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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel gegen Fettsucht, und genauer gesagt ein
Mittel gegen Fettsucht, das Cholest-4-en-3-on (4-Cholesten-3-on) als einen
wirksamen Bestandteil enthält.
HINTERGRUND
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Mit Fettsucht ist ein körperlicher Zustand gemeint, bei dem Fettgewebe (Körperfett)
systematisch übermäßig gespeichert wird, was das Ergebnis einer höheren Zufuhr
von Energie als dem Verbrauch von Energie über einen langen Zeitraum hinweg ist.
Die Fettsucht ist begleitet von einer Einschränkung der physischen Aktivität und
einer übermäßigen Belastung verschiedener innerer Organe und führt zu
verschiedenen, damit verknüpften Erkrankungen wie Arteriosklerose, Tumorbildung
und Diabetes mellitus und somit einer ruinierten Gesundheit des Fettsüchtigen.
Bis heute wurde eine Vielzahl medizinisch-therapeutischer Methoden zur Prävention
der Fettsucht vorgeschlagen, doch müssen diese Methoden verschiedene
Schwierigkeiten bewältigen, um eine zufriedenstellende Wirkung zu gewährleisten.
So erweist sich beispielsweise eine Arzneimitteltherapie unter Verwendung von
Hormonen oder Stoffwechsel-anregender Mittel als darin problematisch, daß
gleichzeitig mit der Zersetzung der Körperfette auch eine Zersetzung von
Körperproteinen gefördert wird. Von den Hormonen ist ein bestimmtes androgenes Hormon
dafür bekannt, gegen Fettsucht gerichtete Wirkungen durch Stimulierung der
myotropen Wirkung und dadurch einer geförderten Verdauung von gespeicherten
Fetten zu zeigen. Beispiele solcher androgener Hormone umfassen
Dehydroepiandrosteron und 3-Keto-Δ-↑-9-19-norsteroid (Japanische ungeprüft veröffentlichte
Patentschrift Nr. Hei 02-275895). Außerdem zeigen Appetitzügler und
Verdauungsenzymhemmer das Problem von Nebenwirkungen, z. B. ein nervöses
Symptom und Diarrhoe.
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Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines
Mittels gegen Fettsucht, das frei von den vorangegangenen Nachteilen ist.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfinder dieser Erfindung haben festgestellt, daß 4-Cholesten-3-on eine
hemmende Wirkung auf die Speicherung von Fett aufweist und daß Fettsucht durch
die Verabreichung der Verbindung verhütet und behandelt werden kann, und haben
so die vorliegende Erfindung zum Abschluß gebracht.
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Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel gegen
Fettsucht bereitgestellt, das 4-Cholesten-3-on als einen wirksamen Bestandteil
enthält und in der Prävention und Behandlung der Fettsucht wirksam ist.
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Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine
medizinische Zusammensetzung bereitgestellt, die 4-Cholesten-3-on als einen
wirksamen Bestandteil und einen pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträger
umfaßt, und die zur Prävention und Behandlung der Fettsucht wirksam ist.
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Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
4-Cholesten-3-on in der Präparation einer medizinischen Zusammensetzung zur
Prävention oder Behandlung der Fettsucht.
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Das Mittel gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung ist recht nützlich, da es
praktisch ungiftig ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Abb. 1 zeigt den zeitlichen Verlauf beim mittleren Körpergewicht von CDF1-Mäusen
in jeder Gruppe.
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Abb. 2 zeigt die Relation zwischen dem Alter in Monaten und der Überlebensrate von
CDF1-Mäusen in jeder Gruppe.
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Abb. 3 zeigt die mittleren Gewichte der Organe, d. h. Hirn, Lunge, Herz, Leber,
Nieren, Milz und Hoden (oder Eierstöcke) von 18 Monate alten CDF1-Mäusen in
jeder Gruppe.
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Abb. 4 zeigt die mittleren Gewichte der Organe, d. h. Hirnanhangdrüse und
Nebenniere, von 18 Monate alten CDF1-Mäusen in jeder Gruppe.
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Abb. 5 zeigt die mittlere Fettmenge, wie in Bauchfettgewebe von 18 Monate alten
CDF1-Mäusen in jeder Gruppe vorhanden.
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Abb. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf beim gemittelten Körpergewicht von CDF1-
Mäusen in jeder Gruppe.
