DE60216620T2

DE60216620T2 - Biosensoren mit positiver antwort und andere sensoren

Info

Publication number: DE60216620T2
Application number: DE60216620T
Authority: DE
Inventors: E. Keith Pittsburgh LEJEUNE; Markus Pittsburgh ERBELDINGER
Original assignee: Agentase LLC
Current assignee: Agentase LLC
Priority date: 2001-05-07
Filing date: 2002-05-02
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2022-05-03
Also published as: EP1430142A2; AU2002303565B2; US20020182662A1; CA2446965A1; EP1430142A4; US6750033B2; DE60216620D1; EP1430142B1; WO2002090577A2; WO2002090577A3; CA2446965C; ATE347612T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind Sensoren mit positiver Antwort und insbesondere enzymatische Biosensoren, in denen zwei Reaktionsschemen eine positive Antwort liefern.
Es gibt viele Arten von Sensoren, die entwickelt wurden, um die Gegenwart von chemischen Spezies nachzuweisen, beispielsweise auf Oberflächen oder in Lösungen. Derartige Sensoren zeigen Signale, die auf einer großen Vielfalt von chemischen, elektrischen oder physikalischen Antworten beruhen. Viele dieser Sensoren beruhen auf „negativen Antworten". In Sensoren mit negativer Antwort inhibiert oder verzögert der chemische Analyt von Interesse einen chemischen oder physikalischen Prozess, der ansonsten im Sensor bei Abwesenheit des Analyten stattfinden würde. Der Begriff „Sensor mit negativer Antwort" bezeichnet somit allgemein Sensoren, in denen die Gegenwart eines Zielanalyten zur Abwesenheit von oder der Verringerung einer Signaländerung oder einer Signaländerung führt.
Enzymatische Proteine sind insofern bemerkenswerte natürliche Katalysatoren, da sie selektiv viele Reaktionen unter relativ milden Reaktionsbedingungen katalysieren. Enzyme bieten auch die Möglichkeit, stereo- und regioselektive Reaktionen auszuführen, die mit der konventionellen Chemie nicht leicht erzielt werden. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Enzym" allgemein Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren. Diese „Biopolymere" schließen Amid-verknüpfte Aminosäuren ein und haben normalerweise Molekulargewichte von 5 000 oder mehr. Eine Verbindung, für die ein bestimmtes Enzym eine Reaktion katalysiert, wird normalerweise als ein „Substrat" des Enzyms bezeichnet.
Im Allgemeinen werden sechs Klassen oder Arten von Enzymen (wie durch die Art der Reaktion, die katalysiert wird, klassifiziert wird) identifiziert. Enzyme, die Reduktion/Oxidation oder Redoxreaktionen katalysieren, werden allgemein als EC 1 (Enzymklasse 1) Oxidoreduktasen bezeichnet. Enzyme, die die Übertragung von spezifischen Radikalen oder Gruppen katalysieren, werden allgemein als EC 2 Transferasen bezeichnet. Enzyme, die Hydrolyse katalysieren, werden allgemein als EC 3 Hydrolasen bezeichnet. Enzyme, die eine Abspaltung von einem oder eine Addition an ein Substrat von spezifischen chemischen Gruppen katalysieren, werden allgemein als EC 4 Lyasen bezeichnet. Enzyme, die eine Isomerisierung katalysieren, werden allgemein als EC 5 Isomerasen bezeichnet. Enzyme, die eine Verknüpfung oder gemeinsame Bindung von Substrateinheiten katalysieren, werden allgemein als EC 6 Ligasen bezeichnet.
Es ist seit den frühen 1960ern bekannt, dass Enzyme nützliche Werkzeuge zum Nachweisen der Gegenwart von chemischen Spezies sind. Rogers, K. R., Biosensors Bioelectronics, 10, 533 (1995). Es wurde eine Anzahl von enzymatischen Biosensoren entwickelt, um eine Vielzahl von verschiedenen Verbindungen nachzuweisen, einschließlich beispielsweise Glucose, Creatinin, Harnstoff und Cholinesteraseinhibitoren. Parente, A. H., Marques, E. T. Jr., Appl. Biochem. Biotechnol. 37, 3, 267 (1992); Yang, S., Atanasov, P., Wilkins, E., Ann. Biomed. Eng., 23, 6, 833 (1995). U.S.-Pat. Nr. 5 858 186 beschreibt einen Harnstoff-basierten Biosensor, in dem Substrathydrolyse mit einer pH-Elektrode kontrolliert wird. U.S.-Patente Nr. 5 945 343 und 5 958 786 beschreiben Enzym-basierte Polymersensoren, die bei Gegenwart von Ammoniak fluoreszieren, das enzymatisch aus Harnstoff bzw. Creatin gebildet wird. Außerdem beschreibt U.S.-Patent Nr. 4 324 858 die Nutzung von Cholinesterase für den kolorimetrischen Nachweis von Organophosphor-Pestiziden und -Nervenkampfstoffen. Ein ähnliches Patent, U.S.-Patent Nr. 4 525 704, beschreibt die Verwendung von Cholinesterasen und elektrischen Strömen beim Nachweisen von toxischen Gasen.
