DE69221069T2

DE69221069T2 - Hemmung von metastasen bei krebspatienten mit pyridyloxazol-2-onen

Info

Publication number: DE69221069T2
Application number: DE69221069T
Authority: DE
Inventors: Alan Bitonti
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-05-14
Filing date: 1992-04-14
Publication date: 1997-11-13
Anticipated expiration: 2012-04-15
Also published as: US5610171A; GR3024832T3; IE921524A1; AU645217B2; CA2087334A1; ES2106874T3; DE69221069D1; EP0539575B1; WO1992020337A3; EP0539575A1; NZ242677A; ATE155686T1; AU2167692A; DK0539575T3; WO1992020337A2

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Pyridinyloxazol-2-one als Inhibitoren von Proteinkinase C zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Hemmung der Metastasenbildung bei Krebspatienten verwendbar ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es wurde gezeigt, daß Phorbolester, die die Proteinkinase C (PKC) aktivieren, die experimentelle Metastasenbildung in der Lunge steigern. Daher war es folgerichtig, daß Inhibitoren der PKC auch die Metastasenbildung modulieren können. Die letztgenannte Möglichkeit wurde mit Pyridyloxazol-2-on, 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon sowie mit den PKC-Inhibitoren H-7 und Staurosporin untersucht.
In EP-A-428 104 sind Pyridyloxazol-2-one offenbart, die zur Behandlung von Tumoren, die gegen mehrere Arzneistoffe resistent sind, verwendet werden können.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter Pyridinyloxazol-2- one der Formel
in der
R und R¹ jeweils unabhängig voneinander aus einem Wasserstoffatom, C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest und einer Phenylgruppe oder einem C&sub1;-C&sub3;-Alkylphenylrest ausgewählt sind, wobei der Phenylring gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei Substituenten, ausgewählt aus einem Fluor-, Chlor-, Bromatom, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- und C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest, substituiert ist; und
R² eine 2-, 3- oder 4-Pyridylgruppe ist, wobei die Pyridylgruppe gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten, ausgewählt aus einem Fluor-, Chlor-, Bromatom, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylthio-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylsulfinyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylsulfonylrest, einer Cyano-, Carboxylgruppe, einem Carb-(C&sub1;-C&sub5;)-alkoxyrest, einer Carbamidogruppe, einem (C&sub1;-C&sub5;)-Alkanoylaminorest, einer Imidazolyl-, Nitro- und einer Trifluormethylgruppe, substituiert ist oder wobei die Pyridylgruppe gegebenenfalls mit einer Phenylgruppe substituiert ist, die gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei der Substituenten, ausgewählt aus einem Fluor-, Chlor-, Bromatom, einem C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- und einem C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest, substituiert ist;
und der pharmazeutisch verträglichen Salze davon zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung von Krebspatienten verwendbar ist, wobei die Metastasenbildung gehemmt wird.
Die 24-stundige Behandlung der Mäusemelanomzellen B16F1 mit 4-Propyl-5-(4- pyridinyl)-2(3H)-oxazolon in Kultur und die nachfolgende intravenöse Injektion der Zellen in C57BL/6-Mäuse ergaben eine 90 %ige Hemmung der Metastasenbildung in der Lunge. Durch die Anwendung des Einbaus von [³H)-Thymidin und durch eine klonogene Untersuchung wurde gezeigt, daß die Lebensfähigkeit behandelter Zellen der unbehandelter Zellen entsprach. Die Hemmung der Metastasenbildung war zeitabhängig, wobei 50 % der maximalen Hemmung durch 8-stundige Inkubation eintraten. Die IC&sub5;&sub0; für die Hemmung der Metastasenbildung mit 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon betrug 7 µM, was mit der Hemmung der mit der Membran von B16F1 verknüpften PKC (IC&sub5;&sub0; = 13 µM), jedoch nicht mit der Hemmung zytosolischer PKC (IC&sub5;&sub0; = 54 µM) korrelierte. B16F1-Zellen, die 24 Stunden mit 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon behandelt wurden, hafteten weniger als unbehandelte Zellen, wenn die Anlagerung an extrazelluläre Matrixproteine/Basalmembranproteine untersucht wurde. Die Haftung an Fibrinogen und Kollagen IV zeigte auf die Hemmung mit 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon die höchste Empfindlichkeit, während die Haftung an Laminin und Fibronectin kaum oder überhaupt nicht gehemmt wurde, was eine Spezifität in der Arzneistoffantwort anzeigte. Es wurde auch gefunden, daß mit 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon behandelte B16F1-Zellen an endothelialen Zellen der menschlichen Nabelvene (HUVEC) weniger hafteten. Es wurde gefunden, daß 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)- oxazolon bezüglich der Hemmung der Metastasenbildung und der Haftung wirksamer als H-7, jedoch wesentlich weniger wirksam als Staurosporin war. Weder H-7 noch Staurosporin hemmten die Haftung der B16F1-Zellen an entweder Fibrinogen, Kollagen IV oder an HUVEC, was auf einen neuen Mechanismus für 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon schließen ließ. Unsere Ergebnisse unterstützen die Hypothese, daß die PKC-vermittelte Phosphorylierung von Rezeptoren für die Haftung an der Zelloberfläche bei der Metastasenbildung eine Rolle spielt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Verwendung der Verbindungen der Formel (1) als Mittel, die bei der Hemmung der Metastasenbildung bei Krebspatienten wirksam sind.
Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "C&sub1;-C&sub3;-Alkylrest", "C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest" und "C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest" unverzweigte oder verzweigte Alkylreste mit 1 bis 3, 1 bis 4 beziehungsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und umfassen solche Gruppen, wie eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, tert.-Butylgruppe und dergleichen, sowie eine Vinyl-, Allyl-, Propenyl-, Butenyl-, Butadienyl-, Isopropenylgruppe und dergleichen. Der Begriff "C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest" bedeutet Alkoxyreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und umfaßt solche Gruppen, wie eine Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, Isopropoxy-, n-Butoxy-, Isobutoxy-, sek.-Butoxy-, tert.-Butoxygruppe und dergleichen. Wenn der Rest R oder R¹ ein "gegebenenfalls substituierter Phenyl- oder C&sub1;-C&sub3;-Alkylphenylrest" ist, können sich der (die) eine, zwei oder drei Substituent(en) an einer beliebigen verfügbaren Stellung an dem Phenylring befinden.
Der Ausdruck "ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz" soll auf beliebige nicht-toxische, organische oder anorganische Säureadditionssalze der Basenverbindungen angewendet werden. Beispiele anorganischer Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure und saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Beispiele organischer Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispiele dieser Säuren sind zum Beispiel Essig-, Glykol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzol-, Hydroxybenzol-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl- und 2-Phenoxybenzoesäure. Weitere organische Säuren, die geeignete Salze bilden, sind die Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Diese Salze und die Basenverbindungen können entweder in einer hydratisierten oder in einer im wesentlichen wasserfreien Form vorkommen. Die sauren Salze werden durch Standardverfahren, wie das Lösen der freien Base in wäßriger oder wäßrig-alkoholischer Lösung oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, das die entsprechende Säure enthält, und das Isolieren durch das Eindampfen der Lösung oder durch die Umsetzung der freien Base in einem organischen Lösungsmittel hergestellt, wobei sich in diesem Fall das Salz direkt abtrennt oder durch das Einengen der Lösung erhalten werden kann. Im allgemeinen sind die Säureadditionssalze der Verbindungen dieser Erfindung kristalline Materialien, die in Wasser und verschiedenen hydrophilen, organischen Lösungsmitteln löslich sind, und die, verglichen mit den Formen ihrer freien Base, höhere Schmelzpunkte und eine erhöhte Löslichkeit zeigen.
Beispiele zur Veranschaulichung der Verbindungen dieser Erfindung umfassen Verbindungen der Formel (1), in der die Reste R wie folgt bezeichnet sind:
Wie es für die meisten Klassen therapeutisch wirksamer Verbindungen zutrifft, sind bestimmte Unterklassen und bestimmte Arten besonders wirksam und gegenüber anderen bevorzugt. In diesem Fall sind die Verbindungen der Formel (1), in der R² eine gegebenenfalls substituierte 2, 3- oder 4-Pyridinylgruppe ist, bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt sind Verbindungen, in denen R ein Wasserstoffatom oder ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist. Insbesondere bevorzugt sind die Verbindungen, in denen R² eine nicht-substituierte 2-, 3- oder 4-Pyridinylgruppe ist, R eine Propylgruppe ist, und R¹ ein Wasserstoffatom ist. Die insbesondere bevorzugte Verbindung dieser Erfindung ist 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon.
Die Herstellung der 2-, 3- oder 4-Pyridinyloxazol-2-one dieser Erfindung ist in dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4698353. Die Herstellung der Verbindungen, die in dem Fachgebiet nicht ausdrücklich angegeben ist, kann durch den Fachmann leicht erfolgen.
Im wesentlichen können die Verbindungen dieser Erfindung durch die Umsetzung einer Verbindung der Formel (2)
in der R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind, mit einem Cyanat in DMF, wobei das entsprechende Isocyanat gebildet wird, das unter den Reaktionsbedingungen einer Cyclisierung unterliegt, wobei sich das erwünschte Produkt der Formel (3)
ergibt, hergestellt werden.
Ein weiteres Verfahren betrifft die Cyclisierung eines Hydroxyketons der Struktur (4)
in der R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind, durch die Umsetzung mit einem Cyanat oder einem Salz in Gegenwart einer Säure.
Die Bromketone der Formel (2) sind entweder in dem Fachgebiet bekannt oder können durch Standardverfahren leicht hergestellt werden. Das Desbromanalogon einer Verbindung der Struktur (2) kann zum Beispiel mit Brom behandelt werden. Wenn die dem zu bromierenden Kohlenstoffatom benachbarte Gruppe ein Wasserstoffatom oder ein (C&sub1;-C&sub5;)- Alkylrest ist, kann zur Beschleunigung der Bromierung ein Radikalstarter verwendet werden. Geeignete Starter umfassen metallisches Eisen und N-Bromsuccinimid. Die Bromierung kann auch durch die Zugabe konzentrierter Bromwasserstoffsäure, üblicherweise 48 %iger wäßriger Bromwasserstoffsäure, zu einer Lösung mit der Desbromverbindung erfolgen. Die Hydroxyketone der Struktur (4) können ebenfalls auf beliebige geeignete Art und Weise leicht hergestellt werden. Man kann zum Beispiel ein Bromketon der Struktur (2) mit einem Acetatsalz, bevorzugt Kaliumacetat, reagieren lassen, wobei das entsprechende Acetoxyketon gebildet wird, das nach der Behandlung mit einer Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, die erwünschte Verbindung der Struktur (4) ergibt.
Die Verbindungen, in denen R ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter Phenyl- oder C&sub1;-C&sub3;-Alkylphenylrest ist, werden durch die nachfolgende Umsetzung der Verbindung der Formel (1), in der R ein Wasserstoffatom ist, mit Natriumhydrid und dem entsprechenden Alkyliodid oder Phenylalkyliodid in Tetrahydrofuran nach in dem Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren hergestellt.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind sowohl in Form der freien Base als auch als Salze verwendbar. Der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliches Salz" bedeutet ein beliebiges organisches oder anorganisches Additionssalz der Basenverbindungen der Formel (1), die in Konzentrationen, die mit einer effektiven Wirksamkeit im Einklang stehen, für einen Patienten verhältnismäßig nicht-toxisch und unschädlich sind, so daß die dem Salz zuzuschreibenden Nebenwirkungen die günstigen Wirkungen der Basenverbindungen der Formel (1) nicht beeinträchtigen. Diese Salze sind im Umfang dieser Erfindung enthalten. Diese Salze umfassen Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalimetallsalze, wie Calcium- und Magnesiumsalze, und dergleichen. Salze mit organischen und anorganischen Säuren, wie zum Beispiel die mit den folgenden Säuren gebildeten, können ebenfalls hergestellt werden: Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Sulfon-, Schwefel-, Phosphor-, Salpeter, Ascorbin-, Methansulfon-, Essig-, Propion-, Wein-, Citronen-, Milch-, Äpfel-, Mandel-, Zimt-, Palmitin-, Itacon-, Fumar-, Benzolsulfon- und Toluolsulfonsäure. Die nicht-toxischen, physiologisch verträglichen Salze sind bevorzugt, obwohl zum Beispiel bei der Isolierung oder Reinigung des Produkts auch andere Salze verwendbar sind.