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Abb. 7 zeigt die Mittelwerte der Serumlipide von CDF1-Mäusen in jeder Gruppe.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
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4-Cholesten-3-on kann chemisch synthetisiert oder ausgehend von Cholesterin als
einem Substrat unter Verwendung von Cholesterinoxidase (Cholesterin : Sauerstoff-
Oxidoreduktase; EC1, 1, 3, 6) hergestellt werden, wie durch Brevibacterium sp.,
Cullulomonas sp., Nocardia erythropolis, Pseudomonas fluorescens, Schizophyllum
commune, Streptomyces sp., Mycobacterium Cholesterinicum oder anderen
Mikroorganismen produziert. Darüber hinaus ist es auch möglich, kommerziell
verfügbares 4-Cholesten-3-on zu verwenden, das mittels eines beliebigen der
vorangegangenen Verfahren hergestellt wurde.
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Die Verbindung, 4-Cholesten-3-on, ist dargestellt durch die folgende Formel (I) und
weist die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:
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(1) Molekülformel: C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub4;O
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(2) Molekulargewicht: 384.65
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(3) Schmelzpunkt (mp): 82ºC
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(4) Spezifisches Drehvermögen, [α]D: + 88º (in Chloroform)
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(5) UVλ max (mn): 240, 320
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(6) : Löslichkeit: Die Verbindung ist in Wasser kaum löslich; in Alkohol etwas löslich;
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in Ether, Chloroform, Pyridin, Benzol und Petroleumether löslich; und in Fetten
und Ölen in hohem Maße löslich.
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(7) Geschmack · Geruch · Farbe. Die Verbindung liegt bei Normaltemperatur als
stabiler geschmackloser, geruchloser und farbloser Kristall vor.
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(8) CAS-Nummer: CAS [601-57-0]
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Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, daß
der Mechanismus, mittels dessen die Verbindung 4-Cholesten-3-on die der Fettsucht
entgegengerichtete Wirkung zeigt, der folgende ist: Die in Form von Nahrung
aufgenommenen Fette werden in das Innere der Kugelmembran des Chylomikrons
überführt, d. h. eines Lipoproteins im Dünndarm, und werden dann in Fettgewebe
überführt. Die in der Leber synthetisierten Fette dagegen werden in das Innere der
Kugelmembran eines VLDL (Lipoprotein sehr geringer Dichte) und dann in die
Fettgewebe überführt. Diese Lipoproteine mit ihrer Fett-transportierenden Funktion
wie Chylomikron und VLDL, sind jeweils aus einer Membran geformt, die drei
Komponenten umfaßt, nämlich Cholesterin, Phospholipide und Apoproteine, und
dazu dient, die Lipide, d. h. Triglycerid und Cholesterinester, darin aufzunehmen und
sie zu jedem Gewebe zu transportieren. Wie oben erläutert wurde, ist Cholesterin ein
Hauptbestandteil des Lipoproteins mit einer Fett-transportierenden Funktion.
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4-Cholesten-3-on verstärkt die Wirkung des Cholesterins, hemmt dadurch die
Bildung des zuvorgenannten Lipoproteins und wiederum den Transport der Lipide
und zeigt demzufolge die hemmende Wirkung auf die Speicherung von Körperfett.
Als Folge dessen gewährleistet die Verbindung die Fettsucht-hemmende Wirkung.
Alternativ dazu wird auch angenommen, daß 4-Cholesten-3-on die Bildung von
Nebennierencorticoid durch eine antagonistische Wirkung auf die des Cholesterins
und dadurch wiederum die Bildung von Fettsäuren in der Leber hemmt und als Folge
dessen die Verbindung ihre der Fettsucht entgegengerichtete Wirkung zeigt.
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Unter Verwendung des Mittels gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung können
Nahrungsmittelprodukte hergestellt werden. Wird das Mittel in
Nahrungsmittelprodukte aufgenommen, so kann 4-Cholesten-3-on jeder Art von Lebensmittel direkt
zugegeben werden, oder die Verbindung kann alternativ dazu zunächst Fetten und
Ölen als Ausgangsstoffe für ein angestrebtes Nahrungsmittel zugegeben und dann
das Nahrungsmittel aus den Fetten und Ölen hergestellt werden. 4-Cholesten-3-on
kann einem Nahrungsmittel oder Fetten und Ölen in einer Menge im Bereich von
1 bis 5.000 mg pro 100 g Nahrungsmittel oder Fetten und Ölen zugegeben werden.
