DE69918542T2

DE69918542T2 - Substituierte trizyklische pyrazolderivate mit protein kinase aktivität

Info

Publication number: DE69918542T2
Application number: DE69918542T
Authority: DE
Inventors: Lee Arnold; Paul Rafferty; Michael Hockley; Allyson Turner
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-28
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2019-04-29
Also published as: DE69918542D1; ATE270549T1; PT1073435E; EP1073435A1; EP1073435B1; WO1999055335A1; CN1311678A; ES2224650T3; JP2002512962A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es gibt wenigstens 400 als Proteinkinasen identifizierte Enzyme. Diese Enzyme katalysieren die Phosphorylierung von Zielproteinsubstraten. Bei der Phosphorylierung handelt es sich normalerweise um eine Übertragungsreaktion einer Phosphatgruppe vom ATP auf das Proteinsubstrat. Die spezifische Struktur des Zielsubstrats, auf welches das Phosphat übertragen wird, ist ein Tyrosin-, Serin- oder Threoninrest. Da diese Aminosäurereste für die Phosphorylübertragung Zielstrukturen sind, werden diese Proteinkinaseenzyme gemeinhin als Tyrosinkinasen oder Serin/Threonin-Kinasen bezeichnet.
Die Phosphorylierungsreaktionen und gegenläufigen Phosphatasereaktionen an den Tyrosin-, Serin- und Threoninresten sind an zahllosen zellulären Vorgängen beteiligt, auf denen Antworten auf diverse intrazelluläre Signale (typischerweise über zelluläre Rezeptoren vermittelt), die Regulation zellulärer Funktionen sowie Aktivierung oder Desaktivierung zellulärer Vorgänge basieren. Eine Kaskade von Proteinkinasen nimmt häufig an der intrazellulären Signaltransduktion teil und wird für den Ablauf dieser zellulären Vorgänge benötigt. Wegen ihrer Allgegenwärtigkeit bei diesen Vorgängen kann man die Proteinkinasen als integralen Teil der Plasmamembran oder als zytoplasmatische oder im Kern lokalisierte Enzyme häufig als Komponenten von Enzymkomplexen vorfinden. In vielen Fällen sind diese Proteinkinasen ein wesentliches Element von Enzym- und strukturellen Proteinkomplexen, die bestimmen, wo und wann ein zellulärer Vorgang innerhalb einer Zelle abläuft.
Proteintyrosinkinasen.
Proteintyrosinkinasen (PTKn) sind Enzyme, welche die Phosphorylierung spezifischer Tyrosinreste zellulärer Proteine katalysieren. Diese posttranslationale Modifizierung dieser Substratproteine, häufig selbst Enzyme, wirken als molekularer Schalter, der die Zellproliferation, -aktivierung oder -differenzierung reguliert (eine Übersicht findet sich in Schlessinger und Ulrich, 1992, Neuron 9:383-391). Eine aberrante oder übermäßige PTK-Aktivität wurde in vielen Erkrankungszuständen M/41562 beobachtet, zu denen benigne und maligne proliferative Erkrankungen genauso wie Erkrankungen, die von einer unzweckmäßigen Aktivierung des Immunsystems herrühren (z.B. Autoimmunerkrankungen), die Allotransplantatabstoßung und die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung gehören. Darüber hinaus vermitteln Rezeptor-PTKn mit Spezifität für endotheliale Zellen, wie KDR und Tie2, den angiogenen Vorgang und sind somit an der Progredienz von Krebs und anderen, eine unzweckmäßige Vaskularisierung beinhaltenden Erkrankungen (z.B. diabetischer Retinopathie, choroidaler Neovaskularisierung wegen einer altersbedingten Makuladegeneration, Psoriasis, Arthritis, infantilen Hämangiomen) unterstützend beteiligt.
Tyrosinkinasen können vom Rezeptortyp (diese haben extrazelluläre, transmembrane und intrazelluläre Domänen) oder vom Nichtrezeptortyp (diese sind in ihrer Gesamtheit intrazellulär) sein.
Rezeptortyrosinkinasen (RTKn).
Die RTKn beinhalten eine umfangreiche Familie von Transmembranrezeptoren mit mannigfaltigen biologischen Aktivitäten. Bis heute sind wenigstens neunzehn (19) verschiedene RTK-Unterfamilien identifiziert worden. Zur Rezeptortyrosinkinase (RTK)-Familie gehören Rezeptoren, die für das Wachstum und die Differenzierung einer Vielzahl von Zelltypen entscheidend sind (Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433-478, 1988; Ullrich und Schlessinger, Cell 61: 243-254, 1990). Die intrinsische Funktion von RTKn wird durch die Ligandenbindung aktiviert, was zur Phosphorylierung des Rezeptors und multipler zellulärer Substrate, und anschließend zu einer Vielzahl von zellulären Antworten führt (Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212). So wird die Rezeptortyrosinkinase-vermittelte Signaltransduktion durch die extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, worauf typischerweise die Rezeptordimerisierung, Stimulierung der intrinsischen Proteintyrosinkinase-Aktivität und die Rezeptor-Transphosphorylierung folgen. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen und infolge Komplexe mit einem Spektrum zytoplasmatischer Signalmoleküle gebildet, was die passende zelluläre Antwort unterstützt (z.B. Zellteilung, Differenzierung, Stoffwechseleffekte, Veränderungen in der extrazellulären Kleinstumgebung (microenvironment) (siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 1–20).
Proteine mit SH2 (src-Homologie 2)- oder Phosphotyrosin bindenden (PTB)-Domänen binden aktivierte Tyrosinkinaserezeptoren und deren Substrate mit hoher Affinität, um in Zellen Signale weiterzutragen. Beide Domänen erkennen Phosphotyrosin (Fantl. et al., 1992, Cell 69: 413-423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Bio. 14: 2777-2785; Sonyang et al., 1993, Cell 72 : 767-778 ; und Koch et al., 1991, Science 252 : 668-678 ; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227-234; und Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6), 835-838). Es wurden einige intrazelluläre Substratproteine identifiziert, die mit Rezeptortyrosinkinasen (RTKn) assoziieren. Diese kann man in zwei Hauptgruppen einteilen: (1) Substrate mit einer katalytischen Domäne; und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren (Sonyang et al., 1993, Cell 72: 767-778). Die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren oder Proteinen und SH2- oder PTB-Domänen ihrer Substrate wird von den Aminosäureresten bestimmt, die unmittelbar um den phosphorylierten Tyrosinrest angeordnet sind. Beispielsweise stehen Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den Aminosäuresequenzen, die um die Phosphotyrosinreste angeordnet sind, auf bestimmten Rezeptoren in Einklang mit den beobachteten Unterschieden ihrer Substratphosphorylierungsprofile (Sonyang et al, 1993, Cell 72: 767-778). Aufgrund von Beobachtungen nimmt man an, dass die Funktion jeder Rezeptortyrosinkinase nicht nur von ihrem Expressionsmuster und der Verfügbarkeit des Liganden, sondern auch von der Abfolge nachgeschalteter (downstream) Signaltransduktionswege, die von einem bestimmten Rezeptor aktiviert werden, genauso wie vom Timing und der Dauer dieser Stimuli bestimmt wird. Somit ist die Phosphorylierung ein wichtiger regulatorischer Schritt, der die Selektivität der von speziellen Wachstumsfaktor-Rezeptoren sowie Differenzierungsfaktor-Rezeptoren in Anspruch genommenen Signalwege bestimmt.
Es wurde vorgeschlagen, dass einige Rezeptortyrosinkinasen und daran bindende Wachstumsfaktoren eine Rolle bei der Angionese spielen, wenngleich einige die Angionese indirekt unterstützen können (Mustonen und Alitalo, J. Cell Biol. 129: 895-898, 1995). Eine derartige Rezeptortyrosinkinase, die als „fötale Leberkinase 1" (FLK-1) bekannt ist, gehört zur Typ-III-Unterklasse der RTKn. Eine alternative Bezeichnung für humane FLK-1 ist „Kinaseninsertionsdomäne enthaltender Rezeptor" (KDR) (Teman et al., Oncogene 6: 1677-83, 1991). Eine weitere alternative Bezeichnung für FLK-1/KDR ist „vaskulärer endothelialer Zellwachstumsrezeptor 2" (VEGFR-2), da sie VEGF mit hoher Affinität bindet. Die murine Version von FLK-1/VGFR-2 ist auch NYK genannt worden (Oelrichs et al., Oncogene 8 (1 ): 11–15, 1993). DNAs, die FLK-1 aus Maus, Ratte und Mensch kodieren, sind isoliert worden, und es wurde über die Nukleotid- und die kodierten Aminosäuresequenzen berichtet (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026-30, 1991; Terman et al., 1991, supra; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579-86, 1992 ; Sarzani et al., supra ; und Millauer et al., Cell 72 835-846, 1993). Zahlreiche Untersuchungen wie diejenigen, von denen Millauer et al., supra, berichten, weisen darauf hin, dass VEGF und FLK-1/KDR/VEGFR-2 ein Ligand-Rezeptor-Paar sind, die bei der Proliferierung vaskulärer endothelialer Zellen und der Bildung und dem Sprießen von Blutgefäßen, als Vaskulogenese bzw. Angiogenese bezeichnet, eine wichtige Rolle spielen.
Eine weitere, als „fms-artige Tyrosinkinase 1" (Flt-1) bezeichnete RTK der Typ-III-Unterklasse ist verwandt mit FLK-1/KDR (DeVries et al., Science 255; 989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5: 519-524, 1990). Eine alternative Bezeichnung für Flt-1 ist „vaskulärer endothelialer Zellwachstumsfaktor-Rezeptor 1" (VEGFR-1 ). Bis heute fand man, dass die Mitglieder der FLK-1/KDR/VEGFR-2- und Flt-1NEGFR-1-Unterfamilien in erster Linie auf endothelialen Zellen exprimiert werden. Die Mitglieder dieser Unterklasse werden von Mitgliedern der vaskulären endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF)-Ligandenfamilie spezifisch stimuliert (Klagsburn und D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7: 259-270, 1996). Der vaskuläre endotheliale Zellwachstumsfaktor (VEGF) bindet Flt-1 mit höherer Affinität als FLK-1/KDR und wirkt auf vaskuläre Endothelzellen mitogen (Terman et a., 1992, supra; Mustonen et al., supra; DeVries et al., supra). Man nimmt an, dass Flt-1 während der vaskulären Entwicklung für die endotheliale Organisation essentiell ist. Die Expression von Flt-1 hängt mit der vaskulären Frühentwicklung in Mausembryonen und mit der Neovaskularisierung während der Wundheilung zusammen (Mustonen und Alitalo, supra). Die Expression von Flt-1 in adulten Organen wie den Nierenglomeruli lässt auf eine zusätzliche, sich nicht auf das Zeltwachstum beziehende Funktion dieses Rezeptors schließen (Mustonen und Alitalo, supra).
Wie bereits angegeben, deuten neuere Belege an, dass VEGF eine Rolle bei der Stimulation der normalen als auch pathologischen Angiogenese spielt (Jakeman et al., Endocrinology 133; 848-859, 1993; Kolch et al., Breast Cancer Research and Treatment 36: 139–155; Ferrara et al., Endocrine Reviews 18(1); 4–25, 1997; Ferrara et al., Regulation of Angiogenesis (Hrsg. L.D. Goldberg und E.M. Rosen), 209–232, 1997). Darüber hinaus ist VEGF mit der Kontrolle und Verstärkung der vaskulären Permeabilität in Verbindung gebracht worden (Connolly et al., J. Bio. Chem. 264: 20017–20024, 1989; Brown et al., Regulation of Angiogenesis (Hrsg. L.D. Goldberg und E.M. Rosen), 233–269, 1997).
Es wurde über unterschiedliche Formen von VEGF, die auf ein alternatives Spleißen der mRNA zurückzuführen sind, berichtet; hierzu gehören die vier von Ferrara et al., (J. Cell. Biochem, 47: 211–218, 1991) beschriebenen Arten. Sowohl sekretierte als auch vornehmlich Zell-assoziierte Arten von VEGF wurden von Ferrera et al., supra, identifiziert, und es ist bekannt, dass das Protein in Form Disulfid-verknüpfter Dimere vorkommt.
Mehrere verwandte Homologe von VEGF sind vor kurzem identifiziert worden. Ihre Rollen bei normalen physiologischen und krankhaften Vorgängen ist allerdings noch nicht aufgeklärt worden. Darüber hinaus werden die Mitglieder der VEGF-Familie oftmals mit VEGF in einer Vielzahl von Geweben koexprimiert und vermögen im Allgemeinen mit VEGF Heterodimere zu bilden. Diese Eigenschaft verändert wahrscheinlich die Rezeptorspezifität und die biologischen Wirkungen der Heterodimere und erschwert ferner die Aufklärung ihrer spezifischen Funktionen, wie nachstehend veranschaulicht (Korpelainen und Alitalo, Curr. Opin. Cell Biol., 159–164, 1998 und die darin zitierten Druckschriften).
Der Plazentawachstumsfaktor (PIGF) hat eine Aminosäuresequenz, die eine signifikante Homologie mit der VEGF-Sequenz aufweist (Park et al., J. Biol. Chem. 269: 25646–54, 1994; Maglione et al. Oncogene 8, 925–31, 1993). Wie im Falle von VEGF sind unterschiedliche Arten von PIGF auf ein alternatives Spleißen der mRNA zurückzuführen und das Protein kommt in dimerer Form vor (Park et al., supra). PIGF-1 und PIGF-2 binden an Flt-1 mit hoher Affinität, und PIGF-2 bindet auch mit Avidität an Neuropilin-1 (Migdal et al., J. Biol. Chem. 273 (35): 22272–22278), aber keines von beiden bindet an FLK-1/KDR (Park et al., supra). PIGF potenziert Berichten zufolge sowohl die vaskuläre Permeabilität als auch die mitogene Wirkung von VEGF auf endotheliale Zellen, wenn VEGF in niedrigen Konzentrationen zugegen ist (es heißt, wegen der Heterodimerbildung) (Park et al., supra).
