DE69231950T2 - Gasgefüllte liposome als ultraschall-kontrastmittel - Google Patents

Gasgefüllte liposome als ultraschall-kontrastmittel

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Description

  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Ultraschall-Bildgebung und insbesondere gasgefüllte Liposomen, die unter Verwendung von Verfahren der Vakuumtrocknung- Gaseintröpfelung bzw. -Gaseinträufelung (engl. "vacuum drying gas instillation") hergestellt werden, und gasgefüllte Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung derartiger Liposomen und Verfahren zum Einsatz derartiger Liposomen in Anwendungen der Ultraschall-Bildgebung.
  • Es gibt ein breite Anzahl von Bildgebungstechniken, die zum Nachweis und zur Diagnose von Krankheiten in Tieren und Menschen verwendet worden sind. Eine der ersten verwendeten Techniken zur diagnostischen Bildgebung waren Röntgenstrahlen. Die durch diese Technik erhaltenen Bilder spiegeln die Elektronendichte des abgebildeten Objekts wider. Es sind Kontrastmittel, wie Barium oder 10d, über Jahre hinweg verwendet worden, um Röntgenstrahlen derart abzuschwächen oder zu blockieren, dass der Kontrast zwischen verschiedenen Strukturen erhöht wird. Beispielsweise wird Barium für gastrointestinale Untersuchungen verwendet, um das Darmlumen zu definieren und die Schleimhautoberflächen des Darms sichtbar zu machen. Iodierte Kontrastmittel werden intravaskulär verwendet, um die Arterien in einem als Angiographie bezeichneten Verfahren mit Röntgenstrahlen sichtbar zu machen. Es ist jedoch bekannt, dass Röntgenstrahlen einigermaßen gefährlich sind, da die bei Röntgenstrahlen eingesetzte Strahlung ionisierend ist und die verschiedenen schädlichen Auswirkungen von ionisierender Strahlung kumulativ sind.
  • Die magnetische Resonanz-Bildgebung (MRI) ist eine weitere wichtige Bildgebungstechnik, jedoch weist diese Technik verschiedene Nachteile, wie hohe Unkosten, und die Tatsache, dass sie nicht als mobile Untersuchung durchgeführt werden kann, auf. Außerdem ist die MRI in vielen medizinischen Zentren nicht verfügbar.
  • Radionuklide, die in der Nuklearmedizin eingesetzt werden, stellen eine weitere Bildgebungstechnik bereit. Beim Einsatz dieser Technik werden Radionuklide, wie Technetium-markierte Verbindungen, in einen Patienten injiziert, und es werden Bilder durch Gamma-Kameras erhalten. Nuklearmedizinische Techniken leiden jedoch an einer schlechten räumlichen Auflösung und setzen das Tier oder den Patienten den schädlichen Auswirkungen von Strahlung aus. Des weiteren gibt es das Problem mit der Handhabung und der Entsorgung von Radionukliden.
  • Der Ultraschall, noch eine weitere diagnostische Bildgebungstechnik, ist der Nuklearmedizin und den Röntgenstrahlen dahingehend unähnlich, dass es den Patienten nicht den nachteiligen Auswirkungen von ionisierender Strahlung aussetzt. Darüber hinaus ist im Gegensatz zur magnetischen Resonanz-Bildgebung, dem Ultraschall vergleichsweise kostengünstig und kann als mobile Untersuchung durchgeführt werden. Bei der Verwendung der Ultraschalltechnik wird Schall in einen Patienten über einen Schallgeber übertragen. Wenn sich die Schallwellen im Körper ausbreiten, treffen sie auf Grenzflächen von Geweben und Fluiden. In Abhängigkeit von den akustischen Eigenschaften der Gewebe und Fluide im Körper werden die Ultraschall-Schallwellen teilweise oder vollständig reflektiert oder absorbiert. Wenn Schallwellen von einer Grenzfläche reflektiert werden, werden sie vom Empfänger im Schallgeber detektiert und zur Erzeugung eines Bildes verarbeitet. Die akustischen Eigenschaften der Gewebe und Fluide im Körper bestimmen den Kontrast, der im resultierenden Bild auftritt.
  • Es sind in den letzten Jahren in der Ultraschalltechnologie Fortschritte erzielt worden. Trotz dieser verschiedenen technologischen Verbesserungen ist der Ultraschall hinsichtlich einer Anzahl von Gesichtspunkten noch ein unvollkommenes Werkzeug, insbesondere hinsichtlich der Bildgebung und dem Nachweis von Krankheiten in der Leber und der Milz, den Nieren, dem Herzen und dem Gefäßsystem, einschließlich der Messung des Blutflusses. Die Befähigung, diese Gegenstände nachzuweisen und zu messen, hängt von der Differenz der akustischen Eigenschaften zwischen Geweben oder Fluiden und den umgebenden Geweben oder Fluiden ab. Daraus resultierend sind Kontrastmittel gesucht worden, welche die akustischen Differenzen zwischen Geweben oder Fluiden und den umgebenden Geweben und Fluiden erhöhen, um die Bildgebung und den Krankheitsnachweis durch Ultraschall zu verbessern.
  • Die der Erzeugung des Bildes beim Ultraschall zugrundeliegenden Prinzipien haben Forscher zum Studium von gasförmigen Kontrastmitteln geführt. Die Veränderungen der akustischen Eigenschaften oder der Schallimpedanz sind am ausgeprägtesten bei Grenzflächen zwischen unterschiedlichen Substanzen mit stark differierender Dichte oder Schallimpedanz, insbesondere bei Grenzflächen zwischen Feststoffen, Flüssigkeiten und Gasen. Wenn Ultraschall-Schallwellen auf derartige Grenzflächen treffen, ergeben die Änderungen der Schallimpedanz eine stärkere Reflexion von Schallwellen und ein stärkeres Signal im Ultraschallbild. Ein weiterer, die Effizienz oder Reflexion von Schall beeinflussender Faktor ist die Elastizität der reflektierenden Grenzfläche. Je größer die Elastizität dieser Grenzfläche ist, desto effizienter ist die Reflexion des Schalls. Substanzen, wie Gasbläschen, stellen hochelastische Grenzflächen dar. Daher haben sich als Ergebnis der vorstehenden Prinzipien die Forscher auf die Entwicklung von Ultraschall-Kontrastmitteln, die auf Gasbläschen oder gashaltigen Körpern beruhen, konzentriert. Jedoch, trotz der theoretischen Gründe, warum derartige Kontrastmittel wirksam sein sollten, sind die diagnostischen Ergebnisse bis jetzt etwas enttäuschend gewesen.
  • WO 91/15244, welche gemäß Artikel 54(3) EPÜ zum Stand der Technik gehört, beschreibt stabile Mikrobläschensuspensionen, die als bildgebende Kontrastmittel in der Ultraschallechographie verwendbar sind. Die Mikrobläschenzusammensetzungen sind durch die Gegenwart laminisierter grenzflächenaktiver Mittel stabilisiert, welche in Form von Liposomen vorliegen können. Die Zusammensetzungen können in gefriergetrockneter Form gelagert werden.
  • US-A-4 900 540 beschreibt Phospholipidliposomen zur Verwendung als Kontrastmittel in der Ultraschall-Bildgebung. Die Liposomen enthalten ein wässriges Medium, umfassend Natriumbicarbonat oder Aminomalonat in Mengen, die zur Bildung eines Gases unter physiologischen pH-Bedingungen wirksam sind.