Darüber hinaus kann 4-Cholesten-3-on zu verschiedenen pharmazeutischen
Formulierungen wie Lösungen, Suspensionen, Kapseln, Pulver, Granulat, Körnern
oder Tabletten (Pillen) formuliert werden und diese Formulierungen dann den
Nahrungsmitteln oder Fetten und Ölen zugegeben werden.
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Das Mittel gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung kann auch zu
Arzneimittelpräparationen formuliert werden. In diesem Fall können die Formulierungen auf
einem beliebigen Weg verabreicht werden. Sie können zum Beispiel auf dem oralen,
intravenösen, intraperitonealen, subkutanen oder intramuskulären Weg verabreicht
werden, wobei die Verabreichung auf dem oralen Wege bevorzugt ist. Im Falle der
oralen Verabreichung kann 4-Cholesten-3-on einzeln oder in Kombination mit
pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträgern in Form verschiedener
Präparationen wie Lösungen, Suspensionen, Pulver, Granulat, Kapseln oder Tabletten
verabreicht werden. Die Arzneimittelträger können allgemein verwendete sein, z. B.
Zucker wie Lactose, Sucrose und Glucose; Stärken; anorganische Stoffe wie
Calciumcarbonat und Calciumsulfat; kristalline Cellulose, destilliertes Wasser,
gereinigtes Wasser, Sesamöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Olivenöl und
Baumwollsamenöl. Bei Formulierung der Verbindung zu Präparationen können verschiedene
Zusatzstoffe verwendet werden, zu deren Beispielen Bindemittel, Schmiermittel,
Dispersionsmittel, Suspendiermittel, Emulgatoren, Verdünnungsmittel, Puffer,
Antioxidantien und Germizide zählen. Darüber hinaus können geeignete Puffer,
isotonische Lösungen und ähnliches den Verbindungen zugegeben und dann das
resultierende Gemisch z. B. in Ölen wie Pflanzenölen aufgelöst werden, um
injizierbare Lösungen zu erhalten. 4-Cholesten-3-on kann auch mit anderen
Arzneistoffen gemischt oder in Kombination damit verwendet werden. Diesbezüglich
können die vorausgehend genannten pharmazeutischen Präparationen einer
Sterilisationsbehandlung unterzogen werden.
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Die Dosis des Mittels gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung variiert in
Abhängigkeit zum Beispiel von Alter, Geschlecht, klinischen Symptomen, Darreichungsweg,
Verabreichungshäufigkeit pro Tag, Dosierungsformen, doch liegt die Dosis für
Erwachsene erwünschterweise im Bereich von etwa 1 bis 1.500 mg/kg
Körpergewicht/Tag bezogen auf das Gewicht des 4-Cholesten-3-ons für die orale
Verabreichung.
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Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
ausführlich erläutert werden. Diese Beispiele sollen in keinem Falle den Umfang der
vorliegenden Erfindung einschränken, sondern der Veranschaulichung der
vorliegenden Erfindung dienen.
(Beispiel 1)
A. Testverfahren
1. Versuchstiere und Pflegebedingungen
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Männliche und weibliche CDF1-Mäuse (BALB/C x DBA/2 F1) im Alter von 4 Wochen
(erhältlich von Charles River Japan Inc.; insgesamt 300 Tiere (jeweils 150 männliche
und 150 weibliche)) wurden in drei Gruppen aufgeteilt, d. h. eine 4-Cholesten-3-on-
Füttergruppe, eine Cholesterin-Füttergruppe und eine unbehandelte Kontrollgruppe
(jede Gruppe wurde in zwei Untergruppen unterteilt, die jeweils 50 männliche und
50 weibliche Tiere umfaßte). Der folgende Test wurde unter Verwendung dieser 6
Untergruppen vorgenommen.
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Alle Mäuse wurden in Aluminiumkäfigen untergebracht (5 Tiere pro Käfig) und 17
Monate in einem Tierraum bei einer Temperatur von 24 ± 1ºC und einer relativen
Feuchtigkeit von 55 ± 5% und bei einem 12 : 12 Std. Hell-/Dunkel-Zeitschema
gezüchtet. Die Käfige und die Streu (White-Flocken) wurden jeden zweiten Tag
erneuert.
