ES2224650T3 - Derivados de pirazol triciclico sustituido con actividad de proteina quinasa. - Google Patents

Abstract

El uso de un compuesto representado por una de las fórmulas: para la fabricación de un medicamento en concentración suficiente para inhibir una o más actividades proteína quinasa, donde X es oxígeno o azufre; el anillo A representa las estructuras: n es 1 ó 2; Ar es y R1 es hidrógeno, metilo, COR3 o SO2R3; R2 representa un halógeno que tiene un peso atómico de aproximadamente 19 a 36; y R3 es -CH3 o donde Y es hidrógeno, cloro o -CH3.

Description

Derivados de pirazol tricíclico sustituido con actividad de proteína quinasa.

Antecedentes de la invención

Hay al menos 400 enzimas identificadas como proteína quinasas. Estas enzimas catalizan la fosforilación de sustratos proteicos diana. La fosforilación es normalmente una reacción de transferencia de un grupo fosfato de ATP al sustrato proteico. La estructura específica en el sustrato proteico al cual se traspasa el fosfato es un resto de tirosina, serina o treonina. Como estos restos aminoacídicos son las estructuras diana para la transferencia de fosforilos, estas enzimas proteína quinasas se denominan habitualmente tirosina quinasas o serina/treonina quinasas.

Las reacciones de fosforilación y las reacciones fosfatasa que las contrarrestan en los restos tirosina, serina y treonina están implicadas en innumerables procesos relacionados con distintas señales intracelulares (mediadas típicamente mediante receptores celulares), regulación de funciones celulares y activación o desactivación de procesos celulares. Una cascada de proteína quinasas participa normalmente en la transducción de la señal intracelular y son necesarias para la realización de estos procesos celulares. Debido a su ubicuidad en estos procesos, las proteína quinasas pueden encontrarse como parte integral de la membrana de plasma o como enzimas citoplasmáticas o localizarse en el núcleo, a menudo como componentes de complejos enzimáticos. En muchos casos, estas proteína quinasas son un elemento esencial de complejos proteicos enzimáticos y estructurales que determinan dónde y cuando tiene lugar un proceso celular dentro de la célula.

Proteína Tirosina Quinasas

Las proteína tirosina quinasas (PTK) son enzimas que catalizan la fosforilación de restos tirosina específicos en las proteínas celulares. Esta modificación post-translacional de estas proteínas del sustrato, habitualmente también enzimas, actúa como conmutador celular que regula la proliferación, activación o diferenciación celular (como referencia, véase Schlessinger y Ulrich, 1992, Neuron 9:383-391). Se ha observado una actividad PTK anormal o excesiva en muchas enfermedades incluyendo trastornos proliferativos benignos y malignos así como enfermedades resultantes de la activación inapropiada del sistema inmunológico (por ejemplo, trastornos autoinmunes), rechazo de transplantes y enfermedad de transplante-huésped. Además, las PTK receptoras específicas de células endoteliales tales como KDR y Tie-2 median el proceso angiogénico y por tanto están implicadas en el progreso de cánceres y otras enfermedades que implican una vascularización inapropiada (por ejemplo, retinopatía diabética, neovascularización coroidal debida a degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, artritis, hemangiomas infantiles).

Las tirosina kinasas puede ser de tipo receptor (con dominios extracelulares, transmembrana e intracelulares) o de tipo no receptor (siendo totalmente intracelulares).

Tirosina Quinasas Receptoras (RTK)

Las RTK comprenden una gran familia de receptores transmembrana con distintas actividades biológicas. En la actualidad, se han identificado al menos diecinueve (19) subfamilias RTK distintas. La familia de las tirosina quinasas receptoras (RTK) incluye receptores que son cruciales para el crecimiento y diferenciación de una diversidad de tipo de células (Yarden y Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich y Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990). La función intrínseca de las RTK se activó tras la unión al ligando, lo que tiene como resultado la fosforilación del receptor y de múltiples sustratos celulares y posteriormente una diversidad de respuestas celulares (Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212). De esta forma, la transducción de la señal mediada por las tirosina quinasas receptoras se inicia por interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando), seguido típicamente de dimerización del receptor, estimulación de la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa y trans-fosforilación del receptor. Por tanto, se crean sitios de unión para las moléculas de transducción de señal intracelular y esto conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplasmática que facilita la respuesta celular apropiada (por ejemplo, división celular, diferenciación celular, efectos metabólicos, cambios en el microentorno extracelular) (véase Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9:1-20).

Las proteínas con SH2 (homología src-2) o dominios de unión a fosfotirosina (PTB) se unen a los receptores de tirosina quinasa activados y sus sustratos con alta afinidad para propagar señales en las células. Ambos dominios reconocen la fosfotirosina (Fantl y col., 1992, Cell 69:413-423; Sonyang y col., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785; Songyang y col., 1993, Cell 72:767-778; Koch y col., 1991, Science 252:668-678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227-234; y Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6), 835-838). Se han identificado varias proteínas de sustrato intracelulares que se asocian con las tirosina quinasas receptoras (RTK). Pueden dividirse en dos grupos principales: (1) sustratos que tienen un dominio catalítico; y (2) sustratos que carecen de tal dominio pero que sirven como adaptadores y se asocian con moléculas catalíticamente activas (Songyang y col., 1993, Cell 72:767-778). La especificidad de las interacciones entre los receptores o proteínas y SH2 o dominios PTB de sus sustratos se determina con los restos aminoacídicos más inmediatamente próximos al resto tirosina fosforilado. Por ejemplo, las diferencias en las afinidades de unión entre dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos que próximas a los restos fosfotirosina en los receptores particulares están correlacionadas con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación de sustrato (Songyang y col., 1993, Cell 72:767-778). Las observaciones sugieren que la función de cada tirosina quinasa receptora se determina no sólo por su patrón de expresión y disponibilidad de ligando sino también por el conjunto de caminos descendentes de transducción de señal que se activan con un receptor particular así como por el momento y duración de esos estímulos. De esta forma, la fosforilación proporciona una importante etapa de regulación que determina la selectividad de los caminos de señalización adquiridos por receptores de un factor de crecimiento específico, así como por receptores de factor de diferenciación.

Se ha sugerido que varias tirosina quinasas receptoras, y factores de crecimiento que se unen a las mismas, tienen un papel en la angiogénesis, aunque algunas pueden promover la angiogénesis de forma indirecta (Mustonen y Alital, J. Cell. Biol. 129:895-898, 1995). Una de estas tirosina quinasas receptoras, conocida como "quinasa 1 de hígado fetal" (FLK-1) es un miembro de la subclase de tipo III de RTK. Como designación alternativa para la FLK-1 humana se tiene "receptor de inserción de quinasa que contiene dominio" (KDR) (Terman y col., Oncogene 6:1677-83, 1991). Otra designación alternativa para FLK-1/KDR es "receptor 2 del factor de crecimiento de células vasculares endoteliales" (VEGFR-2) ya que se une a VEGF con alta afinidad. La versión murina de FLK-1/VEGFR-2 también se ha llamado NYK (Oelrichs y col., Oncogene 8(1):11-15, 1993). Se ha aislado el ADN que codifica FLK-1 de ratón, rata y humana y se han presentado los nucleótidos y las secuencias codificadas con aminoácidos (Matthews y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026-30, 1991; Terman y col., 1991, supra; Terman y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-86, 1992; Sarzani y col.,supra; y Millauer y col., Cell 72:835-846, 1993). Numerosos estudios, tales como los que se presentan en Millauer y col., supra, sugieren que VEGF y FLK-1/KDR/VEGFR-2 es un par de ligando-receptor que tienen un papel importante en la proliferación de células endoteliales vasculares y en la formación y desarrollo de vasos sanguíneos, denominadas vasculogénesis y angiogénesis, respectivamente.