  • Es werden neue und/oder bessere Kontrastmittel zur Ultraschall-Bildgebung benötigt. Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, sich diesen und/oder anderen wichtigen Bedürfnissen zuzuwenden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Kontrastmittel für die Ultraschall-Bildgebung, umfassend gasgefüllte Liposomen in einem wässrigen Träger, deren Inneres zu mindestens 90% frei von Flüssigkeit ist, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend gasgefüllte Liposomen in einem wässrigen Träger, zur Verwendung in Kontrastmitteln für die Ultraschall-Bildgebung bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
  • (i) Setzen von Liposomen unter einen negativen Druck,
  • (ii) Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck für eine Zeit, die ausreicht, um mindestens 90% der Flüssigkeit aus dem Inneren der Liposomen zu entfernen, und
  • (iii) Eintröpfeln von Gas in die Liposomen, bis ein Umgebungsdruck erreicht wird, wobei die Liposomen in einem wässrigen Träger suspendiert sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Kit für die Ultraschall-Bildgebung bereit, umfassend gasgefüllte Liposomen, deren Inneres zu mindestens 90% frei von Flüssigkeit ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kontrastmittels bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Ultraschall-Bildgebung eines inneren Körperbereichs eines Patienten durch Verabreichung der Zusammensetzung an den Patienten und Scannen des Patienten, um sichtbare Bilder des Bereichs zu erhalten, bereit.
  • Überraschenderweise weisen die gasgefüllten Liposomen, die durch ein Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellt werden, und die gasgefüllten Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, welche gemäß dem Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellt werden können, eine Anzahl unerwarteter, aber sehr vorteilhafter Eigenschaften auf. Die erfindungsgemäßen Liposomen weisen eine intensive Echogenizität gegenüber Ultraschall auf, sind gegenüber Druck hoch stabil und/oder weisen eine lange Lagerungfähigkeit, wenn sie entweder trocken oder in einem flüssigen Medium suspendiert gelagert werden, auf. Ebenso überraschend ist die Fähigkeit der Liposomen während des Prozesses der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung sich mit Gas zu füllen, und ihre ursprüngliche zirkuläre Gestalt eher wiederherzustellen, als irreversibel zu einer becherförmigen Gestalt zu kollabieren.
  • Tatsächlich blieben trotz der theoretischen Gründe, warum Ultraschall-Kontrastmittel aus dem Stand der Technik, die auf Gasbläschen oder gashaltigen Körpern beruhen, wirksam sein sollten, die diagnostischen Ergebnisse sehr enttäuschend. Eine Anzahl der gasförmigen Ultraschall-Kontrastmittel, die zuvor von Forschern entwickelt wurden, schlossen nicht-stabilisierte Bläschen ein, und es wurde festgestellt, dass die Instabilität dieser Kontrastmittel die diagnostische Verwendbarkeit derartiger Mittel stark herabsetzt. Andere gasförmige Ultraschall- Kontrastmittel, die zuvor von Forschern entwickelt wurden, schlossen in Konstrukten stabilisierte Gasbläschen ein, welche auch eine bedeutsame Menge Flüssigkeit enthalten, und es wurde festgestellt, dass die Gegenwart einer bedeutsamen Menge Flüssigkeit im Konstrukt zu weniger zufriedenstellenden diagnostischen Ergebnissen führt. Tatsächlich wurde festgestellt, dass die Gegenwart von Flüssigkeit im Konstrukt unvorteilhafter Weise die Resonanzeigenschaften des Gases im Konstrukt verändert, und es wurde festgestellt, dass sie die Diffusion von weiterer Flüssigkeit in das (und gleichzeitig von Gas aus dem) Konstrukt beschleunigt. Die vorliegende Erfindung stellt neue und/oder bessere Kontrastmittel für die Ultraschall-Bildgebung beim Versuch, sich diesen und/oder anderen wichtigen Bedürfnissen zuzuwenden, bereit.
  • Diese und andere Merkmale der Erfindung und deren Vorteile werden im einzelnen in den Figuren und der nachstehenden Beschreibung erläutert.
  • In den Zeichnungen:
  • zeigt Fig. 1 ein Gerät zur Herstellung der vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen und die gasgefüllten Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, welche durch das Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellt sind.
  • ist Fig. 2 eine graphische Darstellung des Reflexionsvermögens in dB von gasgefüllten Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, welche durch das Verfahren der Vakuumtrocknung- Gaseintröpfelung hergestellt sind. Die Daten wurden durch Scannen mit einem 7,5-Megahertz-Schallkopf unter Verwendung eines Acoustic lmagingTM Modell 5200-Scanners (Acoustic Imaging, Phoenix, Arizona) erhalten und wurden unter Verwendung der Systemtestsoftware erzeugt, um das Reflexionsvermögen zu messen. Das System wurde vor jedem Experiment mit einem Phantom mit bekannter Schallimpedanz standardisiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Ultraschall-Kontrastmittel, umfassend gasgefüllte Liposomen, die durch Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellt werden, wobei derartige Liposomen nachstehend gelegentlich als vakuumgetrocknete, gaseingetröpfelte Liposomen bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Kontrastmittel, die gasgefüllte Liposomen umfassen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist.
  • Das Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung, das verwendet werden kann, um sowohl die gasgefüllten Liposomen, die durch das Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellt sind, als auch die gasgefüllten Liposomen herzustellen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, fasst den folgenden Prozess ins Auge. Zuerst werden gemäß dem Prozess die Liposomen unter einen negativen Druck (d. h. verminderter Druck oder Vakuumbedingungen) gesetzt. Danach werden die Liposomen unter diesem negativen Druck für eine Zeit inkubiert, die ausreicht, um im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit aus den Liposomen zu entfernen, wodurch sich im wesentlichen getrocknete Liposomen ergeben. Mit der Entfernung von im wesentlichen der gesamten Flüssigkeit und mit im wesentlichen getrockneten Liposomen ist, wenn diese Begriffe in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, gemeint, dass die Liposomen zu mindestens 90% von Flüssigkeit frei sind, vorzugsweise zu mindestens 95% von Flüssigkeit frei sind, am meisten bevorzugt zu 100% von Flüssigkeit frei sind. Schließlich wird ein ausgewähltes Gas in die Liposomen durch Anlegen des Gases an die Liposomen, bis Umgebungsdrücke erreicht sind, eingetröpfelt, wodurch sich die erfindungsgemäßen Vakuum-getrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen und die erfindungsgemäßen Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, ergeben. Mit deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, sind, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, Liposomen gemeint, deren Inneres zu mindestens 90% frei von Flüssigkeit ist, vorzugsweise zu mindestens 95% frei von Flüssigkeit ist, am meisten bevorzugt zu 100% frei von Flüssigkeit ist.
