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Aufgrund der in den letzten Jahren
immer mehr um sich greifenden Fälschungen
von Markenprodukten oder der Manipulation von Informationen, die
in unmittelbarem Zusammenhang mit dem Produkt stehen, z. B. Verfallsdaten
von Arzneimitteln, besteht ein starkes Bedürfnis nach selektiven, schwer fälschbaren,
schwer zu umgehenden oder zu manipulierenden, einfachen und schnell
durchführbaren Verfahren
zur Prüfung
der Originalität
eines Objekts oder mit dem Objekt in Zusammenhang stehender Informationen.
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Im Stand der Technik sind bereits
verschiedene selektive Verfahren zur Prüfung der Echtheit von Objekten
bekannt.
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So wird in WO 98/33162 ein selektives
Verfahren zur Echtheitsprüfung
von Objekten beschrieben, das auf der selektiven Wechselwirkung
zwischen einem „print
molecule" und einem „molecularly imprinted
molecule" beruht. Bei diesem Verfahren wird die nachzuweisende Komponente
(„print
molecule") einem Polymer eingeprägt,
das danach dreidimensionale Abdrücke
(„molecularly
imprinted molecule") des Moleküls
enthält.
Der Originalitätsnachweis
beruht auf der (mehr oder weniger) spezifischen Erkennung des eingeprägten Moleküls durch
ein Polymer.
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Aus
EP-A-0327163 ,
US-A-5,429,952 und WO 95/06249 ist jeweils
die Verwendung spezifischer Antikörper im Rahmen eines Immunoassays zur
Echtheitsprüfung
bekannt. WO 87/06363 verwendet makromolekulare Testkomponenten,
wie z. B. Proteine und Nukleinsäuren,
zur Markierung von Produkten, wobei der spezifische Nachweis im
Falle der Proteine mit markierten Antikörpern und im Falle der Nukleinsäure mit
entsprechenden markierten Nukleinsäuresonden erfolgt.
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Nachteilig an diesen Verfahren ist,
dass die Bildung eines Komplexes durch zwei komplementäre Bindungspartner
nicht direkt zu einem auswertbaren Signal führt und somit hintereinandergeschaltete Schritte,
z. B. zur Abtrennung von nicht spezifisch gebundenem Reagenz, für die Originalitätsprüfung notwendig
sind, um ein spezifisches Signal zu erhalten.
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Durch die verschiedenen Schritte
werden die Analysen verlängert
und die Kosten erhöht.
Zudem ist bei einer Originalitätsprüfung, die
instrumentenunabhängig,
schnell und auch von ungeschulten Personen durchgeführt werden
soll, ein rasches, einfaches und nicht fehleranfälliges Verfahren besonders
erwünscht.
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PCT/EP01/00764 beschreibt ein Nachweissystem
zur Prüfung
der Originalität,
bei dem das Objekt z. B. mit einem Enzymsubstrat markiert wird und dieses
dann in einer entsprechenden Testvorrichtung mit dem Enzym umgesetzt
wird, wobei die Produkte der Umsetzung direkt oder nach Kombination
mit einem Indikatorsystem ein nachweisbares Signal ergeben. Dieses
Verfahren erlaubt die rasche Durchführung der Prüfung mit
einer relativ einfach aufgebauten Testvorrichtung.
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Demgegenüber besteht die Aufgabe der
vorliegenden Erfindung darin, das Testverfahren noch weiter zu vereinfachen
und die Testvorrichtung durch ein einfaches, kostengünstiges
und effizientes Prüfmittel
zu ersetzen, das dem Anwender jederzeit zur Verfügung steht.
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Diesen Vorgaben wird Speichel als
unkompliziert zugängliches
und jederzeit verfügbares
Prüfmittel
in idealer Weise gerecht. Spezifische, natürliche Inhaltsstoffe von humanem
Speichel fungieren bei der vorliegenden Erfindung als notwendige
Komponente oder Mischung von Komponenten zur erfolgreichen Durchführung einer
Originalitätsprüfung bei einem
entsprechend markierten Objekt, wobei die Erzeugung eines spezifischen
Signals die Originalität des
markierten geprüften
Objekts bestätigt.
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Die obengenannte Aufgabe wird somit
erfindungsgemäß durch
ein Nachweisverfahren zur Prüfung
der Originalität
eines Objekts gelöst,
welches dadurch gekennzeichnet ist, dass durch die Einwirkung von
humanem Speichel oder darin enthaltenen Bestandteilen auf einen
Marken, der mit dem Objekt verbunden bzw. in ihm enthalten ist,
ein spezifisches Signal erzeugt und dieses Signal ausgewertet wird.
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Eine bevorzugte grundsätzliche
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens
beruht auf der Umsetzung eines Substrats (und gegebenenfalls Cosubstrats)
mit einem geeigneten Enzym, wobei die Produkte der Umsetzung direkt oder
nach Kombination mit einem Indikatorsystem ein spezifisches nachweisbares
Signal ergeben, das die Originalität (Echtheit) des Objekts bestätigt.
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Hierbei ist vorzugsweise das katalysierende Enzym
im Speichel enthalten. Die anderen zur Signalerzeugung erforderlichen
Komponenten, wie z. B. Substrat, gegebenenfalls Cosubstrat, Indikatorsystemkomponenten
und andere für
die Signalerzeugung erforderlichen Enzyme, die nicht im Speichel enthalten
sind, liegen in dem Marken vor, der mit dem Objekt verbunden oder
in ihm enthalten ist.
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Als Speichelenzym wird vorzugsweise
das Enzym α-Amylase
im Speichel genutzt. Dieses Enzym spaltet bevorzugt Stärke oder
Stärkederivate wie
beispielsweise Hydroxyethylstärke.