Otra TRK de la subclase de tipo III denominada "tirosina quinasa 1 tipo fms" (Flt-1) está relacionada con la FLK-1/KDR (DeVries y col., Science 255;989-991, 1992; Shibuya y col., Oncogene 5:519-524, 1990). Una designación alternativa para Flt-1 es "receptor 1 del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares" (VEGFR-1). Hasta la fecha, los miembros de las subfamilias FLK-1/KDR/VEGFR-2 y Flt-1/VEGFR-1 se ha encontrado expresadas principalmente en células endoteliales. Estos miembros de la subclase se estimulan específicamente con miembros de la familia del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) de ligandos (Klagsburn y D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7:259-270, 1996). El factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) se une a Flt-1 con mayor afinidad que a FLK-1/KDR y es mitogénica hacia células endoteliales vasculares (Terman y col., 1992, supra; Mustonen y col., supra; DeVries y col., supra). Se cree que Flt-1 es esencial para la organización endotelial durante el desarrollo vascular. La expresión de Flt-1 está asociada con desarrollo vascular inicial en embriones de ratones y con la neovascularización durante la curación de heridas (Mustonen y Alitalo, supra). La expresión de Flt-1 en órganos de adultos tales como glomérulos de riñón sugiere una función adicional para este receptor que no está relacionada con el crecimiento celular (Mustonen y Alitalo, supra).

Como se ha afirmado previamente, las evidencias recientes sugieren que el VEGF tiene un papel en la estimulación de la angiogénesis normal y patológica (Jakeman y col., Endocrinology 133: 848-859, 1993; Kolch y col., Breast Cancer Research and Treatment 36: 139-155, 1995; Ferrara y col., Endocrine Reviews 18(1); 4-25, 1997; Ferrara y col., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg y E.M. Rosen) 209-232, 1997). Además, el VEGF se ha implicado en la mejora de la permeabilidad vascular (Connolly y col., J. Biol. Chem. 264: 20017-20024, 1989; Brown y col., Regulation of Angiogenesis (ed. L.D. Goldberg y E.M. Rosen), 233-269, 1997).

Se ha informado sobre distintas formas de VEGF que surgen como formadores alternativos de ARNm, incluyendo los cuatro tipos descritos por Ferrara y col., (J. Cell. Biochem. 47:211-218, 1991). Se han identificado formas secretadas y asociadas principalmente a la célula en Ferrara y col., supra, y se conoce que la proteína existe en forma de dímeros con unión disulfuro.

Recientemente se han identificado varios homólogos relacionados con VEGF. Sin embargo, sus funciones en los procesos normales fisiológicos y en enfermedades todavía no se han elucidado. Además, los miembros de la familia VEGF se coexpresan normalmente con VEGF en una diversidad de tejidos y pueden, generalmente, formar heterodímeros con VEGF. Esta propiedad altera probablemente la especificidad de receptor y efectos biológicos de los heterodímeros y complica adicionalmente la aclaración de sus funciones específicas como se ilustra a continuación (Korpelainen y Alital, Curr. Opin. Cell Biol., 159-164, 1998 y referencias citadas en la misma).

El factor de crecimiento de la placenta (PlGF) tiene una secuencia de aminoácidos que muestra una homología significativa con la secuencia de VEGF (Park y col., J. Biol. Chem. 269:25646-54, 1994; Maglione y col., Oncogene 8:925-31, 1993). Como con VEGF, surgen distintas formas de PlGF de divisiones alternativas del ARNm, y la proteína existe en forma dimérica (Park y col., supra). El PlGF-1 y PlGF-2 se unen a Flt-1 con alta afinidad, y PlGF-2 también se une fuertemente a neuropilina-1 (Migal y col., J. Biol. Chem. 273 (35):22272-22278) pero ninguna se une a FLK-1/KDR (Park y col., supra). Se ha informado de que el PlGF potencia la permeabilidad vascular y el efecto mitogénico de VEGF en células endoteliales cuando VEGF está presente en bajas concentraciones (supuestamente debido a la formación de heterodímeros) (Park y col., supra).

El VEGF-B se produce en dos isoformas (restos 16 y 185) que también parecen unirse a Flt-1/VEGFR-1. Puede tener un papel en la regulación de la degradación de la matriz extracelular, adhesión celular y migración celular mediante la modulación de la expresión y actividad del activador del plasminógeno tipo uroquinasa y del inhibidor de plasminógeno tipo uroquinasa. (Pepper y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998), 95(20): 11709-11713).

El VEGF-C se clonó originalmente como ligando para VEGFR-3/Flt-4 que se expresa principalmente en células endoteliales linfáticas. En su forma totalmente procesada, VEGF-C también puede unirse a KFR/VEGFR-2 y estimular la proliferación y migración de células endoteliales in vitro y los modelos de angiogénesis in vivo (Lymboussaki y col., Am. J. Pathol. (1998), 153(2):395-403; Witzenbichler y col., Am. J. Pathol. (1998) 153(2), 381-394). La sobreexpresión transgénica de VEGF-C solo causa la proliferación y agrandamiento de los vasos linfáticos mientras que los vasos sanguíneos no se ven afectados. Al contrario que VEGF, no se induce la expresión de VEGF-C con hipoxia (Ristimaki y col., J. Biol. Chem. (1998), 273(14), 8413-8418).

El VEGF-D descubierto más recientemente es estructuralmente muy similar a VEGF-C. Se ha informado de que VEGF-D se une y activa al menos dos VEGFR, VEGFR-3/Flt-4 y KDR/VEGFR-2. Se clonó originalmente como mitógeno inducible con c-fos para fibroblastos y se expresa principalmente en las células mesenquimales del pulmón y de la piel (Achen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998), 95(2) 5489-553 y referencias en la misma).

Se ha reivindicado que VEGF-C y VEGF-D inducen aumentos en la permeabilidad vascular in vivo en un ensayo Miles cuando se inyectan en tejido cutáneo (PCT/US97/14696; WO98/07832, Witzenbichler y col., supra). El papel y significado fisiológico de estos ligandos en la modulación de la hiperpermeabilidad vascular y respuestas endoteliales en los tejidos en los que se expresan sigue siendo desconocido.

