DE69226589T2

DE69226589T2 - Verfahren zum Nachweis eines speziellen Bestandteils in einer Probe und Reagens dazu.

Info

Publication number: DE69226589T2
Application number: DE69226589T
Authority: DE
Inventors: Takeshi C/O Canon Kabushiki Kaisha Ohta-Ku Tokyo Miyazaki; Matsuomi C/O Canon Kabushiki Kaish Ohta-Ku Tokyo Nishimura; Toshikazu C/O Canon Kabushiki Kaisha Ohta-Ku Tokyo Ohnishi; Hidehito C/O Canon Kabushiki Kaish Ohta-Ku Tokyo Takayama; Kazumi C/O Canon Kabushiki Kaisha Ohta-Ku Tokyo Tanaka
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1991-10-01
Filing date: 1992-09-23
Publication date: 1999-03-25
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: ATE169738T1; DE69226589D1; EP0536593A1; JP2683172B2; EP0536593B1; JPH0593726A; US5601983A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG:

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das technische Gebiet der Probenmessung zur Erfassung eines speziellen Spurenbestandteils in der Probe unter Nutzung beispielsweise einer Antigen-Antikörper-Reaktion oder der Hybridisierung (Verschmelzung) einer Nukleinsäure.

Stand der Technik

Die jüngsten Fortschritte bei den Nachweistechniken für spezielle Spurenkomponenten in einer Probe spielen eine wesentliche Rolle auf dem Gebiet der klinischen Tests für die Frühdiagnose oder Entdeckung verschiedener Krankheiten. Seit 1958 durch S. A. Berson et al. veröffentlicht wurde, daß Insulin mittels einer Markierung mit radioaktivem Jod erfaßt wurde, hat sich die Bestimmung von Plasmaprotein, wie etwa IgE, IgG, CRP und Mikroglobulin, Tumormarkern, wie etwa AFP, CEA und CA19-9 Hormonen, wie etwa TSH und T3, pharmazeutischen Substanzen in Blut, Viren, wie etwa HBV und HIV, Antikörpern hierfür und Nukleinsäuren, wie etwa DNA und RNA etabliert - mit der Möglichkeit einer automatisierten Verarbeitung mehrerer Proben.
Die meisten in dieser Spurenbestandteile werden durch Immunoassays unter Anwendung von Antigen-Antikörper-Reaktionen oder durch Verfahren unter Ausnutzung einer Nukleinsäure-Nukleinsäure-Verschmelzung nachgewiesen. Bei die sen analytischen Verfahren wird beispielsweise ein Antigen, ein Antikörper oder eine einkettige Nukleinsäure, die zum Eingehen einer spezifischen Bindung mit der zu bestimmenden Zielsubstanz in der Lage sind, als Sonde verwendet und auf einer festen Oberfläche, wie etwa kleinen Teilchen, Kügelchen oder einer Reaktorwand fixiert und dort eine Antigen-Antikörper-Reaktion oder eine Nukleinsäurehybridisierung mit der Zielsubstanz ausgeführt. Bei einer solchen Reaktion wird ein markiertes Antigen, ein markierter Antikörper oder eine markierte Nukleinsäure benutzt, die eine Kennzeichnungs- bzw. Markierungssubstanz mit hoher Nachweisempfindlichkeit - etwa ein Enzym, eine fluoreszierende Substanz oder eine lichtemittierende Substanz - trägt, um einen Antigen-Antikörper-Komplex oder eine doppelkettige Nukleinsäure nachzuweisen, wodurch die Menge der zu bestimmenden Zielsubstanz ermittelt wird.
Fig. 9 stellt ein typisches Beispiel eines Fluoroimmunoassays (Sandwich- Immunoassays) dar, bei dem die Zielsubstanz ein Antigen ist. Es wird ein erstes Reaktionsmittel präpariert, indem ein Antikörper 24, der eine erste zu einer spezifischen Bindung mit einem in der Probe enthaltenen Antigen 22 bildet, vorab an einem Trägerteilchen 21 fixiert wird, und dieses wird mit einer Probe, etwa einem Serum, gemischt, um eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem Antigen 22 in diesem hervorzurufen (erste Reaktion). Dann wird ein zweites Reaktionsmittel, in dem ein zu einer spezifischen Bindung mit dem Antigen 22 fähiger Antikörper 23 mit einer fluoreszierenden Substanz 25 markiert ist, zu einer Komplexbildung beigemischt (zweite Reaktion). Nach der zweiten Reaktion wird die Menge bzw. der Anteil des Antigens 22 in der Probe durch die Fluoreszenzmessung des Komplexes ermittelt.
Fig. 10 zeigt ein Beispiel für die Fluoreszenzmessung des oben erwähnten Sandwich-Immunoassay unter Einsatz des sog. Flußcytometrieverfahrens. Eine Komplexe 31, 32, die durch die oben erläuterten Reaktionen erhalten wurden, enthaltende Probeflüssigkeit ist in einem Reaktionsflüssigkeitsbad 38 unterge bracht. Es ist zu beachten, daß die Probenflüssigkeit auch verschiedener Substanzen in der Probe, Trägerteilchen, Markierungssubstanz u. ä. enthält. Das Reaktionsflüssigkeitsbad 38 wird über eine Pumpe 39 unter Druck gesetzt, um die Probenflüssigkeit in einer Fluß- bzw. Strömungszelle 35 zuzuführen. In der Flußzelle fließt eine Hüllflüssigkeit 34 zur Erzeugung einer Laminarströmung aufgrund des Hüll- oder Mantelstromprinzips, wodurch die Mehrzahl von Komplexen 31, 32 in einer Richtung strömt. Die Strömung wird mittels einer Laserlichtquelle 36 mit einem Laserstrahlbündel an der Wellenlänge bestrahlt, das die markierende fluoreszierende Substanz anregen kann. Wenn der Komplex 31 durch den Laserstrahl bestrahlt wird, wird durch das Trägerteilchen Streulicht 37a erzeugt und gleichzeitig wird von der Markierungssubstanz 33a Fluoreszenzlicht 37b emittiert. Wenn die Markierungssubstanz 33a, die Zielsubstanz 33b oder das Trägerteilchen 33c jeweils für sich unreagiert strömen, werden das Streulicht 37a und das Fluoreszenzlicht 37b nicht gleichzeitig oder nur mit sehr niedriger Intensität erzeugt. Infolgedessen können die Komplexe 31, 32 unabhängig von anderen Rauschkomponenten für sich allein selektiv gemessen werden, indem die Daten nur verwendet werden, wenn das Streulicht und das Fluoreszenzlicht gleichzeitig erzeugt werden und ein bestimmtes Niveau überschreiten.