Im Allgemeinen funktionieren enzymatische Biosensoren durch ein von zwei Verfahren: (1) das wahrnehmende Enzym wandelt eine ansonsten nicht-nachweisbare Verbindung in eine andere oder eine Reihe von Verbindungen um, die durch visuelle, chemische oder elektrische Techniken nachgewiesen werden können; oder (2) das Enzym wird durch die Gegenwart der Verbindung von Interesse inhibiert und die Enzyminhibierung ist mit einer messbaren Quantität verbunden.
Unabhängig von dem Nutzungsverfahren sind die Signale von Enzymbasierten Biosensoren durch die Art der Enzymaktivität häufig bei praktischer Anwendung begrenzt. Nur im Fall von Enzymsubstratnachweis liefert der Sensor in Gegenwart des Zielanalyten eine positive Antwort. Mit anderen Worten zeigt eine wahrnehmbare Veränderung im Sensor die Gegenwart eines Zielanalyten an. Falls der Nachweis von Enzyminhibitoren oder der Nachweis von Substratmangel gewünscht wird, beruhen existierende Ansätze auf negativen Antwortsignalen oder der Abwesenheit oder dem Abfall einer enzymatischen Reaktion, um die Gegenwart von Inhibitoren oder die Abwesenheit von Zielverbindungen anzuzeigen.
Beispielsweise basieren viele gewerblich erhältliche Sensoren für Nervenkampfstoff auf der Inhibierung von Cholinesterasen. Die Gegenwart von Nervenkampfstoffen blockiert die katalystische Seite auf der Cholinesterase, was ihre Fähigkeit, Reaktionen zu katalysieren, ausschaltet. Solch ein Sensor wird durch Aussetzen des wahrnehmenden Enzyms (Cholinesterase) einer bedenklichen Umgebung eingesetzt. Cholinesterasesubstrat wird später angewendet. In Abhängigkeit von dem Substrat oder dem eingesetzten Assay-System kann Cholinesteraseaktivität zu einer pH-Änderung, Farbveränderung oder einem Fluoreszenzsignal führen. In jedem dieser Systeme mit negativer Antwort tritt eine Signaländerung nur bei Abwesenheit vom Analyten (Nervenkampfstoffe) auf. Das Anfangssignal des Sensors ist bei Gegenwart des Analyten unverändert. Kumaran, S. und Morita, M. Talanta, 42, 649 (1995). Campanella, L., Colapicchioni, C., Favero, G., Sammartino, M. P. und Tomassetti, M. Sensors and Actuators B, 33, 25 (1996). Hart, A. L., Collier, W. A. und Janssen, D. Biosensors & Bioelectronics, 12, 545-654 (1997). Cho, Y. A., Lee, H. S., Cha, G. S. und Lee, Y. T. Biosensors & Bioelectronics, 14, 387-390 (1999). Bachmann, T. T. und Schmidt, R. D. Analytica Chimica Acta, 401, 95 (1999). Diaz, A. und Ramos Peinado, M. C. Sensors and Actuators B, 38-39, 426 (1997).
Es ist sehr wünschenswert, Sensoren und ein Messverfahren zu entwickeln, durch die die nicht-intuitive Eigenschaft von Sensoren mit negativer Antwort zu einem intuitiveren System mit positiver Antwort verändert werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Allgemeinen stellt die vorliegende Erfindung Sensoren und Verfahren bereit, in denen die nicht-intuitive Eigenschaft eines früheren Sensors mit negativer Antwort zu einem intuitiveren System mit positiver Antwort verändert wird. Die vorliegende Erfindung ist für die Anwendung in enzymatischen Biosensoren und enzymatischen Biosensing-Verfahren gut geeignet.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Sensor zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, einschließlich eines ersten Reaktionssystems, das mindestens ein erstes Enzym und mindestens ein Substrat für das erste Enzym einschließt. Der Analyt inhibiert die Reaktion des Substrats, die durch das erste Enzym katalysiert wird (mit anderen Worten, der Analyt inhibiert das erste Enzym). Der Sensor schließt weiter mindestens ein zweites Reaktionssystem ein, das bei Inhibierung des ersten Enzyms einen ersten nachweisbaren Zustand erzeugt. In einigen Ausführungsformen kann die Reaktion des ersten Reaktionssystems einen zweiten nachweisbaren Zustand, verschieden vom ersten nachweisbaren Zustand, erzeugen.
In einer Ausführungsform verursacht die Reaktion des ersten Reaktionssystems (das heißt die Reaktion des Substrats, die durch das erste Enzym katalysiert wird) eine pH-Änderung in einer ersten Richtung und die Reaktion des zweiten Reaktionssystems verursacht eine pH-Änderung in einer zweiten Richtung, der ersten Richtung entgegengesetzt. Das erste Enzym kann beispielsweise eine Hydrolase sein, die Hydrolysereaktionen katalysiert, was normalerweise zu einer pH-Änderung führt.
Das zweite Reaktionssystem kann beispielsweise ein zweites Enzym und ein Substrat für das zweite Enzym einschließen. Das zweite Reaktionssytem kann auch eine nichtenzymatische, chemische Reaktion einschließen. Im Fall, dass das zweite Reaktionssystem ein zweites Enzym einschließt, kann das erste Enzym beispielsweise eine Hydrolase sein und das zweite Enzym kann beispielsweise eine andere Hydrolase sein.
Das erste Enzym und/oder das zweite Enzym kann beispielsweise in einem Polymermedium (beispielsweise in einem schwammartigen Polyurethan) immobilisiert sein oder in Lösung sein. Substrate können beispielsweise zum Polymermedium in Lösung oder als ein Pulver gegeben werden.
Der erste nachweisbare Zustand kann beispielsweise eine kolorimetrische Veränderung sein. Wie hierin verwendet, bezeichnet die Formulierung „kolorimetrische Veränderung" im Allgemeinen eine nachweisbare Veränderung der Farbe. Die kolorimetrische Veränderung kann mit dem menschlichen Auge oder mit in der Technik bekannter Instrumentierung nachgewiesen werden.
Wie vorstehend dargelegt, kann die Reaktion des ersten Reaktionssystems einen zweiten nachweisbaren Zustand erzeugen, der vom ersten nachweisbaren Zustand verschieden ist. Beispielsweise kann der erste nachweisbare Zustand aus der Gegenwart eines ersten pH-empfindlichen Farbstoffs, der eine kolorimetrische Veränderung erzeugt, entstehen und der zweite nachweisbare Zustand kann eine kolorimetrische Veränderung, die von der kolorimetrischen Veränderung des ersten nachweisbaren Zustands verschieden ist, darstellen.
In einer weiteren Ausführungsform verursacht die Reaktion des ersten Reaktionssystems eine erste kolorimetrische Veränderung und die Reaktion des zweiten Reaktionssystems verursacht eine zweite kolorimetrische Veränderung. Die zweite kolorimetrische Veränderung ist von der ersten kolorimetrischen Veränderung verschieden.
Weiterhin kann die Reaktion des ersten Reaktionssystems beispielsweise eine pH-Änderung in einer ersten Richtung verursachen und die Reaktion des zweiten Reaktionssystems kann bei Inhibierung des ersten Enzyms eine pH-empfindliche kolorimetrische Veränderung verursachen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Sensor zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, einschließlich eines ersten Reaktionssystems, das mindestens ein erstes Enzym oder mindestens ein Substrat des ersten Enzyms einschließt. In dieser Ausführungsform ist der Analyt ein Substrat für das erste Enzym, falls das erste Reaktionssystem das erste Enzym einschließt, oder der Analyt ist das erste Enzym, falls das erste Reaktionssytem ein Substrat des ersten Enzyms einschließt. Der Sensor schließt auch mindestens ein zweites Reaktionssystem ein, das reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen, wenn der Analyt unterhalb einer bestimmten Konzentration liegt. Der Sensor stellt somit eine positive oder nachweisbare Antwort bereit, wenn der Analyt abwesend ist oder unzureichend vorliegt. Noch einmal, die enzymatisch katalysierte Reaktion des ersten Reaktionssystems kann einen zweiten nachweisbaren Zustand, verschieden vom ersten nachweisbaren Zustand, erzeugen.
In einer Ausführungsform verursacht die Reaktion, die durch das erste Enzym katalysiert wird, eine pH-Änderung in einer ersten Richtung und die Reaktion des zweiten Reaktionssystems verursacht eine pH-Änderung in einer zweiten Richtung, der ersten Richtung entgegengesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform entsteht der erste nachweisbare Zustand aus der Gegenwart eines ersten pH-empfindlichen Farbstoffs, der eine kolorimetrische Veränderung erzeugt, und der zweite nachweisbare Zustand ist eine kolorimetrische Veränderung, die von der kolorimetrischen Veränderung des ersten nachweisbaren Zustands verschieden ist.
In einer noch weiteren Ausführungsform verursacht die Reaktion des ersten Reaktionssystems eine pH-Änderung in einer ersten Richtung und die Reaktion des zweiten Reaktionssystems verursacht eine pH-empfindliche kolorimetrische Veränderung, wenn der Analyt unterhalb einer bestimmten Konzentration liegt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, das die folgenden Schritte einschließt: Bereitstellen eines ersten Reaktionssystems, einschließlich eines ersten Enzyms und eines Substrats für das erste Enzym, wobei der Analyt das erste Enzym inhibiert; und Bereitstellen von mindestens einem zweiten Reaktionssystem, das bei Inhibierung des ersten Enzyms reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, das den folgenden Schritt einschließt: Bereitstellen eines ersten Reaktionssystems, einschließlich eines ersten Enzyms oder eines Substrats des ersten Enzyms. Der Analyt ist ein Substrat für das erste Enzym, falls das erste Reaktionssytem das erste Enzym einschließt. Der Analyt ist das erste Enzym, falls das erste Reaktionssytem ein Substrat des ersten Enzyms einschließt. Das Verfahren schließt auch den Schritt des Bereitstellens von mindestens einem zweiten Reaktionssystem ein, das reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen, wenn der Analyt unterhalb einer bestimmten Konzentration liegt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit Sensoren und Verfahren zum Nachweis der Gegenart eines Enzyminhibitors oder eines Substratmangels (oder -abwesenheit) mit einem positiven Signal in Form von beispielsweise einer Änderung des pH oder Veränderung der Farbe bereit. Eine Änderung des pH kann durch Verwendung von pH-Farbstoffen, elektrischer Ausrüstung, Elektroden oder speziellen Geräten sichtbar gemacht werden. Noch einmal, Farbveränderungen können entweder innerhalb oder außerhalb des sichtbaren Bereichs liegen, durch das bloße Auge oder durch optische Instrumente nachweisbar sein. Die vorliegende Erfindung stellt Sensoren für die und Verfahren zur Kontrolle der Abwesenheit einer enzymatischen Reaktion als ein Ergebnis der Gegenwart eines Inhibitors oder eines Substratmangels (oder -abwesenheit) durch beispielsweise Kombinieren eines wahrnehmenden Enzyms mit der Verwendung eines zusätzlichen Enzym/Substrat-Paars oder einer zusätzlichen kolorimetrischen chemischen Reaktion bereit.
Die Sensoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung können mit einer Vielzahl von wahrnehmenden Enzymen eingesetzt werden. Wie vorstehend diskutiert, schließen mehrere bevorzugte Ausführungsformen Hydrolase-Enzyme wie beispielsweise solche ein, wie Lipasen, Phosphatasen, Amylasen, Cellulasen, Proteasen, Peptidasen, Ureasen und Deaminasen. Während der Katalyse der Substrathydrolyse verursacht jedes dieser Hydrolase-Enzyme im Allgemeinen ein entsprechendes Signal, das beispielsweise eine pH-Änderung, die Bildung von kalorimetrischen Produkten oder eine Kombination von beiden sein kann. In mehreren Ausführungsformen sind die wahrnehmenden Enzym(e) mit einer zweiten Enzym- Substrat-Kombination oder einer kolorimetrischen chemischen Reaktion gepaart. Die Wahl einer zweiten Reaktion kann beispielsweise von dem/den Hydrolyseprodukt(en) des ersten Enzyms, im Fall einer Hydrolase, abhängen. Beispielsweise kann, zum Ausgleich der Erzeugung von Hydroxyl- oder Hydroniumionen durch das erste oder wahrnehmende Enzym, die zweite Reaktion Hydronium- bzw. Hydroxylionen liefern. Bei Abwesenheit der ersten Enzymaktivität erzeugt die zweite Reaktion einen Überschuss von entweder Hydroxyl- oder Hydroniumionen, was zu einer nachweisbaren pH-Änderung führt.
Das erste oder wahrnehmende Enzym ist jedoch nicht auf Hydrolasen beschränkt. Diesbezüglich sind andere Enzymklassen, einschließlich, doch nicht auf diese begrenzt, Oxidoreduktasen und Transferasen, unter Verwendung von beispielsweise der Bildung von kolorimetrischen Produkten geeignet. Beispielsweise ist das Enzym Peroxidase in Kombination mit dem kolorimetrischen Substrat Dianisidin geeignet, um die Gegenwart von Peroxid anzuzeigen.
Zum Ausgleich der Erzeugung von kolorimetrischen Produkten durch das wahrnehmende Enzym kann eine zweite Reaktion beispielsweise eine andere Farbe liefern, die in der Lage ist, das gesamte Sensorsignal zu einer dritten Farbe zu ändern. Bei Abwesenheit der Aktivität des wahrnehmenden Enzyms zeigt das Sensorsignal die Farbe dieser zweiten Reaktion an. Wenn beispielsweise eine Reaktion eines wahrnehmenden Enzyms zu einem blauen Produkt führt, kann eine zweite Reaktion, die ein gelbes Produkt liefert, verwendet werden. Die Kombination der beiden Reaktionen liefert eine grüne Farbe, während der Sensor bei Abwesenheit der Aktivität des wahrnehmenden Enzyms nur eine gelbe Farbe erzeugt.
Während die Nutzung von Enzymen in Messanwendungen alltäglich geworden ist, verbessern die Sensoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung das Signal derartiger Biosensoren dramatisch. Es gibt unzählige denkbare Messanwendungen, worin der Sensoranalyt keine oder verringerte Enzymaktivität erzeugt. Bei Anwendungen, wie zum Beispiel beim Wahrnehmen von Enzyminhibitoren oder des Mangels von Zielverbindungen, ist ein Signal mit der existierenden Biosensor-Technologie allgemein nicht erzielbar. Definitionsgemäß liegt bei Gegenwart von Inhibitoren oder bei Mangel der Zielverbindungen entweder keine oder verringerte Enzymaktivität vor. Die Umwandlung derartiger negativer Antworten in eine viel informativere und intuitivere positive Antwort ist eine wesentliche Verbesserung der Technik.
Obgleich die Sensoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in Verbindung mit enzymatischen Reaktionssystemen gut geeignet sind, gelten die gleichen Prinzipien auch für nichtenzymatische Reaktionssysteme. Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt einen Sensor zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, einschließlich eines ersten Reaktionssystems, das durch die Gegenwart des Analyten inhibiert wird (das heißt unreaktiv gemacht oder in der Reaktivität reduziert wird). Die erste Reaktion kann beispielsweise zwei Verbindungen (oder eine oder mehr Verbindungen und einen nichtenzymatischen Katalysator) einschließen, die bei Abwesenheit des Analyten reagieren, doch die Reaktion davon wird durch die Gegenwart des Analyten eingeschränkt oder verhindert. Beispielsweise kann der Analyt ein Gift für einen Katalysator, der im ersten Reaktionssytem vorliegt, sein. Der Sensor schließt auch mindestens ein zweites Reaktionssytem ein, das bei Inhibierung des ersten Reaktionssystems reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Sensor zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, einschließlich eines ersten Reaktionssystems, das eine erste Verbindung einschließt, die mit dem Analyten reagiert, und mindestens eines zweiten Reaktionssystems, das reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen, wenn der Analyt unterhalb einer bestimmten Konzentration liegt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, das die folgenden Schritte einschließt: Bereitstellen eines ersten Reaktionssystems, das durch die Gegenwart des Analyten inhibiert wird; und Bereitstellen von mindestens einem zweiten Reaktionssystem, das bei Inhibierung des ersten Reaktionssystems reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung bereit, das die folgenden Schritte einschließt: Bereitstellen eines ersten Reaktionssystems, einschließlich einer ersten Verbindung, wobei der Analyt mit der ersten Verbindung reagiert; und Bereitstellen von mindestens einem zweiten Reaktionssystem, das reagiert, um einen ersten nachweisbaren Zustand zu erzeugen, wenn der Analyt unterhalb einer bestimmten Konzentration liegt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt Reaktionsschemen einer Ausführungsform von einem Sensor der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Nervenkampfstoffen dar.
2 stellt zusätzliche Reaktionsschemen dar, die für die Erzeugung von basischen Bedingungen geeignet sind.
3 stellt Beispiele von enzymatischen Reaktionen dar, die kalorimetrische Produkte liefern.
4 stellt ein Beispiel eines enzymatischen Biosensors mit positiver Antwort dar, der eine zusätzliche, nichtenzymatische chemische Reaktion einschließt.
5 stellt Reaktionsschemen eines Beispiels vom Nachweisen von Nervenkampfstoffen mit einer zusätzlichen Reaktion, um eine Farbveränderung auf zwei Wegen zu erzeugen, dar.
6 stellt Untersuchungen des Nachweises von Nervenkampfstoffen in löslichen Systemen dar (worin ausgefüllte Kreise Untersuchungen mit vorliegendem DFP repräsentieren und unausgefüllte Dreiecke Kontrolluntersuchungen ohne vorliegenden Stoff repräsentieren).
7 stellt den Farbzustand von Kresol Rot, Urease und Butyrylcholinesterase, die Polyurethan-Copolymere enthalten, 5 Minuten nach Abwischen von Kontroll- und kontaminierten Oberflächen dar.
8 stellt die pH-abhängige Farbe von Polymeren, die den Farbstoff Kresol Rot enthalten, dar.
9 stellt numerische Daten von einem analytischen Festkörper-Spektrophotometergerät nach Oberflächenanwendung eines Biosensors mit positiver Antwort der vorliegenden Erfindung dar (worin die Quadrate Untersuchungen mit 1,0 μg/cm² DFP repräsentieren und die Kreise Kontrolluntersuchungen ohne vorliegendes DFP repräsentieren).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung sind hierin zusammen mit einem enzymatischen Biosensor zum Nachweis von Nervenkampfstoffen diskutiert. Beim Nachweis von Nervenkampfstoffen ist ein Biosensor mit positivem Antwortsignal viel intuitiver als ein Sensor mit negativer Antwort. Ein Sensor mit positiver Antwort liefert bei Gegenwart von Kontamination ein sich änderndes Signal. Tabelle 1 vergleicht die Antworten von existierender Biosensor-Technologie mit der vorliegenden Erfindung.
Tabelle 1. Antworten von existierenden Biosensoren und der vorliegenden Erfindung
Die Sensoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung gehen die Unzulänglichkeit von enzymatischen Biosensoren mit negativer Antwort an. Beispielsweise verbessert die vorliegende Erfindung in den Fällen von Inhibitornachweis oder des Nachweises von Verbindung/Substrat-Mangel frühere Sensoren und Verfahren durch Bereitstellen eines positiven Signals, selbst bei Abwesenheit einer enzymatischen Reaktion, wesentlich (Tabelle 1).
Tabelle 2 legt mehrere nicht-erschöpfende Kombinationen von Reaktionsprodukten dar, die geeignet sind, einen enzymatischen Biosensor mit positiver Antwort aus einem System zu erhalten, das ansonsten nur eine negative Antwort bereitstellen würde. Aufgrund der Vielzahl von beispielsweise Hydrolase-Enzymen und kalorimetrischen Reaktionen, gibt es im Wesentlichen unbeschränkte mögliche Kombinationen. Die Enzyme und kalorimetrischen Substrate können löslich oder immobilisiert sein. Die Immobilisierung von Enzymen in Polymermedien ist beispielsweise im U.S.-Patent Nr. 6 291 200 offenbart und auf den Rechtsnachfolger der vorliegenden Erfindung übertragen. Das Enzym/Die Enzyme (von beispielsweise des ersten Reaktionssytems und/oder des zweiten Reaktionssystems) kann/können beispielsweise innerhalb eines Polymermediums gefangen sein oder an ein Polymermedium gebunden sein. Unter Verwendung von pH-empfindlichen Farbstoffen kann man auch eine enzymatische Hydrolysereaktion, die entweder Hydroxyl- oder Hydroniumionen liefert (dabei den pH ändert), mit einer kalorimetrischen Reaktion kombinieren (das heißt Kombination der Zeilen 1 oder 2 mit Zeile 3 von Tabelle 2).
Tabelle 2 Reaktionsprodukte, die zum Erhalten eines enzymatischen Biosensors mit positiver Antwort möglich sind
In mehreren Ausführungsformen bedingt die vorliegende Erfindung allgemein den Einschluss eines zweiten Enzym-Substrat-Paars oder einer zweiten chemischen Reaktion, zusätzlich zum wahrnehmenden Enzym (oder wahrnehmenden Substrats), um gewöhnlich negative Antwortsignale von Enzymbiosensoren in positive Antwortsignale umzuwandeln. Zur Charakterisierung dieser Erfindung wurden mehrere repräsentative Reaktionen, die zum Einschluss in einem existierenden enzymatischen Biosensor geeignet sind, beschrieben.
1 stellt Reaktionsschemen einer Ausführungsform von einem Sensor der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Nervenkampfstoffen dar, wie nachstehend in weiterem Detail diskutiert ist.
2 stellt zusätzliche Beispiele von Reaktionsschemen zur Erzeugung von Base dar, die zur Verwendung in den enzymatischen Biosensoren mit positiver Antwort der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
3 stellt Beispiele von enzymatischen Reaktionen dar, die kalorimetrische Produkte liefern, die zur Verwendung in den enzymatischen Biosensoren mit positiver Antwort der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
4 stellt enzymatische Biosensoren mit positiver Antwort der vorliegenden Erfindung dar, einschließlich einer nichtenzymatischen, zusätzlichen chemischen Reaktion. Das Messschema von 4 kann beim Nachweis eines Asparaginase-Inhibitors verwendet werden. Ein ähnlicher Ansatz ist mit jedwedem anderen wahrnehmenden Enzym, das ein basisches Produkt liefert, möglich. Der Sensor liefert bei Abwesenheit von enzymatischer Aktivität durch das wahrnehmende Enzym (in diesem Fall Asparaginase) ein violettes Signal.
Zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung wurde der enzymatische Nachweis von Diisopropylfluorphosphat (DFP) durch Butyrylcholinesterase (BChE) untersucht. Infolge von strukturellen Ähnlichkeiten kann DFP als ein ausgezeichnetes Modell für Nervenkampfstoffe, wie zum Beispiel Sarin und Soman, mit weniger Toxizität betrachtet werden. Simonian, A. L., diSioudi, B. D. und Wild, J. R. Analytica Chimica Acta, 389, 189 (1999). Ein typischer, derzeit erhältlicher Sensor zum Nachweis von Nervenkampfstoffen schließt Cholinesterase gepaart mit ihrem entsprechenden Substrat, ein. Wenn Nervenkampfstoffe vorliegen, wird Cholinesterase inhibiert und daher ist die Entwicklung eines Signals verzögert oder nicht vorhanden. Nur bei Abwesenheit von Nervenkampfstoffen tritt die enzymatisch katalysierte Reaktion des Substrats auf. In der vorliegenden Erfindung wird ein zweites Enzym, wie zum Beispiel Urease, zu einem Butyrylcholinesterase-basierten Sensor gegeben. Die Hydroxidionen, die bei der Bildung von Ammonium während der Hydrolyse von Harnstoff entstehen, neutralisieren die Protonen, die während der Hydrolyse des Substrats von Cholinesterase (Butyrylcholin) erzeugt wurden. Wenn Nervenkampfstoffe abwesend sind, sind beide enzymatischen Systeme (siehe 1) aktiv und es tritt keine pH-Änderung auf. Wenn ein Stoff vorliegt, werden die Hydroxidionen, die bei der Hydrolyse von Harnstoff entstehen, nicht neutralisiert, da Butyrylcholinesterase inhibiert ist. Dann steigt der pH des Sensors an, was zu einem positiven Signal führt.
Zur weiteren Verbesserung des Signals ist es möglich, eine zusätzliche chromatische Reaktion einzuschließen, um eine Farbveränderung auf zwei Wegen zu erzielen. Diese Farbveränderung auf zwei Wegen ermöglicht eine positive Antwort mit zwei verschiedenen Farben im Fall der Gegenwart von Nervenkampfstoff und im Fall der Abwesenheit von Nervenkampfstoff. Das in 5 dargestellte Reaktionsschema legt solch eine Farbveränderung auf zwei Wegen beim Nachweis von Nervenkampfstoffen dar. Im Fall, dass Nervenkampfstoffe vorliegen, verändert sich die Farbe vom ursprünglichen Gelb zum Rot infolge der Inhibierung von Cholinesterase, wie vorstehend beschrieben ist. Im Fall einer sauberen Oberfläche (das heißt der Abwesenheit von Nervenkampfstoffen) verändert sich die Farbe jedoch von gelb zu grün infolge der zusätzlichen chromatischen Reaktion, was zu einem selbsterklärenden Signal für sowohl die kontaminierte als auch die saubere Oberfläche führt.
Die Daten der Untersuchungen der vorliegenden Erfindung zeigen an, dass der positive Nachweis von kleinen Mengen Enzyminhibitor bei Verwendung der neuartigen Sensoren und Verfahren der vorliegenden Erfindung möglich ist. Die experimentellen Untersuchungen zeigen auch an, dass die Reaktionssysteme der vorliegenden Erfindung mit Sensoren in entweder immobilisierten oder löslichen Zuständen genutzt werden können.
EXPERIMENTELLE METHODEN
Beispiel 1. Nutzen eines Biosensors mit positiver Antwort beim Nachweis von DFP unter Verwendung von löslicher BChE und Urease.
In enzymatischen Biosensoren mit positiver Antwort der vorliegenden Erfindung, einschließlich löslicher BChE (0,14 mg pro ml Substratlösung) und Urease (0,02 mg pro ml Substratlösung), neutralisieren die Hydroxidionen, die bei der Harnstoff-Hydrolyse (50 mM) entstehen, die Protonen, die während der Butyrylcholin-Hydrolyse (100 mM) erzeugt werden. Der pH stabilisiert sich bei Abwesenheit von DFP bei einem Wert von ungefähr 6,6, was zu keiner Signaländerung führt (siehe 6.). Wenn DFP vorliegt, werden die Hydroxidionen, die bei der Harnstoff-Hydrolyse entstehen, nicht neutralisiert und der pH steigt an, was ein positives Signal auslöst.
Beispiel 2. Herstellung und Messanwendung von biokatalytischen Polymeren
BChE aus Pferdeserum und Urease aus Jackbohnen wurden unter Verwendung eines Verfahrens polymerisiert, das ähnlich dem ist, das zuvor in Folgenden beschrieben wurde: LeJeune, K. E., Mesiano, A. J., Bower, S. B., Grimsley, J. K., Wild, J. R. und Russell, A. J. Biotechnol. Bioeng. 54, 105 (1997). LeJeune, K. E. und Russell, A. J. Biotechnol. Bioeng. 51, 450 (1996), deren Offenbarungen hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind. Hypol 3000 Polyurethan-Präpolymer (4 g) und Enzym-Puffer-Lösung (4 ml) wurden für 20 Sekunden mit einem ruderförmigen Mischerkopf bei 2500 rpm gerührt. Die wässrige Phase enthielt 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 1 % (w/w) F68 oberflächenaktives Mittel, 0,2 % (w/w) Kresol Rot – pH-Farbstoff und Enzyme. Die Polymerisation war in wenigen Minuten abgeschlossen und das Biopolymer konnte nach einer Trocknungsdauer von 24 h in Messanwendungen genutzt werden.
Glasoberflächen (70 cm²) wurden mit DFP kontaminiert (10 mg/m²). Kontrollexperimente wurden mit sauberen Oberflächen ausgeführt. Dann wurde eine Lösung aus Butyrylcholin und Harnstoff (1 ml von 100 mM bzw. 50 mM) zu den Biopolymer-Schwammscheiben 100 und 100a gegeben (siehe 7), bevor diese verwendet wurden, um die Polymerscheiben 100 und 100a gleichmäßig abzuwischen.
Innerhalb von 2 Minuten nach dem Abwischen der kontaminierten Oberflächen wurde eine Farbveränderung von gelb zu rot in Polymerscheibe 100a beobachtet, während Polymerscheibe 100 nach dem Abwischen der sauberen (das heißt nicht mit DFP kontaminierten) Kontrolloberflächen gelb blieb. Das Signal repräsentiert eine positive Antwort ohne Farbveränderung nach dem Abwischen der sauberen Oberfläche und ein positives Signal in Form von roter Farbe nach dem Abwischen der kontaminierten Oberfläche. 7 stellt das Sensorsignal 5 Minuten nach der Anwendung dar, wie durch den Zähler 120 bestimmt wurde. Existierende Cholinesterase-Messtechnologie würde erst nach dem Abwischen der sauberen Oberfläche eine Farbveränderung anzeigen. Die negative Antwort von existierenden Sensoren zeigt vollständige enzymatische Aktivität und keine Inhibierung an.
Beispiel 3. Farbabhängigkeit von pH-empfindlichen Farbstoffen, die Polymere enthalten
Unter Nutzung der vorstehend erwähnten Methoden zur Polymersynthese wurden den Farbstoff Kresol Rot enthaltende Polymerschwammscheiben 200a-200d mit einem Farbstoffgehalt von 2 mg Farbstoff/g trockenem Polymer synthetisiert. 8 stellt die entstandenen wirklichen Unterschiede in der physikalischen Eigenschaft dar, wenn die Polymerscheiben 200a-200d in wässrigen Lösungen von variierendem pH inkubiert wurden. Die Farben der Proben reichten von knallgelb bei pH 7,0 bis rot bei pH 10,0.
Beispiel 4. Nutzen des Biosensors mit positiver Antwort beim Nachweis von DFP unter Verwendung von BChE und Urease, die in Polyurethan immobilisiert sind
Der enzymatische Biosensor mit positiver Antwort mit immobilisierter BChE, Urease und einem pH-empfindlichen Farbstoff (Kresol Rot) funktionierte im Allgemeinen nach dem gleichen Prinzip wie vorstehend beschrieben. Hydroxidionen, die bei der Bildung von Ammoniak entstehen, neutralisierten jedwede Protonen, die während der Hydrolyse von Butyrylcholin erzeugt wurden. Es wurde keine Farbveränderung vom ursprünglichen Gelb infolge von stabilisiertem pH beobachtet, wenn beide Enzyme aktiv sind. In Gegenwart von DFP wird BChE jedoch maßgeblich inhibiert, während Urease aktiv bleibt. Es werden nur Hydroxidionen erzeugt und der pH steigt entsprechend an. Ein ansteigender pH führt zu einer Farbveränderung von eingeschlossenem Farbstoff und der Sensor verändert sich von gelb zu rot. Die Farbveränderung wird leicht durch das bloße Auge erkannt. Jedoch um jegliche Subjektivität aus den experimentellen Methoden zu beseitigen, wurde ein Minolta CM-500d Festphasen-Festkörper-Spektrophotometer verwendet, um die Farbveränderung des Sensors zu kontrollieren. Diese Einheit verwendet ein dreidimensionales Farb-Koordinatensystem (L·a·b), um Farben und Intensität zu definieren. Das Biopolymer, das Kresol Rot enthält, entwickelt eine gelbe Farbe, wenn der pH unterhalb von 7,0 liegt und verändert sich zu rot bei einem pH um 8,8. Jede kinetische Reaktion wurde zweifach ausgeführt (siehe 9). Es wird deutlich, dass eine positive Antwort in Gegenwart von DFP, einem starken Inhibitor des die Cholinesterase wahrnehmenden Enzyms, das in dieser Sensorkonstruktion verwendet wurde, beobachtet wurde.

Claims

Sensor zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung, wobei der Sensor Folgendes umfasst: ein erstes Reaktionssystem; einschließlich eines ersten Enzyms und eines Substrats für das erste Enzym, wobei der Analyt das erste Enzym inhibiert; und mindestens ein zweites Reaktionssystem, das bei Inhibierung des ersten Enzyms einen ersten nachweisbaren Zustand erzeugt.
Sensor nach Anspruch 1, worin die Reaktion des ersten Reaktionssystems einen zweiten nachweisbaren Zustand, verschieden vom ersten nachweisbaren Zustand, erzeugt.
Sensor nach Anspruch 1 oder 2, worin die Reaktion des ersten Reaktionssystems eine pH-Änderung in einer ersten Richtung verursacht und die Reaktion des zweiten Reaktionssystems eine pH-Änderung in einer zweiten Richtung, der ersten Richtung entgegengesetzt, verursacht.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das erste Enzym eine Hydrolase ist.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das zweite Reaktionssytem ein zweites Enzym und ein Substrat für das zweite Enzym umfasst.
Sensor nach Anspruch 5, worin das erste Enzym eine Hydrolase ist und das zweite Enzym eine andere Hydrolase ist.
Sensor nach Anspruch 2 oder 3, worin der erste nachweisbare Zustand aus der Gegenwart eines ersten pH-empfindlichen Farbstoffs, der eine kolorimetrische Veränderung erzeugt, entsteht und der zweite nachweisbare Zustand eine kolorimetrische Veränderung, die von der kolorimetrischen Veränderung des ersten nachweisbaren Zustands verschieden ist, darstellt.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5, worin das erste Enzym eine Cholinesterase ist.
Sensor nach Anspruch 8, worin der Analyt ein Nervenkampfstoff ist.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Analyt eine toxische Chemikalie ist.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das erste Enzym in einem Polymermedium immobilisiert ist.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das erste Enzym in einem Polymermedium immobilisiert ist, das zweite Reaktionssystem ein zweites Enzym einschließt und das zweite Enzym in dem Polymermedium immobilisiert ist.
Sensor nach Anspruch 5, worin das erste und das zweite Enzym Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen oder Ligasen sind.
Verfahren zum Nachweisen eines Analyten in einer Umgebung, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen eines ersten Reaktionssystems, einschließlich eines ersten Enzyms und eines Substrats für das erste Enzym, wobei der Analyt das erste Enzym inhibiert; Bereitstellen von mindestens einem zweiten Reaktionssystem, das bei Inhibierung des ersten Enzyms einen ersten nachweisbaren Zustand erzeugt; und Nachweisen des ersten nachweisbaren Zustands.