Das Stärkemolekül wird durch
die α-Amylase
mit statistischer Verteilung der Spaltstellen in oligomer verzweigte Saccharidbruchstücke und
teilweise auch schon in den Einfachzucker Glucose gespalten. Diese
Glucoseeinheiten dienen dann als Substrat für die nachfolgende enzymatische
Umsetzung, die zur Signalerzeugung führt. Optional kann z. B. auch
noch das Enzym 1,6-Glucosidase auf dem Objekt bereitgestellt werden,
um eine weitere Spaltung von Oligomeren in Glucoseeinheiten zu katalysieren.
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Auf dem markierten Objekt sind bevorzugt die
Enzyme Glucoseoxidase, Peroxidase, ein Substrat wie z. B. Tetramethylbenzidin
(TMB), ein Peroxid, z. B. Wasserstoffperoxid, immobilisiert. Bei
der enzymatischen Spaltung der Stärke in Glucoseeinheiten, die
mit Hilfe der α-Amylase
aus Speichel und gegebenenfalls bereitgestellter 1,6-Glucosidase
katalysiert wird, wird durch die enzymatische Umsetzung der Enzyme
Glucoseoxidase und Peroxidase mit Hilfe von z. B. TMB und H2O2 ein z. B. blaues
Signal erzeugt.
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Die nicht im Speichel enthaltenen,
für die
Reaktion erforderlichen Komponenten werden in geeigneten Matrices
auf das Objekt aufgebracht. Solche Matrices sind hydrophile und
hydrophobe Lacke, Farbmaterialien oder Polymere. Je nach Matrix
können
die individuellen Komponenten direkt in diese Matrices eingemischt
werden. Alternativ können
die nicht im Speichel enthaltenen, für die Reaktion erforderlichen
Komponenten in geschützter
Form, z. B. in Mikrokapseln oder Mikropartikel eingeschlossen, eingebracht
werden. Mit Mikrokapseln werden im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung Mikrogehäuse
aus unterschiedlichen Materialien, z. B. Gelatine, Stärke, Cyclodextrin
oder Chitosan verstanden, die mit dem jeweils gewünschten
Inhaltsstoff bzw. Inhaltsstoffen befüllt werden. Als Mikropartikel dagegen
werden poröse
dreidimensionale Strukturen bezeichnet, die ebenfalls aus Gelatine,
Stärke,
Cyclodextrin oder Chitosan bestehen können, aber auch aus Polymeren
oder Copolymeren. Die Mikropartikel enthalten ein oder mehrere Inhaltsstoffe
entweder in die dreidimensionale poröse Struktur eingebettet oder
adsorbtiv an deren Oberfläche
gebunden.
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In einer zweiten bevorzugten grundsätzlichen
Ausführungsform
umfaßt
der Marken daher Mikrokapseln oder Mikropartikel, die durch die
Einwirkung von humanem Speichel oder darin enthaltenen Bestandteilen
aufgeschlossen, d. h., geöffnet,
gespalten oder auf andere Weise, z. B. durch physikalische Wechselwirkung,
dahingehend beeinflußt
werden, dass eingeschlossene oder chemisch gebundene oder adsorbierte
Inhaltsstoffe oder Bestandteile der Mikrokapseln oder Mikropartikel
freigesetzt werden.
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Bei der Mikroverkapselung handelt
es sich um einen Prozeß,
bei dem die gewünschten
Stoffe in Kapseln, vorzugsweise einer Größe von etwa 1–100 μm, eingeschlossen
werden. Dabei werden diese Materialien vollständig und lückenlos umhüllt. Diese Umhüllung dient
zunächst
dem Schutz der umschlossenen Komponenten vor äußeren Einflüssen (z. B. Luftsauerstoff,
Feuchtigkeit, andere chemische Reaktionspartner) und darüber hinaus
der gezielten Freisetzung unter den jeweils geeigneten Bedingungen.
Viele Stoffe würden
in gelöster
Form oder einfach frei in der Matrix vorliegend schnell an Aktivität verlieren
und können
auf diese Weise eingeschlossen bis zum gewünschten Zeitpunkt reaktionsfähig erhalten
werden.
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Die Herstellung von Mikrokapseln
erfolgt mit verschiedenen Technologien, die kommerziell von verschiedenen
Spezialisten angeboten werden und insbesondere in der Lebensmittel-
und Kosmetikindustrie breite Anwendung finden.
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Bei der Herstellung von Mikrokapseln
kommen Verfahren wie Extrusion/Versprühen/Kühlen, Extrusion/Cutting, Coating/Extrusion/Vermahlen,
Koazervation oder Emulsion/Extrusion und andere Verfahren zur Anwendung.
Die Mikrokapseln oder Mikropartikel können sich in einem Medium oder
einer Matrix befinden, welches) gegebenenfalls ebenfalls Komponenten
zur Signalerzeugung enthalten kann.
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Das Medium oder die Matrix, in welches)
die Mikrokapseln oder Mikropartikel z.B. durch Einmischen eingebracht
werden, besteht beispielsweise aus Materialien, die in der Drucktechnik üblicherweise
eingesetzt werden. Dies sind handelsübliche Lacke wie UV-Lacke,
Farben, wasserlösliche
Lacke, z. H. Hydrokett HK P061 von Akzo Nobel, Lösemittellacke oder handelsübliche Kleber
z. B. Hotmeltkleber. Diese Materialien werden auf die entsprechenden Unterlagen
durch übliche
Drucktechniken wie Siebdruck, Tiefdruck, Flexodruck oder Offsetdruck
aufgebracht. Die Trocknung der Materialien erfolgt beispielsweise
durch UV-Trocknung, die zur Polymerisation der Materialien führt.