VEGF-B wird in zwei Isoformen (167 und 185 Reste) produziert, die ebenfalls Flt-1/VEGFR-1 zu binden scheinen. Es könnte eine Rolle bei der Regulation des extrazellulären Matrixabbaus, der Zelladhäsion und der Migration über die Modulation der Expression und Aktivität des Urokinase-artigen Plasminogenaktivators und Plasminogenaktivator-Inhibitors 1 spielen (Pepper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998), 95(20): 11709–11714).
VEGF-C wurde ursprünglich als ein Ligand für VEGFR-3/Flt-4, das primär von lymphatischen endothelialen Zellen exprimiert wird, kloniert. In seiner vollständig prozessierten Form kann VEGF-C ebenfalls KDR/VEGFR-2 binden und die Proliferation und Migration endothelialer Zellen in vitro sowie die Angiogenese in invivo-Modellen stimulieren (Lymboussaki et al., Am. J. Pathol. (1998), 153(2): 395-403; Witzenbichler et al., Am. J. Pathol. (1998), 153(2), 381–394). Die transgene Überexpression von VEGF-C verursacht eine Proliferation und Ausdehnung nur von lymphatischen Gefäßen, während Blutgefäße nicht betroffen sind. Anders als VEGF wird die Expression von VEGF-C durch Hypoxie nicht induziert (Ristimaki et al., J. Biol. Chem. (1998), 273(14), 8413–8418).
Das jüngst entdeckte VEGF-D ist dem VEGF-C strukturell sehr ähnlich. Berichten zufolge bindet und aktiviert VEGF-D wenigstens zwei VEGFRs, VEGF-3/Flt-4 und KDR/VEGFR-2. Es wurde ursprünglich als ein c-fos-induzierbares Mitogen für Fibroblasten kloniert und ist am markantesten in den mesenchymalen Zellen der Lunge und Haut exprimiert (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998), 95(2), 548–553, und die zitierten Druckschriften).
Es ist behauptet worden, dass VEGF-C und VEGF-D in einem Miles-Test in vivo Zunahmen der vaskulären Permeabilität induzierten, wenn sie in kutanes Gewebe injiziert wurden (PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbichler et al., supra). Die physiologische Rolle und Bedeutung dieser Liganden bei der Modulation der vaskulären Hyperpermeabilität und endothelialer Antworten in Geweben, in denen sie exprimiert sind, bleibt unsicher.
Legt man die neu aufkommenden Entdeckungen weiterer Homologe von VEGF und VEGFRs sowie die Präzedenzfälle zur Ligand- und Rezeptor-Heterodimerisierung zugrunde, kann die Bildung von VEGF-Ligand-Heterodimeren und/oder die Heterodimerisierung von Rezeptoren oder die Bindung an einen noch unentdeckten VEGFR an der Wirkung solcher VEGF-Homologe beteiligt sein (Witzenbichler et al., supra). Auch deuten neuere Berichte darauf hin, dass Neuropilin-1 (Migdal et al., supra) oder VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler et al., supra) oder andere Rezeptoren als KDR/VEGFR-2 für die Induktion der vaskulären Permeabilität verantwortlich sein können (Stacker, S.A., Vitali, A., Domagala, T., Nice, E., und Wilks, A.F., „Angiogenesis and Cancer" Conference, Amer. Assoc. Cancer Res., Jan. 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetologia 40: S118–120 (1997)). Bis jetzt ist kein direkter Beleg für die essentielle Rolle von KDR in VEGFvermittelter vaskulärer Hyperpermeabilität gegeben worden.
Die Nichtrezeptortyrosinkinasen.
Die Nichtrezeptortyrosinkinasen stellen eine Sammlung zellulärer Enzyme dar, denen extrazelluläre und transmembrane Sequenzen fehlen. Bis heute sind über 24 einzelne Nichtrezeptortyrosinkinasen identifiziert worden, wozu elf (11) Unterfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack und LIMK) gehören. Die Src-Unterfamilie von Nichtrezeptortyrosinkinasen besteht zur Zeit aus der größten Anzahl von PTKn; hierzu gehören Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Die Src-Unterfamilie von Enzymen ist mit der Oncogenese in Verbindung gebracht worden. Eine detailliertere Auseinandersetzung mit Nichtrezeptortyrosinkinasen findet sich in Bolen, 1993, Oncogene 8: 2025–2031, welche durch Bezugnahme Teil der vorliegenden Offenbarung ist.
Man hat gefunden, dass viele der Tyrosinkinasen, ob RTK oder Nichtrezeptor-tyrosinkinase, an zellulären Signalwegen beteiligt sind, die wiederum an zahlreichen pathogenen Zuständen, Krebs, Psoriasis und weitere hyperproliferative Erkrankun-gen oder Hyperimmunantworten eingeschlossen, beteiligt sind.
Entwicklung von Verbindungen zur Modellierung der PTKn.
Angesichts der vermuteten Bedeutung von PTKn für die Kontrolle, Regulation und Modulation der Zellproliferation, sowie für Erkrankungen und Störungen, die mit einer anormalen Zellproliferation in Verbindung stehen, sind viele Versuche unternommen worden, „Inhibitoren" für Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen zu identifizieren, wobei man eine Vielzahl von Ansätzen verwendete, wozu die Verwendung mutierter Liganden (US-Anmeldung Nr. 4,966,849), löslicher Rezeptoren und Antikörper (Anmeldungsnummer WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci 90: 10705-09; Kim et al., 1993, Nature 362: 841–844), von RNA-Liganden (Jellinek et al., Biochemistry 33 : 10450–56 ; Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella et al., 1992, Exp. Cell Res. 199 : 56–62 ; Wright et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448-57) und Tyrosinkinaseinhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US-Patent Nr. 5,330,992; Mariani et al., 1994, Proc. Am. Associ. Cancer Res., 35: 2268) gehören.
Kürzlich wurden Versuche unternommen, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinaseinhibitoren wirken. Bismonocyklische, bicyklische oder heterocyklische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642) und Vinylenazaindol-Derivate (PCT WO 94/14808) wurden beispielsweise in allgemeiner Form als Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben. Styrylverbindungen (US-Patent Nr. 5,217,999), Styryl-substituierte Pyridylverbindungen (US-Patent- Nr. 5,302,606), gewisse Chinazolin-Derivate (EP-Anmeldungsnr. 0 566 266 A1; Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(4): 475–478), Selenoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyklische Polyhydroxyverbindungen (PCT WO 92/21660), und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495) sind als Verbindungen für die Verwendung als Tyrosinkinaseinhibitoren zur Behandlung von Krebs beschrieben worden. Anilincinnoline (PCT WO 97/34876) und Chinazolinderivat-Verbindungen (PCT WO 97/22596; PCT WO 97/42187) sind als Inhibitoren der Angiogenese und vaskulären Permeabilität beschrieben worden.
Darüber hinaus sind Versuche unternommen worden, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Serin/Threoninkinase-Inhibitoren wirken. Insbesondere ist beschrieben worden, dass bis(Indolylmaleimid)-Verbindungen bestimmte PKC-Serin/Threoninkinase-Isoformen hemmen, deren Fehlfunktion mit einer veränderten vaskulären Permeabilität in mit VEGF in Beziehung stehenden Erkrankungen zusammenhängt (PCT WO 97/40830; PCT WO 97/40831).
Die Identifizierung wirksamer kleiner Moleküle, welche die Signaltransduktion durch eine Modulierung der Aktivität von Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen spezifisch inhibieren, um eine anormale oder unzweckmäßige Zellproliferation, – differenzierung oder -stoffwechselaktivität zu regulieren und zu modulieren, ist daher wünschenswert. Von Nutzen wäre insbesondere die Identifizierung von Verfahren und Verbindungen, die spezifisch die Funktion einer Tyrosinkinase hemmen, welche für den Angiogenesevorgang oder die Bildung der vaskulären Hyperpermeabilität – was zu Ödemen, Ascites, Ergüssen, Exsudaten und makromolekularen Extravasationen und Matrixablagerungen genauso wie zu damit zusammenhängenden Erkrankungen führt – essentiell ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung einer der Formeln:
worin
X Sauerstoff oder Schwefel ist;
Ring A für die Strukturen:
steht;
n 1 oder 2 ist;
Ar
ist; und
R¹ für Wasserstoff, Methyl, -COR³ oder -SO₂R³ steht;
R² für Halogen mit einem Atomgewicht von etwa 19 bis 36 steht; und
R³ für -CH₃ oder
steht, worin Y für Wasserstoff, Chlor oder -CH₃ steht.
Stereoisomere und Gemische von Stereoisomeren gehören zur Erfindung. Tautomere der Verbindungen werden ebenfalls von der Erfindung erfasst. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze dieser Verbindungen gehören auch zu dieser Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Inhibitoren der Proteinkinaseaktivität brauchbar. Vor allem sind die Verbindungen dieser Erfindung brauchbar als Inhibitoren von Proteinkinasen, die für den Angiogenesevorgang und/oder die vaskuläre Permeabilität von Bedeutung sind. Da diese Verbindungen antiangiogen und/oder antiödematös sind, stellen sie wichtige Substanzen dar, um die Progredienz von Erkrankungszuständen zu inhibieren, bei denen eine Angiogenese und/oder ein Ödem festzustellen sind.
Eine bevorzugte Verbindung der vorliegenden Erfindung hat die Formel:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Inhibitoren von Serin/Threonin- und Tyrosinkinasen brauchbar. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verbindungen als Inhibitoren von Tyrosinkinasen brauchbar, die bei hyperproliferativen Erkrankungen, insbesondere beim Angiogenesevorgang, von Bedeutung sind. Da diese Verbindungen antiangiogen sind, stellen sie wichtige Substanzen zur Inhibierung der Progredienz von Erkrankungszuständen dar, bei denen die Angiogenese eine wichtige Komponente ist.
Zur vorliegenden Erfindung gehört des weiteren die Verwendung dieser Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindungen und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können Individuen verabreicht werden, um den Angiogenesevorgang in Angiogenese-unterstützten Erkrankungen zu verlangsamen oder aufzuhalten oder um Ödeme, Ergüsse, Exsudate oder Ascites und weitere mit einer vaskulären Hyperpermeabilität in Verbindung stehende Zustände zu behandeln.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben antiangiogene Eigenschaften. Diese antiangiogenen Eigenschaften sind zumindest zum Teil auf die Inhibierung von Proteintyrosinkinasen, die für Angiogenesevorgänge essentiell sind, zurückzuführen.
Deshalb können diese Verbindungen als aktive Agenzien gegen solche Erkrankungszustände verwendet werden, wie Arthritis, Atherosklerose, Psoriasis, Hämangiome, eine myokardiale Angiogenese, koronare und zerebrale Kollaterale, eine Angiogenese ischämischer Gliedmaßen, Wundheilung, mit gastrointestinalem Helicobacter-Ulcus in Verbindung stehende Erkrankungen, Frakturen, Katzenkratzkrankheit, Rubeose, ein neovaskuläres Glaukom, und Retinopathien wie diejenigen, die mit diabetischer Retinopathie oder altersbedingter Makuladegeneration in Zusammenhang stehen. Hinzu kommt, dass einige dieser Verbindungen als aktive Agenzien gegen solide Tumoren, maligne Ascites, hämatopoetische Krebsarten und hyperproliferative Erkrankungen, wie eine Thyroidhyperplasie (insbesondere Basedow-Krankheit) und Zysten (wie die Hypervaskularität des Ovarstromas als Charakteristikum eines polyzystischen Ovarsyndroms (Stein-Leventhal-Syndrom)) verwendet werden können, da derartige Erkrankungen eine Proliferation von Blutgefäßzellen für Wachstum und Metastase benötigen.
Des weiteren können einige dieser Verbindungen als aktive Agenzien gegen Verbrennungen, chronische Lungenerkrankung, Gehirnschlag, Polypen, Anaphylaxis, chronische und allergische Entzündung, ovariales Hyperstimulationssyndrom, ein mit einem Gehirntumor in Zusammenhang stehendes zerebrales Ödem, ein durch Höhe, Trauma oder Hypoxie induziertes zerebrales oder pulmonales Ödem, okuläre und Makulaödeme, Ascites und weitere Erkrankungen, bei denen vaskuläre Hyperpermeabilität, Ergüsse, Exsudate, Proteinextravasation oder Ödeme eine Erscheinungsform der Krankheit sind, verwendet werden. Die Verbindungen werden auch für die Behandlung von Störungen brauchbar sein, bei denen eine Proteinextravasation zur Ablagerung von Fibrin und extrazellulärer Matrix führt, was die stromale Proliferation fördert (z.B. Fibrose, Zirrhose und Karpaltunnelsyndrom).
VEGFen sind einmalig darin, dass sie die einzigen angiogenen Wachstumsfaktoren sind, von denen bekannt ist, dass sie zur vaskulären Hyperpermeabilität und der Ödembildung beitragen. In der Tat scheinen vaskuläre Hyperpermeabilität und Ödeme, die mit der Expression oder Verabreichung vieler anderer Wachstumsfaktoren in Zusammenhang stehen, über die VEGF-Produktion vermittelt zu sein. Inflammatorische Cytokine stimulieren die VEGF-Produktion. Eine Hypoxie führt dazu, dass VEGF in zahlreichen Geweben deutlich hochreguliert ist; Situationen, an denen ein Infarkt, eine Okklusion, Ischämie, Anämie oder Durchblutungsstörung beteiligt ist, rufen typischerweise VEGF/VPF-vermittelte Antworten hervor. Eine vaskuläre Hyperpermeabilität, ein damit zusammenhängendes Ödem, ein veränderter transendothelialer Austausch und eine makromolekulare Extravasation, oftmals von einer Diapedese begleitet, kann zu einer übermäßigen Matrixablagerung, aberranten stromalen Proliferation, Fibrose, etc. führen. Eine VEGF-vermittelte Hyperpermeabilität kann daher einen signifikanten Beitrag zu Störungen mit diesen etiologischen Merkmalen leisten.