  • Unerwarteter Weise weisen die Liposomen, die gemäß dem Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellt sind, und die gasgefüllten Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, eine Anzahl überraschender, jedoch sehr vorteilhafter Eigenschaften auf. Die erfindungsgemäßen Liposomen zeigen eine intensive Echogenizität gegenüber Ultraschall, sind gegenüber Druck hoch stabil und/oder weisen allgemein eine lange Lagerungsfähigkeit, wenn sie entweder trocken oder in einem flüssigen Medium suspendiert gelagert werden, auf. Die Echogenizität der Liposomen ist offensichtlich bezüglich der diagnostischen Anwendung der Erfindung wichtig und wird in der Fig. 2 veranschaulicht. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Liposomen ein Reflexionsvermögen von größer als 2 dB, vorzugsweise zwischen 4 dB und 20 dB, auf. Innerhalb dieser Bereiche wird das größte Reflexionsvermögen der erfindungsgemäßen Liposomen durch die größeren Liposomen, durch höhere Konzentrationen der Liposomen und/oder dort entfaltet, wo höhere Ultraschallfrequenzen verwendet werden. Die Stabilität der Liposomen ist ebenfalls von großer praktischer Bedeutung. Die erfindungsgemäßen Liposomen neigen dazu, eine größere Stabilität während der Lagerung als andere gasgefüllte Liposomen, die durch bekannte Verfahren, wie Druckerzeugung oder andere Techniken, hergestellt sind, auf. 72 Stunden nach der Bildung sind beispielsweise in üblicher Weise hergestellte Liposomen oft im wesentlichen frei von Gas, wobei das Gas aus den Liposomen herausdiffundiert ist und/oder die Liposomen gerissen und/oder fusioniert sind, was einen gleichzeitige Abnahme des Reflexionsvermögens ergibt. Im Vergleich dazu weisen die erfindungsgemäßen gasgefüllten Liposomen allgemein eine Lagerungsbeständigkeit von größer als 3 Wochen, vorzugsweise eine Lagerungsbeständigkeit von größer als 4 Wochen, mehr bevorzugt eine Lagerungsbeständigkeit von größer als 5 Wochen, noch mehr bevorzugt eine Lagerungsbeständigkeit von größer 3 Monaten und oft eine Lagerungsbeständigkeit, die noch viel länger ist, wie über 6 Monate, 12 Monate oder sogar 2 Jahre, auf.
  • Ebenfalls unerwartet ist die Fähigkeit der Liposomen, sich während des Prozesses der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung mit Gas zu füllen und eher ihre ursprüngliche zirkuläre Gestalt wieder herzustellen, als in eine becherförmige Struktur zu kollabieren, wie nach dem Stand der Technik zu erwarten wäre. Siehe z. B. Crowe et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 242, S. 240-247 (1985); Crowe et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Band 220, S. 477484 (1983); Fukuda et al., J. Am. Chem. Soc., Band 108, S. 2321-2327 (1986); Regen et al., J. Am. Chem. Soc., Band 102, S. 6638-6640 (1980).
  • Die dem erfindungsgemäßen Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung unterworfenen Liposomen können unter Verwendung irgendeiner der Anzahl üblicher Techniken der Liposomenherstellung hergestellt werden, welche einem Fachmann ersichtlich sind. Diese Techniken schließen Einfrier-Abtau-Techniken sowie Techniken, wie Sonifizierung, Chelatdialyse, Homogenisierung, Lösungsmittelinfusion, Mikroemulsifizierung, spontane Bildung, Lösungsmittelverdampfung, Zellpress-Technik, kontrollierte Detergensdialyse, und andere Techniken ein. Die Größe der Liposomen kann, falls erwünscht, vor der Vakuumtrocknung und Gaseintröpfelung durch eine Anzahl von Verfahren, einschließlich Extrusion, Filtration, Sonifizierung, Homogenisierung, Verwenden eines laminaren Stroms eines Flüssigkeitskerns, welcher in eine nicht-mischbare Ummantelungsflüssigkeit eingebracht wird, und ähnliche Verfahren eingestellt werden, um die resultierende liposomale Bioverteilung und Beseitigung zu modulieren. Die Extrusion unter Druck durch Poren definierter Größe ist jedoch das bevorzugte Mittel zum Einstellen der Größe der Liposomen. Die vorstehenden Techniken, wie auch andere, sind beispielsweise diskutiert in US-Patent Nr. 4,728,578; UK-Patentanmeldung GB 2 193 095 A; US-Patent Nr. 4,728,575; US- Patent Nr. 4,737,323; Internationale Anmeldung PCT/US85/01161; Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 858, S. 161-168 (1986); Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 812, S. 66-65 (1985); US-Patent Nr. 4,533,254; Mayhew et al., Methods in Enzymology, Band 149, S 64-77 (1987); Mayhew et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 755, S. 169-74 (1984); Cheng et al., Investigative Radiology, Band 22, S. 47-55 (1987); PCT/US89/05040; US-Patent Nr. 4,162,282; US-Patent Nr. 4,310,505; US-Patent Nr. 4,921,706; und Liposomes Technolopy, Gregoriadis, G., Hg., Band I, S. 29-37, 51-67 und 79-108 (CRC Press Inc. Boca Raton, FL, 1984). Obwohl irgendeine der Anzahl von verschiedenen Techniken verwendet werden kann, werden die Liposomen bevorzugt durch Mikroemulsifizierungstechniken hergestellt. Die durch die verschiedenen üblichen Verfahren hergestellten Liposomen können dann im erfindungsgemäßen Verfahren der Vakuumtrocknung- Gaseintröpfelung eingesetzt werden, um die Liposomen der vorliegenden Erfindung herzustellen.
  • Die Materialien, welche beim Herstellen der im erfindungsgemäßen Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung einzusetzenden Liposomen verwendet werden können, schließen irgendeines der Materialien oder deren Kombinationen ein, das bzw. die einem Fachmann als geeignet für die Konstruktion von Liposomen bekannt ist bzw. sind. Die verwendeten Lipide können entweder natürlicher oder synthetischer Herkunft sein. Derartige Materialien schließen Lipide, wie Fettsäuren, Lysolipide, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidylchlolin, Phosphatidsäure, Sphingomyelin, Cholesterin, Cholesterinhemisuccinat, Tocopherol, Hemisuccinat, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Lysolipide, Sphingomyelin, Glykosphingolipide, Glucolipide, Glykolipide, Sulphatide, Lipide mit Ether- und Esterverknüpften Fettsäuren, polymerisierte Lipide, Diacetylphosphat, Stearylamin, Distearoylphospritidylcholin, Phosphatidylserin, Sphingomyelin, Cardiolipin, Phospholipide mit kurzkettigen Fettsäuren mit einer Länge von 6 bis 8 Kohlenstoffen, synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acylketten (z. B. mit einer Acylkette aus 6 Kohlenstoffen und einer anderen Acylkette aus 12 Kohlenstoffen), 6-(5- Cholesten-3β-yloxy)-1-thio-β-D-galactopyranosid, Digalactosyldiglycerid, 6-(5- Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxy-1-thio-β-D-galactopyranosid, 6-(5- Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid, Dibehenoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin und Dioleoylphosphatidylcholin und/oder Kombinationen davon ein. Andere verwendbare Lipide oder Kombinationen davon, die einem Fachmann ersichtlich sind, können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise können Kohlenhydrate aufweisende Lipide zum in vivo Targeting, wie im US-Patent Nr. 4,310,505 beschrieben, eingesetzt werden. Von besonderem Interesse zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Lipide, die sich im Gelzustand (verglichen mit dem flüssigkristallinen Zustand) bei der Temperatur, bei welcher die Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung durchgeführt wird, befinden. Die Phasenumwandlungstemperaturen verschiedener Lipide sind einem Fachmann leicht ersichtlich und sind beispielsweise in Liposome Technology, Gregoriadis, G., Hg., Band I, S. 1-18 (CRC Press, Inc. Boca Raton, FL 1984), beschrieben. Außerdem wurde festgestellt, dass das Einbringen von mindestens einer geringen Menge negativ geladenen Lipids in eine Liposomenmembran, obwohl nicht erforderlich, zur Bereitstellung hoch stabiler Liposomen vorteilhaft ist. Mit mindestens einer geringen Menge ist 1 Mol% des Gesamtlipids gemeint. Geeignete negativ geladene Lipide sind einem Fachmann leicht ersichtlich und schließen beispielsweise Phosphatidylserin und Fettsäuren ein. Am meisten bevorzugt im Hinblick auf die Kombination aus letztendlicher Echogenizität und Stabilität nach dem Prozess der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung sind Liposomen, die aus Dipalmitoylphosphatidylcholin hergestellt sind.
  • Im Wege einer allgemeinen Anleitung können Dipalmitoylphosphatidylcholin- Liposomen durch Suspendieren von Dipalmitoylphosphatidylcholin-Lipiden in Phosphat-gepufferter Salzlösung oder Wasser und Erwärmen der Lipide auf etwa 50ºC, eine Temperatur, die leicht oberhalb der Temperatur von 45ºC liegt, welche zum Übergang der Dipalmitoylphosphatidylcholin-Lipide aus einem Gelzustand in einen flüssigkristallinen Zustand erforderlich ist, um Liposomen zu bilden, hergestellt werden. Um multilamellare Vesikel mit einer eher heterogenen Größenverteilung von etwa 2 um herzustellen, können die Liposomen dann sanft mit der Hand gemischt werden, während die Liposomenlösung bei einer Temperatur von etwa 50ºC gehalten wird. Die Temperatur wird dann auf Raumtemperatur vermindert, und die Lipsomen bleiben intakt. Es kann eine Extrusion der Dipalmitoylphosphatidylcholin- Liposomen durch Polycarbonatfilter definierter Größe, falls erwünscht, verwendet werden, um Liposomen mit einer homogeneren Größenverteilung herzustellen. Eine für diese Technik verwendbare Vorrichtung ist ein Extruder (Extruder DeviceTM, Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada), ausgerüstet mit einer Wärmetrommel, so dass die Extrusion in bequemer Weise bei der vorstehenden Gelzustand-Flüssigkristall- Übergangstemperatur für Lipide ausgeführt werden kann.
  • In einer anderen Ausführungsform und wiederum im Wege einer allgemeinen Anleitung können übliche Einfrier-Auftau-Verfahren verwendet werden, um entweder oligolamellare oder unilamellare Dipalmitoylphosphatidylcholin-Liposomen herzustellen. Nach den Einfrier-Auftau-Verfahren können dann Extrusionsverfahren, wie vorstehend beschrieben, mit den Liposomen durchgeführt werden.
  • Die so hergestellten Liposomen können dann dem erfindungsgemäßen Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung unterworfen werden, um die vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten und die gasgefüllten Liposomen der vorliegenden Erfindung, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, herzustellen. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Liposomen in ein Gefäß eingebracht, das zum Aussetzen der Liposomen einem negativen Druck (d. h., verminderter Druck oder Vakuumbedingungen) geeignet ist. Dann wird ein negativer Druck für eine Zeit angelegt, die ausreicht, um im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit aus den Liposomen zu entfernen, woraus im wesentlichen getrocknete Liposomen resultieren. Ein mit der vorliegenden Offenbarung ausgestatteter Fachmann erkennt, dass verschiedene negative Drücke verwendet werden können, wobei der wichtige Parameter ist, dass im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit aus den Liposomen entfernt wurde. Im allgemeinen ist ein negativer Druck von mindestens 93 kPa (700 mmHg) und vorzugsweise im Bereich zwischen 93 kPa (700 mmHg) und 101 kPa (760 mmHg) (Manometerdruck), angelegt für 24 bis 72 Stunden, ausreichend, um im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit aus den Liposomen zu entfernen. Andere geeignete Drücke und Zeitspannen sind einem Fachmann anhand der vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
  • Schließlich wird ein ausgewähltes Gas an die Liposomen angelegt, um Gas in die Liposomen einzutröpfeln, bis Umgebungsdrücke erreicht sind, woraus die vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen der Erfindung und die gasgefüllten Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, resultieren. Vorzugsweise erfolgt die Gaseintröpfelung langsam, d. h. über eine Zeitspanne von mindestens 4 Stunden, am meisten bevorzugt über eine Zeitspanne zwischen 4 und 8 Stunden. Es können verschiedene biokompatible Gase verwendet werden. Derartige Gase schließen Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, Argon, Xenon, Neon, Helium oder irgendeine und alle Kombination(en) davon ein. Andere geeignete Gase sind einem Fachmann ersichtlich, wobei das gewählte Gas nur durch die vorgesehene Anwendung auf die Liposomen eingeschränkt wird.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung von Liposomen wird nachstehend als Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung bezeichnet.
  • Falls erwünscht, können die Liposomen, bevor die Liposomen einem negativen Druck ausgesetzt werden, gekühlt werden, und eine derartige Kühlung ist bevorzugt. Vorzugsweise werden die Liposomen auf unter 0ºC, mehr bevorzugt auf zwischen -10ºC und -20ºC und am meisten bevorzugt auf -10ºC, bevor die Liposomen einem negativen Druck ausgesetzt werden, gekühlt. Nach dem Erreichen des gewünschten negativen Drucks wird die Liposomentemperatur dann vorzugsweise auf über 0ºC, mehr bevorzugt zwischen etwa 10ºC und etwa 20ºC und am meisten bevorzugt auf 10ºC erhöht, bis im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit aus den Liposomen entfernt wurde, und der negative Druck wird gestoppt, zu welchem Zeitpunkt dann die Temperatur auf Raumtemperatur zurückkehrt.
  • Falls die Liposomen auf eine Temperatur unter 0ºC gekühlt werden, ist es bevorzugt, dass das Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung entweder mit Liposomen, die anfänglich in Gegenwart von Gefrierschutzmitteln hergestellt wurden, oder mit Liposomen durchgeführt wird, zu denen vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung Gefrierschutzmittel zugegeben wurden. Während sie nicht obligatorisch zugegeben werden müssen, unterstützen derartige Gefrierschutzmittel die Unversehrtheit von Liposomenmembranen bei geringen Temperaturen und tragen auch zur letztendlichen Stabilität der Membranen bei. Bevorzugte Gefrierschutzmittel sind Trehalose, Glycerin, Polyethylenglykol (insbesondere Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400), Raffinose, Saccharose und Sorbit, wobei Trehalose besonders bevorzugt ist.
  • Es wurde auch überraschender Weise festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Liposomen gegenüber Druckänderungen hoch stabil sind. Aufgrund dieser Eigenschaft kann eine Extrusion der Liposomen durch Filter mit definierter Porengröße nach der Vakuumtrocknung und Gaseintröpfelung, falls erwünscht, durchgeführt werden, um Liposomen mit relativ homogener und definierter Porengröße zu erzeugen.
  • Zur Lagerung vor der Verwendung können die erfindungsgemäßen Liposomen in einer wässrigen Lösung, wie eine Salzlösung (beispielsweise eine Phosphatgepufferte Salzlösung), oder einfach Wasser, suspendiert und vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 2ºC und 10ºC, vorzugsweise bei etwa 4ºC, gelagert werden. Vorzugsweise ist das Wasser steril. Am meisten bevorzugt werden die Liposomen in einer hypertonen Salzlösung (z. B. etwa 0,3 bis etwa 0,5% NaCl) gelagert, obwohl, falls erwünscht, die Salzlösung isoton sein kann. Die Lösung kann auch, falls erwünscht, gepuffert sein, um einen pH-Bereich von pH 6,8 bis pH 7,4 bereitzustellen. Geeignete Puffer schließen Acetat, Citrat, Phosphat und Bicarbonat ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es kann auch Dextrose in die suspendierenden Medien eingeschlossen werden. Vorzugsweise ist die wässrige Lösung, bevor die Liposomen darin suspendiert werden, entgast (d. h., unter Vakuumdruck entgast). Es können bakteriostatische Mittel in die Liposomen eingeschlossen werden, um einen bakteriellen Abbau während der Lagerung zu verhindern. Geeignete bakteriostatische Mittel schließen Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Benzoesäure, Benzylalkohol, Butylparaben, Cetylpyridiniumchlorid, Chlorbutanol, Chlorkresol, Methylparaben, Phenol, Kaliumbenzoat, Kaliumsorbat, Natriumbenzoat und Sorbinsäure ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es können ein oder mehrere Antioxidantien in die gasgefüllten Liposomen eingeschlossen werden, um eine Oxidation des Lipids zu verhindern. Geeignete Antioxidantien schließen Tocopherol, Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat ein. Auf die vorstehenden verschiedenen Weisen hergestellte Liposomen können für mindestens einige Wochen oder Monate gelagert werden. Erfindungsgemäße Liposomen können in einer anderen Ausführungsform, falls erwünscht, in ihrer getrockneten, nicht-suspendierten Form gelagert werden, und derartige Liposomen weisen eine Lagerbeständigkeit von größer als einige Wochen oder Monate auf. Insbesondere weisen die in beider Weise gelagerten Liposomen der vorliegenden Erfindung eine Lagerbeständigkeit von größer als etwa 3 Wochen, vorzugsweise eine Lagerbeständigkeit von größer als etwa 4 Wochen, mehr bevorzugt eine Lagerbeständigkeit von größer als etwa 5 Wochen, noch mehr bevorzugt eine Lagerbeständigkeit von größer als etwa 3 Monaten, und oft eine Lagerbeständigkeit auf, die sogar viel länger, wie über 6 Monate, 12 Monate oder sogar 2 Jahre, ist.
  • Fig. 1 zeigt ein bevorzugtes Gerät zum Vakuumtrocknen von Liposomen und zum Eintröpfeln eines Gases in die getrockneten Liposomen. Das Gerät umfasst ein Gefäß 8 zur Aufnahme von Liposomen 19. Falls erwünscht, kann das Gerät ein Eisbad 5, enthaltend Trockeneis 17, welches das Gefäß 8 umgibt, einschließen. Das Eisbad 5 und das Trockeneis 17 erlauben es, die Liposomen auf unter 0ºC zu kühlen. Eine Vakuumpumpe 1 ist mit dem Gefäß 8 über eine Leitung 15 zum Anlegen eines anhaltenden negativen Drucks an das Gefäß verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pumpe 1 zum Anlegen eines negativen Drucks von mindestens 93 kPa (700 mmHg) und vorzugsweise eines negativen Drucks im Bereich von 93 kPa (700 mmHg) bis 101 kPa (760 mmHg) (Manometerdruck) befähigt. Ein Manometer 6 ist mit der Leitung 15 verbunden, um die Überwachung des an das Gefäß 8 angelegten negativen Drucks zu erlauben.
  • Um aus den Liposomen entfernte Flüssigkeit vom Eintritt in die Pumpe 1 zu hindern, unterstützt eine Reihe von Fallen, die mit der Leitung 15 verbunden sind, das Sammeln der Flüssigkeit (und Flüssigkeitsdampf, zusammenfassend in der vorliegenden Erfindung als Flüssigkeit bezeichnet), die den Liposomen entzogen wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei Fallen verwendet. Die erste Falle umfasst vorzugsweise einen Kolben 7, der in einem Eisbad 4 mit Trockeneis 17 angeordnet ist. Die zweite Falle umfasst vorzugsweise eine Kolonne 3, um welche eine Rohrleitung 16 helikal angeordnet ist. Die Kolonne 3 ist an ihrem oberen Ende mit der Leitung 15 und an deren unteren Ende mit einem Ende der Rohrleitung 16 verbunden. Das andere Ende der Rohrleitung 16 ist mit der Leitung 15 verbunden. Wie in Fig. 1 gezeigt, umgibt ein Eisbad 2 mit Trockeneis 17 die Kolonne 3 und die Rohrleitung 16. Falls erwünscht, kann das Trockeneis 17 durch flüssigen Stickstoff, flüssige Luft oder andere kältetechnische Materialien ersetzt werden. Die Eisbäder 2 und 4 unterstützen die Sammlung jeglicher Flüssigkeit und die Kondensation jeglichen Wasserdampfs, welche/welcher den Liposomen zur Sammlung in den Fallen entzogen wurde. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Eisfallen 2 und 4 jeweils bei einer Temperatur von mindestens etwa -70ºC gehalten.
  • Ein Absperrhahn 14 ist in der Leitung 15 stromaufwärts vom Gefäß 8 angeordnet, um die Einspeisung eines ausgewählten Gases in das Gefäß 8 und in die Liposomen 19 aus einer Gasflasche 18 zu erlauben.
  • Das vorstehend beschriebene Gerät wird durch Einbringen der Liposomen 19 in das Gefäß 8 verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Eisbad 5 mit Trockeneis 17 verwendet, um die Temperatur der Liposomen auf unter 0ºC, mehr bevorzugt auf zwischen -10ºC und -20ºC und am meisten bevorzugt auf -10ºC, zu vermindern. Bei geschlossenen Absperrhähnen 14 und 9 wird die Vakuumpumpe 1 angeschaltet. Dann werden die Absperrhähne 10, 11, 12 und 13 vorsichtig geöffnet, um ein Vakuum im Gefäß 8 mit Hilfe der Vakuumpumpe 1 zu erzeugen. Der Druck wird mit Hilfe des Manometers 6 gemessen, bis ein negativer Druck von mindestens 93 kPa (700 mmHg) und vorzugsweise im Bereich zwischen 93 kPa (700 mmHg) und 101 kPa (760 mmHg) (Manometerdruck) erreicht wird. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kondensiert bzw. kondensieren Gefäß 7, gekühlt durch Eisbad 4 mit Trockeneis 17, und Kolonne 3 und Kühlschlange 16, gekühlt durch Eisbad 2 mit Trockeneis 17, zusammen oder einzeln, Flüssigkeitsdampf und fängt bzw. fangen Flüssigkeit, die den Liposomen entzogen wurde, auf, um zu verhindern, dass derartige Flüssigkeiten und derartiger Flüssigkeitsdampf in die Vakuumpumpe 1 eintreten bzw. eintritt. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Temperatur der Eisfallen 2 und 4 jeweils bei einer Temperatur von mindestens etwa -70ºC gehalten. Der erwünschte negative Druck wird im allgemeinen für mindestens 24 Stunden, solange Flüssigkeit und Flüssigkeitsdampf aus den Liposomen 19 im Gefäß 8 entfernt und in den Gefäßen 3 und 7 gefroren wird, gehalten. Der Druck im System wird unter Verwendung des Manometers 6 überwacht und wird im allgemeinen für etwa 24 bis etwa 72 Stunden gehalten, wobei nach dieser Zeit im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit aus den Liposomen entfernt wurde. Zu diesem Zeitpunkt wird der Absperrhahn 10 langsam geschlossen und die Vakuumpumpe 1 abgeschaltet. Der Absperrhahn 14 wird dann allmählich geöffnet und es wird langsam Gas in das System aus der Gasflasche 18 durch den Absperrhahn 14 über die Leitung 15 eingespeist, um Gas in die Liposomen 19 im Gefäß 8 einzutröpfeln. Vorzugsweise erfolgt die Gaseintröpfelung langsam über eine Zeitspanne von mindestens 4 Stunden, am meisten bevorzugt über eine Zeitspanne zwischen etwa 4 und etwa 8 Stunden, bis das System Umgebungsdruck erreicht.
  • Die vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen der vorliegenden Erfindung, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, weisen überlegene Eigenschaften für die Ultraschallkontrast-Bildgebung auf. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung bei der Abbildung eines Patienten allgemein und/oder bei der Diagnose des Vorhandenseins eines krankhaften Gewebes in einem Patienten verwendbar. Der Patient kann irgendeine Art von Säugetier sein, ist jedoch am meisten bevorzugt ein Mensch. Daher wird in weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Bereitstellen eines Bildes eines inneren Körperbereichs eines Patienten bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst das Verabreichen der erfindungsgemäßen Liposomen an den Patienten und Scannen des Patienten unter Verwendung der Ultraschall-Bildgebung, um sichtbare Bilder des Bereichs zu erhalten. Es wird auch ein Verfahren zum Sichtbarmachen des Vorhandenseins von krankhaftem Gewebe in einem Patienten bereitgestellt, wobei das Verfahren das Verabreichen von erfindungsgemäßen Liposomen an einen Patienten und dann das Scannen eines Patienten unter Verwendung der Ultraschall- Bildgebung, um sichtbare Bilder von irgendeinem krankhaften Gewebe in dem Patienten zu erhalten, umfasst. Mit Bereich eines Patienten ist der Gesamtpatient oder ein bestimmter Bereich oder Teil des Patienten gemeint. Beispielsweise kann durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens das Herz eines Patienten oder ein Gefäß eines Patienten (d. h. venöse oder arterielle Systeme) sichtbar gemacht werden und/oder es kann krankhaftes Gewebe diagnostiziert werden. Beim Sichtbarmachen des Gefäßsystems eines Patienten kann der Blutfluss gemessen werden, was einem Fachmann anhand der vorliegenden Offenbarung verständlich ist. Die Erfindung ist auch insbesondere zum Sichtbarmachen und/oder Diagnostizieren einer Krankheit im Rechtsherzen eines Patienten, ein Bereich, der bisher durch Ultraschall nicht leicht abbildbar war, verwendbar. Leber-, Milz- und Nierenbereiche eines Patienten können auch leicht sichtbar gemacht und/oder es kann eine Krankheit darin unter Verwendung der vorliegenden Verfahren nachgewiesen werden.
  • Die Liposomen der vorliegenden Erfindung können verschiedene Größen aufweisen, weisen jedoch vorzugsweise einen Größenbereich auf, in welchem sie einen mittleren äußeren Durchmesser zwischen 30 nm und 10 um aufweisen, wobei der bevorzugte mittlere äußere Durchmesser etwa 2 um beträgt. Wie einem Fachmann bekannt ist, beeinflusst die Liposomengröße die Bioverteilung, und daher können Liposomen unterschiedlicher Größe für verschiedene Zwecke ausgewählt werden. Für die intravaskuläre Verwendung ist die Liposomengröße als mittlerer äußerer Durchmesser im allgemeinen nicht größer als 5 um und im allgemeinen nicht kleiner als 30 nm. Um eine Ultraschall-Verstärkung von Organen, wie der Leber, bereitzustellen, und um eine Unterscheidung von Tumor von normalem Gewebe zu erlauben, sind kleinere Liposomen, zwischen 30 nm und 100 nm mittlerem äußerem Durchmesser, verwendbar.
  • Es kann irgendeine der verschiedenen Arten von Ultraschall-Bildgebungsvorrichtungen bei der Ausübung der Erfindung verwendet werden, wobei die bestimmte Art oder das bestimmte Modell der Vorrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren nicht kritisch ist. Im allgemeinen werden für die diagnostischen Verwendungen der vorliegenden Erfindung Ultraschallfrequenzen zwischen 3,0 und 7,5 Megahertz verwendet.
  • Wie ein Fachmann erkennt, kann die Verabreichung von Bildgebungskontrastmitteln der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Weise, wie intravaskulär, intralymphatisch, parenteral, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, interstitiell, hyperbarisch, oral oder intratumoral, unter Verwendung einer Anzahl verschiedener Dosierungsformen, durchgeführt werden. Ein bevorzugter Verabreichungsweg ist der intravaskuläre. Für die intravaskuläre Verwendung wird das Kontrastmittel im allgemeinen intravenös injiziert, kann jedoch auch intraarteriell injiziert werden. Die zu verabreichende verwendbare Dosis und die Art der Verabreichung sind in Abhängigkeit vom Alter, Gewicht und des zu untersuchenden Säugetiers und der beabsichtigten spezifischen diagnostischen Anwendung veränderlich.
  • Typischerweise wird mit der Dosierung bei niedrigeren Spiegeln begonnen, und sie wird erhöht, bis die erwünschte Kontrastverstärkung erreicht wird. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Kontrastmittel in Form einer wässrigen Suspension, wie in Wasser oder einer Salzlösung (z. B. Phosphat-gepufferter Salzlösung), verabreicht. Vorzugsweise ist das Wasser steril. Es ist auch bevorzugt, dass die Salzlösung eine hypertone Salzlösung (z. B. 0,3 bis 0,5% NaCl) ist, obwohl, falls erwünscht, die Salzlösung isoton sein kann. Die Lösung kann auch, falls erwünscht, gepuffert sein, um einen pH-Bereich von pH 6,8 bis pH 7,4 bereitzustellen. Außerdem kann vorzugsweise Dextrose in den Medien eingeschlossen sein. Vorzugsweise ist die wässrige Lösung vor dem Suspendieren der Liposomen darin entgast (d. h. unter Vakuumdruck entgast).
  • Für die Ultraschall-Bildgebung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbare Kits umfassen gasgefüllte, durch ein Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung hergestellte Liposomen und gasgefüllte Liposomen, deren Inneres im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, zusätzlich zu üblichen Komponenten eines Kits für die Ultraschall-Bildgebung. Derartige übliche Komponenten eines Kits für die Ultraschall- Bildgebung sind bekannt und schließen beispielsweise Filter zum Entfernen bakterieller Verunreinigungen oder zum Auseinanderbrechen liposomaler Aggregate vor der Verabreichung ein.
  • Es wird angenommen, dass sich die erfindungsgemäßen Liposomen von den Liposomen aus dem Stand der Technik in einer Anzahl von Gesichtspunkten, sowohl hinsichtlich physikalischer als auch funktioneller Eigenschaften, unterscheiden. Beispielsweise sind die erfindungsgemäßen Liposomen im Inneren im wesentlichen frei von Flüssigkeit. Definitionsgemäß sind die Liposomen im Stand der Technik durch die Gegenwart eines wässrigen Mediums charakterisiert worden. Siehe z. B. Dorland's Illustrated Medical Dictionary, S. 946, 27. Aufl. (W. B. Saunders Company, Philadelphia 1988). Darüber hinaus zeigen die vorliegenden Liposomen eine intensive Echogenizität gegenüber Ultraschall und weisen eine lange Lagerstabilität, Eigenschaften von großem Vorteil bei der Verwendung der Liposomen als Ultraschall-Kontrastmittel, auf.
  • Über diejenigen in der vorliegenden Erfindung im einzelnen beschriebenen hinausgehend, gibt es verschiedene andere Anwendungen für die erfindungsgemäßen Liposomen. Derartige zusätzliche Verwendungen schließen beispielsweise Anwendungen, wie Hyperthermie-Verstärker für Ultraschall und Arzneistoff-Freisetzungsvehikel, ein.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Beispiele 1 bis 8 sind konkrete Beispiele, welche die Herstellung und das Testen der vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, beschreiben. Die Beispiele 9 bis 11 sind vorausschauende Beispiele, welche die Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen beschreiben. Die folgenden Beispiele sind nicht als den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche einschränkend auszulegen.
    • BEISPIELE Beispiel 1
  • Dipalmitoylphosphatidylcholin (1 Gramm) wurde in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert, die Suspension wurde auf etwa 50ºC erwärmt und dann von Hand in einem Rundkolben für etwa 30 Minuten geschwenkt. Die Wärmequelle wurde entfernt und die Suspension wurde für 2 weitere Stunden geschwenkt, während es der Suspension erlaubt wurde, auf Raumtemperatur abzukühlen, um Liposomen zu bilden.
  • Die so hergestellten Liposomen wurden in ein Gefäß in einer Vorrichtung, ähnlich derjenigen, die in Fig. 1 gezeigt ist, gekühlt auf etwa -10ºC, eingebracht und dann einem hohen negativen Vakuumdruck unterworfen. Die Temperatur der Liposomen wurde dann auf etwa 10ºC erhöht. Der hohe negative Vakuumdruck wurde für etwa 48 Stunden gehalten. Nach etwa 48 Stunden wurde Stickstoffgas allmählich in die Kammer über eine Zeitspanne von etwa 4 Stunden eingetröpfelt, wonach der Druck auf Umgebungsdruck zurückkehrte. Die resultierenden vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von irgendwelcher Flüssigkeit ist, wurden dann in 10 ml Phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und bei etwa 4ºC für etwa 3 Monate gelagert.
    • Beispiel 2
  • Um die Liposomen von Beispiel 1 ultrasonographisch zu testen, wurde eine Probe von 250 mg dieser Liposomen in 300 ml entgaster Phosphat-gepufferter Salzlösung (d. h. unter Vakuumdruck entgast) suspendiert. Die Liposomen wurden dann in vitro bei verschiedenen Zeitintervallen mit einem 7,5 mHz-Schallgeber unter Verwendung eines Acoustic Imaging Modell 5200-Scanners (Acoustic Imaging, Phoenix, AZ) und Verwenden der Systemtestsoftware, um das Reflexionsvermögen in dB zu messen, gescannt. Das System wurde vor dem Testen der Liposomen mit einem Phantom bekannter Schallimpedanz standardisiert. Ein Graph, welcher das Reflexionsvermögen in dB zeigt, ist in der Fig. 2 bereitgestellt.
    • Beispiel 3
  • Dipalmitoylphosphatidylcholin (1 Gramm) und das Gefrierschutzmittel Trehalose (1 Gramm) wurden in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert, die Suspension wurde auf etwa 50ºC erwärmt und dann in einem Rundkolben für etwa 30 Minuten geschwenkt. Die Wärmequelle wurde entfernt und die Suspension wurde für etwa 2 weitere Stunden geschwenkt, während es der Suspension erlaubt wurde, auf Raumtemperatur abzukühlen, um Liposomen zu bilden.
  • Die so hergestellten Liposomen wurden dann vakuumgetrocknet und gaseingetröpfelt, wobei im wesentlichen dem in Beispiel 1 gezeigten Verfahren gefolgt wurde, was vakuumgetrocknete, gaseingetröpfelte Liposomen, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von jeglicher Flüssigkeit ist, ergab. Die Liposomen wurden dann in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert und dann bei etwa 4ºC für einige Wochen gelagert.
    • Beispiel 4
  • Um die Liposomen von Beispiel 3 ultrasonographisch zu testen, wurde im wesentlichen den Verfahren von Beispiel 2 gefolgt. Das Reflexionsvermögen in dB der Liposomen war ähnlich dem in Beispiel 2 berichteten Reflexionsvermögen in dB.
    • Beispiel 5
  • Dipalmitoylphosphatidylcholin (1 Gramm) wurde in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert, die Suspension wurde auf etwa 50ºC erwärmt und dann von Hand in einem Rundkolben für etwa 30 Minuten geschwenkt. Die Suspension wurde dann 5 Extrusionszyklen durch eine Extrudervorrichtung, ummantelt mit einer Wärmetrommel (Extruder DeviceTM, Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada), sowohl mit als auch ohne üblicher Einfrier-Auftau-Behandlung vor der Extrusion, unterworfen, während die Temperatur bei etwa 50ºC gehalten wurde. Die Wärmequelle wurde entfernt und die Suspension wurde für etwa 2 weitere Stunden geschwenkt, während es der Suspension erlaubt wurde, auf Raumtemperatur abzukühlen, um Liposomen zu bilden.
  • Die so hergestellten Liposomen wurden dann vakuumgetrocknet und gaseingetröpfelt, wobei im wesentlichen den in Beispiel 1 gezeigten Verfahren gefolgt wurde, was vakuumgetrocknete, gaseingetröpfelte Liposomen, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von jeglicher Flüssigkeit ist, ergab. Die Liposomen wurden dann in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert und dann bei etwa 4ºC für einige Wochen gelagert.
    • Beispiel 6
  • Um die Liposomen von Beispiel 5 ultrasonographisch zu testen, wurde im wesentlichen den Verfahren von Beispiel 2 gefolgt. Das Reflexionsvermögen in dB der Liposomen war dem in Beispiel 2 berichteten Reflexionsvermögen in dB ähnlich.
    • Beispiel 7
  • Um die Stabilität der erfindungsgemäßen Liposomen zu testen, wurde die Liposomensuspension von Beispiel 1 durch 2 um-Polycarbonatfilter in einer Extrudervorrichtung (Extruder DeviceTM, Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada) fünfmal bei einem Druck von etwa 4,1 MPa (600 psi) geführt. Nach der Extrusionsbehandlung wurden die Liposomen, wie in Beispiel 2 beschrieben, ultrasonographisch untersucht. Überraschenderweise behielten die erfindungsgemäßen Liposomen selbst nach der Extrusion unter hohem Druck im wesentlichen ihre Echogenizität.
    • Beispiel 8
  • Die Liposomen von Beispiel 1 wurden durch Ultraschall unter Verwendung von Schallgeberfrequenzen, die von 3 bis 7,5 mHz variierten, gescannt. Die Ergebnisse zeigten, dass bei einer höheren Ultraschallfrequenz die Echogenizität schneller abklingt, was eine vergleichsweise hohe Resonanzfrequenz und eine höhere, mit den höheren Frequenzen zusammenhängende Energie widerspiegelt.