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In beiden Ausführungsformen wird die signalerzeugende
Reaktion einfach dadurch gestartet, dass das markierte Objekt, beispielsweise
ein Produkt, eine Produktverpackung, eine Zollmarke, ein Etikett
oder ein Wertdruck, vom prüfenden
Anwender mit Speichel oder einer Flüssigkeit, die mindestens einen
Speichelbestandteil, vorzugsweise ein oder mehrere Speichelenzym(e),
enthält,
an der Stelle der Markierung benetzt wird. Das Signal entsteht vorzugsweise
direkt auf dem markierten Objekt. Alternativ ist jedoch auch eine Übertragung
von signalerzeugenden Komponenten auf eine separate Testvorrichtung,
wie z. B. in
DE 100
02 819 A1 offenbart, möglich.
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Die Erfindung stellt somit ein Nachweissystem
zur Prüfung
der Originalität
eines Objekts bereit, wobei mindestens ein Bestandteil, der für den Nachweis
erforderlich ist, in Speichel enthalten ist und mindestens eine
Komponente in einem Marker vorliegt, der mit dem Objekt verbunden
bzw. in ihm enthalten ist.
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Einige nicht-beschränkende Beispiele
für geeignete
enzymatische Aktivitäten
in humanem Speichel sind Amylasen, vorzugsweise α-Amylasen, Lysozym, Peroxidase
und Lactoferrin. Diese können
als Speichel oder in Form einer Flüssigkeit, die eines oder mehrere
dieser Enzyme enthält,
eingesetzt werden.
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Die in der zweiten grundsätzlichen
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
einzusetzenden Kapseln bzw. Partikel besitzen eine Größe und/oder
Wandstärke,
die den jeweiligen Anforderungen für optimale Signalerzeugung
und bequeme Markierung des Objekts (z. B. durch Druckverfahren)
angepasst ist. Die Größe der Kapseln bzw.
Partikel beträgt
vorzugsweise 1–100 μm. Zur Herstellung
und Befüllung
der Kapseln können
gängige
Verfahren eingesetzt werden (siehe z. B. Carbohydrate Polymers 1994,
24 (4) 295–300,
Advances in Polymer Science 136, Springer Verlag, 1998; Abe, Albertson
et al.). Geeignete Kapseln, die einem gewünschten Anforderungsprofil
entsprechen, können auch
von darauf spezialisierten Firmen bezogen werden.
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Die Technologie zur Verkapselung
bzw. zum Einschluß von
Inhaltsstoffen hängt
großenteils
auch von der Natur der Inhaltsstoffe ab. Um die Verkapselungstechnologie
mit den beabsichtigten Inhaltsstoffen zur Signalerzeugung möglichst
unkompliziert zu gestalten, kann sie an gängige Technologien zur Verkapselung
anderer Inhaltsstoffe angelehnt werden. So können die hier interessierenden
Inhaltsstoffe auch mit Hilfsstoffen kombiniert verkapselt bzw. in
Mikropartikel eingeschlossen bzw. gebunden werden.
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Bevorzugte Grundmaterialien für solche
Mikrokapseln oder Mikropartikel sind Substanzen, welche als Substrate
für Speichelenzyme,
wie z. B. die oben genannten, dienen können. Die Enzym-Substrat-Umsetzung
führt dann
zu einer Öffnung
der Mikrokapseln und/oder zur Spaltung von Strukturen der Mikropartikel und
zur Freisetzung der eingeschlossenen bzw. anderweitig gebundenen
oder immobilisierten Komponenten für die Signalerzeugung. Diese Grundmaterialien
können
nach Bedarf so modifiziert und/oder mit Hilfsstoffen ergänzt bzw.
kombiniert werden, dass gewünschte
chemische oder physikalische Eigenschaften bezüglich der hier vorgesehenen Anwendung
optimiert werden. Zu diesen Eigenschaften zählen beispielsweise eine ausreichende
enzymatische Spaltbarkeit durch die Speichelenzyme, eine ausreichende
chemische Langzeitstabilität
auf dem markierten Objekt, eine ausreichende Eignung bezüglich der
technischen Verarbeitbarkeit und geeignete Löslichkeitseigenschaften in
der technischen Verarbeitung und im Rahmen des Prüfprozesses
mit Speichel. Um eine Löslichkeit
der Kapseln bzw. Partikel durch Wasser allein, also ohne die Einwirkung von
speichelspezifischen Enzymen, zu minimieren bzw. auszuschließen, kann
beispielsweise eine Vernetzung oder anderweitige Modifizierung der
Kapsel- oder Partikelobertläche
vorgenommen werden. Eine solche Vernetzung kann beispielsweise mit
Polypeptiden erfolgen. Entsprechende Modifikationen des Kapsel-
bzw. Partikelmaterials führen
auch dazu, dass ein Aufschluß der
Kapseln bzw. Partikel rasch und unter realistischen Bedingungen,
also vorzugsweise bei Raumtemperatur, erfolgt und somit eine ausreichend
rasche und intensive Signalerzeugung gewährleistet ist.
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Bevorzugte Grundmaterialien sind
das Polymer Chitosan und Derivate davon, die durch das Speichelenzym
Lysozym spaltbar sind, oder Poly-L-lysin.
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Ebenfalls bevorzugt sind Materialien
auf Stärkebasis,
die durch Amylasen, vorzugsweise α-Amylasen,
spaltbar sind. Solche Materialien auf Stärkebasis umfassen Stärke und
verschiedene Arten von modifizierten Stärkederivaten, beispielsweise eine
Hydroxyalkylstärke,
z. B. Hydroxyethylstärke, oder
Cyclodextrin, deren chemische und physikalischen Eigenschaften an
die vorgesehene Verwendung angepasst werden können.