Die Salze können durch herkömmliche Mittel, wie durch die Umsetzung der Formen der freien Säure oder freien Base des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalent(en) der entsprechenden Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder Medium, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Lösungsmittel, wie Wasser, das anschließend unter reduziertem Druck oder durch Gefriertrocknung entfernt wird, oder durch den Austausch der Kationen eines vorhandenen Salzes durch ein anderes Kation auf einem geeigneten Ionenaustauscherharz, gebildet werden.
Die Haftung der Zellen ist ein wichtiger Faktor bei der Metastasenbildung von Tumoren. Die Zellen gelangen durch den Verlust der Haftungseigenschaften vom Primärtumor in den Kreislauf, während die Hemmung und Bildung einer neuen Kolonie von der Entwicklung der gesteigerten Fähigkeit dieser Zellen, an endothelialen Zellen, die das Gefäßsystem auskleiden, oder an den extrazellulären Matrixproteinen zu haften, abhängt Diese Ereignisse in der metastatischen Kaskade müssen eine Herabregulierung von Rezeptoren für die Zellhaftung zum Austritt ins Gewebe und nachfolgend eine Hochregulierung für die Anlagerung von Zellen an ihren endgültigen Bestimmungsort beinhalten. Die als Integrine bezeichneten Rezeptoren für die Zellhaftung wurden zu der Tumor- und Metastasenbildung in Beziehung gesetzt. Diese Rezeptoren sind Glykoproteine der Zelloberfläche, die sich mit einer verhältnismäßig niedrigen Affinität an Basalmembranproteine, wie Fibrinogen, Fibronectin, Laminin und Kollagen, binden. Kleine Peptide, die eine Arginin-Glycin-Aspartat-(RGD)-Sequenz, eine bei Proteinen für die Haftung gefundene Bindungssequenz, enthalten, hemmen die normale Wirkung von Integrinen. Die Bedeutung von Integrinen für die Metastasenbildung wurde in Versuchen erkannt, in denen große Mengen an RGD-Peptiden gleichzeitig mit Tumorzellen in Mäuse injiziert wurden, was zu einer verminderten Anaahl von metastatischen Herden führte. Ferner wurden Struuturänderungen oder eine Expression von Integrinen mit Zellen in Verbindung gebracht, die einen malignen Phänotyp erworben haben.
Die Phosphorylierung von Proteinrezeptoren induziert häufig Konformationsänderungen in dem Protein, die die Eigenschaften der Bindung an seinen Liganden beeinflussen können. Proteinkinasen phosphorylieren Integrine und einen Wirt weiterer zellulärer Proteine. Die Proteinkinase C ist von besonderem Interesse, da ihre Aktivierung zu einem erhöhten Potential für die Haftung und einer erhöhten metastatischen Aktivität von Tumorzellen in Beziehung gesetzt wurde. Diese Calcium-aktivierte und Phospholipid-abhängige Kinase vermittelt die Signalübermittlung für die Sekretion und die Freisetzung von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Proteasen und Neurotransmittern. Die Kopplung dieser Stimulantien an ihre Membranrezeptoren verursacht die Spaltung von Phosphoinositiden in Diacylglycerin und Inosittriphosphat. Diacylglycerin aktiviert die PKC, die wiederum die Phosphorylierung spezieller Proteine katalysiert. Inosittriphosphat verursacht die Freisetzung von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum, was auch zur Aktivierung der Kinase beiträgt. Ferner ist die PKC der hauptsächliche intrazelluläre Rezeptor für die tumorbeschleunigenden Phorbolester, die sich in entsprechender Art wie Diacylglycerin an das Enzym binden und es aktivieren.
Es wurde gezeigt, daß Tumorbeschleuniger und Verbindungen, die die Calciummobilisierung aktivieren, in experimentellen Tiermodellen die Metastasenbildung verstärken und auch das Potential der Haftung von Tumorzellen erhöhen. Die Behandlung der Mäusemelanomzellen B16 in vitro mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und die nachfolgende intravenöse Injektion in Mäuse ergaben eine erhöhte Anzahl metastatischer Herde in den Lungen. In einem Modell spontaner Metastasenbildung in Mäusen führte die Behandlung der Mammaadenokarzinomzellen SP1 bei Mäusen, wobei die Zellen gewöhnlich nicht metastasieren, mit entweder PMA oder dem Calciumionophor A23187 zur Metastasenbildung aus dem Primärtumor. Ferner führt die Behandlung von Lewis-Lungenkarzinomzellen mit PMA zu einer Steigerung der Haftung an endothelialen Zellen. Es ist daher folgerichtig, daß die Hemmung von PKC das Potential von Tumorzellen zur Metastasenbildung vermindern kann. In der hier in dieser Patentanmeldung dargestellten Untersuchung untersuchten wir die Wirkung von 4- Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon und weiterer neuer PKC-Inhibitoren in einem experimentellen Modell der Metastasenbildung. Wurden die Melanomzellen B16F1 4-Propyl-5-(4- pyridinyl)-2(3H)-oxazolon in vitro ausgesetzt, verringerte sich die Anzahl von Lungenmetastasen, wenn die behandelten Zellen nachfolgend in Mäuse injiziert wurden. Ferner zeigten mit diesem Arzneistoff behandelte B16F1-Zellen eine verminderte Haftung an einigen Basalmembranproteinen und an endothelialen Gefaßzellen in vitro. Es wird die Ansicht vertreten, daß der Arzneistoff die Zellhaftungseigenschaften, die zu der Phosphorylierung von Integrin in Beziehung stehen, durch die Hemmung der PKC beeinflußt.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Zellkultur