2. Zubereitung des Versuchsfutters
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Die folgenden Testfutter (1) bis (3) wurden unter Verwendung eines handelsüblichen
Futters mit hohem Fettgehalt für die Aufzucht (Typ CMF, Oriental Yeast Co., Ltd.,
Tokyo) als Grundnahrung zubereitet, zu Kügelchen geformt und in Schüttrichter
eingebracht. Als Trinkwasser wurde Leitungswasser in Wasserflaschen eingeführt,
und wurde Futter und Wasser den Tieren ad libitum zur Verfügung gestellt. Wurde
das folgende Futter 1) und 2) verwendet, so betrugen die Dosen an 4-Cholesten-3-
on bzw. Cholesterin pro Maus etwa 650 mg/kg Körpergewicht/Tag.
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1) Futter für die 4-Cholesten-3-on-Füttergruppe: 4-Cholesten-3-on (erhältlich von
Aldrich Chemical Co., USA) wurde der Grundnahrung in einer Menge von 0,5
Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Grundnahrung, zugegeben.
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2) Futter für die Cholesterin-Füttergruppe: Cholesterin (erhältlich von Aldrich
Chemical Co., USA) wurde der Grundnahrung in einer Menge von 0,5 Gew.-%,
bezogen auf das Gewicht der Grundnahrung, zugegeben.
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3) Futter für die unbehandelte Kontrollgruppe: Der Grundnahrung wurde keinerlei
Zusatzstoff zugegeben.
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Das CMF-Futter wies die folgende Zusammensetzung auf: Rohproteine 29,4%;
Rohfette 8,7%; Mineralien 6,5%; Rohfasern 3, 4%; löslicher Stickstofffreier Extrakt
43,6%; und wies einen Feuchtigkeitsgehalt von 8,4% und einen Kalorienwert von
370 Kcal/100 g auf. Hierbei handelte es sich um ein Futter mit einem höheren
Fettgehalt und Kalorienwert als beim handelsüblichen Futter, das einen
Rohfettgehalt von 4, 4% und einen Kalorienwert von 343 Kcal/100 g aufweist.
3. Zu untersuchende Parameter
(1) Bestimmung der Veränderungen beim Körpergewicht
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Alle überlebenden Mäuse wurden monatlich auf ihr Körpergewicht untersucht,
gefolgt von einer Berechnung des Mittelwerts daraus für jede Gruppe.
(2) Bestimmung der Überlebensrate
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Die Anzahl der überlebenden Tiere wurde monatlich bestimmt, um die
Überlebensrate zu errechnen. Darüber hinaus wurden die toten Mäuse einer
Autopsie unterzogen, um das Auftreten von Tumoren und anderer Schädigungen zu
untersuchen, und die erhaltenen Ergebnisse wurden aufgezeichnet.
(3) Bestimmung des Organgewichts
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Nach 17-monatiger Fütterung wurden alle Mäuse durch Anästhesieren mit
Kohlendioxid geopfert und die Tiere, die frei von jeglicher Schädigung waren, zur
Untersuchung des Auftretens von Tumoren und anderen Schädigungen seziert. Bei
Tieren ohne Schädigungen wurde das Gewicht von Hirn, Lunge, Herz, Leber, Nieren,
Milz, Hoden (oder Eierstöcken), Hirnanhangdrüse und Nebenniere gemessen und
der Mittelwert daraus für jede Gruppe errechnet.
(4) Bestimmung der Menge an Bauchfettgewebe
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Nach 17-monatiger Fütterung wurden die Tiere ohne Schädigung auf die Menge an
Bauchfettgewebe untersucht, gefolgt durch Errechnen des Mittelwerts daraus für
jede Gruppe.
(5) Bestimmung der Häufigkeitsrate von Tumoren
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Nach 17-monatiger Fütterung wurden alle Mäuse durch Anästhesieren mit
Kohlendioxid geopfert und die Anzahl der Tiere, bei denen sich ein Tumor gebildet
hatte, bewertet.
8. Testergebnisse
(1) Bestimmung der Veränderungen beim Körpergewicht
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Der zeitliche Verlauf des gemittelten Körpergewichts jeder Gruppe ist in Abb. 1
zusammen mit den Bezugsdaten aufgetragen. Jeder in Abb. 1 aufgetragene Wert ist
bezogen auf den Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Das Symbol: *
bedeutet, daß die Wahrscheinlichkeit (p) im Ergebnis des t-Tests kleiner 0,05 ist,
und das Sympol: *** bedeutet, daß p kleiner 0,001 ist.