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Die Verwendung unterschiedlicher
Kapsel- bzw. Partikeltypen, beispielsweise auf der Grundlage unterschiedlicher
chemischer Modifikationen und/oder Wandstärken, ermöglicht einen zeitlich versetzten
Aufschluß.
Dadurch ist es möglich, verschiedene
Inhaltsstoffe aus verschiedenen Kapsel- und/oder Partikeltypen sukzessive
freizusetzen und damit Signale zeitlich hintereinander zu erzeugen und
Signalkaskaden zu bilden. Dadurch wird das Imitieren der Signalerzeugung
erheblich erschwert.
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Das erfindungsgemäß erzeugte Signal kann auf
verschiedene Arten nachweisbar sein. Vorzugsweise wird es ein Signal
sein, das direkt mit einem der menschlichen Sinne wahrnehmbar ist.
Besonders bevorzugt wird es sich um ein optisches, insbesondere
farbiges, Signal handeln. Das optische Signal kann auch ein Fluoreszenz-,
Lumineszenz- oder Phosphoreszenzsignal sein, welches erst unter
geeigneten Bedingungen, z. B. Bestrahlung mit UV-Licht oder im Dunkeln,
sichtbar wird. Alternativ könnte
das Signal auch mit dem Geruchs- oder Geschmackssinn wahrnehmbar
sein.
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In einer alternativen Ausführungsform
wird ein physikalisches, einschließlich optisches, Signal erzeugt,
das durch ein geeignetes Meßinstrument ausgewertet
werden kann. Solche Instrumente können z. B. Fluoreszenzmesser,
Reflektometer, Leitfähigkeitsmesser
etc. sein.
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In einer weiteren Ausführungsform
wird ein Signal erzeugt, das durch eine andere nicht-instrumentelle
Prüfvorrichtung,
beispielsweise in Anlehnung an die Prüfvorrichtung in
DE 100 02 819 A1 , ausgewertet
werden kann.
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Das Signal kann durch die Freisetzung
einer einzelnen Komponente, durch die Freisetzung unterschiedlicher
Komponenten oder durch das Zusammenwirken bzw. eine Reaktion unterschiedlicher Komponenten
erzeugt werden.
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In einer Ausführungsform können alle
für die Signalerzeugung
erforderlichen Komponenten mit Ausnahme der Speichelkomponenten
in den Mikrokapseln bzw. Mikropartikeln eingeschlossen und zur Signalerzeugung
gezielt freigesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform,
die in jedem Fall mehr als nur eine Komponente zur Signalerzeugung
erfordert, wird nur ein Teil der Komponenten in Mikrokapseln bzw.
Mikropartikel eingeschlossen, während
der andere Teil der Komponenten frei im umgebenden Medium, beispielsweise
einer Druckfarbe oder Kunststoffmatrix (siehe oben), vorliegen kann.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft auch Verfahren und Zusammensetzungen zur Signalerzeugung,
bei denen ein spezifisches Signal durch die Einwirkung von mechanischen Scherkräften und/oder
Lösungsmitteln,
insbesondere organischen Lösungsmitteln,
auf das markierte Objekt erzeugt wird.
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In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung
werden Mikrokapseln oder Mikropartikel eingesetzt, welche vorzugsweise
durch die Einwirkung von mechanischen Scherkräften geöffnet werden können. Geeignete
Grundmaterialien für
derartige Kapseln sind beispielsweise Wachse, Alginate, Casein,
Gelatine oder Liposomen. Diese Grundmaterialien können nach
Bedarf so modifiziert und/oder mit Hilfsstoffen ergänzt bzw.
kombiniert werden, dass gewünschte
chemische oder physikalische Eigenschaften bezüglich der hier vorgesehenen
Anwendung optimiert werden. Zu diesen Eigenschaften zählen beispielsweise
eine ausreichende chemische und mechanische Langzeitstabilität auf dem
markierten Objekt und technische Verarbeitbarkeit. Die Kapseln besitzen
eine Größe und Wandstärke, die
den jeweiligen Anforderungen für
optimale Signalerzeugung und bequeme Markierung des Objekts und
dem speziellen Verwendungszweck angepaßt sind. Die Kapselgröße wird
im allgemeinen in einem Bereich von etwa 1–100 μm liegen. Geeignete Kapseln
mit den speziell gewünschten
Eigenschaften können
von spezialisierten Firmen bezogen werden. In den Kapseln sind signalerzeugende
Komponenten eingeschlossen, die nach Öffnung der Kapseln durch Scherkräfte freigesetzt
werden und ein spezifisches Signal entsprechend den im folgenden
beschriebenen Mechanismen erzeugen. Diese Art der Signalerzeugung
durch mechanische Einwirkung auf das markierte Objekt kann zu verschiedenen
Zwecken eingesetzt werden.
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In einer Ausführungsform wird die Originalität eines
so markierten Objekts auf einfache und unkomplizierte Weise überprüft. Die
mechanischen Scherkräfte
z. B. durch Reiben eines Gegenstand, beispielsweise des Fingernagels
des Prüfers,
auf dem markierten Objekt, beispielsweise einem Etikett, erzeugt,
dienen hier als einfaches, kostenloses und jederzeit verfügbares Prüfmittel.