B16F1-Zellen (American Tissue Culture Collection Nr. 6323) wurden in minimalem essentiellem Medium (MEM) gezüchtet, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 µM L-Glutamin und 5 µg Gentamycin pro Liter ergänzt war.
Endotheliale Zellen der menschlichen Nabelvene (HUVEC) wurden von Clonetics Corporation erhalten und unter Verwendung von Wachstumsmedium für endotheliale Zellen der Nabelvene (EGM-UV), das mit Zellen ergänzt war, als Monoschichten gezüchtet.

Untersuchung der Koloniebildung

100 lebensfähige Zellen, wie durch Trypanblau-Ausschluß bestimmt, wurden pro Platte mit 35 mm in MEM plattiert und 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Als nächstes wurde 4- Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon zugegeben, die Inkubation wurde weitere 24 Stunden fortgesetzt, anschließend wurden die Platten zweimal mit ausgewogener Salzlösung nach Hank (HBSS) gewaschen und mit MEM aufgefüllt. 10 Tage später wurden Kolonien mit einem Durchmesser von 2 mm oder größer gezählt.

Untersuchung der experimentellen Metastasenbildung

Subkonfluente B16F1-Zellen wurden durch Waschen mit HBSS und nachfolgende 1-minütige Behandlung mit Trypsin geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (250 g, 5 Minuten) sedimentiert und zweimal mit HBSS gewaschen. Nach der Verdünnung mit Trypanblau wurden die lebensfähigen Zellen gezählt. Eine Suspension einer Einzelzelle aus 10&sup5; Zellen in 0,2 ml HBSS wurde 16-18 C57BL/6-Mäusen intravenös über die Schwanzvene injiziert. Drei Wochen später wurde die Zahl der metastatischen Herde in der Lunge gezählt.

Herstellung der Proteinkinase C

Zytostolische und membranverknüpfte PKC wurde, wie in Thomas, T. P., Gopalakrishna, R. und Anderson, W. B., Hormone- and tumor promoter-induced activation of membrane association of protein kinase C in intact cells, Methods in Enzymology, 141: 399-411, 1987 beschrieben, hergestellt. Subkonfluente B16F1-Kulturen (insgesamt 4x10&sup7; Zellen) wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, und anschließend zweimal mit Puffer A (20 mM Tris, pH 7,5, 2mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,33 mM Saccharose, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 2 µg/ml Leupeptin) gewaschen. Die Zellen wurden von den Platten in Puffer A geschabt, homogenisiert (40 Stöße) und durch 1-stündige Zentrifugation bei 100000 g sedimentiert. Das Cytosol wurde auf Eis aufbewahrt, während die partikuläre Fraktion mit Puffer B (20 mM Tris, pH 7,2, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA und 2 mM PMSF) gewaschen wurde. Die Membranen wurden erneut mit Puffer B suspendiert und mit 10 Stößen homogenisiert. Nonidet P-40 (1 % Endkonzentration) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC auf einem Rotationsmischer inkubiert. Nicht-gelöstes Material wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 1400 g entfernt.
Zytostolische und membrangebundene PKC wurde durch Chromatographie über mit Puffer B äquilibrierte Säulen mit 1 ml DE-52 (Whatman) teilweise gereinigt. Das Enzym wurde auf die Säule aufgetragen und mit 2x3 ml Puffer B gewaschen. Die Elution der PKC wurde anschließend durch die Zugabe von 2 ml Puffer B, der 100 mM NaCl enthielt, durchgeführt.