Es ist abzusehen, dass die oben angegebenen Störungen in erheblichem Maße durch eine Proteintyrosinkinase-Aktivität unter Beteiligung der KDR/VEGFR-2- und/oder der Flt-1/VEGFR-1-Tyrosinkinasen vermittelt sind. Indem man die Aktivität dieser Tyrosinkinasen inhibiert, wird die Progredienz der aufgeführten Störungen inhibiert, da die angiogene oder vaskuläre Hyperpermeabilitätskomponente des Erkrankungszustandes empfindlich eingeschränkt wird. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, über ihre Selektivität für spezifische Tyrosinkinasen, führt zu einer Minimierung von Nebenwirkungen, die auftreten würden, wenn weniger selektive Tyrosinkinase-Inhibitoren verwendet würden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine inhibitorische Aktivität gegen Proteinkinasen. Die Verbindungen modulieren nämlich die Signaltransduktion der Proteinkinasen. Erfindungsgemäße Verbindungen inhibieren Proteinkinasen aus den Serin/Threonin- und Tyrosinkinase-Klassen. Insbesondere inhibieren die Verbindungen die Aktivität der KDR/FLK-1/VEGFR-2-Tyrosinkinasen selektiv. Bestimmte Verbindungen der Erfindung inhibieren auch die Aktivität weiterer Tyrosinkinasen, wie Flt-1/VEGFR-1, Kinasen der Src-Unterfamilie, wie Lck, Src, fyn, yes, etc. Hinzu kommt, dass einige erfindungsgemäße Verbindungen Serin/Threonin-Kinasen wie CDKs, die bei der Zellzyklus-Progression eine wesentliche Rolle spielen, signifikant hemmen. Die Stärke und Spezifität der generischen Verbindungen dieser Erfindung im Hinblick auf eine bestimmte Proteinkinase kann oftmals verändert und optimiert werden, indem man die Art, Zahl und Anordnung der Substituenten (d.h. R¹, R² und R³) dieser Verbindungen und Konformationseinschränkungen variiert. Darüber hinaus können auch die Metaboliten bestimmter Verbindungen eine signifikante inhibitorische Aktivität für Proteinkinasen aufweisen.
Werden die erfindungsgemäßen Verbindungen Individuen, die solche Verbindungen benötigen, verabreicht, inhibieren sie in diesen Individuen eine vaskuläre Hyperpermeabilität und die Bildung von Ödemen. Es ist anzunehmen, dass die Verbindungen wirken, indem sie die Aktivität der KDR-Tyrosinkinase, die am Vorgang der vaskulären Hyperpermeabilität und Ödembildung beteiligt ist, inhibieren. Die KDR-Tyrosinkinase kann ebenfalls als FLK-1-Tyrosinkinase, NYK-Tyrosinkinase oder VEGFR-2-Tyrosinkinase bezeichnet werden. Die KDR Tyrosinkinase wird aktiviert, wenn der vaskuläre endotheliale Zellwachstumsfaktor (VEGF) oder ein anderer aktivierender Ligand (wie VEGF-C, VEGF-D oder das HIV-Tat-Protein) an einen KDR-Tyrosinkinaserezeptor bindet, welcher auf der Oberfläche von vaskulären Endothelialzellen liegt. Einer solchen KDR-Tyrosinkinase-Aktivierung schließt sich eine Hyperpermeabilität der Blutgefäße an und Flüssigkeit bewegt sich aus dem Blutstrom hinter die Blutgefäßwände in interstitielle Räume, wodurch sich ein Ödembereich bildet. Diese Antwort wird häufig auch von einer Diapedese begleitet. In ähnlicher Art und Weise kann eine übermäßige vaskuläre Hyperpermeabilität den normalen molekularen Austausch über das Endothel in kritischen Geweben und Organen (z.B. der Lunge und der Niere) stören, was zu makromolekularer Extravasation und Ablagerung führt. Im Anschluss an diese akute Antwort auf die KDR-Stimulation, von der man annimmt, dass sie den anschließenden angiogenen Vorgang unterstützt, führt eine anhaltende KDR- Tyrosinkinase-Stimulation zur Proliferation und Chemotaxis vaskulärer Endothelzellen und zur Bildung neuer Gefäße. Dadurch, dass man die Aktivität der KDR- Tyrosinkinase inhibiert, indem man entweder die Produktion des aktivierenden Liganden blockiert, die Bindung des aktivierenden Liganden an den KDR-Tyrosinkinaserezeptor blockiert, die Rezeptordimerisierung und Transphosphorylierung unterbindet, die Enzymaktivität der KDR-Tyrosinkinase inhibiert (die Phosphorylierungsfunktion des Enzyms inhibiert) oder einen weiteren Mechanismus verwendet, der die nachgeschaltete (downstream) Signalgebung der Kinase stört (D. Mukhopedhyay et al., Cancer Res. 58: 1278–1284 (1998) und die darin zitierten Druckschriften) kann die Hypermermeabilität genauso wie die damit zusammenhängende Extravasation, anschließende Ödembildung und Matrixablagerung, und können angiogene Antworten inhibiert und minimiert werden.
Eine Gruppe bevorzugter erfindungsgemäßer Verbindungen besitzt die Eigenschaft, die Aktivität der KDR-Tyrosinkinase zu inhibieren, ohne die Aktivität der Flt-1-Tyrosinkinase (die Flt-1-Tyrosinkinase wird auch als VEGFR-1-Tyrosinkinase bezeichnet) signifikant zu inhibieren. Sowohl die KDR-Tyrosinkinase als auch die Flt-1-Tyrosinkinase werden aktiviert, indem VEGF an KDR-Tyrosinkinaserezeptoren bzw. an Flt-1-Tyrosinkinaserezeptoren bindet. Da die Aktivität der Flt-1-Tyrosinkinase wichtige Ereignisse bei der Instandhaltung des Endothels und der vaskulären Funktion vermitteln kann, kann eine Inhibierung dieser Enzymaktivität zu toxischen oder ungünstigen Wirkungen führen. Allermindestens wird eine solche Inhibierung für die Blockierung angiogener Antworten, die Induktion vaskulärer Hyperpermeabilität und die Ödembildung nicht benötigt, so dass sie überflüssig und für das Individuum nicht von Wert ist. Gewisse bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind einzigartig, da sie die Aktivität einer VEGF-Rezeptor-Tyrosinkinase (KDR), die von aktivierenden Liganden aktiviert wird, inhibieren, andere Rezeptortyrosinkinasen, wie Flt-1, die ebenfalls von gewissen aktivierenden Liganden aktiviert werden, jedoch nicht inhibieren. Die bevorzugten Verbindungen dieser Erfindung sind daher in ihrer Tyrosinkinase-inhibierenden Aktivität selektiv.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls bei der Behandlung von Geschwüren – bakteriellen Geschwüren, Pilzgeschwüren, Mooren-Geschwüren und ulcerativer Colitis – brauchbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar bei der Behandlung von Zuständen, bei denen eine unerwünschte Angiogenese, ein Ödem oder stromale Ablagerung bei viralen Infektionen vorkommt, wie Herpes simplex, Herpes Zoster, AIDS, Kaposisarkom, Protozoen-Infektionen und Toxoplasmose, im Anschluss an eine Verletzung, Strahlung, einen Gehirnschlag, eine Endometriose, ein ovariales Hyperstimulationssyndrom, einen systemischen Lupus, eine Sarcoidose, Synovitis, Crohn-Krankheit (Morbus Crohn), Sichelzellanämie, Lyme-Krankheit, ein Pemphigoid, Paget-Krankheit, ein Hyperviskositätssyndrom, eine Osler-Weber-Rendu-Krankheit, chronische Entzündung, chronische okklusive Lungenerkrankung, Asthma, rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar bei der Behandlung von okulären Bedingungen wie okulären und Makulaödemen, okulärer neovaskulärer Erkrankung, Scleritis, radialer Keratotomie, Uveitis, Vitritis, Myopie, optischen Pits, chronischer Netzhautablösung, Komplikationen nach Laserbehandlung, Konjunktivitis, Stargardt-Krankheit und Eales-Krankheit zusätzlich zur Retinopathie und Makuladegeneration.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar bei der Behandlung kardiovaskulärer Bedingungen, wie Atherosklerose, Restenose, Gefäßverschluss und obstruktiver Erkrankung der Carotis.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar bei der Behandlung von Indikationen, die mit Krebs in Zusammenhang stehen, wie soliden Tumoren, Sarkomen (insbesondere Ewing-Sarkomen und Osteosarkomen), Retinoblastomen, Rhabdomyosarkomen, Neuroblastomen, hämatopoetischen Entartungen, Leukämien und Lymphome eingeschlossen, Tumor-induzierten pleuralen oder perikardialen Ergüssen und maligner Ascites.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar bei der Behandlung diabetischer Bedingungen, wie Glaukomen, diabetischer Retinopathie und Mikroangiopathie.
Es ist abzusehen, dass die oben angegebenen Störungen in einem signifikanten Maße durch eine Proteintyrosinkinase-Aktivität, an der die VEGF-Rezeptoren (z.B. KDR und Flt-1) beteiligt sind, vermittelt sind. Indem man die Aktivität dieser Rezeptortyrosinkinasen inhibiert, wird die Progredienz der angegebenen Störungen inhibiert, da die angiogene Komponente der Erkrankungszustände empfindlich eingeschränkt wird. Die Wirkung der Verbindungen dieser Erfindung führt über ihre Selektivität für spezifische Tyrosinkinasen zu einer Minimierung von Nebenwirkungen, die auftreten würden, falls weniger selektive Tyrosinkinase-Inhibitoren verwendet würden.
Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel I, wie eingangs definiert (einschließlich der Maßgaben), zur Verwendung als Medikamente, insbesondere als Inhibitoren der Proteinkinaseaktivität, z.B. der Tyrosinkinaseaktivität, Serinkinaseaktivität und Threoninkinaseaktivität, zur Verfügung. Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Verbindungen der Formel I, wie eingangs definiert (einschließlich der Maßgaben), bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Inhibierung einer Proteinkinaseaktivität zur Verfügung.
Erfindungsgemäß gelten die folgenden Definitionen:
„Pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz" bezieht sich auf diejenigen Salze, welche die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen beibehalten und die durch Umsetzung mit anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder organischen Säuren wie Sulfonsäure, Carbonsäure, organischer Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Milchsäure, Weinsäure und dergleichen erhalten werden.
„Alkyl" bezieht sich auf einen gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoff, wozu geradkettige und verzweigte Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen gehören.
„Alkoxy" bezieht sich auf eine „O-Alkyl"-Gruppe, worin „Alkyl" wie zuvor beschrieben definiert ist.
Pharmazeutische Formulierungen
Die identifizierten erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen sie mit geeigneten Trägern oder Exzipienten vermischt sind, einem menschlichen Patienten in Dosen zur Behandlung oder Verbesserung einer Vielzahl von Störungen verabreicht werden. Gemische dieser Verbindungen können dem Patienten als einfaches Gemisch oder in zweckmäßig formulierten pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich des Weiteren auf diejenige Menge der Verbindung oder der Verbindungen, die ausreicht, um eine Prävention der Erkrankungsprogredienz zu führen. Techniken zur Formulierung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, zu finden.
Verabreichungswege
Zu geeigneten Verabreichungswegen gehören beispielsweise die orale, rektale, transmuköse, topische oder intestinale Verabreichung oder die Verabreichung in Form von Augentropfen; die parenterale Abgabe – intramuskuläre, subkutane, intrameduläre Injektionen genauso wie intrathecale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokuläre Injektionen eingeschlossen.
Alternativ kann man die Verbindung in einer eher lokalen als systemischen Weise verabreichen, beispielsweise durch Injektion der Verbindung direkt in einen soliden Tumor, oftmals in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung.
Außerdem kann man den Wirkstoff in einem System zur gezielten Wirkstoffabgabe verabreichen, beispielsweise in einem mit tumorspezifischem Antikörper beschichteten Liposom. Die Liposomen werden gezielt an den Tumor herangeführt und von ihm selektiv aufgenommen.
Zusammensetzung
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, z. B. mittels konventioneller Verfahren zum Vermischen, Lösen, Granulieren, Dragieren, Pulverisieren, Emulgieren, Einkapseln, Einschließen oder Lyophilisieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die erfindungsgemäße Verwendung können somit in konventioneller Art und Weise formuliert werden, wobei man einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger verwendet, die Exzipienten und Hilfsstoffe beinhalten, welche das Prozessieren der aktiven Verbindungen in pharmazeutisch verwendbare Zubereitungen erleichtern. Die richtige Formulierung hängt von dem gewählten Verabreichungsweg ab.