En base a los recientes descubrimientos de otros homólogos de VEGF y VEGFR y en los precedentes de heterodimerización de ligandos y receptores, las acciones de tales homólogos de VEGF pueden implicar la formación de heterodímeros de VEGF ligando y/o la heterodimerización de receptores o la unión a un VEGFR no descubierto todavía (Witzenbichler y co., supra). Además, los informes recientes sugieren que la neuropilina-1 (Migdal y col., supra) o VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler y col., supra) o receptores distintos de KDR/VEGFR-2 pueden ser responsables de la inducción de permeabilidad vascular (Stacker, S.A. Vitali, A., Domagala, T. Nice, E. y Wilks, A.F. "Angiogenesis and Cancer" Conference, Amer. Assoc. Cancer Res. Enero 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia 40:S118-120 (1997). Hasta ahora, no se ha descrito ninguna evidencia directa del papel esencial de KDR en la hiperpermeabilidad vascular mediada por VEGF.

Las Tirosina Quinasas No Receptoras

Las tirosina quinasas no receptoras representan una seria de enzimas celulares que carecen de secuencias extracelulares y transmembrana. En la actualidad, se han identificado más de veinticuatro tirosina quinasas no receptoras, comprendiendo once (11) subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack y LIMK). Actualmente, la subfamilia Src de las tirosina quinasas no receptoras comprende el mayor número de PTK e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr e Yrk. La subfamilia Src de enzimas se ha relacionado con la oncogénesis. En Bolen, 1993, Oncogene 8:2025-2031, que se incorpora por referencia en este documento, se proporciona una discusión más detallada de las tirosina quinasas no receptoras.

Se ha descubierto que muchas de las tirosina quinasas, RTK o tirosina quinasas no receptoras, están implicadas en los caminos de señalización celular implicados en diversas afecciones patogénicas, incluyendo cáncer, psoriasis y otros trastornos hiperproliferativos o respuestas hiper-inmunes.

Desarrollo de Compuestos para Modular las PTK

A la vista de la supuesta importancia de las PTK para el control, regulación y modulación de la proliferación celular, de las enfermedades y de los trastornos asociados con una proliferación celular anormal, se han hecho muchos intentos para identificar "inhibidores" de las tirosina quinasas receptoras y no receptoras usando varios enfoques, incluyendo el uso de ligandos mutantes (Patente de Estados Unidos 4.966.849), receptores y anticuerpos solubles (Solicitud Nº WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10705-09; Kim y col., 1993, Nature 362:841-844), ligandos de ARN (Jellinek y col., Biochemistry 33:10450-56; Takano y col., 1993, Mol. Biol. Cell 4:358A; Kinsella y col., 1992, Exp. Cell. Res 199:56-62; Wright y col., 1992, J. Cellular Phys. 152:448-57) e inhibidores de la tirosina quinasa (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente de Estados Unidos Nº 5.330.992; Mariani y col., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268).

Más recientemente, se han hecho intentos para identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de tirosina quinasa. Por ejemplo, los compuestos monocíclicos, bicíclicos o heterocíclicos de arilo (PCT WO 92/20642) y derivados de vinilen-azaindol (PCT WO 94/14808) se ha descrito generalmente como inhibidores de tirosina quinasa. Los compuestos de estirilo (Patente de Estados Unidos Nº 5.217.999), compuestos piridilo sustituidos con estirilo (Patente de Estados Unidos Nº 5.302.606), ciertos derivados de quinazolin (Solicitud EP Nº 0 566 266 A1; Expert Opin. Ther. Pat (1998), 8(4): 475-478), selenoindoles y selenuros (PCT WO94/03427), compuesto polihidroxílicos tricíclicos (PCT WO 92/21660) y compuestos de ácido bencilfosfónico (PCT WO 91/15495) se han descrito como compuestos para usar como inhibidores de tirosina quinasa para uso en el tratamiento del cáncer. Las anilinocinolinas (PCT WO 97/34876) y compuestos derivados de quinazolina (PCT WO97/22596; PCT WO97/42187) se han descrito como inhibidores de la angiogénesis y de la permeabilidad vascular.

Además, se han hecho intentos para identificar pequeñas moléculas que actúan como inhibidores de la serina/treonina quinasa. En particular, se han descrito compuestos de bis(indolilmaleimida) como inhibidores de isoformas particulares de la PKC serina/treonina quinasa cuya disfunción está asociada con una permeabilidad vascular asociada en enfermedades relacionadas con VEGF (PCT WO97/40830; PCT WO97/40831).

Por tanto, la identificación de pequeños compuestos eficaces que inhiben específicamente la transducción de la señal modulando la actividad de tirosina y serina/treonina quinasas receptoras y no receptoras para regular y modular la proliferación, diferenciación o metabolismo celular anormal o inapropiado es deseable. En particular, sería beneficiosa la identificación de métodos y compuestos que inhiben específicamente la función de una tirosina quinasa esencial para el proceso angiogénico o para la formación de hiperpermeabilidad vascular que forma edema, ascites, efusiones, exudados y extravasación macromolecular y deposición de la matriz, así como trastornos asociados.

Sumario de la invención

Esta invención se refiere a compuestos representados por una de las fórmulas:

1

en la que:

X es oxígeno o azufre;

el anillo A representa las estructuras:

2

n es 1 ó 2;

AR es

3

y

R^{1} es hidrógeno, metilo, COR^{3} o SO_{2}R^{3};

R^{2} representa un halógeno que tiene un peso atómico de aproximadamente 19 a 36;

y

R^{3} es -CH_{3} o

4

donde Y es hidrógeno, cloro o -CH_{3}.

Los estereoisómeros y mezclas de estereoisómeros están incluidos en esta invención. Los tautómeros de los compuestos también están dentro del alcance de la invención. Las sales de adición ácida de estos compuestos también están incluidas en esta invención.

Los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de la actividad proteína quinasa. En particular, los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de las proteína quinasas que son importantes en el proceso de angiogénesis y/o permeabilidad vascular. Como estos compuestos son anti-angiogénicos y/o antiedematosos, son sustancias importantes para inhibir la progresión de enfermedades en las que se manifiesta angiogénesis y/o edema.

Un compuesto preferido de la presente invención tiene la fórmula:

5

Los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de las serina/treonina y tirosina quinasas. En particular, los compuestos de esta invención son útiles como inhibidores de tirosina quinasas que son importantes en las enfermedades hiperproliferativas, especialmente en el proceso de angiogénesis. Como estos compuestos son anti-angiogénicos y/o antiedematosos, son sustancias importantes para inhibir la progresión de enfermedades en las que la angiogénesis es un componente importante.

La presente invención incluye el uso de estos compuestos en composiciones farmacéuticas con una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos descritos anteriormente y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse a los individuos para reducir o parar el proceso de angiogénesis en enfermedades en las que se manifiesta angiogénesis o para tratar efusiones de edemas, exudados o ascites y otras afecciones asociadas con la hiperpermeabilidad vascular.