Untersuchung der Proteinkinase C

Die PKC wurde, wie in Thomas et al. ibid. beschrieben, quantitativ bestimmt. Der Ansatz enthielt 20 mM Tris (pH 7,5), 0,75 mM CaCl, 10 mM Magnesiumacetat, 0,1 g/ml Histon III-S, 0,25 µg/ml Leupeptin, 100 µM [γ-32P]-ATP (120 cpm/pmol), 0,96 µg/ml Phosphatidylserin und 0,0064 µg/ml 1,2-Diolein in einem Gesamtvolumen des Ansatzes von 250 µl. Blindproben enthielten kein Calcium oder Phospholipide. Die Inkubation betrug 5 Minuten bei 30ºC und zu diesem Zeitpunkt wurde die Umsetzung durch die Zugabe von 1 ml 25 %iger Trichloressigsäure (TCA) beendet. Die Proben wurden auf GF/B-Filter von Whatman aufgetragen, das Röhrchen wurde zweimal mit 5 %iger TCA gespült, und das Filter wurde anschließend fünfmal mit 5 %iger TCA gewaschen.

Haftung von B16F1-Zellen an Proteinen der Basalmembran

Immulon I Removawells von Dynatech wurden mit Proteinen zur Haftung (2 µg/Vertiefung) beschichtet und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden anschließend 1 Stunde mit 400 µl PBS, pH 7,2, die 1 % Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, bei 37ºC blockiert. Vor der Zugabe der Zellsuspension wurde die Blockierungslösung abgesaugt.
Subkonfluente Zellen wurden zweimal mit HBSS gewaschen und durch 10-minütige Inkubation bei 37ºC mit PBS (pH 7,2), 2 mM EDTA, 1 % BSA aus den Kolben entfernt. Die Zellen wurden zweimal mit MEM, das 20 mM Hepes und 0,1 % BSA enthielt, gewaschen und erneut in demselben Medium suspendiert, wobei sich eine Zelldichte von 1x10&sup5; Zellen/ml ergab.
50 µl Zellen (5x10&sup4; Zellen) wurden in die Vertiefungen gegeben und bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden ausgesaugt und dreimal mit 400 µl PBS (pH 7,2), die 0,1 % BSA enthielt, gewaschen. Die Vertiefungen wurden abgetrennt und in 5 ml Fertigprotein von Beckmann gezählt. Die Blindproben wurden nicht mit dem Protein beschichtet, wurden jedoch, wie vorstehend beschrieben, mit BSA blockiert.