Zur Injektion können die Agenzien der Erfindung in wässrigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung formuliert werden. Für die transmuköse Verabreichung werden für die zu permeierende Barriere geeignete Penetriermittel in der Formulierung verwendet. Derartige Penetriermittel sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen auf einfache Art und Weise formuliert werden, indem man die aktiven Verbindungen mit dem Fachmann hinlänglich bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert. Derartige Träger gestatten es, die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Breis, Suspensionen und dergleichen für die orale Aufnahme durch den zu behandelnden Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung können erhalten werden, indem man die aktive Verbindung mit einem festen Exzipienten kombiniert, das resultierende Gemisch gegebenenfalls mahlt und das Granulatgemisch, nach Zusatz geeigneter Hilfsmittel, sofern gewünscht, zu Tabletten oder Drageekernen verarbeitet. Geeignete Exzipienten sind vor allem Füllmittel, wie Zucker – Lactose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol eingeschlossen; Cellulose-Zubereitungen, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Sofern gewünscht, können desintegrierende Mittel zugesetzt werden, wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure, oder ein Salz davon, wie Natriumalginat.
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen. Dazu kann man konzentrierte Zuckerlösungen verwenden, die gegebenenfalls arabisches Gummi, Talc, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethlenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten- oder Drageeüberzügen zugesetzt werden, um sie erkennbar oder verschiedene Kombinationen von Dosen aktiver Verbindung kenntlich zu machen.
Zu pharmazeutischen Zubereitungen, die oral verwendet werden können, gehören Steckkapseln aus Gelatine genauso wie geschlossene Weichkapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glyzerin oder Sorbitol. Die Hartkapseln können die aktiven Inhaltsstoffe im Gemisch mit Füllmitteln wie Lactose, Bindemitteln wie Stärken und/oder Gleitmitteln wie Talc oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls Stabilisierungsmitteln enthalten. In Weichkapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie fetten Ölen, Flüssigparaffin oder flüssigen Polyethylenglykolen, gelöst oder suspendiert sein. Hinzu kommt, dass Stabilisierungsmittel zugegeben werden können. Sämtliche Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in für die Verabreichung geeigneten Dosierungen vorliegen.
Für die buccale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen haben, die in herkömmlicher Art und Weise formuliert sind.
Für die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung bequem in Form einer Aerosol-Spray-Zubereitung aus Druckbehältern oder Nebulisierern unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder eines anderen geeigneten Gases, abgegeben werden. Im Fall eines Druckaerosols kann die Dosiseinheit bestimmt werden, indem man ein Ventil zur Abgabe einer abgemessenen Menge vorsieht. Kapseln oder Kartuschen aus beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Pulverzerstäuber können formuliert werden, wobei sie ein Pulvergemisch der Verbindung und einer geeigneten Pulverbase wie Laktose oder Stärke enthalten.
Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung durch Injektion, z.B. Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Dosiseinheitsform vorliegen, z.B. in Ampullen oder Multidosis-Behältern, mit einem zugesetzten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen, und sie können Formuliermittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten.
Zu pharmazeutischen Formulierungen für die parenterale Verabreichung gehören wässrige Lösung der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Hinzu kommt, dass Suspensionen der aktiven Verbindungen als zweckmäßige ölige Injektionssuspensionen zubereitet werden können. Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören fette Öle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran. Gegebenenfalls können die Suspensionen auch geeignete Stabilisierungsmittel oder Mittel, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen oder mit denen sich hochkonzentrierte Lösungen zubereiten lassen, enthalten.
Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff in Pulverform vorliegen, um vor Gebrauch mit einem geeigneten Vehikel, z.B. sterilem pyrogenfreien Wasser, rekonstituiert zu werden.
Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen, wie Suppositorien oder Retentionsklistiers, die z.B. herkömmliche Suppositorienbasen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotzubereitungen formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können mittels Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär oder durch intramuskuläre Injektion) verabreicht werden. So können die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise einer Emulsion in einem verträglichen Öl) oder lonenaustauschharzen, oder als wenig lösliche Derivate, beispielsweise als wenig lösliches Salz, formuliert werden.
Ein pharmazeutischer Träger für die erfindungsgemäßen hydrophoben Verbindungen ist ein Cosolvenssystem, das Benzylalkohol, ein nichtpolares Tensid, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase umfasst. Das Cosolvenssystem kann das VPD-Cosolvenssystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3 % G/V Benzylalkohol, 8 % G/V des nichtpolaren Tensids Polysorbat 80 und 65 % G/V Polyethylenglykol 300 in absolutem Ethanol. Das VPD-Cosolvenssystem (VPD:5W) besteht aus VPD, das 1 : 1 mit einer Lösung von 5 % Dextrose in Wasser verdünnt ist. Dieses Cocolvenssystem löst hydrophobe Verbindungen gut und ruft nach systemischer Verabreichung selbst geringe Toxizität hervor. Natürlich kann die anteilige Zusammensetzung des Cosolvenssystems beachtlich variiert werden, ohne dass dessen Lösungs- und Toxizitätseigenschaften abhanden kommen. Außerdem kann die Art der Cosolvenskomponenten variiert werden: Beispielsweise können an Stelle von Polysorbat 80 andere nichtpolare Tenside mit geringer Toxizität verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglykols kann variiert werden; weitere biokompatible Polymere können Polyethylenglykol ersetzen, z.B. Polyvinylpyrrolidon; und weitere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposomen und Emulsionen stellen hinlänglich bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Träger für hydrophobe Wirkstoffe dar. Bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid können auch eingesetzt werden, wenngleich in der Regel auf Kosten einer größeren Toxizität. Hinzu kommt, dass die Verbindungen abgegeben werden können, indem man ein System mit verzögerter Freisetzung verwendet, wie semipermeable Matrizes fester hydrophober Polymere, die das therapeutische Agens enthalten. Verschiedene Materialien mit verzögerter Freisetzung sind etabliert worden und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Kapseln mit verzögerter Freisetzung können in Abhängigkeit von ihrer chemischen Natur die Verbindungen wenige Wochen bis zu über 100 Tage lang freisetzen. In Abhängigkeit von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Agens, können zusätzliche Strategien zur Stabilisierung von Proteinen eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete Träger oder Exzipienten für eine Fest- oder Gelphase umfassen. Zu solchen Trägern oder Exzipienten gehören beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglykole, ohne darauf beschränkt zu sein.
Viele der erfindungsgemäßen Proteinkinase-modulierenden Verbindungen können als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen zur Verfügung gestellt werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet werden; hierzu gehören Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Bernsteinsäure etc., ohne darauf beschränkt zu sein. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Basenformen.
Wirksame Dosierung
Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet sind, gehören Zusammensetzungen, in denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, so dass der beabsichtigte Zweck erreicht wird. Insbesondere meint eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die wirksam die Entwicklung von Symptomen des zu behandelnden Subjekts verhindert oder vorhandene Symptome lindert. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt ohne weiteres im Bereich fachmännischen Könnens, vor allem dann, wenn man die hier gegebene detaillierte Offenbarung berücksichtigt.
Für jede beliebige, im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis zunächst an zellulären Assays bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Dosis in Tiermodellen formuliert werden, um einen Kreislaufkonzentrationsbereich zu erzielen, welcher die im zellulären Assay bestimmte IC₅₀ (d.h. diejenige Konzentration der Testverbindung, welche eine halbmaximale Inhibierung der PTK-Aktivität bewirkt) beinhaltet. Eine derartige Information kann verwendet werden, um die in Menschen brauchbaren Dosen genauer zu bestimmen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die zu einer Verbesserung von Symptomen oder einem längeren Überleben eines Patienten führt. Toxizität und therapeutische Wirksamkeit therapeutischer Verbindungen können mit Hilfe standardisierter pharmazeutischer Vorgehensweisen in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z.B. zur Bestimmung einer maximal verträglichen Dosis (MTP) und der ED₅₀ (die Dosis, die bei 50 % der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index und kann als Verhältnis zwischen MTP und ED₅₀ angegeben werden. Bevorzugt werden Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes haben. Die mit diesen Zellkultur-Assays und Tierstudien erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines für Menschen verwendbaren Dosierungsbereichs verwendet werden. Die Dosierung derartiger Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Kreislaufkonzentrationen, welche die ED₅₀ mit geringer Toxizität oder ohne Toxizität beinhalten. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren, je nach eingesetzter Dosierungsform und des verwendeten Verabreichungswegs. Die Formulierung, Verabreichungsweg und Dosierung können letztendlich von dem jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustandes des Patienten gewählt werden (siehe z.B. Fingt et al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kapitel 1, S. 1).
Dosierungsmenge und Dosierungsabstand können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Einheit zur Verfügung zu stellen, die ausreichen, um die Kinase-modulierenden Wirkungen oder die minimal wirksame Konzentration (MEC) aufrecht zu erhalten. Die MEC ist von Verbindung zu Verbindung verschieden; sie kann aber anhand von in-vitro-Daten bestimmt werden; z.B. diejenige Konzentration, die unter Verwendung des hier beschriebenen Assays eine 50 bis 90 %ige Inhibition der Kinase erzielt. Die zum Erreichen der MEC erforderliche Dosierung hängt von den individuellen Eigenschaften und dem Verabreichungsweg ab. HPLC-Assays oder Bioassays können allerdings verwendet werden, um die Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosierungsabstände können auch unter Verwendung des MEC-Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung eines Verabreichungsschemas verabreicht werden, mit dem die Plasmaspiegel 10 bis 90 der Zeit, vorzugsweise 30 bis 90 % und am bevorzugtesten 50 bis 90 % oberhalb der MEC gehalten werden. Im Falle einer lokalen Verabreichung oder einer selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Wirkstoffs nicht mit der Plasmakonzentration in Beziehung stehen.
Die verabreichte Menge der Verbindung wird natürlich von dem zu behandelnden Subjekt, dem Gewicht des Subjekts, der Schwere des Leidens, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden Arztes abhängen.
Verpackung
Falls gewünscht, können die Zusammensetzungen in einer Verpackung oder einer Abgabevorrichtung dargeboten werden, in der eine oder mehrere den aktiven Inhaltsstoff enthaltende Dosierungseinheiten enthalten sind. Die Packung kann beispielsweise eine Metall- oder Plastikfolie umfassen, beispielsweise einen Blister. Der Packung oder Abgabevorrichtung können Instruktionen für die Verabreichung beigefügt sein. Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße, in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formulierte Verbindung beinhalten, können auch zubereitet, in einen geeigneten Behälter gegeben und zur Behandlung eines angegebenen Zustandes markiert werden. Zu geeigneten Zuständen, die auf der Markierung angegeben sind, gehören die Behandlung zellulärer hyperproliferativer Erkrankungen, die Inhibierung der Angiogenese, die Behandlung von Fibrose, Diabetes und dergleichen.
In einigen Formulierungen kann es von Nutzen sein, die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form von Partikeln sehr geringer Größe, wie man sie beispielsweise durch Fluidenergiemahlung erhält, zu verwenden.