Fig. 11 ist ein Kurvenformdiagramm, das die Signale des Streulichts und Fluoreszenzlichts bei der in Fig. 10 dargestellten Messung zeigt. In dem in Fig. 11 gezeigten Idealfall ist die Intensität des vorwärtsgestreuten Lichts hoch, wenn ein Komplex das Bestrahlungsgebiet der Strömungszelle erreicht, und niedrig außerhalb dieses Gebietes, da durch das Trägerteilchen starkes Streulichts 51 erzeugt wird. Daher wird ein Trägersignal 52 erzeugt, wenn die Intensität des vorwärts gestreuten Lichtes oberhalb eines vorbestimmten Pegels liegt, und die Intensität des Fluoreszenzlichts 53 wird zum Zeitpunkt des Trägersignals 52 gemessen, wodurch die Intensität des Fluoreszenzlichts von dem Komplex selektiv bestimmt werden kann. Wenn Fluoreszenzlicht erzeugt wird, kann die Aussage getroffen werden, daß die Zielsubstanz vorliegt und eine Antigen-Antikörper-Reaktion oder eine Nukleinsäuren-Hydbridisierungs-Reaktion stattgefunden hat. Wenn auf der anderen Seite kein Fluoreszenzlicht erzeugt wird, kann die Aussage getroffen werden, daß eine solche Reaktion nicht stattgefunden hat. Die Zielsubstanz kann durch statistische Verarbeitung einer Mehrzahl von Messungen bestimmt werden.
In der Praxis ist jedoch das Idealergebnis gemäß Fig. 11 nicht zu erhalten, da wie in Fig. 12 dargestellt - eine Erhöhung der Lichtintensität durch andere Einflüsse als das durch die Komplexe selbst vorwärts gestreute Licht bewirkt wird. Ein Beispiel für solche Einflußgrößen sind in der eigentlichen Reaktionsflüssigkeit vorhandene Schwebstoffe und darin erzeugte Blasen. In einem solchen Fall zeigt, wie in Fig. 12 dargestellt, das vorwärts gestreute Licht nicht nur ein von den Komplexen herrührendes Peak 61, sondern auch ein von den Schwebstoffen oder den Blasen herrührendes Peak 62. Folglich wird zusätzlich zum Trägersignal 63, das den Komplexen entspricht, ein falsches Trägersignal 64 aufgrund solcher Schwebstoffe oder Blasen erzeugt, so daß die Fluoreszenzintensität (der Nullpegel) zu dieser Zeit ausgelesen wird. Dies verursacht einen Fehler, der sich so auswirkt, als ob es Trägerteilchen gäbe, die keine Antigen-Antikörper-Reaktion oder Nukleinsäure-Hybridisierungs-Reaktion bewirkt haben, was signifikant die Genauigkeit der quantitativen Messung verschlechtert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Bestandteils in einer Probe anzugeben, mit dem eine Probenmessung mit einer hohen Genauigkeit erreichbar ist. Diese Aufgabe wird durch die Merkmale von Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterentwicklungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gegeben, von denen die Ansprüche 10 bis 12 auf eine vorteilhafte Vorrichtung zur Ausführungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gerichtet sind und Anspruch 13 auf die Verwendung des im Schritt (a) gemäß Anspruch 1 erhaltenen Reaktionsmittels gerichtet ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Meßvorrichtung zum Einsatz bei einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
Fig. 2 ist eine Prinzipdarstellung der Messung bei der ersten Ausführungsform,
Fig. 3 ist ein Kurvenformdiagramm, welches bei der Messung gemäß der ersten Ausführungsform erhaltenen Nachweissignale zeigt,
Fig. 4 ist eine Prinzipdarstellung der Messung gemäß der zweiten Ausführungsform,
Fig. 5 ist ein Kurvenformdiagramm, das die Erfassung von bei der Messung gemäß der zweiten Ausführungsform erhaltenen Signalen darstellt,
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung einer Messvorrichtung zum Einsatz bei einer dritten Ausführungsform,
Fig. 7 ist eine Prinzipdarstellung der Messung gemäß der dritten Ausführungsform,
Fig. 8 ist ein Kurvenformdiagramm, das bei der Messung gemäß der dritten Ausführungsform erhaltenen Nachweissignale zeigt,
Fig. 9 ist eine Prinzipdarstellung des herkömmlich Sandwich- Immunoassays Fig. 10 ist eine Prinzipdarstellung der herkömmlichen Fluoreszenzmessung unter Verwendung des Flußcytometrieverfahrens,
Fig. 11 ist ein Kurvenformdiagramm, das eine ideale Messung gemäß dem Stand der Technik verdeutlicht und
Fig. 12 ist ein Kurvenformdiagramm, das eine tatsächliche Messung beim Stand der Technik verdeutlicht.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Nachfolgend werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen erläutert.