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Einen Monat nach Beginn des Experiments wurde das Körpergewicht der 4-
Cholesten-3-on-Füttergruppe (sowohl männliche als auch weibliche Gruppen) als
geringer befunden als das für die unbehandelten Kontrollgruppen beobachtete,
wobei die Differenz zwischen beiden im zeitlichen Verlauf größer wurde. Nach 4
Monaten war das Körpergewicht der 4-Cholesten-3-on-Füttergruppe (männliche
Untergruppe) um 13% geringer als das der Kontrollgruppe, woraufhin die Differenz
zwischen ihnen dann zwischen 13 und 15% variierte, während das Körpergewicht
der 4-Cholesten-3-on-Füttergruppe (weibliche Untergruppe) um 12% geringer war als
das der Kontrollgruppe nach 6 Monaten und die Differenz zwischen ihnen dann
zwischen 12 und 14% variierte.
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Das Körpergewicht der Cholesterin-Füttergruppen (sowohl männliche als auch
weibliche Gruppen) war nahezu identisch mit dem für die unbehandelten
Kontrollgruppen, doch neigten sie im zeitlichen Verlauf zum Steigen im Vergleich mit dem
der Kontrollgruppe.
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Die Bezugsdaten für männliche Tiere sind die von Morisada et al. (Jpn. J. Cancer
Res., 1989, 80, S. 77-82), berichteten, d. h. das mittlere Körpergewicht von CDF1-
Mäusen (erhältlich von Charles River Japan Inc.), die bis zum Alter von 4 Monaten
unter Verwendung des handelsüblichen Fertigfutters gezüchtet und aufgezogen
wurden. Diese Daten sind fast identisch mit den für die 4-Cholesten-3-on-
Füttergruppe erhaltenen Daten.
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Die männlichen und weiblichen Mäuse in den 4-Cholesten-3-on-Füttergruppen
wuchsen in normalem Aussehen auf, während die Mäuse der
Cholesterin-Füttergruppen und unbehandelten Kontrollgruppen eindeutig eine korpulenten Körper
aufwiesen. Die vorangegangenen Ergebnisse weisen darauf hin, daß das
Körpergewicht der Cholesterin-Füttergruppen und unbehandelten Kontrollgruppen in
fettsüchtiger Weise aufgrund der Fütterung eines Futtermittels mit hohem
Energiewert erhöht war, während die 4-Cholesten-3-on-Füttergruppen normal
aufgezogen und gezüchtet waren.
(2) Bestimmung der Überlebensrate
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Die für jede Gruppe beobachtete Mortalitätskurve ist in Abb. 2 gezeigt.
Es ist keine signifikante Differenz bei der Überlebensrate zwischen den getesteten
Gruppen (einschließlich sowohl männlicher als auch weiblicher Untergruppen) von
bis zu 18 Monate alten Mäusen feststellbar.
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Diese Tatsache weist darauf hin, daß die Fütterung von 4-Cholesten-3-on die
Mortalität nicht beeinflußt und es für ungiftig gehalten wird.
(3) Bestimmung der Organgewichts
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Das gemittelte Gewicht dieser Organe, wie für jede Gruppe beobachtet, ist in Aben.
3 und 4 aufgetragen.
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Es zeigte sich keine signifikante Differenz beim Gewicht jedes Organs, d. h. Hirn,
Lunge, Herz, Leber, Nieren, Milz oder Hoden (oder Eierstöcke) zwischen den
Gruppen (einschließlich sowohl männlicher als auch weiblicher Untergruppen).
Darüber hinaus wurde auch keine signifikante Differenz beim Gewicht der
Hormonproduzierenden Organe, d. h. Hirnanhangdrüse und Nebenniere, zwischen den
Gruppen (sowohl männliche als auch weibliche Untergruppen) beobachtet.
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Wie aus diesen Fakten ersichtlich, beeinflußte die Fütterung von 4-Cholesten-3-an
das Wachstum und die Funktionen jedes Organs nicht nachteilig.
(4) Bestimmung der Menge an Bauchfettgewebe
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Die durchschnittliche Menge an Bauchfettgewebe, wie für jede Gruppe beobachtet,
ist in Abb. 5 gezeigt. Jeder Wert in Abb. 5 ist bezogen auf den Mittelwert ±
Standardabweichung ausgedrückt. Das Symbol: * bedeutet, daß die Wahrscheinlichkeit (p) im
Ergebnis des t-Tests kleiner 0,05 ist, und das Symbol: ** bedeutet, daß p kleiner
0,01 ist.