In den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen kann die aktive Verbindung gewünschtenfalls mit anderen kompatiblen pharmakologisch aktiven Inhaltsstoffen zusammengebracht werden. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen pharmazeutischen Agenzien, die die Produktion von VEGF inhibieren oder verhindern, intrazelluläre Antworten auf VEGF mindern, intrazelluläre Signaltransduktion blockieren, vaskuläre Hyperpermeabilität inhibieren, Entzündung reduzieren oder die Bildung von Ödemen oder die Neovaskularisierung inhibieren oder verhindern, verabreicht werden. Die Verbindungen der Erfindung können vor, im Anschluss an oder gleichzeitig mit dem zusätzlichen pharmazeutischen Agens verabreicht werden, welches Verabreichungsschema auch immer zweckmäßig ist. Zu den zusätzlichen pharmazeutischen Agenzien gehören Steroide gegen Ödeme, NSAIDs, ras-Inhibitoren, anti-TNF-Agenzien, anti-IL1-Agenzien, anti-Histamine, PAF-Antagonisten, COX-1-Inhibitoren, COX-2-Inhibitoren, NO-Synthase-Inhibitoren, PKC-Inhibitoren und PI3-Kinase-Inhibitoren, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und die zusätzlichen pharmazeutischen Agenzien wirken entweder additiv oder synergistisch. Die Verabreichung einer solchen Kombination von Substanzen, welche die vaskuläre Hyperpermeabilität inhibiert und/oder die Bildung von Ödemen inhibiert, kann daher eine bessere Linderung von den verheerenden Wirkungen einer hyperproliferativen Störung, der Angiogenese, der vaskulären Hyperpermeabilität oder eines Ödems verschaffen als die Verabreichung einer der Substanzen allein. Bei der Behandlung maligner Erkrankungen sind Kombinationen mit antiproliferativen oder cytotoxischen Chemotherapeutika oder Bestrahlung vorauszusehen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Verwendung einer Verbindung der Formel I als Medikament.
Sowohl die Src- als auch die Syk-Kinasefamilien spielen entscheidende Rollen bei der Regulation der Immunfunktion. Zur Src-Familie gehören derzeit Fyn, Lck, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yes, Hck und Blk. Zur Syk-Familie gehören derzeitigem Verständnis nach lediglich Zap und Syk. Die Janus-Familie von Kinasen ist an der Transduktion von Wachstumsfaktor- und proinflammatorischen Cytokinsignalen über eine Vielzahl von Rezeptoren beteiligt. Wenngleich BTK und ITK, Mitglieder der Tec-Familie von Kinasen, eine weniger gut verstandene Rolle in der Immunbiologie spielen, kann sich ihre Modulation durch einen Inhibitor als therapeutisch nützlich erweisen. Die Kinasen RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, IKK-1 und IKK-2 sind an den Signaltransduktionswegen für die proinflammatorischen Schlüssel-Cytokine TNF und IL-1 beteiligt. Anhand ihre Vermögens, eine oder mehrere dieser Kinasen zu inhibieren, können die Verbindungen der Formel I als immunmodulatorische Agenzien funktionieren, welche für den Erhalt von Allotransplantaten und bei der Behandlung von Autoimmunstörungen nützlich sein können. Wegen ihres Vermögens, die T-Zellaktivierung oder die Verstärkung eines entzündlichen Vorgange zu regulieren, können diese Verbindungen auch zur Behandlung solcher Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Wegen Abstoßungsphänomenen, entweder Wirt-gegen-Transplantat bei soliden Organen oder Transplantat-gegen-Wirt bei Knochenmark, sind Transplantate durch die Toxizität der derzeit verfügbaren immunsuppressiven Agenzien begrenzt und würden von einem wirksamen Wirkstoff mit verbessertem therapeutischen Index Nutzen ziehen. Gezielte Genexperimente haben die wesentliche Rolle von Src in der Biologie der Osteoklasten, den für die Knochenresorption verantwortlichen Zellen, gezeigt. Wegen ihres Vermögens, Src zu regulieren, können die Verbindungen der Formel I auch bei der Behandlung der Osteoporose, Osteopetrose, Paget-Erkrankung, Tumor-induzierter Hypercalcämie und bei der Behandlung von Knochenmetastasen nützlich sein.
Es ist gezeigt worden, dass eine Vielzahl von Proteinkinasen Protoonkogene sind. Ein Chromosomenbruch (am Itk-Kinase-Bruchpunkt auf Chromosom 5), eine Translokation wie im Falle des Abl-Gens mit BCR (Philadelphia-Chromosom), eine Verkürzung wie im Falle von c-Kit oder EGFR, oder einer Mutation (z.B. Met) erzeugen disregulierte Proteine, wobei sie von Protoonkogenen in onkogene Produkte überführt werden. Bei anderen Tumoren wird die Onkogenese durch eine autokrine oder parakrine Ligand/Wachstumsfaktor-Rezeptor-Wechselwirkung vorangetrieben. Mitglieder der src-Kinasefamilie sind typischerweise an der nachgeschalteten (downstream) Signaltransduktion beteiligt, wodurch sie die Onkogenese verstärken und durch eine Überexpression oder Mutation ihrerseits onkogen werden können. Indem man die Proteinkinaseaktivität dieser Proteine inhibiert, kann der Erkrankungsvorgang unterbrochen werden. An der vaskulären Restenose kann der Vorgang einer FGF- und/oder PDGF-unterstützten Proliferation glatter Muskel- und Endothelzellen beteiligt sein. Die Inhibierung der FGFr- oder PDGFr-Kinaseaktivität kann eine wirksame Strategie zur Inhibierung dieses Phänomens darstellen. Verbindungen der Formel I, welche die Kinaseaktivität normaler oder aberranter c-kit-, c-met-, c-fms-, src-Familienmitglieder, EGFr, erbBs, erbB4, BCR-Abl, PDGFr, FGFr und weiterer Rezeptor- oder cytosolischer Tyrosinkinasen hemmen, können daher für die Behandlung benigner und neoplastischer proliferativer Erkrankungen von Wert sein.
Bei vielen pathologischen Bedingungen (beispielsweise soliden Primärtumoren und Metastasen, Kaposi-Sarkomen, rheumatoider Arthritis, Blindheit aufgrund einer unzweckmäßigen okulären Neovaskularisierung, Psoriasis und Atherosklerose) ist die Progredienz der Erkrankung durch eine fortwährende Angiogenese bedingt. Polypeptid-Wachstumsfaktoren werden oftmals von dem erkrankten Gewebe oder damit zusammenhängenden Entzündungszellen produziert und ihre entsprechenden Endothelzellen-spezifischen Rezeptortyrosinkinasen (z.B. KDR/VEGFR-2, Flt-1/VEGFR-1, Tie2/Tek und Tie) sind für die Stimulierung des Wachstums, der Migration, Organisation, Differenzierung von Endothelzellen und dem Aufbau der benötigten neuen funktionellen Vaskulatur essenziell.
Als Ergebnis der Aktivität eines „vaskulären Permeabilitätsfaktors" bei der Vermittlung vaskulärer Hyperpermeabilität nimmt man auch an, dass die VEGF-Stimulierung einer VEGFR-Kinase eine wichtige Rolle bei der Bildung von Tumorascites, cerebralen und pulmonalen Ödemen, pleuralen und perikardialen Ergüssen, Hypersensitivitätsreaktionen vom verzögerten Typ, Gewebeödemen und Organfehlfunktionen im Anschluss an Verletzungen, Verbrennungen, Ischämie, diabetischen Komplikationen, Endometriose, posttraumatischer Lungeninsuffizienz (ARDS), mit einem kardiopulmonalen Bypass in Zusammenhang stehender Hypotonie und Hyperpermeabilität und okulären Ödemen, die aufgrund einer unzweckmäßigen Neovaskularisierung zu Glaukomen oder Blindheit führen, spielt. Zusätzlich zu VEGF können auch die erst kürzlich identifizierten VEGF-C und VEGF-D und das HIV-Tat-Protein ebenfalls eine vaskuläre Hyperpermeabilitätsantwort über die Stimulierung einer VEGFR-Kinase verursachen.
Tie-2 ist auch in ausgewählten Populationen hämatopoetischer Stammzellen exprimiert, in denen es eine Rolle bei ihrer Rekrutierung, Adhäsion, Regulierung und Differenzierung spielt (Blood 89, 4317–4326 (1997)); diese Tie-2-exprimierende Population kann als zirkulierender angiogener endothelialer Vorläufer dienen.
Bestimmte Agenzien der Formel I vermögen die Kinaseaktivität von Endothelialzellspezifischen Kinasen zu blockieren und können daher die Progredienz von Erkrankungen, an denen diese Situationen beteiligt sind, inhibieren.
Die Verbindungen der Formel I oder ein Salz davon oder pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge davon enthalten, können bei der Behandlung von benignen und neoplastischen proliferativen Erkrankungen und Störungen des Immunsystems verwendet werden. Zu solchen Erkrankungen gehören Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Thyroiditis, Diabetes vom Typ I, Multiple Sklerose, Sarkoidose, entzündliche Darmerkrankung, Myasthenia gravis und systemischer Lupus erythematosus; Psoriasis, Organtransplantatabstoßung (z.B. Nierenabstoßung, Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung), benigne und neoplastische proliferative Erkrankungen, Humankrebs, wie Lungen-, Brust-, Magen-, Blasen-, Kolon-, Pankreas-, Ovarial-, Prostata- und Rektalkrebs und Krebs hämapoetischer Zellen (Leukämie und Lymphom) und Erkrankungen, an denen eine unzweckmäßige Vaskularisierung beteiligt ist, beispielsweise diabetische Retinopathie, choroidale Neovaskularisierung wegen altersbedingter Makuladegeneration, und infantile Hämangiome in menschlichen Wesen. Hinzu kommt, dass solche Inhibitoren bei der Behandlung von Störungen brauchbar sein können, an denen VEGF-vermittelte Ödeme, Ascites, Ergüsse und Exsudate beteiligt sind, wozu beispielsweise Makulaödeme, cerebrale Ödeme und eine posttraumatische Lungeninsuffizienz (ARDS) gehören.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch bei der Prophylaxe der obigen Erkrankungen brauchbar sein.
Einem weiteren Aspekt zufolge stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung einer Verbindung der Formel I oder eines Salzes davon bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung vaskulärer Hyperpermeabilität, Angiogenese-abhängiger Erkrankungen, proliferativer Erkrankungen und/oder Erkrankungen des Immunsystems in Säugern, insbesondere menschlichen Wesen, zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung vaskulärer Hyperpermeabilität, unzweckmäßiger Neovaskularisierung, proliferativer Erkrankungen und/oder Erkrankungen des Immunsystems zur Verfügung, wobei eine therapeutische wirksame Menge einer Verbindung der Formel I einem Säuger, insbesondere einem menschlichen Wesen, das dessen bedarf, verabreicht wird.
Die Stärke der Verbindungen in vitro bei der Inhibierung dieser Proteinkinasen kann anhand der nachstehend im einzelnen beschriebenen Vorgehensweisen bestimmt werden.
Die Stärke der Verbindungen kann bestimmt werden, indem man das Ausmaß der Inhibition der Phosphorylierung eines exogenen Substrats (z.B. eines synthetischen Peptids (Z. Sonyang et al., Natur. 373: 336–539) durch eine Testverbindung bezogen auf die Kontrolle bestimmt.
Beispiele
I. Synthese
Verbindungen der Strukturformel I können anhand der in US-Patent 3,816,438 angegebenen Verfahren synthetisiert werden. Verbindungen der Strukturformel II können anhand der in US-Patent 3,816,437 angegebenen Verfahren synthetisiert werden.
Die Bildung des Pyrazolrings bewerkstelligt man, indem man Verbindungen der Struktur IV mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel erwärmt. Die Umsetzung führt man vorzugsweise für eine Dauer von 8 Stunden bis 5 Tagen bei einer Temperatur von 35°C bis 150°C, vorzugsweise bei der Rückflusstemperatur des Systems, durch. Dann dehydriert man die Verbindung V zur Verbindung 1, indem man sie Siliziumdioxid oder Aluminiumdioxid im Beisein von Luft oder Sauerstoff aussetzt. Alternativ kann man ein dehydrierendes Agens, wie Schwefel oder Palladium, oder ein oxidierendes Agens, wie Mangandioxid, verwenden. Verwendet man ein dehydrierendes Agens oder ein oxidierendes Agens, ist es bevorzugt, dass ein inertes Lösungsmittel verwendet wird, die Reaktionszeit 5 bis 50 Stunden beträgt und die Reaktionstemperatur 20 bis 250°C beträgt. Das folgende Schema steht für diese Transformation.
In ähnlicher Weise kann man die Verbindung II bilden, indem man Verbindung VI mit Hydrazin erwärmt und anschließend dehydriert.
Ein zweites Verfahren zur Bildung des Pyrazolrings besteht darin, eine Verbindung der Strukturformel VII mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel zu behandeln. Man führt die Umsetzung bei einer Temperatur von 30 bis 150°C, vorzugsweise bei der Rückflusstemperatur des Reaktionsgemisches, durch. Das folgende Schema steht für diese Transformation.
Wiederum in ähnlicher Weise kann man Verbindung II bilden, indem man Verbindung VIII mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel behandelt.
Ein drittes Verfahren zur Bildung des Pyrazolrings besteht darin, das Epoxid der Strukturformel IX mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel im Beisein einer katalytischen Menge einer Mineralsäure, einer starken organischen Säure oder einer Lewis-Säure zu behandeln. Bevorzugte Säuren sind p-Toluolsulfonsäure und Bortrifluorid. Man führt die Umsetzung bei einer Temperatur von 35 bis 200°C, vorzugsweise bei der Rückflusstemperatur des Reaktionsgemisches, durch. Die Zeitdauer der Umsetzung beträgt 8 Stunden bis 5 Tage. Das folgende Schema steht für diese Transformation.