Descripción detallada de la invención

Los compuestos de esta invención tienen propiedades antiangiogénicas. Estas propiedades antiangiogénicas se deben al menos en parte a la inhibición de proteína tirosina quinasas esenciales para el proceso angiogénico. Por esta razón, estos compuestos pueden usarse como agentes activos frente a enfermedades tales como artritis, aterosclerosis, psoriasis, hemangiomas, angiogénesis miocárdica, lesiones colaterales coronarias y cerebrales, angiogénesis isquémica en los miembros, curación de heridas, úlcera péptica, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas, fiebre por arañazo de gato, rubeosis, glaucoma neovascular y retinopatías tales como las asociadas con la retinopatía diabética o degeneración macular relacionada con la edad. Además, algunos de estos compuestos pueden usarse como agentes activos contra tumores sólidos, ascites malignos, cánceres hematopoyéticos y trastornos hiperproliferativos tales como hiperplasia tiroide (especialmente enfermedad de Grave) y quistes (tales como hipervascularidad del estroma ovárica característica del síndrome de ovario poliquístico (síndrome de Stein-Leventhal) ya que tales enfermedades requieren una proliferación de células de vasos sanguíneos para el crecimiento y/o metástasis.

Además, algunos de los compuestos pueden usarse como agentes activos frente a quemaduras, enfermedad crónica pulmonar, ataques, pólipos, anafilaxis, inflamación crónica y alérgica, síndrome de hiperestimulación ovárica, edema cerebral asociado con tumor cerebral, alta altitud, edema pulmonar o cerebral inducido por trauma o hipoxia, edema macular y ocular, ascites y otras enfermedades en las que la hiperpermeabilidad vascular, efusiones, exudados, extravasación proteica o edema son manifestaciones de la enfermedad.

Los compuestos también serán útiles para tratar trastornos en los que la extravasación proteica lleva a la deposición de fibrina y matriz extracelular, provocando proliferación del estroma (por ejemplo, fibrosis, cirrosis y síndrome del túnel carpiano).

Los VEGF son los únicos factores de crecimiento angiogénicos que se conoce que contribuyen a la hiperpermeabilidad vascular y a la formación de edema. De hecho, la hiperpermeabilidad vascular y el edema asociado con la expresión o administración de muchos otros factores de crecimiento parece estar mediado por la producción de VEGF. Las citoquinas inflamatorias estimulan la producción de VEGF. La hipoxia tiene como resultado un aumento notable de VEGF en distintos tejidos, de aquí que las situaciones que implican infartos, oclusión, isquemia, anemia o impedimento circulatorio invocan típicamente respuestas mediadas por VEGF/VPF. La hiperpermeabilidad vascular, edemas asociado, intercambio transendotelial alterado y extravasación macromolecular, que están acompañadas habitualmente por diapédesis, pueden tener como resultado una excesiva deposición de matriz, proliferación anormal del estroma, fibrosis, etc. Por tanto, la hiperpermeabilidad mediada por VEGF puede contribuir de forma significativa a trastornos con estas características etiológicas.

Se supone que los trastornos enumerados anteriormente están mediados en gran medida por la actividad de proteína tirosina quinasa que implica las tirosina quinasas KDR/VEGFR-2 y/o Flt-1/VEGFR-1. Inhibiendo la actividad de estas tirosina quinasas, se inhibe la progresión de los trastornos enumerados ya que el componente angiogénico o de hiperpermeabilidad vascular de la enfermedad ser reduce en gran medida. La acción de los compuestos de esta invención, por su selectividad por tirosina quinasas específicas, tiene como resultado una minimización de los efectos secundarios que tendrían lugar si se usasen inhibidores de la tirosina quinasa menos selectivos.

Los compuestos de esta invención tiene actividad inhibidora contra las proteína quinasas. Es decir, estos compuestos modulan la transducción de la señal de proteína quinasas. Los compuestos de esta invención inhiben las proteína quinasas de las clases serina/treonina y tirosina. En particular, estos compuestos inhiben selectivamente la actividad de las tirosina quinasas KDR/FLK-1/VEGFR-2. Ciertos compuestos de esta invención también inhiben la actividad de otras tirosina quinasas tales como Flt-1/VEGFR-1, quinasas de la subfamilia Src tales como Lck, Src, Fyn, yes, etc. Adicionalmente, algunos de los compuestos de esta invención inhiben significativamente serina/treonina quinasas tales como las CDK que tienen un papel esencial en la progresión del ciclo celular. La potencia y especificidad de los compuestos genéricos de esta invención hacia una proteína quinasa particular puede alterarse y optimizarse normalmente por variaciones en la naturaleza, número y disposición de los sustituyentes (es decir, R^{1}, R^{2} y R^{3}) de estos compuesto y de sus limitaciones conformacionales. Además, los metabolitos de ciertos compuestos también poseen actividad inhibidora de proteína quinasa significativa.

Los compuestos de esta invención, cuando se administran a individuos en necesidad de tales compuestos, inhiben la hiperpermeabilidad vascular y la formación de edemas en estos individuos. Estos compuestos actúan, supuestamente, inhibiendo la actividad de la KDR tirosina quinasa que está implicada en el proceso de la hiperpermeabilidad vascular y de la formación de edema. La KRD tirosina quinasa también puede denominarse FLK-1 tirosina quinasa, NYK tirosina quinasa o VEGFR-2 tirosina quinasa. La KDR tirosina quinasa se activa cuando el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares u otro ligando de activación (tal como VEGF-C, VEGF-D o proteína HIV Tat) se une a un receptor de KDR tirosina quinasa en la superficie de células endoteliales vasculares. Después de tal activación de KDR tirosina quinasa tiene lugar la hiperpermeabilidad de los vasos sanguíneos y el líquido se mueve del flujo sanguíneo a los espacios intersticiales a través de las paredes de los vasos sanguíneos, formando por tanto un área de edema. La diapédesis acompaña habitualmente a esta respuesta. De forma similar, la hiperpermeabilidad vascular excesiva puede interrumpir el intercambio molecular normal a través del endotelio en tejidos y órganos críticos (por ejemplo, pulmón y riñón), causando por lo tanto extravasación macromolecular y deposición. Después de esta respuesta aguda a la estimulación con KDR que se cree que facilita el proceso angiogénico posterior, la estimulación prolongada con KDR tirosina quinasa tiene como resultado la proliferación y quimiotaxis de células endoteliales vasculares y la formación de nuevos vasos. Al inhibir la actividad de la KDR tirosina quinasa, bloqueando la producción del ligando de activación, bloqueando la unión del ligando de activación al receptor de la KDR tirosina quinasa, evitando la dimerización y transfosforilación del receptor , inhibiendo la actividad enzimática de la KDR tirosina quinasa (inhibiendo la función de fosforilación de la enzima) o por otro mecanismo que interrumpe la señalización descendente (D. Mukhopedhyay y col., Cancer Res. 58:1278-1284 (1998) y referencias en la misma), puede inhibirse y minimizarse la hiperpermeabilidad así como la extravasación asociada, posterior formación de edema y deposición de matriz y respuestas angiogénicas.