Ein solches Nachweisverfahren kann zusätzlich oder alternativ zu dem oben
beschriebenen Nachweisverfahren unter Verwendung von menschlichem
Speichel eingesetzt werden. Die diesbezüglich gemachten allgemeinen Ausführungen
zur Herstellung und Verwendung von Mikrokapseln bzw. Mikropartikeln
gelten, soweit nicht speziell auf die Öffnung der Kapseln durch Speichelenzyme
bezogen, grundsätzlich
auch für
das hier angesprochene Verfahren mit mechanisch zu öffnenden
Kapseln. Dies trifft insbesondere auch für die im folgenden beschriebenen
verschiedenen Mechanismen und Systeme der Signalerzeugung zu.
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In einer zweiten Ausführungsform
werden die hier beschriebenen, mechanisch zu öffnenden Kapseln zum Nachweis
der Manipulation eines markierten Originalprodukts eingesetzt.
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Beispielsweise versuchen Fälscher,
Etiketten von gebrauchten Originalprodukten zu entfernen und auf
Nachahmungen aufzubringen. Um dies zu verhindern, können beispielsweise
derartige Kapseln in die Klebstoffmatrix auf der Rückseite
des Etiketts eingebracht werden. Beim Versuch, das Etikett durch Abreißen vom
Originalprodukt zu entfernen, öffnen sich
die Kapseln durch die auftretenden Scherkräfte und ein Signal, z. B. eine
Färbung,
wird erzeugt.
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Bei einer alternativen Vorgehensweise
versuchen Fälscher,
die Etiketten mit Hilfe von Benzin oder anderen, vorzugsweise organischen
Lösungsmitteln
zu entfernen.
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Um eine solche Manipulation nachzuweisen, sollte
das Etikett dabei so verändert
werden, dass es als manipuliert erkannt werden kann. Eine Möglichkeit
hierfür
besteht in der Einführung
von signalerzeugenden Komponenten, beispielsweise Pigmentpartikeln,
in z. B. die Klebstoffmatrix des Etiketts, die unter dem Einfluß von Lösungsmitteln
durch physikalische oder chemische Wechselwirkung ein Signal ergeben. So
können
z. B. in einer Ausführungsform
lipophile Farbstoffe, vorzugsweise als Dispersion, in die Matrix eingebracht
werden. Eine Manipulation zum Zweck des Ablösens des Etiketts führt dazu,
dass sich der Farbstoff in der Matrix löst und so ein Signal verursacht,
welches das Etikett nachweisbar verändert.
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Beispielsweise kann der lipophile
Farbstoff β-Carotin
in Form kleinster Tröpfchen
als Dispersion in die Klebstoffmatrix eingebracht werden. Unter
dem Einfluß lipophiler
Lösungsmittel,
wie beispielsweise Benzin, verteilen sich die in der Dispersion
kaum sichtbaren Tröpfchen
gleichmäßig auf
der gesamten Oberfläche
und erzeugen so eine Färbung,
die das Etikett als manipuliert kennzeichnet. Diese Markierungs-
und Signalerzeugungsverfahren zum Schutz vor Fälschungen und Manipulationen
werden vorzugsweise parallel zu den oben beschriebenen Nachweisverfahren
zur Prüfung
der Originalität
eines Objekts, vorzugsweise unter Verwendung von humanem Speichel
als Prüfmittel,
eingesetzt.
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Im Folgenden werden beispielhaft
verschiedene Systeme und Komponenten zur Signalerzeugung beschrieben.
In der zweiten grundsätzlichen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens
zur Prüfung
der Originalität
eines Objekts unter Verwendung von humanem Speichel ist dabei jeweils
mindestens eine der zur Signalerzeugung erforderlichen Komponenten
durch die Einwirkung von humanem Speichel bzw. von darin enthaltenen
Komponenten, z. B. der obengenannten Speichelenzyme, aus Mikrokapseln
bzw. Mikropartikeln freizusetzen. Die einsetzbaren Systeme und Komponenten,
z. B. Katalysatoren, insbesondere Enzyme, Reaktionspartner, Indikatoren
oder auch das durch die Freisetzung von Komponenten im Medium veränderte Milieu,
sind sehr variabel und können
somit auch eine sehr große
Bandbreite von Signalen erzeugen. Dem entsprechend sind die im Folgenden
erläuterten
speziellen Ausführungsformen
keineswegs als Beschränkung
der Erfindung zu verstehen. Für
einen Fachmann werden geeignete Modifikationen oder Alternativen
der beschriebenen Ausführungsformen unschwer
ersichtlich sein.
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Direkte Signalerzeugung
durch Farbstoffe
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Farbgebende Komponenten, wie z. B.
Farbpigmente u. B. Carotinoide, Azorubin oder Gelborange, oder andere
Pigmente wie Cobaltblau oder Rinmansgrün, werden in Mikrokapseln oder
Mikropartikel eingeschlossen. In den Kapseln bzw. Partikeln liegen
die Farbstoffe in kompakter Form vor, während sie sich nach der Freisetzung relativ
gleichmäßig im Medium
verteilen. Dieses veränderte
Verteilungsmuster liefert ein optisches Signal, das vorzugsweise als
Färbung
auf dem Objekt wahrnehmbar ist.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist die Färbung
von Pigmenten durch die Mikrokapseln oder -partikel ganz oder teilweise
abgeschirmt oder verändert.
Die Freisetzung der Pigmente reduziert diese Abschirmung und führt somit
zu einem optischen Signal.
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Direkte Signalerzeugung
durch Indikatoren
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Substanzen, die als pH-Indikatoren
in bekannten Reaktionen fungieren, werden mikroverkapselt. Bei Freisetzung
des Indikators tritt eine pH-Änderung
ein, die entweder durch den Speichel hervorgerufen wird oder durch
eingebrachte Substanzen, z. B. Salze im umgebenden Medium, z. B.
ein flüssiges Medium
wie Druckerfarbe oder ein Matrixmaterial, vorgegeben ist, und führt so zu
einem Farbumschlag des Indikators. Dabei wird der Indikator z. B.
in neutralem Milieu verkapselt und findet im Medium ein saures oder
basisches Milieu vor, wodurch ein Farbumschlag hervorgerufen wird.
Beispielsweise werden Phenolphthalein oder Lackmus bei definiertem pH-Wert
in neutralem Milieu verkapselt und finden nach der Freisetzung einen
basischen pH-Wert im Medium vor, wodurch ein Farbumschlag nach rot
erfolgt.
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Signalerzeugung
durch anorganische Reaktionen
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Es werden z. B. Salze oder Salzlösungen, also
Ionenlösungen,
in verschiedenen Kapselkollektiven separat verkapselt. Der Begriff
Kapselkollektiv, wie hier verwendet, umfaßt diejenigen gleichartigen Kapseln,
die identisches Material verkapseln. Nach der Freisetzung kommen
Ionen in Kontakt, die präzipitierende,
vorzugsweise farbige, Niederschläge,
farbige Kolloide oder Suspensionen oder farbige Lösungen,
beispielsweise Komplexverbindungen, bilden. Diese farbigen Produkte
werden als optisches Signal auf dem markierten Objekt sichtbar.
Alternativ kann auch eine der Komponenten unverkapselt im umgebenden
Medium vorliegen.
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In einem typischen Beispiel wird
eine Lösung von
rotem Blutlaugensalz (K3[Fe(CN)6)])
und eine Lösung
von Eisen(II)-Salz oder eine Lösung
von gelbem Blutlaugensalz (K4[Fe(CN)6)]) und eine Lösung von Eisen(III)-Salz separat
verkapselt. Nach Öffnung der
Kapseln wird kolloidal gelöstes
Berlinerblau gebildet.
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Es folgen einige weitere, nicht beschränkende Beispiele
für Ionenreaktionen
mit farbigen Reaktionsprodukten, vorzugsweise farbigen Präzipitaten:
S2O3
2+ +
Ag+ → Ag2SO3; Präzipitat:
erst weiß,
dann gelb, schließlich
schwarz
Li+ + FeIO4 → Li2FeIO6; Präzipitat:
weiß/gelb
Ni++/+++ + Na2CO3 → Ni-Carbonat:
Präzipitat
Co++/+++ + Na2CO3 → Co-Carbonat:
bläulich/rötliches Präzipitat
Fe+++ + SCN– → Fe(SCN)3: rotes Präzipitat
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Bei den beispielhaft genannten Umsetzungen
werden jeweils Komponenten verkapselt bzw. in Mikropartikeln eingeschlossen,
die beim Kontakt mit anderen Komponenten zu entsprechenden Präzipitaten
bzw. Reaktionsprodukten führen.
Dabei ist mindestens eine Ionenkomponente verkapselt bzw. in Mikropartikeln
eingeschlossen, während
die andere Ionenkomponente entweder ebenfalls eingeschlossen oder
frei in dem umgebenden Medium vorliegen kann.
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Signalerzeugung
durch organische Reaktionen
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Grundsätzlich sind alle Reaktionen
geeignet, bei denen mindestens zwei Reaktionspartner zur Bildung
farbiger Reaktionsprodukte beitragen und damit zur Signalerzeugung
führen.
Der Begriff „organische
Reaktionen", wie hier verwendet, soll auch Reaktionen einschließen, bei
denen nur ein Reaktionspartner ein organisches Molekül ist. Es
können
wiederum alle Reaktionspartner oder mindestens einer davon in Mikrokapseln
bzw. Mikropartikeln eingeschlossen sein, so dass alle zur signalerzeugenden Reaktion
erforderlichen Komponenten erst nach Freisetzung aus den Mikrokapseln
bzw. Mikropartikeln in Kontakt kommen. Vorzugsweise soll die Reaktion spontan
durch den Kontakt der Reaktionspartner im Medium, also insbesondere
auch ohne erhebliche externe Energiezufuhr, ablaufen.
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Einige spezielle Beispiele für geeignete
organische Reaktionen sind die Bildung von Triphenylmethanfarbstoffen
oder die Bildung von Methylenblau, das aus einer Leukoverbindung
durch eine Redoxreaktion entsteht, oder die Bildung von Azofarbstoffen.
Bevorzugte Beispiele sind die Bildung von Indigoblau aus Indigo
mit Dithionit oder die Diazotierung von Anilin zu Anilingelb.
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Ein Beispiel für die Bildung eines farbigen Komplexes
zwischen einem Metallion und organischen Liganden ist der Ni-Diacetyldioxim-Komplex, der
einen intensiv roten Niederschlag ergibt. Ein weiteres Beispiel
ist die Reaktion vieler Phenole mit Fe(III)chlorid unter Bildung
farbiger Komplexe.
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Eine bevorzugte Gruppe von organischen Reaktionen
sind diejenigen zwischen Elektronenakzeptor-Verbindungen und Elektronendonor-Verbindungen,
die zur Bildung von farbigen Charge-Transfer-Komplexen führen. Als
Elektronendonor bevorzugt sind aromatische und hetero-aromatische
Verbindungen mit elektronenliefernden Substituenten, z. B. aromatische
Amine (Anilin), Alkylbenzole (Friedel-Crafts-Acylierung). Als Elektronenakzeptor
kommen z. B. substituierte Aromaten und Hetero-Aromaten mit elektronenziehenden
Substituenten, z. B. aromatische Ketone, sowie andere organische
oder anorganische elektrophile Verbindungen, z. B. bekannte Lewissäuren, in
Frage (Trimethylboran, Magnesiumionen, Trimethylkationen). Die Bindungspartner für Charge-Transfer-Komplexe
können
auch anorganische oder organische Ionen oder Radikale sein.