Wiederum in ähnlicher Weise bildet man Verbindung II, indem man Verbindung X mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel mit einer katalytischen Menge einer Säure behandelt.
Verbindungen der Strukturformel IV synthetisiert man, indem man eine Verbindung der Formel XI mit dem geeigneten Arylaldehyd XII im Beisein einer katalytischen Menge einer Säure oder einer Base in einem inerten Lösungsmittel behandelt. Zu geeigneten Basen gehören Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Triethylamin oder Diethylamin. Zu geeigneten Säuren gehören Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Toluolsulfonsäure und Methylsulfonsäure. Die Reaktionstemperatur beträgt 15 bis 130°C und die Zeitdauer der Umsetzung beträgt 2 bis 24 Stunden. Das folgende Schema steht für diese Transformation:
In ähnlicher Weise kann man Verbindungen der Strukturformel VI aus Verbindungen der Formel XIII synthetisieren, indem man diese Verbindungen mit einem geeigneten Arylaldehyd in einem inerten Lösungsmittel mit einer katalytischen Menge einer Säure oder Base umsetzt.
Verbindungen der Strukturformel IX synthetisiert man, indem man eine Verbindung der Formel XIV mit einem Arylaldehyd unter basischen Bedingungen in einem inerten Lösungsmittel unter einer inerten Atmosphäre behandelt. Zu geeigneten Basen gehören Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxide, Alkalimetall(nieder)alkoxide, tertiäre aliphatische und aromatische Amine und tertiäre cyklische Amine wie Pyridin. Man führt die Umsetzung 1 bis 5 Stunden bei 0 bis 30°C durch. Das folgende Schema steht für diese Transformation:
worin Z eine Abgangsgruppe ist, wie ein Halogen, Tosylat, Mesylat und dergleichen.
In ähnlicher Weise kann man Verbindungen der Strukturformel X aus Verbindungen der Formel XV synthetisieren, indem man diese Verbindungen mit einem geeigneten Arylaldehyd in einem inerten Lösungsmittel unter basischen Bedingungen umsetzt.
Verbindungen der Strukturformeln XIV und XV synthetisiert man anhand standardisierter Vorgehensweisen aus Verbindungen der Strukturformeln XI bzw. XIII. Beispielsweise kann man eine Verbindung der Strukturformel XI in einem inerten Lösungsmittel mit Chlor oder Brom 1 bis 12 Stunden bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 50°C behandeln, was eine Verbindung der Formel XIV ergibt.
Verbindungen der Strukturformeln VII, VIII, XI und XIII sind bekannt und können anhand von Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind, hergestellt werden.
Spezielle Beispiele für obige Transformationen sind im US-Patent 3,816,438 oder US-Patent 3,816,437 zu finden.
II. In-Vitro-Proteinkinase-Assays
Die nachstehenden in-vitro-Assays können verwendet werden, um das Aktivitäts- und Wirkungsniveau der verschiedenen erfindungsgemäßen Verbindungen auf eine oder mehrere der Proteinkinasen zu bestimmen. In Anlehnung an dieselben Vorgaben können ähnliche Assays für weitere Proteinkinasen entworfen werden, indem man hinlänglich bekannte Techniken verwendet.
A. KDR-Proteinproduktion unter Verwendung eines Baculovirus-Systems:
Die kodierende Sequenz für die KDR-intrazelluläre Domäne (AS 789–1354) wurde durch PCR unter Verwendung von aus HUVEC-Zellen isolierten cDNAs erzeugt. Am N-Terminus dieses Proteins wurde auch eine Poly-His₆-Sequenz eingefügt. Dieses Fragment wurde an der Xba1- und Not1-Stelle in den Transfektionsvektor pVL1393 kloniert. Ein rekombinanter Baculovirus (BV) wurde durch Cotransfektion erzeugt, wobei man das BaculoGold-Transfektionsreagens (PharMingen) verwendete. Der rekombinante BV wurde plaquegereinigt und mittels Western-Analyse verifiziert. Für die Proteinproduktion ließ man SF-9-Zellen in SF-900-II-Medium bei 2 × 10⁶/ml wachsen, und diese wurden mit 0,5 plaquebildenden Einheiten pro Zelle (MOI) infiziert. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen geerntet.
B. KDR-Reinigung
(His)₆KDR(AS 789–1354) exprimierende SF-9-Zellen wurden lysiert, indem man 50 ml Triton X-100-Lyse-Puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10 Glycerin, 1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin) zum Zellpellet aus 1 L Zellkultur gab. Das Lysat wurde bei 19000 UPM in einem Sorval SS-34-Rotor 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Zelllysat wurde auf eine 5 ml NiCl₂-chelatisierende Sepharosesäule, die mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgetragen. KDR wurde unter Verwendung desselben, 0,25 M Imidazol enthaltenden Puffers eluiert. Die Säulenfraktionen wurden unter Verwendung von SDS-PAGE und einem ELISA-Assay (siehe unten), der die Kinase-Aktivität misst, analysiert. Der gereinigte KDR wurde in einen 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM NaCl, 5 mM DTT-Puffer überführt und bei -80°C gelagert.
Herstellung und Reinigung der humanen Tie-2-Kinase
Die kodierende Sequenz für die humane Tie-2-intrazelluläre Domäne (AS 775–1124) wurde durch PCR unter Verwendung von aus Humanplazenta isolierten cDNAs als Templat erzeugt. Am N-Terminus wurde ein Poly-His₆-Sequenz eingefügt, und dieses Konstrukt wurde an der Xba1- und Not1-Stelle in den Transfektionsvektor pVL1939 kloniert. Rekombinanter BV wurde unter Verwendung von BaculoGold-Transfektionsreagens (PharMingen) durch Cotransfektion erzeugt. Rekombinanter BV wurde plaquegereinigt und durch Western-Analyse verifiziert. Für die Proteinproduktion ließ man SF-9-Insektenzellen in SF-900-II-Medium bei 2 × 10⁶/ml wachsen, und diese wurden bei einer MOI von 0,5 infiziert. Die Reinigung der im Screening verwendeten His-markierten Kinase war analog zu der für KDR beschriebenen.
Produktion und Reinigung der humanen Flt-1-Tyrosinkinase
Es wurde der baculovirale Expressionsvektor pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA) verwendet. Eine Poly-His₆ kodierende Nukleotidsequenz wurde 5' zur Nukleotidregion, welche die gesamte intrazelluläre Kinasedomäne von humanem Flt-1 (Aminosäuren 786–1338) kodiert, angeordnet. Die die Kinasedomäne kodierende Nukleotidsequenz wurde durch PCR unter Verwendung von aus HUVEC-Zellen isolierten cDNA-Bänken erzeugt. Die Histidinreste ermöglichten die Affinitätsreinigung des Proteins in einer Weise, die zu der für KDR und ZAP70 analog war. SF-9-Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert und 48 Stunden nach Infektion geerntet.
Quellen für die EGFR-Tyrosinkinase
EGFR wurde von Sigma (Cat # E-3641; 500 Einheiten/50 μl) und der EGF-Ligand von Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat # PF011–100) erworben.
ZAP70-Expression
Es wurde der baculovirale Expressionsvektor pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA) verwendet. Die Aminosäuren M(H)6LVPR₉S kodierende Nukleotidsequenz wurde 5' zur Nukleotidregion, welche das gesamte ZAP70 (Aminosäuren 1–619) kodierte, angeordnet. Die Nukleotidsequenz, welche die ZAP70 kodierende Region kodierte, wurde durch PCR unter Verwendung von aus immortalisierten Jurkat-T-Zellen isolierten cDNA-Bänken erzeugt. Die Histidinreste ermöglichten die Affinitätsreinigung des Proteins (siehe unten). Die LVPR₉S-Brücke stellte eine Erkennungssequenz für die proteolytische Spaltung durch Thrombin dar, wodurch die Entfernung des Affinitätstags aus dem Enzym ermöglicht wurde. SF-9-Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert und 48 Stunden nach Infektion geerntet.
Extraktion und Reinigung von ZAP70
SF-9-Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der 20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10 % Glycerin, 1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin und 1 mM Natriumorthovanadat enthielt. Das lösliche Lysat wurde auf eine chelatisierende Sepharose-Hi-Trap-Säule (Parmacia), die in 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgetragen. Das Fusionsprotein wurde mit 250 mM Imidazol eluiert. Das gewonnene Enzym wurde in einem Puffer aufbewahrt, der 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl und 5 mM DTT enthielt.
Lck-Quelle
Lck oder verkürzte Formen von Lck sind kommerziell erhältlich (z.B. von Upstate Biotechnology Inc., (Saranac Lake, NY) oder Santa Cruz Biotechnology, Inc., (Santa Cruz, CA) oder können aus bekannten natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung konventioneller Methoden aufgereinigt werden.
Cdc2-Quelle
Die humanen rekombinanten Enzyme und Testpuffer sind kommerziell erhältlich (New England Biolabs, Beverly, MA., USA) oder können aus bekannten natürlichen Quellen unter Verwendung konventioneller Methoden aufgereinigt werden.
Cdc2-Assay
Man verwendete das mit den bezogenen Reagenzien zur Verfügung gestellte Protokoll unter geringfügigen Modifikationen. Kurzum, die Reaktion wurde in einem 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01 % Brij, 5% DMSO und 10 mM MgCl₂ (kommerzieller Puffer) bestehenden, mit frischem 300 μm ATP (31 μCi/ml) und 30 μg/ml Histon vom Typ Illss (Endkonzentrationen) supplementierten Puffer durchgeführt. Ein Reaktionsvolumen von 80 μl, welches Enzymeinheiten enthielt, wurde 20 Minuten bei 25°C im Beisein oder in Abwesenheit eines Inhibitors inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 120 μl 10 %iger Essigsäure gestoppt. Das Substrat wurde von nicht eingebauter Markierung abgetrennt, indem man das Gemisch auf Phosphocellulosepapier spottete und anschließend 3 mal 5 Minuten mit jeweils 75 mM Phosphorsäure wusch. Die Zählimpulse wurden mit einem Betazähler im Beisein von Szintillationsflüssigkeit gemessen.
Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung inhibieren cdc2 bei Konzentrationen unterhalb von 50 μM signifikant.
PKC-Kinasequelle
Die katalytische Untereinheit von PKC kann kommerziell bezogen werden (Calbiochem).
PKC-Kinaseassay
Es wurde ein radioaktiver Kinaseassay eingesetzt, wobei man einer veröffentlichten Vorgehensweise folgte (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y., Biochemical and Biophysical Research Communication 3: 166, 1220–1227 (1990)). Kurzum, alle Reaktionen wurden in einem Kinasepuffer durchgeführt, der aus 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 μM ATP, 8 μM Peptid, 5 % DMSO und ³³P ATP (8Ci/mM) bestand. Verbindung und Enzym wurden in dem Reaktionsbehältnis miteinander vermischt, und die Reaktion wurde durch Zugabe des ATPs und des Substratgemisches initiiert. Im Anschluss an die Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 10 μL Stopppuffer (5 mM ATP in 75 mM Phosphorsäure) wurde ein Teil des Gemisches auf Phosphocellulosefilter gespottet. Die gespotteten Proben wurden dreimal in 75 mM Phosphorsäure bei Raumtemperatur 5 bis 15 Minuten gewaschen. Der Einbau der radioaktiven Markierung wurde durch Flüssigszintillationszählung quantitativ bestimmt.
Erk2-Enzymquelle
Das rekombinante murine Enzym und der Testpuffer sind kommerziell erhältlich (New England Biolabs, Beverly, MA., USA) oder können aus bekannten natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung konventioneller Methoden aufgereinigt werden.
Erk2-Enzymassay
Kurzum, die Reaktion führte man in einem aus 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01 % Brij, 5 % DMSO und 10 mM MgCl₂ (kommerzieller Puffer) bestehenden mit frischem 100 μM ATP (31 μCi/ml) und 30 μM basischem Myelinprotein supplementierten Puffer unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durch. Die Reaktionsvolumina und das Verfahren zur Bestimmung eingebauter Radioaktivität waren wie für den PKC-Assay beschrieben (siehe oben).
C. Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) können verwendet werden, um vorhandene Tyrosinkinase-Aktivität nachzuweisen und zu messen. Die ELISA können in Anlehnung an bekannte Protokolle durchgeführt werden, die beispielsweise in Voller et al., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" in ManuaL of Clinical Immunology, 2. Ausgabe, hgg. von Rose and Friedman, S. 359–371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C. beschrieben sind.
Das wiedergegebene Protokoll kann angepasst werden, um die Aktivität in Bezug auf eine spezielle RTK zu bestimmen. Beispielsweise werden bevorzugte Protokolle zur Durchführung der ELISA-Experimente für KDR nachstehend vorgestellt. Es gehört zum fachmännischen Können, diese Protokolle anzupassen, um die Aktivität einer Verbindung für weitere Mitglieder aus der RTK-Familie und Nichtrezeptortyrosinkinasen zu bestimmen.
KDR-IN-VITRO-ELISA
Die folgende Vorgehensweise wurde verwendet, um die inhibierende Wirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen auf die KDR-Tyrosinkinase-Aktivität zu bestimmen:
Puffer und Lösungen:

PGT : Poly (Glu,Tyr) 4 : 1
Bewahre Pulver bei -20°C auf. Löse das Pulver in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 50 mg/ml Lösung. Bewahre Aliquots von 1 ml bei -20°C auf. Für die Anfertigung von Platten verdünne auf 250 μg/ml in Gibco-PBS.

Reaktionspuffer:

100 mM HEPES, 20 mM MgCl₂, 4mM MnCl₂, 5mM DTT, 0,02 % BSA, 200 μM NaVO₄, pH 7,10
ATP: Bewahre Aliquots von 100 mM bei -20°C auf. Verdünne auf 20 μM in Wasser.

Waschpuffer:

PBS mit 0,1 % Tween 20

Antikörper-Verdünnungspuffer:

0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS

TMB-Substrat:

Vermische TMB-Substrat und Peroxidlösungen 9 : 1 unmittelbar vor Gebrauch oder verwende K-Blue-Substrat von Neogen

Stopplösung:

1 M Phosphorsäure

Vorgehensweise
1. Plattenzubereitung:
Verdünne PGT-Stammlösung (50 mg/ml, gefroren) in PBS auf 250 μg/ml. Verwende modifizierte Hochaffinitäts-ELISA-Platten mit flachen Böden von Corning (Corning #25805-96) und gebe 125 μl pro Loch zu. Gebe 125 μl PBS in freie Löcher. Bedecke mit Verschlussband und inkubiere über Nacht bei 37°C. Wasche 1x mit 250 μl Waschpuffer und trockne etwa 2 Stunden bei 37°C in einem Trockeninkubator.
Bewahre die beschichteten Platten in einem verschlossenen Behälter bei 4°C bis zum Gebrauch auf.
2. Tyrosinkinasereaktion:

– Bereite Inhibitorlösungen mit 4x-Konzentration in 20 % DMSO in Wasser zu.
– Bereite Reaktionspuffer zu.
– Bereite Enzymlösungen zu, so dass die gewünschten Einheiten in 50 μl vorliegen, z.B. verdünne für KDR auf 1 ng/μl bei insgesamt 50 ng pro Reaktionsloch. Bewahre auf Eis auf.
– Stelle 4x-ATP-Lösungen zu 20 μM aus 100 mM Stammlösungen in Wasser her. Bewahre auf Eis auf.
– Gebe pro Loch 50 μl Enzymlösung zu.
– Gebe 25 μl 4x-Inhibitor zu.
– Gebe 25 μl 4x-ATP für den Inhibitionsassay zu.
– Inkubiere 10 Minuten bei Raumtemperatur.
– Stoppe Reaktion durch Zugabe von 50 μl 0,05N HCl pro Loch
– Wasche Platte

** Endkonzentrationen für Reaktion:
ATP: 5 μM
5 % DMSO

3. Antikörperbindung

– Verdünne 1 mg/ml Aliquot von PY20-HRP (Pierce)-Antikörper auf 50 ng/ml in 0,1 % BSA in PBS durch 2-stufige Verdünnung (100x, dann 200x).
– Gebe pro Loch 100 μl Ak zu. Inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inkubiere 1 Stunde bei 4°C.
– Wasche Platte 4x.

4. Farbreaktion

– Bereite TMB-Substrat zu uns gebe pro Loch 100 μl zu.
– Verfolge OD bei 650 nm bis 0,6 erreicht ist.
– Stoppe mit 1 M Phosphorsäure. Schüttle auf Plattenlesegerät.
– Lese sofort die OD bei 650 nm ab.

Die optimalen Inkubationszeiten und Enzymreaktionsbedingungen variieren leicht mit den Enzymzubereitungen und werden empirisch für jede Charge bestimmt.
Der für Lck verwendete Reaktionspuffer war 100 mM MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCl₂, 20 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,2 % BSA, 200 mM NaVO₄ bei analogen Assay-Bedingungen.
Verbindungen der Formel I können therapeutisch brauchbar sein bei der Behandlung von Erkrankungen, an denen sowohl identifizierte, einschließlich derer, die hier nicht erwähnt sind, als auch noch nicht identifizierte Proteintyrosinkinasen, die von Verbindungen der Formel I inhibiert werden, beteiligt sind. Sämtliche hier beispielhaft belegten Verbindungen inhibieren signifikant die KDR-Kinase bei Konzentrationen von 50 Mikromolar oder niedriger. Einige erfindungsgemäße Verbindungen inhibieren auch andere PTKn wie Ick bei Konzentrationen von 50 Mikromolar oder weniger.
Resultate
Die folgende inhibitorische Konzentration einer repräsentativen Verbindung wurde erhalten:
Diese Resultate zeigen, dass erfindungsgemäße Verbindungen eine bemerkenswerte inhibitorische Aktivität für die KDR-Tyrosinkinase genauso wie für andere Kinasen besitzen.
In-vitro-Modelle für die T-Zellaktivierung
Nach Aktivierung durch Mitogen oder Antigen werden T-Zellen zur Sekretion von IL-2, einem Wachstumsfaktor der ihre anschließende proliferative Phase unterstützt, induziert. Man kann daher entweder die Produktion von IL-2 durch oder die Zellproliferation von primären T-Zellen oder geeigneten T-Zelllinien als Surrogat für die T-Zellaktivierung messen. Beide Assays sind in der Literatur gut beschrieben und ihre Parameter gut dokumentiert (in Current Protocols in Immunology, Vol. 2, 7.10.1–7.11.2).
Kurzum, man kann T-Zellen aktivieren, indem man sie mit allogenen Stimulatorzellen cokultiviert, ein Vorgang, der als einwegige gemischte Lymphozytenreaktion bezeichnet wird. Antwortende („responder") und stimulierende („stimulator") periphere mononukleäre Blutzellen werden mittels Ficoll-Hypaque Gradient (Pharmacia) den Anweisungen des Herstellers folgend aufgereinigt. Man inaktiviert stimulierende Zellen methodisch durch Behandlung mit Mitomycin C (Sigma) oder γ-Strahlung. Responder- und Stimulator-Zellen werden bei einem Verhältnis von 2:1 im Beisein und in Abwesenheit der Testverbindung cokultiviert. Typischerweise mischt man 10⁵ Responder mit 5 × 10⁴ Stimulatoren und gibt sie (200 μl Volumen) auf eine Mikrotiterplatte mit U-Böden (Costar Scientific). Man kultiviert die Zellen in RPMI 1640, das entweder mit Hitze-inaktiviertem fötalen Rinderserum (Hyclone Laboratories) oder gepooltem humanen AB-Serum von männlichen Spendern, 5 × 10^-5 M 2-Mercaptoethanol und 0,5 % DMSO supplementiert war. Man pulste die Kulturen mit 0,5 μCi ³H-Thymidin (Amersham) 1 Tag vor der Ernte (typischerweise an Tag 3). Man erntete die Kulturen (Betaplate, Erntevorrichtung, Wallac) und bestimmte die Isotopenaufnahme mit Flüssigszintillation (Betaplate, Wallac).
Man kann das gleiche Kultursystem verwenden, um die T-Zellaktivierung durch Messung der IL-2-Produktion zu bestimmen. 18 bis 24 Stunden nach Kulturbeginn entfernt man die Überstände und misst die IL-2-Konzentration mittels ELISA (R- und D-Systeme) den Angaben des Herstellers folgend.
In-vivo-Modelle der T-Zellaktivierung
Man kann die in-vivo-Wirksamkeit von Verbindungen in Tiermodellen testen, von denen bekannt ist, dass sie die T-Zellaktivierung direkt messen oder für die sich T-Zellen als Effektoren erwiesen haben. Man kann T-Zellen in vivo aktivieren, indem man den konstanten Teil des T-Zellrezeptors mit einem monoklonalen anti-CD3-Antikörper (Ak) ligiert. In diesem Modell verabreicht man BLAB/c-Mäusen 10 μg anti-CD3-Ak intraperitoneal 2 Stunden vor dem Ausbluten. Tiere, die den zu testenden Wirkstoff bekommen, werden mit einer Einzeldosis der Verbindung 1 Stunde vor der Verabreichung des anti-CD3-Ak vorbehandelt. Man misst die Serumspiegel der proinflammatorischen Cytokine Interferon-γ (IFN-γ) und Tumor-Nekrosis-Faktor-α (TNF-α), Indikatoren der T-Zellaktivierung, mittels ELISA. Ein ähnliches Modell verwendet das Primen von T-Zellen in vivo mit einem spezifischen Antigen wie dem Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses (KLH für keyhole limpet hemocyanin) gefolgt von einem sekundären „challenge" in vitro von Zellen abführender Lymphknoten mit dem gleichen Antigen. Wie zuvor verwendet man die Messung der Cytokinproduktion, um den Aktivierungszustand der kultivierten Zellen zu beurteilen. Kurzum, C57BL/6-Mäuse werden subkutan mit 100 μg KLH, das in komplettem Freund-Adjuvans (CFA) emulgiert war, am Tag 0 immunisiert. Die Tiere werden 1 Tag vor der Immunisierung und anschließend an den Tagen 1, 2 und 3 nach Immunisierung mit der Verbindung vorbehandelt. Man entnimmt die abführenden Lymphknoten an Tag 4 und kultiviert ihre Zellen bei 6 × 10⁶ pro ml in Gewebekulturmedium (mit Hitze-inaktiviertem fötalen Rinderserum (Hyclone Laboratories), 5 × 10^-5 M 2-Mercaptoethanol und 0,5 % DMSO supplementiertes RPMI 1640) sowohl 24 als auch 48 Stunden. Man testet dann die Kulturüberstände mittels ELISA auf die autokrinen T-Zellwachstumsfaktor-Spiegel Interleukin-2 (IL-2) und/oder IFN-γ.
Leitverbindungen kann man auch in Tiermodellen für humane Erkrankungen testen. Hierzu gehören beispielsweise die experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) und die Kollagen-induzierte Arthritis (CIA). EAE-Modelle, durch die Aspekte der humanen Multiplen Sklerose nachgestellt werden, sind sowohl in Ratten als auch Mäusen beschrieben (zusammengefasst in FASEB J. 5:2560–2566, 1991; Murines Modell: Lab. Inves. 4(3): 278, 1981; Nager-Modell: J. Immunol. 146(4):1163-8, 1991). Kurzum, man immunisiert Mäuse oder Ratten mit einer Emulsion des basischen Myelinproteins (MBP) oder neurogenen Peptidderivaten davon und CFA. Man kann die akute Erkrankung durch Zugabe bakterieller Toxine wie Bordetella perfussis induzieren. Eine rezidivierende/ausstrahlende Erkrankung induziert man durch adoptiven Transfer von T-Zellen aus MBP/Peptid-immunisierten Tieren.
CIA kann man in DBA/1-Mäusen induzieren, indem man mit Kollagen vom Typ II immunisiert (J. Immunol.: 142(7): 2237–2243). Die Mäuse entwickeln bereits 10 Tage nach dem Antigen-Challenge Anzeichen von Arthritis, die bis zu 90 Tagen nach Immunisierung noch nachweisbar sind. Sowohl im EAE- als auch im CIA-Modell kann man eine Verbindung entweder prophylaktisch oder zum Zeitpunkt des Ausbruchs der Erkrankung verabreichen. Wirksame Wirkstoffe sollten die Schwere und/oder Häufigkeit verringern.
Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung, die eine oder mehrere angiogene Rezeptor-PTKn und/oder eine an der Vermittlung entzündlicher Antworten beteiligte Proteinkinase wie Lck inhibieren, können die Schwere und Häufigkeit von Arthritis in diesen Modellen verringern.
Man kann Verbindungen auch in Allotransplantat-Maus-Modellen, entweder Haut (s.o. in Ann. Rev. Immunol, 10: 333-58, 1992; Transplantation: 57(12): 1701-1706, 1994) oder Herz (Am. J. Anat.: 113: 273, 1963) testen. Kurzum, Hauttransplantate von ganzer Stärke werden von C57BL/6-Mäusen auf BALB/c-Mäuse transplantiert. Die Transplantate werden täglich beginnend an Tag 6 auf Anzeichen für eine Abstoßung untersucht. In dem neonatalen Hauttransplantationsmodell der Maus transplantiert man neonatale Herzen von C57BL/6-Mäusen ektopisch in die Ohrmuscheln adulter CBA/J-Mäuse. Die Herzen fangen 4 bis 7 Tage nach Transplantation an zu schlagen, und die Abstoßung kann visuell beurteilt werden, indem man mit einem Seziermikroskop nach dem Aufhören des Schlagens schaut.
Zelluläre Rezeptor-PTK-Assays
Die folgenden zellulären Assays können verwendet werden, um die Aktivitäts- und Wirkungsniveaus verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen auf KDR/VEGFR2 zu bestimmen. In Anlehnung an dieselben Vorgaben können ähnliche, einen spezifischen Ligandenstimulus verwendende PTK-Assays für weitere Tyrosinkinasen entworfen werden, wobei man hinlänglich bekannte Techniken verwendet.
VEGF-induzierte KDR-Phosphorylierung in humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), gemessen mit Western-Blots.