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Die durchschnittliche Menge an Bauchfettgewebe, wie für die 4-Cholesten-3-on-
Füttergruppe beobachtet, betrug etwa 113 dessen für die unbehandelte
Kontrollgruppen und die Cholesterin-Füttergruppen bei den männlichen Untergruppen
beobachteten und etwa die Hälfte des für die unbehandelte Kontrollgruppen und die
Cholesterin-Füttergruppen bei den weiblichen Untergruppen beobachteten.
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Außerdem wiesen die unbehandelten Kontroll- und Cholesterin-Füttergruppen
subkutane Fettpolster im Rücken- und Bauchbereich auf, während die 4-Chalesten-
3-on-Füttergruppe lediglich ein leichtes subkutanes Fettpolster in diesen Bereichen
aufwies (Daten sind nicht gezeigt).
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Es kann gefolgert werden, daß die Fütterung von 4-Cholesten-3-on die Speicherung
von Körperfett im Bauch und subkutanen Bereich hemmt und die Fettsucht
verhindert.
(5) Bestimmung der Häufigkeitsrate von Tumoren
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Die Zahl der Tumorvorkommen, wie in jeder Tiergruppe festgestellt, sind in der
folgenden Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1: Auftreten von Tumor bei CDF1-Mäusen Anzahl der Mäuse mit Tumoren
Tabelle 1 (Forts.) Anzahl der Mäuse mit Tumoren
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a) Anzahl der Mäuse, die Lebensmonat 18 überlebten; b) Der Zahlenwert in
Klammern zeigt den prozentualen Anteil.
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In allen Gruppen wurde eine Dünndarm-Polyposis (einer der gutartigen Tumoren) in
hohem Vorkommen beobachtet, das nicht weniger als 40% bei männlichen Mäusen
und nicht weniger als 30% bei weiblichen Mäusen betrug, doch war überhaupt keine
signifikante Differenz beim Vorkommen zwischen den getesteten Gruppen
beobachtbar. Bezüglich Tumoren, die sich an Stellen wie Lunge, Leber, Milz,
Sexualorganen und anderen Stellen bildeten, wurde keinerlei charakteristische
Tendenz in allen Gruppen beobachtet. Darüber hinaus war das Gesamtvorkommen
von Tumoren bei den männlichen Mäusen größer als bei den weiblichen Mäusen,
doch war überhaupt keine signifikante Differenz beim Vorkommen zwischen den
getesteten Gruppen beobachtbar.
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Es kann aus den vorangegangenen Fakten gefolgert werden, daß die Fütterung von
4-Cholesten-3-on (etwa 650 mg/kg Körpergewicht/Tag) keine Karzinogenität und
Tumor-fördernde Wirksamkeit zeigt. Es wurde berichtet, daß die Dünndarm-
Polyposis bei einem Anteil von 51% bzw. 37% für männliche bzw. weibliche BALBlc-
Mäuse von 12 Monaten entsteht, wobei die weiblichen BALB/c-Mäuse die Mütter der
CDF1-Mäuse sind (Mizutani et al., Cancer Lett., 1984, 25, S. 19-23). Demgemäß ist
das Auftreten von Dünndarm-Polyposis in allen getesteten Gruppen aus dem
Grunde hoch, daß die Polyposis von den CDF1-Mäusen ererbt wird.
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Außerdem war kein charakteristischer Unterschied zwischen den getesteten
Gruppen hinsichtlich der Entwicklung von anderen Erkrankungen oder Schädigungen
als Tumoren beobachtbar.
(Beispiel 2)
A. Testverfahren
1. Versuchstiere und Pflegebedingungen
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Männliche und weibliche CDF1-Mäuse von 5 Wochen (erhältlich von Charles River
Japan Inc.; insgesamt 60 Tiere) wurden in sechs Gruppen aufgeteilt (jeweils 30
Tiere), d. h. männliche und weibliche Gruppen, denen herkömmliches Futter gefüttert
wurde (im folgenden bezeichnet als "Füttergruppe mit herkömmlichem Futter"), in
männliche und weibliche Gruppen, denen ein Futter mit hohem Fettgehalt gefüttert
wurde (im folgenden bezeichnet als "Füttergruppe mit Futter eines hohen
Fettgehalts") und in männliche und weibliche Gruppen, denen ein Futter mit einem
hohen Fettgehalt und einem 4-Cholesten-3-on-Gehalt gefüttert wurde (im folgenden
bezeichnet als "4-Cholesten-3-on-Füttergruppe"), wobei jede Gruppe 10 Mäuse
umfaßte. Alle Mäuse wurden in Aluminiumkäfigen untergebracht (5 Tiere pro Käfig)
und 13 Monate in einem Tierraum bei einer Temperatur von 24 ± 1ºC und einer
relativen Feuchtigkeit von 50 ± 5% und bei einem 12 : 12 Std. Hell-/Dunkel-
Zeitschema gezüchtet. Die Käfige und die Streu wurden jeden zweiten Tag erneuert.
2. Zubereitung des Versuchsfutters
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Die folgenden Testfutter (1) bis (3) (Maischefutter) wurden unter Verwendung einer
modifizierten AIN-Formel-gereinigten Nahrung (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo) als
Grundnahrung zubereitet und in Schüttrichter eingebracht. Als Trinkwasser wurde
Leitungswasser in Wasserflaschen eingebracht und Futter und Wasser den Tieren
ad libitum zur Verfügung gestellt.
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1) Futter für die Ausgangsfutter-Füttergruppe: Es wurde das Grundfutter als solches
verwendet. Sein Fettgehalt wurde mit 6% festgestellt.
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2) Futter für die Füttergruppe eines Futters mit hohem Fettgehalt: Dem Grundfutter
wurde Sojabohnenöl in einer Menge von 11,5 g pro 100 g des ersteren zur
Einstellung seines Fettgehalts auf 15% zugegeben.
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3) Futter für 4-Cholesten-3-on-Füttergruppe: Dem Futter für die Füttergruppe eines
Futters mit hohem Fettgehalt wurde 4-Cholesten-3-on zugegeben (erhältlich von
Aldrich Chemicals Co., USA) bis zu einer Konzentration von 1% zugegeben. Sein
Fettgehalt entsprach 14,8%.
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Die modifizierte AlN-Formel-gereinigte Nahrung weist die folgende
Zusammensetzung auf: Maisstärke 41,5%; Casein 25%; α-Stärke 10%; Cellulosepulver 8%;
Sojabohnenöl 6%; Mineralien (AIN-76) 3,5%; granulierter Zucker 5%; und Vitamine
(AlN-76 und Cholinbitartrat) 1%.
3. Zu untersuchende Parameter
(1) Bestimmung der Veränderungen beim Körpergewicht
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Die Mäuse wurden auf ihr Körpergewicht am 6. und 13. Tag untersucht, gefolgt von
einer Berechnung des Mittelwerts daraus für jede Gruppe. Jedes Nahrungsmittel
wurde jeden zweiten Tag durch neues ersetzt, wobei bei diesem Schritt das
verbliebene Nahrungsmittel zur Berechnung der Menge der
Nahrungsmittelaufnahme abgewogen wurde.
2) Autopsie und Analyse der Lipide im Serum
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Nach 13-tägiger Zucht wurden alle Mäuse unter Verwendung von Kohlendioxid
geopfert und dann die Autopsie und die Analyse der Lipide in den Seren
vorgenommen.
B. Testergebnis
(1) Bestimmung der Veränderungen beim Körpergewicht
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Die Abweichung des mittleren Körpergewichts jeder Gruppe ist in Abb. 6
aufgetragen. Jeder in Abb. 6 aufgetragene Wert ist bezogen auf den Mittelwert aus
10 Tieren in jeder Gruppe ± Standardabweichung ausgedrückt. Das Symbol: *
bedeutet, daß die Wahrscheinlichkeit (p) im Ergebnis des t-Tests kleiner 0,05 ist,
und das Symbol: *** bedeutet, daß p kleiner 0,001 ist. Die Füttergruppe mit
herkömmlichem Futter und die Füttergruppe mit Futter eines hohen Fettgehalts
zeigte eine konstante Zunahme im Körpergewicht, während die 4-Cholesten-3-on-
Füttergruppe keinerlei Anstieg im Körpergewicht zeigte und das Körpergewicht sogar
eher zur Abnahme neigte. Im Falle der männlichen Mäuse war bald, nämlich schon
nach 6 Tagen, eine statistisch signifikante Differenz (p < 0,05) zwischen der 4-
Cholesten-3-on-Füttergruppe und den anderen beiden Gruppen beobachtbar. Im
Falle der weiblichen Mäuse war dasselbe Phänomen wie bei den männlichen
Mäusen beobachtbar, doch nahm die Differenz über den gesamten Zeitraum hinweg
beständig zu.
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Die Mengen der Nahrungsaufnahme, wie bezogen auf das Gewicht (g)/Tier/Tag
ausgedrückt, wurden als 4,20 für die Ausgangsfutter-Füttergruppe befunden, 4,25 für
die Füttergruppe mit Futter eines hohen Fettgehalts bzw. 4,38 für die 4-Cholesten-3-
on-Füttergruppe festgestellt und waren daher annähernd miteinander identisch. Die
Menge an 4-Cholesten-3-on, die den jeweiligen Gruppen gefüttert wurde, wurde
ausgehend von der derart bestimmten Menge der Futteraufnahme mit etwa 2.100
mg/kg Körpergewicht/Tag berechnet.
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Die Mäuse in jeder der Testgruppen waren sichtlich aktiv, und es lagen keinerlei
klinische Symptome wie Rauhheit des Fells und Diarrhoe vor.
(2) Autopsie und Analyse der Lipide im Serum
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Als Ergebnis der Autopsie wurden keine Abnormalitäten wie Hypertrophie, Atrophie
und veränderter Farbton der Hauptorgane, d. h. Lunge, Herz, Leber, Nieren, Milz und
Hoden (oder Eierstöcke) als auch der Nebennieren, bei allen getesteten Gruppen
beobachtet.
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Die Ergebnisse der Analyse der Serumlipide sind in Abb. 7 gezeigt. Jeder in Abb. 7
gezeigte Wert ist bezogen auf den Mittelwert aus 10 Tieren in jeder Gruppe ±
Standardabweichung ausgedrückt. Das Symbol: * bedeutet, daß die
Wahrscheinlichkeit (p) im Ergebnis des t-Tests kleiner 0,05 ist, das Symbol: ** bedeutet, daß p
kleiner 0,01 ist und das Symbol: *** bedeutet, daß p kleiner 0,001 ist. Der
Triglyceridgehalt im Serum war in der 4-Cholesten-3-on-Füttergruppe vermindert,
wobei diese Tendenz bei den männlichen Mäusen besonders auffällig war. Der
Gesamtcholesteringehalt im Serum dagegen, wie für die 4-Cholesten-3-on-
Füttergruppe beobachtet, war geringfügig höher als der für die Ausgangsfutter-
Füttergruppe beobachtete Gehalt und war nahezu identisch mit dem für die
Füttergruppe mit Futter eines hohen Fettgehalts beobachteten Gehalt. Die
Phospholipidwerte in den Seren, wie für die 4-Cholesten-3-on-Füttergruppe und die
Ausgangsfutter-Füttergruppe beobachtet, waren für die männlichen Mäuse
annähernd miteinander identisch, während die für die weiblichen Mäuse
beobachteten Werte etwas höher als die für die männlichen Mäuse beobachteten
Werte waren, doch wurde keine statistisch signifikante Tendenz festgestellt.
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Das vorangegangene weist darauf hin, daß das Körpergewicht der CDF1-Mäuse
nicht erhöht war, doch durch Zugabe von 1% 4-Cholesten-3-on zum Futter sank und
daß die Triglyceridwerte in den Seren der CDF1-Mäuse ebenfalls vermindert waren.
Es wurde auch festgestellt, daß die Körpergewicht-kontrollierende Wirkung von 4-
Cholesten-3-on unabhängig von der Differenz in der Menge der Futteraufnahme war.
Darüber hinaus wurde 4-Cholesten-3-on als praktisch ungiftig befunden.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Das Mittel gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung ist aufgrund der hemmenden
Wirkung auf eine Zunahme des Körpergewichts und die Speicherung von Körperfett
wichtig. Darüber hinaus ist das Mittel gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung
praktisch ungiftig und kann die Speicherung von Körperfett hemmen und dadurch zur
Prävention oder Behandlung der Fettsucht selbst dann dienen, wenn Nahrung mit
hohem Energiewert aufgenommen wird. Das Mittel gegen Fettsucht der Erfindung ist
außerdem nützlich, da die Prävention oder Behandlung der Fettsucht mit dem Mittel
gegen Fettsucht der vorliegenden Erfindung die Verhütung verschiedener, mit der
Fettsucht verknüpfter Erkrankungen wie Arteriosklerose, Tumorbildung und Diabetes
mellitus ermöglicht.