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Beispiele für derartige Charge-Transfer-Komplexe
sind die farbigen Addukte von p-Benzochinon und Hydrochinon mit
z. B. Dimethylbenzol oder Trimethylbenzol oder der Komplex, welcher
das Ergebnis der Umsetzung von 3-(Dimethylamino)benzoesäure mit
4-(Dimethylamino)antipyrin in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und
Peroxidase ist (
US 4,321,397 ).
Ein weiteres Beispiel ist die Farbreaktion des nahezu farblosen
Aquokomplexes von Fe
3+ bei Zugabe der entsprechenden
Ionen in geeigneten Konzentrationen zum gelben Chlorokomplex oder
zu den roten Rhodanidkomplexen. Bei Verwendung im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren
liegt mindestens ein Reaktionspartner für das Addukt verkapselt oder
in Mikropartikeln vor.
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Signalerzeugung
durch katalysierte Reaktionen
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Bei dieser Ausführungsform ist die katalytische
Komponente zuerst von den Reaktionspartnern der chromogenen Reaktion
getrennt. Dabei ist es möglich,
entweder nur die katalytische Komponente oder die katalytische Komponente
und einen oder alle Reaktionspartner zu verkapseln bzw. in Mikropartikel
einzuschließen.
Alternativ liegt die katalytische Komponente in der Matrix bzw.
dem Medium vor, während
ein oder mehrere Reaktionspartner verkapselt ist/sind. Die Verkapselung
oder der Einschluß katalytischer
Komponenten erlaubt es, dass der oder die Reaktionspartner bereits
in dem Medium oder der Matrix vorliegen können und die Freisetzung der
katalytischen Komponente die Reaktion in Gang setzt. Da Katalysatoren
häufig
in sehr geringen Mengen wirksam sind, bietet dies den Vorteil, dass
bereits die Freisetzung geringer Mengen an katalytischer Substanz
die chromogene Reaktion auslösen
kann. Dies ist im Sinne einer raschen Reaktion und damit einer raschen
Signalerzeugung sehr günstig.
Ein Beispiel für
eine katalytische Reaktion ist die säurekatalysierte Dimerisierung
bestimmter Ausgangsverbindungen durch Firedel-Crafts-Acylierung.
Dies führt
zur Ausbildung von Zwischenstufen, die katalytisch durch Luftsauerstoff
zur Endstufe des Farbstoffs oxidiert werden.
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Signalerzeugung
durch Enzym-Substrat-Systeme
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Die Signalerzeugung erfolgt vorzugsweise mit
chromogenen Substraten, wobei sich beispielsweise das Enzym in einem
Kapselkollektiv, das Substrat und gegebenenfalls weitere chromogene
Komponenten bzw. Indikatorkomponenten in mindestens einem weiteren
Kapselkollektiv oder im umgebenden Medium befinden. Bei Enzymen,
die aus einem Apoenzym und einem Coenzym aufgebaut sind, kann sich
das Coenzym zusammen mit dem Apoenzym in einem Kapselkollektiv oder
getrennt davon befinden. Im letzteren Falle kann es allein in einem
Kapselkollektiv oder in dem Medium, oder zusammen mit dem Substrat
in einem Kapselkollektiv oder dem Medium vorliegen. Die Spaltung
der Kapseln führt
zum Kontakt der zuvor separaten Komponenten und ermöglicht so
die Reaktionen, die eine Signalerzeugung zur Folge haben.
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Erfindungsgemäß verwendbare Substrate sind
alle chemische Verbindungen, deren enzymatische Umsetzung direkt
zu einem nachweisbaren signalerzeugenden Produkt, z. B. einem farbigen
Produkt, führt
oder deren Umsetzung zu einem primären Produkt führt, das
durch Kombination mit einem Indikatorsystem zu einem signalerzeugenden
sekundären
Produkt führt.
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Solche Substrate sind für viele
gebräuchliche
Enzyme bekannt oder können
nach bekannten Verfahren hergestellt werden. So können beispielsweise
geeignete Substrate von kohlenhydratspezifischen Enzymen, Proteasen,
Nukleasen, Lipasen, Oxidasen, Peroxidasen, Oxidoreduktasen, Transferasen,
Hydrolasen, Lyasen und Kinasen erfindungsgemäß eingesetzt werden. Speziellere,
nicht beschränkende
Beispiele sind Substrate von Amylasen, z. B. α-Amylasen, Oxidasen, z. B. Cholesterinoxidase,
Uricase, Peroxidasen, Phosphatasen, z. B. alkalische Phosphatase,
Galaktosidasen, Glukosidasen, DNAsen, RNAsen, Lysozym, Lactoferrin
etc. Beispiele für
chromogene Substrate sind p-Nitrophenylphosphat, das durch alkalische
Phosphatase in ein gelbes Reaktionsprodukt umgesetzt wird, oder
Tetramethylbenzidin (TMB), das in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid
in ein blaues Reaktionsprodukt umgesetzt wird. Eine grundsätzliche
Vorgehensweise zur Herstellung chromogenen Substrate besteht beispielsweise
darin, an ein größeres Molekül eine latent
chromogene Gruppe zu koppeln, welche durch die enzymatische Reaktion
abgespalten wird und dann ein optisches Signal ergibt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
werden geeignete Substrate für
Speichelenzyme, wie z. B. Amylasen, Peroxidase, Lysozym oder Lactoferrin, gewählt. Dies
bietet den Vorteil, dass die enzymatische Aktivität von humanem
Speichel bzw. von darin enthaltenen Komponenten sowohl die Mikrokapseln/partikel
aufschließen
als auch die signalerzeugende Reaktion starten kann.