Erste Ausführungsform

Bei einer ersten Ausführungsform wird eine die Wellenlänge von eingestrahltem Licht ändernde Substanz - speziell eine fluoreszierende Substanz - als Markierungssubstanz für Trägerteilchen eingesetzt und die Trägerteilchen werden durch erzeugtes Fluoreszenzlicht identifiziert.
Die vorliegende Ausführungsform nützt die nachfolgenden Reaktionsmittel bzw. Reagentien. Ein erstes Reagens wird durch aktives Anbinden einer ersten Substanz an eine in der Probe zu erfassenden Zielsubstanz mittels Polystyrolteilchen mit einer Teilchengröße von beispielsweise 1 um erhalten, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sind. Die fluoreszenzmarkierten Teilchen können durch physikalische oder chemische Verbindung von Polymerteilchen beispielsweise aus Polystyrol, mit der fluoreszierenden Substanz oder durch Copolymerisation eines fluoreszierenden Monomers im Zusammenhang mit der Polymerisation der Polymerteilchen erhalten werden. Die fluoreszierende Substanz kann beispielsweise aus Cyanfarbstoffen, Acridinfarbstoffen und Rhodaminfarb stoffen geeignet gewählt werden, so daß sie eine Fluoreszenzcharakteristik hat, die sich von derjenigen einer zweiten fluoreszierenden Substanz (die später erläutert wird) unterscheidet. Die aktive Anbindung der ersten Substanz an die Zielsubstanz mit den fluoreszierenden Teilchen wird mittels bekannter physikaler und chemischer Verfahren bewerkstelligt.
Beispiele der ersten, gegenüber der Zielsubstanz aktiven Substanz sind natürliche oder synthetische Peptide, Proteine, Enzyme, Zucker, Lecithine, Viren, Bakterien, Nukleinsäure, DNA, RNA und Antikörper. Von diesen Substanzen sind die nachfolgend aufgeführten klinisch besonders bedeutsam: Immunoglobuline, wie etwa IgG oder IgE, Proteine und ihre Antikörper, wie etwa Kompliment, CRP, Pheritin, α&sub1;- oder β&sub1; - Mikroglobulin, Principalmarker und ihre Antikörper, etwa α- Hetoprotein, Carcinoembryon-Antigen (CEA), DA19-9 oder CA-125, Hormone und ihre Antikörper, etwa luteinisierendes Hormon (LH), follikel-stimulierendes Hormon (FSH), menschliches Chorionin-Gonadotropin (HCG), Östrogen oder Insulin, mit Virusinfektionen in Zusammenhang stehende Substanzen und ihre rekominanten Antigene und Antikörper, wie etwa HBV-bezogene Antigene, HIV oder ATL, Bakterien oder ihre Antikörper, etwa der Diphtheriebazillus, der Botulinbazillus, Mykoplasma oder Treponemapallidum, Protozon und ihre Antikörper, wie etwa Toxoplasma, Trichomonas, Leishmania, Trypanosomia oder Malaria, Antiepileptika, wie etwa Phenytoin oder Phenobarbital, anti-arrhythmische Wirkstoffe, wie etwa Chinidin, Cardiovasculäre Wirkstoffe, wie etwa Digoxin, Vasodilatoren, wie etwa Theophyllin, Antibiotika, wie etwa Chloramphenikol oder Gentamycin, und Antikörper dieser Wirkstoffe, Enzyme, Exotorine und ihre Antiköper, wie etwa Streptolysin O. Eine zum Bewirken einer Äntigen-Antiköper-Reaktion mit der Zielsubstanz in der Probe fähige Reaktion wird in Abstimmung auf die Art der Zielsubstanz geeignet ausgewählt.
In dem Fall, daß die Nukleinsäurehybridisierung anstelle der oben erwähnten Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet wird, wird eine Nukleinsäuresonde mit einer Basensequenz komplementär zu derjenigen der nachzuweisenden Nukleinsäure ausgewählt.
Auf der anderen Seite wird ein zweites Reagens durch Verbinden einer Kennzeichnungs- bzw. Markierungssubstanz mit einer zweiten Substanz erhalten, die aktiv gegenüber der zu erfassenden Zielsubstanz ist und sich von der ersten Substanz unterscheidet. Die Markierungssubstanz ist beispielsweise eine fluoreszierende Substanz mit Fluoreszenzeigenschaften, die sich von denjenigen der zur Markierung der Trägerteilchen verwendeten fluoreszierenden Substanz unterscheiden, oder eine lichtemittierende Substanz. Das Anbinden wird chemisch durch ein Vernetzungsagens, wie etwa Polyamin oder Carbodiimid, ausgeführt.