Un grupo de compuestos preferidos de esta invención tiene la propiedad de inhibir la actividad de la KDR tirosina quinasa sin inhibir de forma significativa la actividad de la Flt-1 tirosina quinasa (la Flt-1 tirosina quinasa también se denomina VEGFR-1 tirosina quinasa). La KDR tirosina quinasa y la Flt-1 tirosina quinasa se activan mediante la unión de VEGF a receptores de KDR tirosina quinasa y a receptores de Flt-1 tirosina quinasa respectivamente. Como la actividad de Flt-1 tirosina quinasa puede mediar eventos importantes en el mantenimiento endotelial y en la función vascular, una inhibición de esta actividad enzimática puede conducir a efectos tóxicos o adversos. Como mínimo, tal inhibición es innecesaria para bloquear las respuestas angiogénicas, la inducción de la hiperpermeabilidad vascular y la formación de edema, de forma que es no es necesaria ni valiosa para el individuo. Ciertos compuestos preferidos de esta invención son únicos porque inhiben la actividad de una tirosina quinasa receptora de VEGF (KDR) que se activa con ligandos de activación pero no inhibe otras tirosina quinasa receptoras tales como Flt-1, que también se activan con ciertos ligandos de activación. Los compuestos preferidos de esta invención son, por lo tanto, selectivos en su actividad inhibidora de la tirosina quinasa.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de úlceras, úlceras bacterianas, por hongos, Mooren y colitis ulcerativa.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de afecciones en las que tiene lugar angiogénesis no deseada, edema o deposición de estroma en infecciones víricas tales como Herpes simplex, Herpes Zoster, SIDA, sarcoma de Kaposi, infecciones con protozoos y toxoplasmosis, post-trauma, radiación, ataques, endometriosis, síndrome de hiperestimulación ovárica, lupus sistémico, sarcoidosis, sinovitis, enfermedad de Crohn, anemia drepanocítica, enfermedad de Lyme, penfigoide, enfermedad de Paget, síndrome de hiperviscosidad, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, inflamación crónica, enfermedad oclusiva pulmonar crónica, artritis reumatoide y osteoartritis.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de afecciones oculares tales como edema ocular y macular, enfermedad neovascular ocular, escleritis, queratotomía radial, uveitis, vitritis, miopía, fosasópticas, separación de retina crónica, complicaciones post-láser, conjuntivitis, enfermedad de Stargardft y enfermedad de Eagle además de retinopatía y degeneración macular.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de afecciones cardiovasculares tales como aterosclerosis, restenosis, oclusión vascular y enfermedad obstructiva de la carótida.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de indicaciones relacionadas con el cáncer tales como tumores sólidos, sarcomas (especialmente sarcoma de Ewing y osteosarcoma), retinoblastoma, rabdomiosarcomas, neuroblastoma, malignidades hematopoyéticas, incluyendo leucemia y linfoma, efusiones pleurales o pericárdicas inducidas por tumores y ascites malignos.

Los compuestos de la presente invención también son útiles en el tratamiento de afecciones diabéticas tales como glaucoma, retinopatía diabética y microangiopatía.

Se supone que los trastornos enumerados anteriormente están mediados en gran medida por la actividad tirosina quinasa que implica los receptores VEGF (por ejemplo, KDR y Flt-1). Al inhibir la actividad de estas tirosina quinasa receptoras, la progresión de los trastornos enumerados se inhibe debido a que se limita en gran medida el componente angiogénico de la enfermedad. La acción de los compuestos de esta invención, por su selectividad por tirosina quinasas específicas, tiene como resultado una minimización de los efectos secundarios que tendrían lugar si se usasen inhibidores de la tirosina quinasa menos selectivos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos de fórmula I como se han definido anteriormente (incluyendo las condiciones) para usar como medicamentos, particularmente como inhibidores de la actividad proteína quinasa, por ejemplo, actividad tirosina quinasa, actividad serina quinasa y actividad treonina quinasa. En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I como se han definido anteriormente (incluyendo las condiciones) en la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de la actividad proteína quinasa.

Las siguientes definiciones son aplicables en esta invención:

El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a aquellas sales que mantienen las propiedades y eficacia biológica de las sales libres y que se obtienen por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico o ácidos orgánicos tales como ácido sulfónico, ácido carboxílico, ácido fosfórico orgánico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico, ácido láctico, ácido tartárico y similares.

El término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, incluyendo grupos de cadena lineal y cadena ramificada que tienen de 1 a 4 átomos de carbono.

El término "alcoxi" se refiere a un grupo "O-alquilo", donde "alquilo" se define como se ha descrito anteriormente.

Formulaciones Farmacéuticas

Los compuestos identificados de esta invención pueden administrarse a un paciente humano solos o en composiciones farmacéuticas en las que se mezclan con vehículos o excipientes adecuados en dosis para tratar o mejorar una diversidad de trastornos. La mezcla de estos compuestos puede administrarse a un paciente como mezcla simple o en composiciones farmacéuticas adecuadamente formuladas. A una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una cantidad del compuesto o compuestos suficiente para tener como resultado la prevención de la progresión de la enfermedad. Las técnicas de formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Vías de Administración

Las vías adecuadas de administración pueden incluir, por ejemplo, administración oral, en gotas oculares, rectal, tranmucosal, tópica o intestinal; administración parenteral, incluyendo intramuscular, subcutánea, inyecciones intramedulares así como inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

Alternativamente, se puede administrar el compuesto de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, normalmente en formulación de liberación sostenida o de depósito.

Además, se puede administrar el fármaco en un sistema de administración dirigida de fármaco, por ejemplo, en un liposoma recubierto con anticuerpo específico para un tumor. Los liposomas se dirigirán y serán absorbidos de forma selectiva por el tumor.

Composición/Formulación

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de forma conocida, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, disolución, granulación, fabricación de comprimidos, levigación, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofilización convencionales.

De esta forma, las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención pueden formularse de forma convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesado de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación correcta depende de la vía de administración escogida.

Para inyección, los agentes de la invención pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón de solución salina fisiológica. Para la administración transmucosa, se usan en la formulación permeantes apropiados para la barrera a traspasar. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

Para administración oral, los compuestos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten a los compuestos de la invención formularse como comprimidos, píldoras, pastillas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, suspensiones y similares, para su ingestión oral por parte del paciente a tratar.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse combinando el compuesto activo con un excipiente sólido, triturando opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de pastillas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulusa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como polivinilpirrolidina reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos tales como alginato sódico.

Los núcleos de las pastillas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Con este propósito, pueden usarse soluciones de azúcar concentrado, que pueden contener opcionalmente goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los recubrimientos de los comprimidos o pastillas para su identificación o para caracterizar distintas combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse oralmente incluyen cápsulas enchufables fabricadas con gelatina, así como cápsulas blandas cerradas herméticamente fabricadas con gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas enchufables pueden contener los ingredientes activos en mezcla con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar forma de comprimidos o pastillas formuladas de la forma habitual.

Para la administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de presentación con nebulizador aerosol en recipientes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorotrifluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso del aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para proporcionar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para usar en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, inyección de bolo o por infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o recipientes multi-dosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden formar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes o agentes para la dispersión.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del compuesto activo en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones oleosas para inyección apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluye aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres sintéticos de aceites grasos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.

Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógenos, antes de su uso.

Los compuestos también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también pueden formularse como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de larga actuación pueden administrarse mediante implante (por ejemplo, de forma subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De esta forma, por ejemplo, los compuestos puede formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, en forma de sal moderadamente soluble.

Un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos de esta invención en un sistema de codisolvente que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico mezclable con agua y una fase acuosa. El sistema codisolvente puede ser el sistema codisolvente VPD. VPD es una solución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% del tensioactivo no polar polysorbate 80 y 65% p/v de polietilenglicol 300, rellenado en volumen con etanol puro. El sistema codisolvente VPD (VPD:5W) consiste en VPD diluido 1:1 con una dextrosa al 5% en solución de agua. Este sistema codisolvente disuelve bien compuestos hidrófobos y produce poca toxicidad con la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema codisolvente pueden variarse considerablemente sin destruir su solubilidad y sus características de toxicidad. Además, puede variarse la identidad de los componentes del co-disolvente: por ejemplo, pueden usarse otros tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar del polysorbate 80; la proporción de polietilenglicol puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

Alternativamente, pueden emplearse otros sistemas de administración para los compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos de administración para fármacos hidrófobos. También pueden emplearse ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente con el coste de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden administrarse usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrófobos que contienen al agente terapéutico. Los especialistas en la técnica han establecido y conocen distintos materiales de liberación sostenida. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos de la invención desde unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, pueden emplearse otras estrategias para la estabilización de las proteínas.

Las composiciones farmacéuticas también comprenden vehículos o excipientes en fase sólida o gel. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero sin limitación, carbonato cálcico, fosfato cálcico, distintos azúcares, almidones, derivados de la celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Muchos de los compuestos que modulan la proteína quinasa de la invención pueden proporcionarse en forma de sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles pueden formarse con muchos ácidos incluyendo, pero sin limitación, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos o en otros disolventes protónicos que las correspondientes formas de base libre.

Dosificación Eficaz

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir su propósito. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para prevenir el desarrollo o aliviar los síntomas existentes del sujeto que se está tratando. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de las habilidades del especialista en la técnica, especialmente a la vista de la descripción detallada que se proporciona en este documento.

Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente con ensayos celulares. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en circulación que incluye el EC_{50} determinado en ensayos celulares (es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue la mitad de la inhibición máxima de actividad PTK). Tal información puede usarse para determinar con más precisión las dosis útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto que tiene como resultado una mejora de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la dosis máxima tolerada (MTD) y el ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación entre MTD y ED_{50}. Se prefieren los compuestos que muestran altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para usar en seres humanos. La dosificación de tales compuestos están preferiblemente en un intervalo de concentraciones en circulación que incluye el ED_{50} con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación, vía de administración y dosificación exacta puede ser seleccionada por el médico a la vista del estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p. 1).

La cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma del resto activo suficientes para mantener los efectos moduladores de quinasa o una concentración mínima eficaz (MEC). La MEC variará para cada compuesto pero puede estimarse con datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para conseguir un 50-90% de inhibición de la quinasa usando los ensayos descritos en este documento. Las dosificaciones necesarias para conseguir la MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Sin embargo, pueden usarse ensayos HPLC o bioensayos para determinar concentraciones en plasma.

Los intervalos de dosificación también pueden determinarse usando el valor MEC. Los compuestos deben administrarse usando un régimen que mantiene los niveles en plasma por encima del MEC durante 10-90% del tiempo, preferiblemente entre 30-90% y más preferiblemente entre 50-90%. En casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local eficaz del fármaco puede no estar relacionada con la concentración en plasma.

La cantidad de composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, de la edad del sujeto, la gravedad de la afección, la forma de administración y del juicio del médico.

Envasado

Las composiciones pueden presentarse, si se desea, en un pack o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El pack puede comprender por ejemplo una lámina metálica o de plástico, tal como un blister pack. El pack o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones para la administración. También pueden prepararse composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo farmacéuticamente aceptable, introducirse en un recipiente adecuado y etiquetarse para el tratamiento de una enfermedad indicada. Las condiciones adecuadas indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo celular, inhibición de la angiogénesis, tratamiento de fibrosis, diabetes y similares.

En algunas formulaciones de la presente invención el compuesto activo puede, si se desea, asociarse con otros ingredientes activos farmacológicamente compatibles. Por ejemplo, los compuestos de esta invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes farmacéuticos adicionales que inhiben o previenen la producción de VEGF, atenúan las respuestas intracelulares a VEGF, bloquean la transducción intracelular de la señal, inhiben la hiperpermeabilidad vascular, reducen la inflamación o inhiben o previenen la formación de edema o la neovascularización. Los compuestos de la invención pueden administrarse antes, después o de forma simultánea con el agente farmacéutico adicional, sea cual sea la vía de administración adecuada. Los agentes farmacéuticos adicionales incluyen, pero sin limitación, esteroides anti-edémicos, NSAID, inhibidores ras, agentes anti-TNF, agentes anti-IL1, antihistamínicos, antagonistas de PAF, inhibidores de la COX-1, inhibidores de la COX-2, inhibidores de la NO sintasa, inhibidores de PKC e inhibidores de la quinasa PI3. Los compuestos de la invención y los agentes farmacéuticos adicionales actúan de forma aditiva o sinérgica. De esta forma, la administración de tal combinación de sustancias que inhiben la hiperpermeabilidad vascular y/o inhibe la formación de edema puede proporcionar mayor beneficio de los efectos perjudiciales de un trastorno hiperproliferativo, angiogénesis, hiperpermeabilidad vascular o edema que la administración de cada sustancia por separado. En el tratamiento se trastornos malignos se anticipan combinaciones con quimioterapias antiproliferativas o quimiotóxicas.

La presente invención también comprende el uso de un compuesto de fórmula I como medicamento.

Las familias Src y Syk de quinasas tienen papeles decisivos en la regulación de la función inmune. La familia Src incluye actualmente Fyn, Lck, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yes, Hck y Blk. La familia Syk incluye solo Zap y Syk. La familia Janus de quinasas está implicada en la transducción del factor de crecimiento y de las señales proinflamatorias de citoquina mediante varios receptores. Aunque la BTK e ITK, miembros de la familia Tec de quinasas, tienen un papel menos conocidos en inmunobiología, su modulación con un inhibidor puede mostrarse terapéuticamente beneficioso. La quinasas RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, IKK-1 e IKK-2 están implicadas en los caminos de transducción de la señal para las citoquinas proinflamatorias fundamentales TNF e IL-1. Por virtud de su capacidad para inhibir una o más de estas quinasas, los compuestos de fórmula I pueden funcionar como agentes inmunomoduladores útiles para el mantenimiento de implantes y el tratamiento de trastornos autoinmunes. Debido a su capacidad para regular la activación de células T o la potenciación de un proceso inflamatorio, estos compuestos podrían usarse para tratar tales enfermedades autoinmunes. Los transplantes debidos a fenómenos de rechazo, de huésped contra implante en órganos sólidos o de transplante contra huésped en médula ósea, están limitados por la toxicidad de los agentes inmunosupresores disponibles en la actualidad y se beneficiarían de un fármaco eficaz con un mejor índice terapéutico. Los experimentos de dirección genética han demostrado el papel esencial de Src en la biología de los osteoclastos, las células responsables de la resorción ósea. Los compuestos de fórmula I, mediante su capacidad para regular Src, también pueden ser útiles en el tratamiento de la osteoporosis, osteopetrosis, enfermedad de Paget, hipercalcemia inducida por tumor y en el tratamiento de metástasis óseas.

Se ha demostrado que varias proteína quinasas son protooncógenos. La ruptura del cromosoma (en el punto de ruptura quinasa ltk en cromosoma 5), translocación como en el caso del gen Abl con BCR (cromosoma Philadelphia), truncación en casos como el c-Kit o EFGR o mutación (por ejemplo, Met) tienen como resultado la creación de proteínas dis-reguladas que las transforman de productos protooncógenos en oncógenos. En otros tumores, la oncogénesis está dirigida por interacciones de ligando autocrino o paracrino/factor de crecimiento. Los miembros de las quinasas de familia Src están implicadas típicamente en la transducción de la señal descendente potenciando de esta manera la oncogénesis y pueden convertirse en si mismas en oncogénicas por sobreexpresión o mutación. Inhibiendo la actividad proteína quinasa de estas proteínas puede interrumpirse el proceso de la enfermedad. La restenosis vascular puede implicar el proceso de proliferación celular endotelial y de músculo liso promocionado con FGF y/o PDGF. La inhibición de la actividad quinasa FGFr o PDGFr puede ser una estrategia eficaz para inhibir este fenómeno. De esta forma, los compuestos de fórmula I que inhiben la actividad quinasa de c-kit- c-met, c-fms, miembros de la familia src, EGFr, erbB2, erbB4, BCR-Abl, PDGFr, FGFr y otras tirosina quinasas receptoras o citosólicas pueden ser valiosos en el tratamiento de enfermedades proliferativas benignas y neoplásicas.

En muchas afecciones patológicas (por ejemplo, tumores primarios sólidos y metástasis, sarcoma de Kaposi, artritis reumatoide, ceguera debida a neovascularización ocular inapropiada, psoriasis y aterosclerosis), la progresión de la enfermedad depende de una angiogénesis persistente. Los factores de crecimiento polipéptidos producidos habitualmente en el tejido de la enfermedad o en células inflamatorias asociadas y sus tirosina quinasas receptoras específicas de células endoteliales correspondientes (por ejemplo, KDR/VEGFR-2, Flt-1/VEGFR-1, Tie-2/Tek y Tie) son esenciales para la estimulación del crecimiento, migración, organización, diferenciación de células endoteliales y el establecimiento de la nueva vasculatura funcional.

Como resultado de la actividad "factor de permeabilidad vascular" de VEGF en la mediación de la hiperpermeabilidad vascular, también se cree que la estimulación con VEGF de una VEGFR quinasa tiene un papel importante en la formación de ascites tumorales, edema cerebral y pulmonar, efusiones pleurales y pericárdicas, reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado, edema en tejidos y disfunciones orgánicas después de trauma, quemaduras, isquemia, complicaciones diabéticas, endometriosis, síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS), hipotensión e hiperpermeabilidad relacionada con bypass cardio-pulmonar y edema ocular que conduce a un glaucoma o ceguera debido a una neovascularización inapropiada. Además de VEGF, los VEGF-C y VEGF-D y proteína HIV-Tat recientemente identificados también pueden provocar una respuesta de hiperpermeabilidad vascular mediante la estimulación de una VEGFR quinasa.

La Tie-2 también se expresa en una población selecta de células madre hematopoyéticas en las que puede tener un papel en su reclutamiento, adhesión, regulación y diferenciación (Blood 89, 4317-4326 (1997)); esta población que expresa Tie-2 puede servir como progenitores endoteliales angiogénicos en circulación. Ciertos agentes de acuerdo con la fórmula I capaces de bloquear la actividad quinasa de quinasas específicas de células endoteliales podrían por tanto inhibir la progresión de la enfermedad que implica estas situaciones.

Los compuestos de fórmula I o una sal de los mismos o composición farmacéutica que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de los mismos puede usarse en el tratamiento de enfermedades proliferativas neoplásicas malignas y benignas y trastornos del sistema inmune. Tales enfermedades incluyen enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, tiroiditis, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, sarcoidosis, enfermedad inflamatoria del intestino, miastenia gravis y lupus sistémico eritematoso; psoriasis, rechazo de transplante de órgano (por ejemplo, rechazo de riñón, implante contra huésped), enfermedades proliferativas malignas y benignas, cánceres humanos, tales como cáncer de pulmón, de mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y rectal y células hematopoyéticas (leucemia y linfoma) y enfermedades que implican una vascularización inapropiada por ejemplo retinopatía diabética, neovascularización coroidal debida a degeneración macular relacionada con la edad y hemangiomas infantiles en seres humanos. Además, tales inhibidores pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos que implican edemas, ascites, efusiones y exudados mediados por VEGF, incluyendo por ejemplo, edema macular, edema cerebral y síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (ARDS).

Los compuestos de la presente invención también pueden ser útiles en la profilaxis de las enfermedades anteriores.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de fórmula I o una sal del mismo en la fabricación de un medicamento para tratar hiperpermeabilidad vascular, trastornos dependientes de la angiogénesis, enfermedades proliferativas y/o trastornos del sistema inmune en mamíferos, particularmente en seres humanos.

La presente invención también proporciona un método para tratar hiperpermeabilidad vascular, neovascularización inapropiada, enfermedades proliferativas y/o trastornos del sistema inmune que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I a un mamífero, particularmente un ser humano, en necesidad del mismo.

La potencia in vitro de compuesto en la inhibición de estas proteína quinasas puede determinarse con los procedimientos detallados anteriormente.

La potencia de los compuestos puede determinarse por la cantidad de inhibición de la fosforilación de un sustrato exógeno (por ejemplo, péptido sintético (Z. Songyang y col., Nature, 373:536-639) de un compuesto de prueba en relación con un control.

Ejemplificaciones I Síntesis

Los compuestos representados por la fórmula estructural I pueden sintetizarse con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos 3.816.438. Los compuestos representados por la fórmula estructural II pueden sintetizarse con los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos 3.816.437.