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Falls kein primäres Reaktionsprodukt der enzymatischen
Umsetzung ein direkt nachweisbares Signal ergibt, kann das oder
ein Reaktionsprodukt mit Komponenten eines geeigneten Indikatorsystems unter
Bildung eines nachweisbaren, z. B. farbigen oder fluoreszierenden,
sekundären
Produkts umgesetzt werden. Im Stand der Technik sind eine Reihe geeigneter
Indikatorsysteme für
verschiedene bekannte Enzym-Substrat-Systeme bekannt. Entsteht beispielsweise
bei der enzymatischen Reaktion ein Oxidationsmittel, wie z. B. Wasserstoffperoxid,
so kann dieses einen geeigneten Reaktionspartner, z. B. gelbes Blutlaugensalz,
oxidieren, wodurch ein stark gefärbtes
Produkt entsteht. Auf analoge Weise kann auch ein entstandenes Reduktionsmittel
weiter umgesetzt werden. Alternativ kann das oder ein primäres Reaktionsprodukt
als Substrat für
ein zweites Enzym dienen, welches dann ein gefärbtes oder anderweitig nachweisbares
Reaktionsprodukt ergibt. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass
das oder ein Reaktionsprodukt mit einem spezifischen Bindungspartner
umgesetzt wird, der nach der Kopplung ein Signal erzeugen kann.
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Ein spezielles Beispiel für ein erfindungsgemäßes Enzym-Substrat-System
ist die Verkapselung des Enzyms Peroxidase in einem Kapselkollektiv
und von geeigneten Substratkomponenten, vorzugsweise TMB-Fertigsubstrat
(z. B. TMB ONE von Biotrend, Köln,
Deutschland) in einem weiteren Kollektiv. Das TMB-Fertigsubstrat
wird nach einem bekannten Reaktionsmechanismus in ein blaues Endprodukt
umgesetzt.
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Signalerzeugung
durch Kombination von spezifischen Bindungspartnern
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Der Einschluß von mindestens einem von zwei
oder mehr spezifischen Bindungspartnern in Mikrokapseln oder Mikropartikel
führt nach
der Freisetzung zur Bindung und anschließend direkt oder indirekt mit
Hilfe entsprechender Marken zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals.
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Ein Beispiel dafür ist die separate Verkapselung
von zueinander komplementären
einzelsträngigen
Nukleinsäure-Molekülen, z.
B. DNS oder RNS oder Hybride davon, die nach der Freisetzung miteinander
zu einem Doppelstrang hybridisieren, wobei als Folge der Hybridisierung
ein spezifisches Signal erzeugt wird. Dieses Signal kann beispielsweise durch
Interkalation eines Farbstoffes oder Fluoreszenzfarbstoffes, z.
B. Ethidiumbromid, in den Doppelstrang erzeugt werden. Alternativ
können
die Einzelstränge
jeweils mit Markermolekülen
versehen sein, die erst nach der Hybridisierung miteinander in Kontakt
kommen und das Signal erzeugen können.
Solche Marken sind im Stand der Technik bekannt (z. B. erhältlich von
der November AG, Erlangen). Zum Schutz der Nukleinsäure vor
UV-Strahlung können ferner
Hilfsstoffe, z. B. Zinkoxid, eingesetzt werden.
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Ein weiteres Beispiel ist der separate
Einschluß,
vorzugsweise die Verkapselung, von zueinander komplementären Proteinen
oder anderen Molekülen,
z. B. Antigen und Antikörper
oder Rezeptor und Ligand, oder der Einschluß von mindestens einem der
jeweils komplementären
Bindungspartner. Auch hier muß mindestens
ein Bindungspartner mit einem Marker versehen sein, der erst nach
der Vereinigung der Bindungspartner ein Signal ergibt.
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Signalerzeugung
durch Kombination mehrerer Mechanismen
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Die genannten Methoden zur Signalerzeugung
können
auch beliebig miteinander kombiniert werden, wobei Komponenten einzeln
oder gemeinsam in verschiedenen Kapselkollektiven oder Partikelkollektiven
eingeschlossen und freigesetzt werden können. Damit sind auch mehrstufige
Reaktionskaskaden möglich,
so dass mehrere unterschiedliche Signale an derselben Stelle des
markierten Objekts gleichzeitig oder zeitlich versetzt erzeugt werden können und
das entstehende komplexe Signalmuster ausgewertet werden kann. Zusätzlich oder
alternativ ist es auch möglich,
mehrere unterschiedliche Signale an verschiedenen Stellen des Objekts
zu erzeugen. Eine komplexere Signalerzeugung erhöht die Sicherheit vor möglichen
Fälschungen.
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Die folgenden Beispiele sollen das
erfindungsgemäße Nachweisverfahren
näher erläutern.
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BEISPIEL
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Mit Silbernitratlösung (10 mg/ml) gefüllte Stärkekapseln
werden mit einem Volumenanteil von 5 Gewichtsprozent in den Lack
Hydrokett HKP061 von Akzo Nobel eingemischt. Zusätzlich wird eine Natriumchloridlösung (7%-ig)
im Verhältnis
1/10 bis ¼ in
den Lack unverkapselt eingemischt. In Folge wird der Lack mit üblichen
technologischen Verfahren auf die Papieroberfläche in einer Schichtdicke von
mehreren μm
aufgebracht und luftgetrocknet.
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Bei Benetzung mit Speichel diffundiert
dieser in die Lackmatrix und die Kapseln werden geöffnet. Die
freigesetzte Silbernitratlösung
bildet mit den Chlorid-Ionen eine schwarze Färbung, die durch einen Niederschlag
ausgelöst
wird.