Sowohl das erste als auch das zweite Reagens sind in einem hauptsächlich aus Wasser bestehenden Dispersionsmedium dispergiert. Dem Dispersionsmedium kann in geeigneter Weise ein pH-Puffer, ein Protein, ein oberflächenaktives Mittel oder eine wasserlösliche Polymerverbindung beigefügt sein. Die Reaktion zwischen dem ersten Reagens und dem zweiten Reagens und der Zielsubstanz schreitet in Abhängigkeit vom Reaktionsvermögen zwischen der Zielsubstanz der dieser gegenüber aktiven, im Reagens enthaltenen Substanz und auch in Abhängigkeit von der Konzentration der Zielsubstanz voran. Nach Reaktionen unter jeweils geeigneten Bedingungen wird die Reaktionsflüssigkeit mit einer hauptsächlich aus Wasser bestehenden Verdünnungsflüssigkeit verdünnt, um die Probenflüssigkeit zu erhalten.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Meßvorrichtung der vorliegenden Ausführungsform. In einem Strömungsgebiet 1a einer Strömungszelle 1 strömt die Probenflüssigkeit in eine Richtung senkrecht zur Zeichenfläche, in einem durch eine Hüll- bzw. Mantelflüssigkeit umgebenen Zustand laminarer Hochgeschwindigkeitsströmung, die durch das sog. Mantelstromprinzip bewirkt wird, wodurch die verschiedenen in der Probenflüssigkeit enthaltenen kleinen Substan zen abwechselnd längs einer Linie strömen. Eine Laserlichtquelle 2 ist senkrecht zur Strömungsrichtung angeordnet, und ein durch diese emittiertes Laserstrahlbündel wird durch eine Linse 3 in einen kleinen ovalen Leuchtfleck zur Bestrahlung des Strömungsgebietes umgewandelt. Die Wellenlänge des Laserstrahls ist so gewählt, daß sie sowohl die zur Markierung der Trägerteilchen eingesetzte fluoreszierende Substanz als auch die zur Markierung der zweiten Substanz eingesetzte anregen kann. Um gemäß dem Dunkelfeldprinzip das durch die Bestrahlungsposition hindurchlaufenden kleinen Teilchen erzeugte vorwärts gestreute Licht messen zu können, sind ein Wellenlängenfilter 10, ein Lichtunterbrecher 11, Sammellinsen 4a, 4b und ein Photodetektor 5 aufeinanderfolgend gegenüber der Linse 3 (bezogen auf die Strömungszelle 1) längs der optischen Achse angeordnet. Das Wellenlängenfilter 10 ist so aufgebaut, daß Filter mit verschiedenen Wellenlängencharakteristiken entsprechend dem konkreten Zweck der Messung eingeschaltet sein können. Bei der vorliegenden Ausführungsform ist das Wellenlängen- bzw. Wellenlängenauswahlfilter 10 zum selektiven Durchlassen der Wellenlänge λ des Laserstrahls ausgebildet.
Längs einer zur Strömungsrichtung der Probenflüssigkeit und zur Einstrahlrichtung des Laserstrahls senkrecht der optischen Achse sind in dieser Reihenfolge, ausgehend von der Strömungszelle 1, Sammellinsen 6a, 6b, eine Kollimatorlinse 6c, dichroitische Spiegel 7a, 7b mit Wellenlängenselektionseigenschaften und ein Spiegel 7c angeordnet, in den Refektionsrichtungen der die dichriotischen Spiegel 7a, 7b, sind Sperrfilter 8a, 8b und Photodetektoren 9a, 9b und in Reflektionsrichtung des Spiegels 7c ein Sperrfilter 8c und ein Photodetektor 9c vorgesehen.
Durch die Trägerteilchen, Blasen und kleine Teilchen in der Probenflüssigkeit, die nacheinander in das Strömungsgebiet 1a der Strömungszelle 1 einströmen, wird Streulicht erzeugt. Weiterhin wird durch den zur Markierung der Trägerteilchen eingesetzten fluoreszierenden Farbstoff Fluoreszenzlicht 1 einer ersten Wellenlänge erzeugt, und durch die fluoreszierende Markierungssubstanz der zweiten Substanz wird Fluoreszenzlicht 2 einer zweiten Wellenlänge erzeugt. Das Fluoreszenzlicht 1 wird durch den dichroitischen Spiegel 7a und des Sperrfilter 8a einer Wellenlängenselektion und durch den Photodetektor 9a einer Intensitätserfassung unterzogen. Weiterhin wird das Fluoreszenzlicht 2 durch den dichroitischen Spiegel 7b und das Sperrfilter 8b einer Wellenlängenselektion durch den Photodetektor 9b einer Intensitätserfassung unterzogen. Der Photodetekor 9c, der zur Erfassung der Intensität des lateralen Streulichts vorgesehen ist, kann weggelassen werden, da er bei der vorliegenden Ausführungsform nicht eingesetzt wird.