1. HUVEC-Zellen (aus gepoolten Spendern) wurden von Clonetics (San Diego, CA) bezogen und den Herstellerhinweisen entsprechend kultiviert. Nur die frühen Passagen (3–8) wurden für diesen Assay verwendet. Die Zellen wurden in 100-mm-Schälchen (Falcon für Gewebekultur; Becton Dickinson; Plymouth, England) kultiviert, wobei man komplette EBM-Medien (Clonetics) verwendete.
2. Um die inhibitorische Aktivität einer Verbindung zu bewerten, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und jedes Loch von 6-Loch-Clusterplatten (Costar; Cambridge, MA) wurde mit 0,5–1,0 × 10⁵ Zellen/Loch beimpft.
3. 3–4 Tage nach dem Beimpfen waren die Platten zu 90–100 % konfluent. Es wurde das Medium aus allen Löchern entfernt, die Zellen wurden mit 5–10 ml PBS gewaschen und 18–24 Stunden mit 5 ml EBM-Basismedium ohne zugesetzte Supplementierung (d.h. Serumstarvation) inkubiert.
4. Serielle Verdünnungen von Inhibitoren wurden in 1 ml EBM-Medium (25 μM, 5 μM, oder 1 μM Endkonzentration) zu den Zellen gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Humaner rekombinanter VEGF₍₁₆₅₎ (R&D Systemes) wurde in 2 ml EBM-Medium dann zu allen Löchern mit einer Endkonzentration von 50 ng/ml gegeben und 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Unbehandelte oder nur mit VEGF behandelte Kontrollzellen wurden verwendet, um den Phosphorylierungshintergrund durch VEGF zu bewerten.

Alle Löcher wurden dann mit 5–10 ml kaltem PBS, der 1 mM Natriumorthovanadat (Sigma) enthielt, gespült, und die Zellen wurden lysiert und in 200 μl RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl pH7, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,25 % Natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA), welcher Proteaseinhibitoren (PMSF 1 mM, Aprotinin 1 μg/ml, Pepstatin 1 μg/ml, Leupeptin 1 μg/ml, Na-Vanadat 1 mM, Na-Fluorid 1 mM) und 1 μg/ml Dnase (sämtliche Chemikalien von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt, geschabt. Das Lysat wurde bei 14000 UPM 30 Minuten zentrifugiert, um Kerne zu entfernen.
Gleiche Mengen Proteine wurden dann durch Zugabe von kaltem (-20-°C) Ethanol (2 Volumina) für mindestens 1 Stunde oder maximal über Nacht präzipitiert. Die Pellets wurden in Laemli-Probepuffer, der 5 % β-Mercaptoethanol (BioRad; Hercules, CA) enthielt, rekonstituiert und 5 Minuten erwärmt. Die Proteine wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (6 %, 1,5 mm Novex, San Diego, CA) aufgelöst und auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung des Novex-Systems transferiert. Nachdem man mit Rinderserumalbumin (3 %) blockiert hatte, wurden die Proteine über Nacht mit polyklonalem anti-KDR-Antikörper (C20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) oder mit monoklonalem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) bei 4°C ausgetestet. Nachdem man gewaschen und 1 Stunde mit HRP-konjugiertem F(ab)₂ von Ziege-anti-Kaninchen- oder Ziege-anti-Maus-IgG inkubiert hatte, wurden die Banden unter Verwendung des Emissionschemilumineszenz (ECL)-Systems (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL) visualisiert.
Bestimmte Beispiele der vorliegenden Erfindung inhibieren die zelluläre VEGFinduzierte KDR-Tyrosinkinase-Phosphorylierung bei Konzentrationen von weniger als 50 μM.
In-vivo-Gebärmutterödem-Modell
Dieser Test misst die Fähigkeit von Verbindungen, die in den ersten Stunden nach Östrogenstimulierung auftretende akute Zunahme des Gebärmuttergewichts in Mäusen zu inhibieren. Dieser frühe Beginn der Gebärmuttergewichtszunahme ist bekanntlich auf ein Ödem zurückzuführen, welches durch die zunehmende Permeabilität der Gebärmuttervaskulatur verursacht wird. Cullinan-Bove und Koss (Endocrinology, 1993, 133: 829–837) haben eine enge zeitliche Beziehung zwischen dem Östrogen-stimulierten Gebärmutterödem und der erhöhten Expression von VEGF-mRNA in der Gebärmutter gezeigt. Diese Ergebnisse sind bestätigt worden, indem man VEGF-neutralisierende monoklonale Antikörper verwendete, welche die akute Zunahme des Gebärmuttergewichts nach Östrogenstimulierung signifikant verminderten (WO 97/42187). Dieses System kann daher als Modell für die Inhibition der VEGF-Signalgebung in vivo und die damit verbundene Hyperpermeabilität und das Ödem dienen.
Materialien: Alle Hormone wurden von Sigma (St. Louis, MO) oder Calbiochem (La Jolla, CA) als lyophilisierte Pulver bezogen und den Anweisungen des Herstellers entsprechend zubereitet.
Vehikel-Komponenten (DMSO, Cremaphor EL) wurden von Sigma (St. Louis, MO) bezogen.
Mäuse (Balb/c, 8–12 Wochen alt) wurden von Taconic (Germantown NY) bezogen und in einer pathogenfreien Tierbehausung in Anlehnung an institutionelle Richtlinien des Komitees zur Tierpflege und -verwendung gehalten.
Methode:

Tag 1: Man verabreichte Balb/c-Mäusen eine intraperitoneale (i.p.) Injektion von 12,5 Einheiten Gonadotropin aus dem Serum einer trächtigen Stute (PMSG).
Tag 3: Die Mäuse bekamen 15 Einheiten humanes Chorion-Gonadotropin (hCG) i.p.
Tag 4: Die Mäuse wurden zufällig auf 5–10 Gruppen verteilt. Man verabreichte Testverbindungen je nach Löslichkeit und Vehikel auf i.p.-, i.v.- oder p.o.-Wegen in Dosierungen im Bereich von 1–100 mg/kg. Die Vehikel-Kontrollgruppe bekam lediglich Vehikel und zwei Gruppen blieben unbehandelt.

30 Minuten später gab man den experimentellen, Vehikel- und einer der unbehandelten Gruppen eine i.p.-Injektion von 17β-Estradiol (500 μg/kg). Nach 2–3 Stunden wurden die Tiere durch CO₂-Inhalation geopfert. Im Anschluss an einen Einschnitt an der Mittellinie isolierte und entfernte man jede Gebärmutter, indem man gerade unterhalb des Gebärmutterhalses und an den Verbindungen der Gebärmutter zu den Eileitern schnitt. Fett- und Bindegewebe entfernte man, wobei man acht gab, die Gebärmutter vor dem Wiegen unversehrt zu lassen. Man verglich die mittleren Gewichte der behandelten Gruppen mit denen der unbehandelten oder Vehikel-behandelten Gruppen. Die Signifikanz bestimmte man mit dem Studenten-T-Test. Nicht stimulierte Kontrollgruppen verwendet man, um die Antwort auf Estradiol zu verfolgen.
Die Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Ödembildung inhibieren, wenn sie über verschiedene Wege systemisch verabreicht werden.
Es kann gezeigt werden, dass bestimmte Verbindungen dieser Erfindung, die Inhibitoren von angiogenen Rezeptortyrosinkinasen sind, ebenfalls in einem Matrigel-Implantationsmodell der Neovaskularisierung aktiv sind. Das Matrigel-Neovaskularisierungsmodell beinhaltet die Bildung neuer Blutgefäße innerhalb einer klaren „Murmel" aus subkutan implantierter extrazellulärer Matrix, welche durch die Gegenwart von proangiogenen Faktor produzierenden Tumorzellen induziert wird (siehe beispielsweise: Passaniti, A., et al., Lab Investig. (1992), 67(4), 519–528; Anat. Rec. (1997), 249(1), 63–73; Int. J. Cancer(1995), 63(5), 694–701; Vasc. Biol. (1995), 15(11), 1857-6). Das Modell geht vorzugsweise über 3 bis 4 Tage; zu den Endpunkten gehören eine makroskopische visuelle/bildhafte Beurteilung der Neovaskularisierung, mikroskopische Bestimmungen der Kleinstgefäßdichte und die quantitative Hämoglobinbestimmung (Drabkin-Methode) im Anschluss an die Entfernung des Implantats, bezogen auf Kontrolltiere, die nicht mit Inhibitoren behandelt worden waren. In dem Modell kann man alternativ bFGF oder HGF als Stimulus verwenden.
Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung, die eine oder mehrere Onkogene, Protoonkogene oder proliferationsabhängige Proteinkinasen oder eine angiogene Rezeptor-PTK inhibieren, inhibieren ebenfalls das Wachstum von primären Xenotransplantattumoren aus Maus, Ratte oder Menschen in Mäusen, oder sie inhibieren die Metastase in Mausmodellen.
ÄQUIVALENTE
Wenngleich diese Erfindung mit Bezug auf ihre bevorzugten Ausführungsformen genau aufgezeigt und beschrieben worden ist, wird der Fachmann dennoch verstehen, dass man mannigfaltige Änderungen an Form und Details vornehmen kann, ohne vom Umfang der Erfindung, wie er in den anhängenden Ansprüchen definiert ist, abzuweichen. Viele Äquivalente zu den hier spezifisch beschriebenen, spezifischen Ausführungsformen der Erfindung erkennt oder vermag der Fachmann festzustellen, wobei er nicht mehr als routinemäßig experimentiert. Solche Äquivalente sollen vom Schutzumfang der Ansprüche erfasst werden.

Claims

Verwendung einer Verbindung der Formel:
bei der Herstellung eines Medikaments in ausreichender Konzentration zur Inhibierung einer oder mehrerer Proteinkinase-Aktivitäten, wobei X Sauerstoff oder Schwefel ist; Ring A für die tautomeren Strukturen
steht; n 1 oder 2 ist; Ar
ist; und R¹ für Wasserstoff, Methyl, -COR³ oder -SO₂R³ steht; R² für Halogen mit einem Atomgewicht von etwa 19 bis 36 steht; und R³ für -CH₃ oder
steht, worin Y für Wasserstoff, Chlor oder -CH₃ steht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung in stereoisomerer Form oder als Gemisch von Stereoisomeren vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung als Gemisch mit einer oder mehreren anderen von den Verbindungen vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Proteinkinase entweder eine Tyrosinkinase vom Rezeptortyp oder eine Tyrosinkinase vom Nichtrezeptortyp ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Tyrosinkinase ausgewählt ist unter KDR, flt-1, TIE-2, Lck, Src, Fyn und yes.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aktivität der Proteinkinase die Angiogenese beeinflusst.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Inhibition der Proteinkinase antiangiogen ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Inhibition der Proteinkinase die Progression eines Erkrankungszustandes inhibiert, der ausgewählt ist unter Krebs, Arthritis, Atherosklerose, Psoriasis, Hämangiome, myokardiale Angiogenese, koronare und zerebrale Kollaterale, Angiogenese ischämischer Gliedmaßen, kornealer Erkrankung, Rubeose, neovaskulären Glaukomen, Makuladegeneration Wunchelung Magengeschwür, mit Helicobacter in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, Frakturen, diabetischer Retinopathie und Katzenkratzfieber.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Aktivität der Proteinkinase die vaskuläre Hyperpermeabilität oder die Ödemproduktion beeinflusst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Inhibition der Proteinkinase antiödematös ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Inhibition der Proteinkinase die Progression eines Erkrankungszustandes inhibiert, der ausgewählt ist unter Verbrennungen, chronischer Lungenerkrankung, Gehirnschlag, Polypen, Psoriasis, allergischer Entzündung, Makuladegeneration, diabetischer Retinopathie, ovarialem Hyperstimulationssyndrom und mit einem Gehirntumor in Zusammenhang stehenden zerebralen Ödemen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Proteinkinase eine Serinkinase ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Proteinkinase eine Threoninkinase ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung