Reaktionsansatz zu identifizieren, aus dem das Partikel stammt. Das Verfahren ermöglicht das Überprüfen vieler Reaktionsansätze in kurzer Zeit.

Fig. 7a und 7b zeigen schematisch, wie durch eine Kombination von Nukleinsäuren unterschiedlicher Sequenzlänge P als Iden­ tifizierungsstoffe eine Information kodiert und identifiziert werden kann. Die in Fig. 7a dargestellten Nukleinsäuren wei­ sen identische oder voneinander abweichende Primerbindungsse­ quenzen 28 und 30 auf. Die Nukleinsäuren werden mit Hilfe ei­ ner PCR amplifiziert. Fig. 7b zeigt schematisch die Analyse der amplifizierten Nukleinsäuren mittels Gel- oder Kapillare­ lektrophorese. Bei der gelelektrophoretischen Analyse erlaubt der Vergleich mit gleichzeitig gelelektrophoretisch aufge­ trennten Markernukleinsäuren MA die Identifizierung der am­ plifizierten Nukleinsäuren. Bei der kapillarelektrophoreti­ schen Analyse erzeugt jede der amplifizierten Nukleinsäuren ein in optischen Einheiten o. u. meßbares Signal. Jedes Signal weist eine für eine der Nukleinsäuren charakteristische Verzögerungszeit t auf. Alternativ können die amplifizierten Nu­ kleinsäuren auch massenspektroskopisch analysiert werden.

Zur Herstellung eines synthetischen Partikels 18 werden Oli­ gonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 und SEQ ID NO 3 gemäß dem anliegenden Sequenzprotokoll bereitge­ stellt. Sie weisen Sequenzlängen von 60, 70 und 80 Basen auf. 3'- und 5'-terminal befinden sich jeweils identische Primer­ bindungssequenzen. Dazwischen liegt ein Bereich mit einer für jede Sequenz charakteristischen Länge. Das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO 1 ist am 5'-Ende mit 5[6]- Carboxyfluorescein (FAM) markiert. In doppelt destilliertem Wasser werden je 100 µg/ml Oligonukleotide gelöst. Die Lösun­ gen werden vereinigt. 300 µm einer Lösung mit 50 µg/ml Prota­ min werden zugesetzt. Die Mischung wird intensiv für eine Mi­ nute bei Raumtemperatur geschüttelt. Dabei kommt es spontan zu einer Partikelbildung, die nach einer halben Stunde abge­ schlossen ist. Dieses Verfahren ist in der DE 198 58 005 be­ schriebenen. Die gebildeten Partikel werden abzentrifugiert und in doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Der durch­ schnittliche Partikeldurchmesser beträgt 0,9 µm. 100 µl einer Suspension mit 1 Vol.% der Partikel werden mit 10 mg Paraf­ fin, das einen Schmelzpunkt von 60°C aufweist, in Wasser bei 65°C suspendiert und unter Rühren mit Eiswasser abgeschreckt. Dabei bilden sich umhüllte Partikel. Die Partikel werden durch mehrfaches Zentrifugieren und Suspendieren gewaschen.

Die Partikel werden einer zu markierenden Lösung zugesetzt. Um ein Partikel aus dieser Lösung zu isolieren, wird die Lö­ sung mit den Partikeln auf einem Objektträger ausgebreitet. Mit einem Fluoreszensmikroskop sind die Partikel auf dem Ob­ jektträger aufgrund der FAM-Markierung sichtbar. Ein einzel­ nes Partikel wird mit einer fein ausgezogenen Glaskapillare aufgenommen. Das Isolieren eines Partikels kann auch mittels eines Fluoreszenz-aktivierten Partikelsortierers erfolgen. Das Partikel wird in einem Gesamtvolumen von ca. 1 µl in ein 100 µl PCR-Reaktionsgefäß überführt. Zur Identifizierung wird eine Heißstart-PCR unter Verwendung des Taq-PCR-Kits der Fir­ ma Roche Diagnostics GmbH in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Dazu wird nach Zugabe der Primer mit den Se­ quenzen SEQ ID NO 4 und SEQ ID NO 5 das folgende PCR- Protokoll ausgeführt:

• 1. 10 Minuten 95°C,
• 2. 1 Minute 95°C,
• 3. 30 Sekunden 58°C,
• 4. 30 Sekunden 72°C,
• 5. 35 Zyklen 2. bis 4. und
• 6. eine Stunde 4°C.

10 µl des PCR-Ansatzes werden auf einem 15% Polyacrylamid­ mini-Gel in Tris-Acetat-EDTA-Puffer für 1,5 Stunden bei 100 V aufgetrennt. Als Größenmarker wird eine 10 Basenpaarleiter der Firma Roche Diagnostics GmbH verwendet. Die DNA-Banden werden mittels Ethidiumbromid gefärbt und auf einen UV- Transiluminator bei 305 nm sichtbar gemacht. Die Größe der PCR-Produkte wird durch Vergleich mit der 10 Basenpaarleiter bestimmt. Es sind PCR-Produkte mit einer Länge von 60, 70 und 80 Basenpaaren sichtbar.

Bezugszeichenliste

10

Identifizierungsstoff

12

Identifizierungsstoff

14

Umhüllung bildendes Molekül

16

Umhüllung

18

synthetisches Partikel

20

Hilfsstoff

22

Partikel

24

Partikel

25

weiterer Stoff

26

Partikel

28

Primerbindungssequenz

30

Primerbindungssequenz
IDS Identifizierungssequenz
A Kopplungsgruppe
B, C, D, E, G, H, J weitere Moleküle
P Kombination von Nukleinsäuren unter­ schiedlicher Sequenzlänge
o. u. optische Einheit
t Verzögerungszeit

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (25)

1. Synthetisches Partikel zur Markierung einer Substanz, be­ stehend aus einer Mehrzahl von in fester Form vorliegen­ den Identifizierungsstoffen (10, 12) und mindestens einer die Identifizierungsstoffe (10, 12) umgebenden geschlos­ senen Umhüllung (16), wobei die Identifizierungsstoffe (10, 12) so ausgewählt sind, daß das synthetische Parti­ kel (18) durch gleichzeitiges Identifizieren der Identi­ fizierungsstoffe (10, 12) in ein und demselben Identifi­ zierungsverfahren aufgrund nichtoptischer Eigenschaften der Identifizierungsstoffe (10, 12) identifizierbar ist.

2. Synthetisches Partikel nach Anspruch 1, wobei die Umhül­ lung (16) Proteine, Peptide, Polyole, Polymere, Wachs, Lipide, Metall, Biotin, Streptavidin oder Avidin enthält.

3. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei die Umhüllung (16) Kopplungsgruppen (A), insbesondere Amino-, Thiol-, Tosyl-, Carboxyl-, Epoxy-, Carbonyl-, Aldehyd-, Antigen-, Antikörper-, Biotin-, Streptavidin- oder Avidin-Gruppen aufweist.

4. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei die Identifizierungsstoffe (10, 12) aus einer Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus Metall, Me­ tallionen, niedermolekularen Stoffen einschließlich Zuc­ ker-Resten, Alkohol-Resten, Aminosäure-Resten, deren Ana­ loga, modifizierten Aminosäure-Resten, Nukleotiden, deren Analoga, modifizierten Nukleotiden und/oder PNA oder ei­ nem Polymer aus mindestestens einem dieser niedermoleku­ laren Stoffe.

5. Synthetisches Partikel nach Anspruch 4, wobei das Polymer aus 3 bis 600 Monomeren gebildet ist.

6. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei an der Außenseite der Umhüllung (16) min­ destens ein weiteres Molekül (B, C, D, E, G, H, J) gebun­ den ist.

7. Synthetisches Partikel nach Ansprüch 6, wobei das weitere Molekül (B, C, D, E, G, H, J) ein Protein, eine Nuklein­ säure, Avidin, Streptavidin, Biotin, ein superparamagne­ tisches oder fluoreszierendes Teilchen oder ein Fluoro­ phor ist.

8. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei das synthetische Partikel (18) mindestens einen Hilfsstoff (20) enthält.

9. Synthetisches Partikel nach Anspruch 8, wobei der Hilfs­ stoff (20) mindestens ein Mitglied einer Gruppe enthält, bestehend aus Fällungsmittel für mindestens einen der Identifizierungsstoffe, Polyanion, künstliches oder na­ türliches Polymer, Fluorophor, Mikrokapsel, Nanokapsel, Mikropartikel, Nanopartikel, Peptid oder Protein, Poly­ lysin oder ein Derivat davon, Protamin oder ein Derivat davon, Silica-, Polystyrol-, Polystyrol/Copolymer-, Poly­ vinylchlorid-, Polyethylen-, Nylon-, Polymethacrylat-, Polyvinyltoluen-, Glas-Teilchen, Teilchen aus porösem Ma­ terial, aus einem Protein, aus CPG, Stärke, Agarose, Po­ lyacrylamid, Wang-, Rink-, Merrifield-Harz und Metallpar­ tikel.

10. Synthetisches Partikel nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Hilfsstoff (20) Amino-, Thiol-, Tosyl-, Carboxyl-, Epoxy-, Carbonyl-, Aldehyd-, Antigen-, Biotin-, Strept­ avidin-, Avidin- oder fluorophore Gruppen aufweist.

11. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei mindestens einer der Identifizierungsstof­ fe (10, 12) an der Innenseite der Umhüllung (16) oder den Hilfsstoff (20) gebunden ist.

12. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei mindestens einer der Identifizierungsstof­ fe (10, 12) mittels einer der Kopplungsgruppen (A) oder eines Crosslinkers an der Innenseite der Umhüllung (16) gebunden ist.

13. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei die Identifizierungsstoffe (10, 12) auf­ grund ihres Molekulargewichts, ihrer Sequenz, ihrer Se­ quenzlänge und/oder ihres jeweiligen Gewichts im Verhält­ nis zum Gewicht der im synthetischen Partikel (18) vor­ handenen Identifizierungsstoffe (10, 12) identifizierbar sind.

14. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei der Durchmesser des synthetischen Parti­ kels (18) zwischen 1 mm und 0,2 µm, insbesondere zwischen 20 µm und 0,5 µm, liegt.

15. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei das synthetische Partikel (18) fluoreszie­ rend, superparamagnetisch, farbig, lichtstreuend oder elektrisch geladen ist.

16. Synthetisches Partikel nach einem der vorhergehenden An­ sprüche, wobei die Identifizierungsstoffe (10, 12) aus einer vorgegebenen Gruppe eindeutig voneinander unter­ scheidbarer Identifizierungsstoffe ausgewählt sind.

17. Verwendung eines synthetischen Partikels nach einem der Ansprüche 1-16 zur Markierung einer Substanz.

18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Substanz an der Oberfläche des synthetischen Partikels gebunden wird.

19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Substanz eine lebende Zelle ist.

20. Verfahren zum Markieren einer Substanz mit einem synthe­ tischen Partikel, wobei das synthetische Partikel (18) aus mindestens einem aufgrund nichtoptischer Eigenschaf­ ten identifizierbaren Identifizierungsstoff (10, 12) und mindestens einer den Identifizierungsstoff (10, 12) umge­ benden geschlossenen Umhüllung (16) besteht, wobei die Substanz an der Außenseite der Umhüllung gebunden wird.

21. Verfahren zum Identifizieren einer mit einem syntheti­ schen Partikel nach einem der Ansprüche 1-16 markierten Substanz, wobei die Umhüllung (16) geöffnet wird und das synthetische Partikel (18) durch gleichzeitiges Identifi­ zieren der Identifizierungsstoffe (10, 12) in ein und demselben Identifizierungsverfahren aufgrund nichtopti­ scher Eigenschaften der Identifizierungsstoffe (10, 12) identifiziert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei mindestens einer der Identifizierungsstoffe (10, 12) eine Nukleinsäure ist, welche vor dem Identifizieren vervielfältigt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei mindestens ei­ ner der Identifizierungsstoffe (10, 12) aufgrund seines Molekulargewichts, seiner Sequenz, seiner Sequenzlänge und/oder seines Gewichts im Verhältnis zum Gewicht der im synthetischen Partikel (18) vorhandenen Identifizierungs­ stoffe (10, 12) identifiziert wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21-23, wobei das synthetische Partikel (18) fluoreszierend, superparama­ gnetisch, farbig, lichtstreuend oder elektrisch geladen ist und aufgrund einer dieser Eigenschaften aussortiert wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21-24, wobei das synthetische Partikel (18) aus der Substanz mittels einer zur Durchflußzytometrie geeigneten Vorrichtung aussor­ tiert wird.