Haftung von Tumorzellen an endothelialen Zellen

Runde Thermanox-Gewebekultur-Deckgläser mit 15 mm von Lux wurden in Gewebekulturcluster mit 12 Vertiefungen und einem Durchmesser von 22 mm von Corning gegeben. HUVEC (2x10&sup6;) wurden zu jeder Vertiefung gegeben und bis zur Konfluenz gezüchtet. Subkonfluente B16F1-Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC mit 1 µCi/ml [³H]-Thymidin (New England Nuclear, 78,5 Ci/mmol) markiert.
Bei der Vorbereitung der Untersuchung der Haftung wurden die Gewebekulturvertiefungen, die entweder HUVEC oder keine Zellen enthielten, mit MEM, das 20 mM HEPES und 1 % BSA enthielt, 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Die B16F1-Zellen wurden, wie vorstehend bezüglich der Haftung an Basalmembranproteinen beschrieben, aus den Kolben entfernt und bis zu einer Dichte von 2x10&sup5; lebensfähigen Zellen/ml in MEM verdünnt (die Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Ausschluß bestimmt).
Die Blockierungslösung wurde aus den Vertiefungen abgesaugt und 1 ml Zellen wurde pro Vertiefung zugegeben und bei 37ºC inkubiert. Nicht-haftende Zellen wurden, wie in Wright, P.S., Cross-Doersen, D., McCann, P. P. und Bitonti, A. J., Plasmodium falciparum: a rapid assay for cytoadherence of [³H]-Hypoxanthin-labeled infected erythrocytes to human melanoma cells, Exp. Parasitol., 71: 346-349, 1990 beschrieben, von den Deckgläsern abgewaschen. Die Deckgläser wurden mit Pinzetten von den Vertiefungen geborgen und zehnmal in ein Becherglas mit 100 ml MEM getaucht. Die Deckgläser wurden in Szintillationsgläschen gelegt und in 10 ml Fertigprotein von Beckman gezählt. TABELLE 1 WIRKUNGEN VON 4-PROPYL-5-(4-PYRIDINYL)-2(3H)-OXAZOLON AUF DIE KOLONIEBILDUNG VON B16F1 10² B16F1-Zellen wurden plattiert und 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Als nächstes wurde 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon (Verbindung 1) zugegeben, die Inkubation weitere 24 Stunden fortgesetzt und zu diesem Zeitpunkt wurde der Arzneistoff entfernt. 10 Tage später wurden die Kolonien mit einem größeren Durchmesser als 2 mm gezählt. TABELLE 2 HEMMUNG DER EXPERIMENTELLEN METASTASENBILDUNG VON B16F1-ZELLEN DURCH 4-PROPYL-5-(4-PYRIDINYL)-2(3H)-OXAZOLON Subkonfluente B16F1-Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC mit 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)oxazolon (Verbindung 1) inkubiert. Die Zellen wurden anschließend geerntet, und 1x10&sup5; Zellen wurden Mäusen intravenös injiziert. Drei Wochen später wurden, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, die metastatischen Knötchen gezählt. TABELLE 3 WIRKUNGEN VON PKC-INHIBITOREN AUF DIE PKC-AKTIVITÄT UND DIE EXPERIMENTELLE METASTASENBILDUNG VON B16F1
a Subkonfluente B16F1-Zellen wurden geerntet und Cytosol- und Membranfraktionen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben, hergestellt. Die PKC-Aktivität wurde anschließend in Gegenwart der aufgeführten Arzneistoffe gemessen.
b Subkonfluente B16F1-Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC den Arzneistoffen ausgesetzt. Die Zellen wurden anschließend geerntet und 1x10&sup5; Zellen wurden intravenös in Mäuse injiziert. Die Zahl der metastatischen Knötchen wurde 3 Wochen später quantitativ bestimmt.
c Verbindung 2 ist 4-Methyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon.
d Verbindung 3 ist 4-Ethyl-5-(4-chinolinyl)-2(3H)-oxazolon.
e Verbindung 5 ist 4-Propyl-5-(4-chinolinyl)-2(3H)-oxazolon.
f N.D., nicht bestimmt. TABELLE 4 PKC-AKTIVITÄT IN CYTOSOL UND MEMBRANEN VON MIT 4-PROPYL-5-(4- PYRIDINYL)-2(3H)-OXAZOLON VORBEHANDELTEN B16F1-ZELLEN B16F1-Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC mit 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)- oxazolon inkubiert. Die PKC wurde anschließend hergestellt und ihre Aktivtiät wurde, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, gemessen. TABELLE 5 HEMMUNG DER HAFTUNG VON B16F1-MELANOMZELLEN AN ENDOTHELIALEN ZELLEN (HUVEC) B16F1-Zellen wurden 24 Stunden bei 37ºC mit 4-Propyl-5-(pyridinyl)-2(3H)- oxazolon behandelt. Die Zellen wurden anschließend geerntet, in Vertiefungen gegeben, die konfluente HUVEC-Zellen enthielten, und für die angezeigte Zeit bei 37ºC inkubiert. Einzelheiten sind in Materialien und Verfahren angegeben.
a Mittelwert ± SE
b Werte in Klammern bedeuten haftende B16F1-Zellen, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle.
Der hier verwendete Begriff "Patient" bedeutet Säuger, wie Primaten, umfassend Menschen, Schafe, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse.
Die Menge des Oxazolonderivats der Formel 1, die in einem zu verabreichenden Arzneimittel enthalten ist, kann gemäß der speziellen verwendeten Dosierungseinheit, der Behandlungsdauer, dem Alter und Geschlecht des behandelten Patienten, der Art und dem Entwicklungsgrad des zu behandelnden Lungentumors und dem speziellen ausgewählten Oxazolonderivat breit variieren. Die Menge eines Oxazolonderivats der Formel 1, die die Metastasenbildung bei Patienten mit Lungenkrebs wirksam hemmt, liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 15 mg/kg bis 500 mg/kg. Eine Einheitsdosierung kann 25 bis 500 mg des Oxazolonderivats enthalten und kann einmal oder mehrmals pro Tag eingenommen werden. Das Oxazolonderivat kann mit einem pharmazeutischen Träger unter Verwendung herkömmlicher Dosierungseinheitsformen entweder oral oder parenteral verabreicht werden.
Der bevorzugte Verabreichungsweg ist die orale Verabreichung. Für die orale Verabreichung kann das Oxazolonderivat in festen oder flüssigen Zubereitungen, wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Bonbons, Schmelzen, Pulvern, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, formuliert werden. Die festen Einheitsdosierungsformen können eine Kapsel sein, die aus dem gewöhnlichen Gelatinetyp mit harter oder weicher Hülle bestehen kann und zum Beispiel Netzmittel, Gleitmittel und inerte Füllstoffe, wie Lactose, Saccharose, Calciumphosphat und Maisstärke, enthält. In einer anderen Ausführungsform können die Verbindungen dieser Erfindung mit herkömmlichen Tablettengrundstoffen, wie Lactose, Saccharose und Maisstärke, in Kombination mit Bindemitteln, wie Gunnni arabicum, Maisstärke oder Gelatine, Tablettensprengmitteln, wie Kartoffelstärke, Alginsäure, Maisstärke und Guar Gum, die das Aufbrechen und Auflösen der Tablette nach der Verabreichung erleichtern sollen, Gleitmitteln, zum Beispiel Talk, Stearinsäure oder Magnesium-, Calcium- oder Zinkstearat, die das Rieseln der Tablettengranulationen verbessern sollen und die Haftung des Tablettenmaterials an der Oberfläche der Tablettenpreßformen und -stempel verhindern sollen, Farbstoffen, farbgebenden Mitteln und Geschmackstoffen, die die ästhetischen Qualitäten der Tabletten erhöhen und sie für den Patienten annehmbarer machen sollen, tablettiert werden. Zur Verwendung in oralen flüssigen Dosierungsformen geeignete Excipientien umfassen Verdünnungsmittel, wie Wasser und Alkohole, zum Beispiel Ethanol, Benzylalkohol und die Polyethylenalkohole, entweder mit oder ohne den Zusatz eines pharmazeutisch verträglichen Netzmittels, Suspendiermittels oder Emulgators.
Die Oxazolonderivate dieser Erfindung können auch parenteral, das heißt subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal, als injizierbare Dosierungen der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger, der eine sterile Flüssigkeit oder Flüssigkeitsgemisch, wie Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und Lösungen verwandter Zucker, ein Alkohol, wie Ethanol, Isopropanol oder Hexadecylalkohol, Glykole, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, Glycerinketale, wie 2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol, Ether, wie Poly(ethylenglykol) 400, ein Öl, eine Fettsäure, ein Fettsäureester oder -glycerid oder ein acetyliertes Fettsäureglycerid sein kann, mit oder ohne den Zusatz eines pharmazeutisch verträglichen Netzmittels, wie einer Seife oder einem Detergens, Suspendiermitteln, wie Pektin, Carbomere, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose, oder eines Emulgators und weiterer pharmazeutischer Adjuvantien verabreicht werden. Beispiele von Ölen, die in den parenteralen Formulierungen dieser Erfindung verwendet werden können, sind die des Petroleums, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, zum Beispiel Erdnußöl, Sojabohnenöl, Sesamöl, Baumwollsamenöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Petrolatum und Mineralöl. Geeignete Fettsäuren umfassen Ölsäure, Stearinsäure und Isostearinsäure Geeignete Fettsäureester sind zum Beispiel Ölsäureethylester und Myristinsäureisopropylester. Geeignete Seifen umfassen Alkalimetall-, Ammonium- und Triethanolaminsalze von Fettsäuren, und geeignete Detergenzien umfassen kationische Detergenzien, zum Beispiel Dimethyldialkylammoniumhalogenide, Alkylpyridiniumhalogenide und Alkylaminacetate; anionische Detergenzien, zum Beispiel Alkyl-, Aryl- und Olefinsulfonate, Alkyl-, Olefin-, Ether- und Monoglyceridsulfate und Sulfosuccinate; nicht-ionische Detergenzien, zum Beispiel Fettsäureaminoxide, Fettsäurealkanolamide und Polyoxyethylenpolypropylencopolymere; und amphotere Detergenzien, zum Beispiel β-Aminopropionsäurealkylester und die quartären Ammoniumsalze des 2-Alkylimidazolins, sowie Gemische. Die parenteralen Zusammensetzungen dieser Erfindung enthalten üblicherweise etwa 0,5 bis etwa 25 Gew.-% des Oxazolonderivats der Formel (1) in Lösung. Konservierungsstoffe und Puffer können vorteilhafterweise auch verwendet werden. Um Reizungen an der Injektionsstelle möglichst gering zu halten oder auszuschließen, können diese Zusammensetzungen ein nicht-ionisches Netzmittel mit einem hydrophilen-lipophilen Gleichgewicht (HLB) von etwa 12 bis etwa 17 enthalten. Die Menge des Netzmittels in diesen Formulierungen liegt im Bereich von etwa 5 bis etwa 15 Gew.-%. Das Netzmittel kann eine einzelne Komponente mit dem vorstehenden HLB oder kann ein Gemisch aus zwei oder mehreren Komponenten mit dem erwünschten HLB sein. Beispiele von Netzmitteln, die in den parenteralen Formulierungen verwendet werden, sind die Klasse der Polyethylensorbitanfettsäureester, zum Beispiel Monoölsäuresorbitanester und die Addukte mit hohem Molekulargewicht aus Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch die Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglykol gebildet werden.
Die folgenden speziellen Beispiele werden zur Veranschaulichung der Synthese der Verbindungen dieser Erfindung dargestellt.

BEISPIEL 1

4-Ethyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon

26,4 g (0,16 mol) 1-Hydroxy-2-(4-pyridyl)butan-2-on wurden zuerst in 350 ml 2 N HCl gelöst. 38,9 g (0,48 mol) Kaliumcyanat wurden während einer Dauer von 1 Stunde unter Rühren portionsweise zu dieser Lösung gegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde konzentrierte Chlorwasserstoffsäure zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung 1 war. Nach einer weiteren Stunde wurde das Reaktionsgemisch durch die Zugabe einer Natriumhydrogencarbonatlösung basisch gestellt, und das entstandene Gemisch wurde über Nacht gerührt. Der entstandene feste Niederschlag wurde aufgenommen und zweimal aus 50 %igem wäßrigem Ethanol umkristallisiert, wobei sich 14,4 g (47 % der theoretischen Ausbeute) der Titelverbindung, Smp. 287-289ºC (Zers.), ergaben.
Die Verwendung des vorstehenden Verfahrens, jedoch unter Verwendung von 1- (Hydroxy)-1-(4-pyridyl)pentan-2-on oder 1-(Hydroxy)-1-(4-pyridyl)propan-2-on anstelle von 1-(Hydroxy)-1-(4-pyridyl)butan-2-on, ergibt 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon, Smp. 257-259ºC (Zers.) oder4-Methyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon, Smp. > 310ºC.

BEISPIEL 2

4-Ethyl-5-(2-pyridyl)-2(3H)-oxazolon

35,4 g (0,44 mol) Kaliumcyanat wurden zu einer Lösung von 31 g (0,15 mol) 2- Hydroxy-1-(2-pyridyl)butan-1-on in 250 ml 2 N HCl, die mit 300 ml Wasser verdünht worden war, gegeben. Nach einer Stunde wurde die Acidität mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (pH = 1) eingestellt, und anschließend ließ man über Nacht rühren. Das Gemisch wurde durch die Zugabe von wäßrigem Natriumhydrogencarbonat basisch gestellt. Der entstandene gummiartige Niederschlag wurde auf Silicagel chromatographiert und zweimal aus 50 %igem wäßrigem Ethanol umkristallisiert, wobei sich die Titelverbindung, Smp. 196-197ºC (Zers.) ergab.
In einer Art und Weise, die der der Beispiele 1 und 2 weitgehend ähnlich war, wurden die Verbindungen 4-Phenyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon (Smp.> 300ºC) und 4-Propyl- 5-(2-phenylpyridin-4-yl)-2(3H)-oxazolon (Smp. 202-204ºC) hergestellt.

BEISPIEL 3

Eine Tablette wird hergestellt aus
4-Propyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon 250 mg
Stärke 40 mg
Talk 10 mg
Magnesiumstearat 10 mg

BEISPIEL 4

Eine Kapsel wird hergestellt aus
4-Ethyl-5-(4-pyridinyl)-2(3H)-oxazolon 400 mg
Talk 40 mg
Natriumcarboxymethylcellulose 40 mg
Stärke 120 mg

BEISPIEL 5

Eine Tablette wird hergestellt aus
4-Methyl-5-(3-pyridinyl)-1(3H)-oxazolon 250 mg
Stärke 40 mg
Talk 10 mg
Magnesiumstearat 10 mg

BEISPIEL 6

Eine Kapsel wird hergestellt aus
4-Phenyl-5-(2-pyridinyl)-1(3H)-oxazolon 400 mg
Talk 40 mg
Natriumcarboxymethylcellulose 40 mg
Stärke 120 mg
Einem Fachmann sollte offensichtlich sein, daß Änderungen und Modifikationen in dieser Erfindung gemacht werden können, ohne daß der hier angegebene Kern oder Umfang der Erfindung geändert wird.

Claims

1. Verwendung einer Verbindung der Formel (1)

in der

R und R¹ jeweils unabhängig voneinander aus einem Wasserstoffatom, C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest und einer Phenylgruppe oder einem C&sub1;-C&sub3;-Alkylphenylrest ausgewählt sind, wobei der Phenylring gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei Substituenten, ausgewählt aus einem Fluor-, Chlor-, Bromatom, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- und C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest, substituiert ist; und

R² eine 2-, 3- oder 4-Pyridylgruppe ist, wobei die Pyridylgruppe gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten, ausgewählt aus einem Fluor-, Chlor-, Bromatom, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxy-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylthio-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylsulfinyl-, C&sub1;-C&sub4;-Alkylsulfonylrest, einer Cyano-, Carboxylgruppe, einem Carb-(C&sub1;-C&sub5;)-alkoxyrest, einer Carbamidogruppe, einem (C&sub1;-C&sub5;)-Alkanoylaminorest, einer Imidazolyl-, Nitro- und einer Trifluormethylgruppe, substituiert ist oder wobei die Pyridylgruppe gegebenenfalls mit einer Phenylgruppe substituiert ist, die gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei der Substituenten, ausgewählt aus einem Fluor-, Chlor-, Bromatom, einem C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- und einem C&sub1;-C&sub4;-Alkoxyrest, substituiert ist;

oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Hemmung der Metastasenbildung bei einem Krebspatienten verwendbar ist.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei R² eine gegebenenfalls substituierte 2-, 3- oder 4-Pyridylgruppe ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei R und R¹ jeweils unabhängig voneinander aus einem Wasserstoffatom oder einem C&sub1;-C&sub6;-Alkyfrest ausgewählt sind.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei R ein C&sub1;-C&sub6;-Alkylrest ist, und R¹ ein Wasserstoffatom ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei R² eine nicht-substituierte 2-, 3- oder 4-Pyridylgruppe ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei R² eine 4-Pyridylgruppe ist, R eine Propylgruppe ist, und R¹ ein Wasserstoffatom ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 4-Propyl-5-(4-pyridinyl)- 2(3H)-oxazolon ist.