Die Ausgänge der Photodetektoren 9a, 9b, 9c werden einem Signalverarbeitungssystem 15 zugeführt, welches die Signalverarbeitung für die Probenmessung aufgrund der Signale von den Detektoren ausführt, wie weiter unten beschrieben.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Meßprinzips der vorliegenden Ausführungsform, die den Zustand im Strömungsgebiet der Strömungszelle darstellt. Die in einem Zustand der Ummantelung durch die Hüllflüssigkeit fließende Probenflüssigkeit enthält die Komplexe 31, 32, die fluoreszenzmarkierte zweite Substanz 33a, die Zielsubstand 33b, die Trägerteilchen 33c und andere Substanzen, Blasen und Partikel, die sukzessive in das Strömungsgebiet einströmen. Im Ansprechen auf den eingestrahlten Laserstrahl erzeugen die Trägerteilchen das Streulicht und das Fluoreszenzlicht 1, und die fluoreszierende Substanz erzeugt das Fluoreszenzlicht 2. Da die fluoreszierende Substanz und die Zielsubstanzen sehr klein sind, erzeugen sie kein oder nur ein schwaches Streulicht. Der Komplex 31 oder 32, der aus dem Trägerteilchen, der zur erfassenden Zielsubstanz und der fluoreszierenden Substanz gebildet ist, erzeugt bei Durchlaufen des betrahlten Abschnitts das Streulicht, das Fluoreszenzlicht 1 und das Fluoreszenzlicht 2. Wenn das Fluoreszenzlicht 1 erfaßt wird, wird es dem Vorhandensein eines Trägerteilchens zugeschrieben und bei der vorliegenden Ausführungsform als Träger zur Erfassung des Fluoreszenzlichtes 2 verwendet. Das Trägerteilchen kann auch durch das logische Produkt des Fluoreszenzlichtes 1 und des Streulichts identifiziert werden.
Fig. 3 ist ein Kurvenformdiagramm, welches die in der Vorrichtung nach Fig. 1 gemessenen Signale anzeigt. Möglicherweise ist die Intensität des vorwärts gestreuten Lichtes für die Erzeugung des Trägersignals zum Nachweis des Fluoreszenzlichts verwendet worden, aber die Genauigkeit der Messung ist ungenügend gewesen, weil das Trägersignal auch durch vorwärts gestreutes erzeugt wird, welches von Blasen und Partikeln herrührt, wie mit der Bezugsziffer 72 in Fig. 3 gezeigt. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ein Trägersignal 74 erzeugt, wenn das Fluoreszenzlicht 1 einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. Das Trägersignal kann auch durch das logische Produkt des (vorwärts oder seitlich) gestreuten Lichts und des Fluoreszenzlichts 1 erzeugt werden. Die Intensität 75 des Fluoreszenzlichtes 2 wird zum Timing des Trägersignals gemessen. Folglich ist die vorliegende Ausführungsform zu einer präzisien Bestimmung der Menge der Markierungssubstanz im Komplex in der Lage, wodurch eine hochgenaue quantitative Bestimmung der Zeilsubstanz in der Probe ohne Einfluß von Rauschkomponenten, wie etwa Staub und Blasen (wie im herkömmlichen Zustand) ermöglicht wird.
Das folgende Experiment wurde zur Verifizierung der Wirkung der oben beschriebenen Ausführungsform durchgeführt. Eine wässrige Dispersion epoxylierter Polysterolteilchen, an die die fluoreszierende Substanz FITC angebunden wurde, mit einer Teilchengröße von 1,0 um und einer Teilchenkonzentration von 0,5 Gew.- %, wurde 10.000-fach verdünnt und mit der Vorrichtung gemessen. Zum Vergleich des herkömmlichen Verfahrens und des Verfahrens der vorliegenden Ausführungsform wurde zuerst die Anzahl der durch die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts während 30 sec. erzeugten Trägersignale gezählt und dann wurde in gleicher Weise für 30 sec, die Anzahl der durch die Intensität des Fluoreszenz lichts 1 erzeugten Trägersignale gezählt. Es ergab sich, daß beim herkömmlichen Verfahren auf der Grundlage des vorwärts gestreuten Lichts der erhaltene Zählwert um etwa 20% höher lag. Es wird angenommen, daß der höhere Zählwert im Einfluß von Rauschkomponenten, wie etwa Schwebstoffen bzw. Partikeln und Blasen in der wässrigen Dispersion zuzuschreiben ist, die Anlaß zu zusätzlichen Zählungen gaben. Wie oben erläutert, ermöglichte die Verwendung der markierten Teilchen, die durch Anbinden der fluoreszierenden Substanz FITC an die Trägerteilchen präpariert wurden, eine hochgenaue Bestimmung mit hohem Signal- /Rauschverhältnis.

Zweite Ausführungsform

Bei einer nachfolgend beschriebenen zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine die Wellenlänge des eingestrahlten Lichts verändernde Substanz, genauer gesagt, eine Harmonische des Streulichts erzeugende Substanz - wie etwa SHG oder THG - zur Markierung von Trägerteilchen verwendet, und die Trägerteilchen werden durch Erfassung in der Wellenlänge umgesetzten Lichtes identifiziert.
Bei der vorliegenden Ausführungsform wird das erste Reagens beispielsweise durch Verbinden einer auf eine Zielsubstanz akiv wirkenden ersten Substanz mit kleinen Teilchen einer Teilchengröße von etwa 1 um mit SHG-Aktivität (der Fähigkeit der Erzeugung der zweiten Harmonischen; "second harmonic generation" = SHG) erhalten. Am Beispiel solcher Teilchen mit SHG-Aktivität sind Polymerpartikel mit einer polaren Substanz mit großer Hyperpolarisierbarkeit β 2. Ordnung. Spezieller kann eine solche Substanz mit SHG-Aktivität durch Dotierung von Polyoxyethylen- oder Lacton-Polymeren mit p-Nitroanilin oder durch Emulsions-polymerisation von chemisch modifizierten p-Nitroanilin mit Styren-Monomer päpariert werden. Das Anbinden der gegenüber der Zielsubstanz akiven ersten Substanz an die Teilchen mit SHG-Aktivität kann durch ein bekanntes physikalisches oder chemisches Verfahren bewerkstelligt werden.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung des Meßprinzips der vorliegenden Ausführungsform, die den Zustand des Strömungsabschnitts der Strömungszelle zeigt. Die Konfiguration der gesamten Vorrichtung ist ähnlich der in Fig. 1 gezeigten, mit der Ausnahme, daß das Wellenländenauswahlfilter 10 so ausgebildet ist, daß es das Licht der halben Wellenlänge λ/2 der ursprünglichen Wellenlänge λ des Laserstrahls hindurchläßt, und daß der Photodetektor 5 so ausgebildet ist, daß das durch die SHG-Substanz erzeugte Licht mit umgesetzter Wellenlänge erfaßt wird. In dem Fall, daß zur Markierung der Trägerteilchen eine THG- Substanz, die Oberwellen der 3. Ordnung erzeugt, eingesetzt wird, wird in Wellenlängenauswahl- bzw. Durchlaßfilter 10 eingesetzt, das zur Auswahl einer Wellenlänge λ/3 ausgebildet ist. Die in dem durch die Hüllflüssigkeit ummantelten Zustand strömende Probenflüssigkeit enthält die Komplexe 31, 32 der fluoreszenzmarkierten zweiten Substanz 33a, die Zielsubstanz 33b, die Trägerteilchen 33c und weitere Substanzen, Blasen und Schwebstoffe, die sukzessive in den Strömungsabschnitt fließen. Ansprechend auf den eingestrahlten Laserstrahl der Wellenlänge λ, erzeugen die Trägerteilchen Streulicht 1 einer Wellenlänge λ und Streulicht 2 der SHG-konvertierten Wellenlänge λ/2, erzeugt die fluoreszierende Substanz Fluoreszenzlicht. Da die fluoreszierende Substanz und die Zielsubstanzen sehr klein sind, erzeugen sie kein oder nur ein geringes Streulicht. Der Komplex 31 oder 32, der aus den Trägerteilchen, der Zielsubstanz und der fluoreszierenden Substanz gebildet ist, erzeugt beim Passieren des bestrahlten Abschnitts sowohl das Steulicht 1 und 2 als auch das Fluoreszenzlicht. Das Streulicht 2 (λ/2) wird durch das Wellenlängenauswahlfilter 10 gemäß Fig. 1 ausgewählt. Es wird ein Trägerteilchen als vorhanden angesehen, wenn Streulicht 2 durch den Photodetektor 5 erfaßt wird. Dieser Erfassung wird bei der vorliegenden Ausführungsform als Träger zur Erfassung des Fluoreszenzlichts benutzt. Es ist auch möglich, ein zur gleichzeitigen Erfassung des Streulichts 1 und 2 fähiges optisches System bereitzustellen und das logische Produkt der Intensitäten des Streulichts 1 und 2 als Trägers zu benutzen.
Fig. 5 ist ein Kurvenformdiagramm, das die mit der Vorrichtung gemäß Fig. 1 gemessene Signale zeigt. Üblicherweise ist die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts (λ) zur Erzeugung des Trägersignals zur Erfassung des Fluoreszenzlichts verwendet worden, aber die Genauigkeit der Messung ist unzureichend gewesen, weil das Trägersignal auch durch Streulicht erzeugt wird, welches von Blasen und Schwebstoffen - wie in Fig. 5 mit Ziffer 72 bezeichnet - herrührt. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ein Trägersignal 74 erzeugt, wenn das Streulicht 2 der umgewandelten Wellenlänge %12 einen bestimmten Schwellenwert übersteigt, und die Intensität 75 des Fluoreszenzlichts wird zum Zeitpunkt der Erzeugung des Trägersignals gemessen. Folglich ist die zweite Ausführungsform zu einer genauen Bestimmung des Anteils der Markierungssubstanz im Komplex in der Lage, wodurch eine hochgenaue quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der Probe ohne Beeinflussung durch beim herkömmlichen Verfahren störende Bestandteile, wie Blasen und Schwebestoffe, ermöglicht wird.
Das nachfolgende Experiment wurde zur Verifizierung des Effekts der geannten Ausführungsform durchgeführt. Eine wässrige Dispersion aus Polysternteilchen mit einer Teilchengröße von 1,0 um und einer Teilchenkonzentration von 0,5 Gew-%, denen durch Dotierung mit p-Nitroanilin SHG-Aktivität verliehen wurde, wurde 10.000-fach verdünnt und mit der Vorrichtung ausgemessen. Zum Vergleich des herkömmlichen Verfahrens und des Verfahrens der vorliegenden Ausführungsform wurde zuerst ein Wellenlängenauswahlfilter 10 zur Auswahl der Wellenlänge X eingesetzt, und die Anzahl der durch die Intenistät des vorwärts gestreuten Lichts 1 der Wellenlänge λ erzeugten Trägersignale wurde während 30 sec. gezählt. Dann wurde ein Wellenlängenauswahlfilter 10 eingesetzt, das eine Wellenlänge λ/2 auswählt, und die Anzahl der durch die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts 2 der Wellenlänge λ/2 erzeugten Trägersignale wurde gleichermaßen während 30 sec. gezählt. Im Ergebnis war der Zählwert beim herkömmlichen Verfahren, unter Benutzung der auf dem vorwärts gestreuten Licht 1 beruhenden Trägersignale, um etwa 20% größer. Der höhere Zählwert wird dem Einfluß der Störkomponenten, wie etwa in der wässrigen Lösung enthaltenen Schwebstoffen und Blasen, zugeschrieben, die Anlaß zu zusätzlichen Zählwerten gaben. Wie oben beschrieben, ermöglichte die Verwendung markierter Teilchen, die durch Anbindung der SHG-aktiven Substanz an die Trägerteilchen präpariert wurden, eine hochpräzise Bestimmung mit hohem Signal-/Rausch-Verhältnis.

Dritte Ausführungsform

Eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die nachfolgend erläutert wird, nutzt eine magnetische Substanz zur Markierung von Trägerteilchen, und die Trägerteilchen werden durch ein magnetisches Erfassungsverfahren identifiziert.
Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ein erstes Reagens durch Verbinden einer gegenüber der in der Probe zu erfassenden Zielsubstanz aktiven ersten Substanz mit kleinen Teilchen mit Abmessungen von beispielsweise etwa 1 um erhalten, die eine magnetisierbare Substanz enthalten. Die magnetische Substanz kann durch verschiedene Verbindungen, wie etwa Magnetit oder γ-Ferrit, oder Metalle, wie etwa Eisen oder Kobalt, gebildet sein, und es kann in geeigneter Weise eine gegenüber der Probe stabile Substanz ausgewählt werden. Das Verbinden der gegenüber der Zielsubstanz aktiven ersten Substanz mit den magnetischen Teilchen kann durch ein bekanntes physikalisches oder chemisches Verfahren erfolgen.
Fig. 6 zeigt die Konfiguration einer Meßapparatur, die bei der vorliegenden Ausführungsform verwendet werden soll, wobei gleiche Komponenten wie in Fig. 1 mit den selben Ziffern bezeichnet sind. Die festen Teilchen in den Komplexen in der Reaktionsflüssigkeit, die in der Strömungszelle 1 strömt, werden durch einen Magneten 20 magnetisiert, und die Komplexe werden durch einen Magnetsensor 21, der einen Magnetflußmesser aufweist, erfaßt. Der Magnet 20 kann weggelassen sein, wenn vormagnetisierte Trägerteilchen verwendet werden. Die Aus gänge der Photodetektoren 5, 9a, 9b, 9c und des Magnetsensors 21 werden einem Signalverarbeitungssystem 15 zugeführt, das aufgrund der Detekorsignale einer weiter unten beschriebenen Signalverarbeitung für die Probenmessung ausführt.
Fig. 7 zeigt schematisch das Meßprinzip der vorliegenden Ausführungsform unter Einsatz von Trägerteilchen, die die erwähnte magnetisierbare Substanz (magnetische Teilchen) enthalten und stellt den Zustand im Strömungsabschnitt der Strömungszelle dar. Die, durch die Hüllflüssigkeit umgeben, strömende Probenflüssigkeit enthält die Komplexe 31, 32, die fluoreszenzmarkierte zweite Substanz 33a, die Zielsubstanz 33b, die Trägerteilchen 33c und andere Substanzen, Blasen und Schwebstoffe, die sukzessive in den Strömungsabschnitt fließen. In Reaktion auf den eingestrahlten Laserstrahl erzeugt das Trägerteilchen - wie beim herkömmlichen Verfahren - Streulicht, und die fluoreszierende Substanz erzeugt Fluoreszenzlicht. Da die fluoreszierende Substanz und die Zielsubstanz sehr klein sind, erzeugen sie kein oder nur schwaches Streulicht. Der Komplex 31 oder 32, der aus dem Trägerteilchen, der Zielsubstanz oder der fluoreszierenden Substanz gebildet ist, erzeugt bei Passieren des bestrahlten Abschnitts sowohl Streulicht als auch Fluoreszenzlicht. Bei der vorliegenden Ausführungsform enthalten die festen Teilchen eine magnetisierbare Substanz, und die magnetische Intensität der festen Teilchen wird mittels des Magneten 20 und des Magnetsensors 21 gemessen, wobei ein Peak 73 in der magnetischen Intensität die Gegenwart der festen Teilchen kennzeichnen. Dies wird als Trigger bzw. Auslöser für die Fluoreszenzlichterfassung benutzt. Das Trägerteilchen kann auch durch das logische Produkt aus Streulicht und magnetischer Intensität identifiziert werden.
Fig. 8 ist ein Kurvenformdiagramm der in der Vorrichtung des Fig. 6 gemessenen Signale. Üblicherweise ist die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts zur Erzeugung des Triggersignals zur Erfassung des Fluoreszenzlichts benützt worden, aber die Genauigkeit der Messung ist ungenügend gewesen, weil das Trägersi gnal auch durch vorwärts gestreutes Licht erzeugt wird, das von Blasen und Schwebstoffen - wie sie in Fig. 8 mit der Bezugsziffer 72 bezeichneten sind herrührt. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ein Trägersignal 74 erzeugt, wenn die magnetische Intensität des vorbeikommenden Trägerteilchens einen bestimmten Schwellwert übersteigt. Das Trägersignal kann auch durch das logische Produkt der magnetischen Intensität und des Streulichts erzeugt werden. Die Intensität 75 des Fluoreszenzlichts wird zum Zeitpunkt des Trägersignals gemessen. Folglich ist die vorliegende Ausführungsform zu einer päzisen Bestimmung des Anteils bzw. der Menge der Markierungssubstanz im Komplex in der Lage, wodurch eine hochpräzise quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der Probe ermöglicht wird, ohne daß - wie im herkömmlichen Fall - eine Beeinflussung durch Störkomponenten, wie etwa Blasen und Schwebstoffe, aufträte.
Das folgende Experiment wurde ausgeführt, um den Effekt der genannten Ausführungsform zu verifizieren. Eine wässrige Dispersion aus magnetischem Polysterenteilchen mit einer Teilchengröße von 1,0 um und einer Teilchenkonzentration von 0,5 Gew.-%, die Magnetit enthalten, wurde 10.000-fach verdünnt und durch die Vorrichtung gemessen. Zum Vergleich des herkömmlichen Verfahrens und des Verfahrens der vorliegenden Ausführungsform wurde zuerst die Anzahl der durch die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts während 30 sec. erzeugten Trägersignale gezählt, und dann wurde gleichermaßen während 30 sec. die Anzahl der Trägersignale gezählt, die anhand der mittels des Magnetsensors 21 bestimmten magnetischen Intensität erhalten wurden. Im Ergebnis war der erhaltene Zählwert beim herkömmlichen Verfahren aufgrund der aus dem vorwärts gestreuten Licht resultierenden Trägersignale um etwa 20% höher. Der höhere Zählwert wird den Stör- bzw. Rauschkomponenten zugeschrieben, die Anlaß zu zusätzlichen Zählungen gaben - etwa den in der wässrigen Dispersion enthaltenen Schwebstoffen und Blasen. Wie oben erläutert, ermöglicht der Einsatz der magnetisch markierten Teilchen eine hochpräzise Erfassung mit hohem Signal- /Rausch-Verhältnis.

Abwandlungen

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die erwähnten Ausführungsformen beschränkt, sondern kann verschiedenen Abwandlungen unterliegen. Beispielsweise kann zur Markierung der Trägerteilchen eine radioaktive Substanz eingesetzt werden, die aufgrund der Erfassung der radioaktiven Intensität identifiziert werden kann. In diesem Falle kann der Detektor zur Erfassung der Radioaktivität auf ähnliche Weise wie der in Fig. 7 gezeigte Magnetsensor 21 positioniert sein.
Weiterhin ist in den geannten Aufsführungsformen die zweite Substanz mit einer fluoreszierenden Substanz markiert, aber der Effekt der vorliegenden Erfindung kann auch bei Markierung der zweiten Substanz mit einer anderen Substanz erreicht werden, etwa einer Substanz, die Harmonische erzeugt, einer magnetischen Substanz oder einer radioaktiven Substanz, sowie bei Einsatz einer Differenzmarkierung für die Trägerteilchen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines speziellen Bestandteils in einer Probe mit den Schritten:

(a) Herstellen eines ersten Reagens, das durch Bindung eines Liganden für einen speziellen Bestandteil in der Probe an Trägerpartikeln erzeugt wird, und eines zweiten Reagens, das durch Markierung eines Liganden für den speziellen Bestandteil mit einem ersten Marker erzeugt wird, wobei die Trägerteilchen mit einem sich vom ersten Marker unterscheidenden zweiten Marker markiert werden,

(b) Bewirken einer Reaktion der Probe mit dem ersten Reagens und dem zweiten Reagens und

(c) Messen der einzelnen Substanzkomplexe, die im Schritt (b) erhalten wurden, zum Nachweis des speziellen Bestandteils, wobei die Messung einen Nachweis des zweiten Markers zur Erfassung des ersten Markers unter Nutzung der Erfassung des zweiten Markers als Trigger einschließt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein erster Marker verwendet wird, der eine fluoreszierende Substanz einschließt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein zweiter Marker verwendet wird, der eine wellenlängenkonvertierende Substanz für Bestrahlungslicht einschließt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine wellenlängenkonvertierende Substanz verwendet wird, die eine fluoreszierende Substanz einschließt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei eine wellenlängenkonvertierende Substanz verwendet wird, die eine Substanz zur Erzeugung von Harmonischen einschließt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein zweiter Marker verwendet wird, der eine magnetische Substanz einschließt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein zweiter Marker verwendet wird, der eine radioaktive Substanz einschließt.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Aktivität auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion beruht.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aktivität auf einer Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion beruht.

10. Verwendung einer Vorrichtung, welche aufweist:

- Mittel zur Erzeugung einer Strömung der im Verfahrensschritt (b) von Anspruch 1 erhaltenen Substanzkomplexe, und

- Mittel zur Erfassung des speziellen Bestandteils in den strömenden einzelnen Substanzkomplexen, wobei die Mittel einschließen

- Mittel zur Erfassung des zweiten Markers, und

- Mittel zur Erfassung des ersten Markers unter Nutzung der Erfassung des zweiten Markers als Trigger,

zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Strömungsmittel eine Strömungszelle und ein Fluidsystem zum Bewirken eines Strömens der einzelnen Substanzkomplexe in die Strömungszelle einschließen.

12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Meßmittel eine Lichtquelle zur Bestrahlung der strömenden einzelnen Substanzkomplexe mit Licht und einen Detektor zur Erfassung des Lichts von der bestrahlten Substanz einschließen.

13. Verwendung des im Schritt (a) von Anspruch 1 erhaltenen Reaktionspartners zum Nachweis eines speziellen Bestandteils in einer Probe mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9.