  • Die folgenden Beispiele, Beispiele 9, 10 und 11, sind vorausschauende Beispiele.
    • Beispiel 9
  • Einem Patienten mit Verdacht auf Herzmuskelischämie wird eine intravenöse Dosis von 500 mg vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 2 um, welche Stickstoffgas einkapseln, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, verabreicht, und der linke ventrikuläre Herzmuskel wird ultrasonographisch untersucht.
    • Beispiel 10
  • Einem Patienten mit Verdacht auf Herzmuskelischämie wird eine intravenöse Dosis von 500 mg vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 2 um, welche Stickstoffgas einkapseln, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, verabreicht, und der linke ventrikuläre Herzmuskel wird ultrasonographisch untersucht.
    • Beispiel 11
  • Einem Patienten mit Verdacht auf Lebermetastasen wird eine intravenöse Dosis von 500 mg vakuumgetrockneten, gaseingetröpfelten Liposomen mit einem mittleren Durchmesser von 2 um, welche Stickstoffgas einkapseln, wobei das Innere der gasgefüllten Liposomen im wesentlichen frei von Flüssigkeit ist, verabreicht, und die Leber wird ultrasonographisch untersucht.
  • Es sind verschiedene Modifikationen der Erfindung im Schutzbereich der beigefügten Ansprüche zusätzlich zu denjenigen, die in der vorliegenden Erfindung gezeigt und beschrieben werden, einem Fachmann anhand der vorhergehenden Beschreibung ersichtlich.

Claims (29)

1. Kontrastmittel für die Ultraschall-Bildgebung, umfassend gasgefüllte Liposomen in einem wässerigen Träger, deren Inneres zumindestens 90% frei von Flüssigkeit ist.
2. Kontrastmittel nach Anspruch 1, wobei die gasgefüllten Liposomen durch ein Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung erhältlich sind.
3. Kontrastmittel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Liposomen Lipidmaterialien umfassen, die aus der Gruppe, bestehend aus Fettsäuren, Lysolipiden, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Cholesterin, Cholesterinhemisuccinat, Tocopherolhemisuccinat, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Glycosphingolipiden, Glucolipiden, Glycolipiden, Sulfatiden, Lipiden mit Ether- und Esterverknüpften Fettsäuren und polymerisierten Lipiden, ausgewählt sind.
4. Kontrastmittel nach Anspruch 3, wobei die Liposomen Dipalmitoylphosphatidylcholin umfassen.
5. Kontrastmittel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Liposomen mit einem Gas gefüllt sind, das aus der Gruppe, bestehend aus Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, Argon, Xenon, Helium und Neon, ausgewählt ist.
6. Kontrastmittel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Liposomen eine Stabilität von größer als drei Wochen aufweisen.
7. Kontrastmittel nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Liposomen ein Reflexionsvermögen von größer als 2 dB aufweisen.
8. Kontrastmittel nach Anspruch 7, wobei die Liposomen ein Reflexionsvermögen zwischen 2 dB und 20 dB aufweisen.
9. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, umfassend gasgefüllte Liposomen in einem wässerigen Träger zur Verwendung in Kontrastmitteln für die Ultraschall-Bildgebung, welches die folgenden Schritte umfaßt:
(i) Setzen von Liposomen unter einem negativen Druck,
(ii) Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck für eine Zeit, die ausreicht, um mindestens 90% der Flüssigkeit aus dem Inneren der Liposomen zu entfernen, und
(iii) Eintröpfeln von Gas in die Liposomen, bis ein Umgebungsdruck erreicht wird,
wobei die Liposomen in einem wässerigen Träger suspendiert sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, weiter umfassen das Abkühlenlassen der Liposomen vor und während Schritt (i) auf eine Temperatur von -10ºC und -20ºC, das Erwärmenlassen der Liposomen während Schritt (ii) auf eine Temperatur zwischen 10ºC und 20ºC und das Erwärmenlassen der Liposomen während Schritt (iii) auf Umgebungstemperatur.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, wobei der negative Druck zwischen 93 kPa (700 mmHg) und 101 kPa (760 mmHg) liegt und für 24 bis 72 Stunden angelegt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei das Gas in die Liposomen über eine Zeitspanne von 4 bis 8 Stunden eingetröpfelt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, welches weiter nach Schritt (iii) das Extrudieren der Liposomen durch mindestens einen Filter mit ausgewählter Porengröße umfaßt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei das Gas aus der Gruppe, bestehend aus Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, Argon, Xenon, Neon und Helium, ausgewählt ist.
15. Kit für die Ultraschall-Bildgebung, umfassend gasgefüllte Liposomen, deren Inneres, wenn sie in einem wässerigen Träger suspendiert sind, zu mindestens 90% frei von Flüssigkeit ist.
16. Kit zur Ultraschall-Bildgebung nach Anspruch 15, wobei die gasgefüllten Liposomen durch ein Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung erhältlich sind.
17. Kit nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, weiter umfassend übliche Ultraschall-Bildgebungskomponenten.
18. Verwendung eines Kontrastmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Ultraschall- Bildgebung eines inneren Körperbereichs eines Patienten durch Verabreichung der Zusammensetzung an den Patienten und Scannen des Patienten, um sichtbare Bilder des Bereichs zu erhalten.
19. Verwendung nach Anspruch 18 zur Diagnose des Vorhandenseins von krankhaftem Gewebe.
20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Patient im Bereich des Rechtsherzens des Patienten gescannt wird.
21. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Patient im Bereich des Linksherzens des Patienten gescannt wird.
22. Zusammensetzung, die, in einem wässerigen Träger, ein gasgefülltes Liposom umfaßt, dessen Inneres zumindest 90% frei von Flüssigkeit ist.
23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das gasgefüllte Liposom durch ein Verfahren der Vakuumtrocknung-Gaseintröpfelung erhältlich ist.
24. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Liposom polymerisierte Lipide umfaßt.
25. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, die weiter Polyethylenglykol umfaßt.
26. . Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Liposom ein Material zum in vivo-Targeting umfaßt.
27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Targetingmaterial Kohlenhydrat umfaßt.
28. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Liposom gegenüber Druckänderungen stabil ist.
29. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Liposom ein Lipid umfaßt, das aus der Gruppe, bestehend aus Fettsäuren, Lysolipiden, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Sphingomyelin, Cholesterin, Cholesterinhemisuccinat, Tocopherolhemisuccinat, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinosit, Glycosphingolipiden, Glucolipiden, Gycolipiden, Sulfatiden, Lipiden mit Ether- und Esterverknüpften Fettsäuren, polymerisierten Lipiden, Diacetylphosphat, Stearylamin, Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Cardiolipin, Phospholipiden mit kurzkettigen Fettsäuren mit einer Länge von 6-8 Kohlenstoffen, synthetischen Phospholipiden mit asymmetrischen Acylketten, 6-(5-Cholesten-3β- yloxy)-1-thio-β-D-galactopyranosid, Digalactosyldiglycerid, 6-(5-Cholesten- 3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxy-1-thio-β-D-galactopyranosid, 6-(5- Cholesten-3β-ylxy)hexyl-6-amino-6-deoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid, Dibehenoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin und Dioleoylphosphatidylcholin und Kombinationen davon, ausgewählt ist.
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