La formación del anillo pirazol se efectúa calentado los compuestos de estructura IV con hidrazina en un disolvente inerte. La reacción se realiza preferiblemente durante un periodo de 8 horas a 5 días a una temperatura de 35ºC a 150º, preferiblemente a temperatura de reflujo del sistema. Después, el compuesto V se deshidrogena en compuesto I por exposición a sílice o alúmina en presencia de aire u oxígeno. Alternativamente, puede usarse un agente de deshidrogenación, tal como azufre o paladio o un agente oxidante tal como dióxido de manganeso. Cuando se usa un agente deshidrogenante o un agente oxidante, es preferible que se use un disolvente inerte, el tiempo de reacción es de 5 a 50 horas y la temperatura de reacción está entre 20º y 250ºC. El siguiente esquema es representativo de esta transformación.

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De forma similar, el compuesto II puede formarse calentado compuesto IV con hidrazina seguido de deshidrogenación.

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Un segundo método para formar el anillo pirazol es por tratamiento con un compuesto representado por la fórmula estructural VII con hidrazina en un disolvente inerte. La reacción se realiza a una temperatura entre 30º y 150ºC, preferiblemente a la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción. El siguiente esquema es representativo de esta transformación.

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De nuevo, de forma similar, el compuesto II puede formarse tratando el compuesto VIII con hidrazina en un disolvente inerte.

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Un tercer método para formar el anillo pirazol es por tratamiento del epóxido representado con la fórmula estructural IX con hidrazina en un disolvente inerte en presencia de una cantidad catalítica de ácido mineral, un ácido orgánico fuerte o un ácido de Lewis. Los ácidos preferidos con ácido p-toluenosulfónico y trifluoruro de boro. La reacción se realiza a una temperatura de entre 35ºC y 200ºC, preferiblemente a temperatura de reflujo de la mezcla de reacción. La duración de esta reacción es de 8 horas a 5 días. El siguiente esquema es representativo de esta transformación.

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De nuevo, de forma similar, el compuesto II puede formarse tratando el compuesto X con hidrazina en un disolvente inerte con una cantidad catalítica de un ácido.

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Los compuestos representados por la fórmula estructural IV se sintetizan por tratamiento con un compuesto representado por la fórmula XI con el aril aldehído XII apropiado en presencia de una cantidad catalítica de un ácido o una base en un disolvente inerte. Las bases adecuadas incluyen hidróxido sódico, hidróxido potásico, trietilamina o dietilamina. Los ácido adecuados incluyen ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido toluenosulfónico y ácido metilsulfónico. La temperatura de reacción es de 15ºC a 100ºC y la duración de la reacción de 2 a 24 horas. El siguiente esquema es representativo de esta transformación.

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De forma similar, los compuestos de fórmula estructural VI pueden sintetizarse con compuestos de fórmula XIII haciendo reaccionar estos compuestos con un arilaldehído apropiado en un disolvente inerte con una cantidad catalítica de un ácido o una base.

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Los compuestos representados por la fórmula estructural IX se sintetizan tratando un compuesto representado por la fórmula estructural XIV con un arilaldehído en condiciones básicas en un disolvente inerte en una atmósfera inerte. Las bases adecuadas incluyen hidróxidos alcalinos o alcalinotérreos, alcóxidos inferiores de metales alcalinos, aminas terciarias alifáticas y aromáticas y aminas terciarias cíclicas tales como piridina. La reacción se realiza de 0ºC a 30ºC durante 1 a 5 horas. El siguiente esquema es representativo de esta transformación.

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en el que Z es un grupo saliente, tal como halógeno, tosilato, mesilato y similar.

De la misma forma, los compuestos de fórmula estructural X pueden sintetizarse con compuestos de fórmula XV haciendo reaccionar estos compuestos con un aldehído apropiado en un disolvente inerte en condiciones básicas.

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Los compuestos representados por las fórmulas estructurales XIV y XV se sintetizan con procedimientos convencionales a partir de compuestos representados con las fórmulas estructurales XI y XIII, respectivamente. Por ejemplo, un compuesto representado por la fórmula estructural XI, puede tratarse en un disolvente inerte con cloro o bromo a temperaturas en el intervalo de temperatura ambiente a 50ºC durante un periodo de 1 a 12 horas para dar un compuesto de fórmula XIV.

Los compuestos con fórmula estructural VII, VIII, XI y XIII son conocidos y pueden prepararse por métodos descritos en la literatura.

Algunos ejemplos específicos de las transformaciones anteriores pueden encontrarse en la Patente de Estados Unidos 3.816.438 o Patente de Estados Unidos 3.816.437.

II Ensayos con Proteína Quinasa In Vitro

Los siguientes ensayos in vitro pueden usarse para determinar el nivel de actividad y efecto de los distintos compuestos de la presente invención en una o más de las proteína quinasas. Pueden designarse ensayos similares en la misma línea para otras quinasas usando técnicas conocidas en la técnica.

A. Producción de Proteína KDR Usando Sistema Baculovirus

La secuencia de codificación del dominio intracelular de KDR (aa789-1354) se generó mediante PCR usando ADNc aislado de células HUVEC. También se introdujo una secuencia poly-His_{6} en el extremo N de esta proteína. Este fragmento se clonó en un vector de transfección pVL1393 en el sitio Xba 1 y Not 1. El baculovirus recombinante (BV) se generó mediante cotransfección usando el reactivo de Transfección BaculoGold (PharMingen). El BV recombinante se purificó en placa y se verificó mediante análisis Western. Para la inducción de la proteína, se cultivaron células SF-9 en medio SF-900-II a 2 x 10^{6}/ml y se infectaron 0,5 unidades formadoras de placa por célula (MOI). Las células se recogieron 48 horas post-infección.

B. Purificación de KDR

Las células SF-9 que expresaban (His)_{6}KDR(aa7899-1354) se lisaron añadiendo 50 ml de tampón de lisis Triton X-100 (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 1%, PMSF 1mM, 10 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de leupeptina) al gránulo de células con 1 l de cultivo celular. El lisado se centrifugó a 19.000 rpm en un rotor Sorval SS-34 durante 30 minutos a 4ºC. El lisado celular se aplicó a una columna de 5 ml de sepharose quelante NiCl_{2}, equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3M. La KDR se eluyó usando el mismo tampón que contenía imidazol 0,25M. Las fracciones de la columna se analizaron usando SDS-PAGE y un ensayo ELISA (a continuación) que mide la actividad quinasa. La KDR purificada se intercambió en tampón HEPES 25 mM, pH 7,5, NaCl 25 mM, DTT 5 mM y se almacenó a -80ºC.

Producción y Purificación de Quinasa Humana Tie-2

La secuencia de codificación del dominio intracelular de la Tie-2 humana (aa775-1124) se generó mediante PCR usando ADNc aislado de placenta humana como plantilla. También se introdujo una secuencia poly-His_{6} en el extremo N de esta proteína y esta construcción se clonó en un vector de transfección pVL1939 en el sitio Xba 1 y Not 1. El BV recombinante se generó mediante cotransfección usando el reactivo de Transfección BaculoGold (PharMingen). El BV recombinante se purificó en placa y se verificó mediante análisis Western. Para la inducción de la proteína, se cultivaron células SF-9 en medio SF-900-II a 2 x 10^{6}/ml y se infectaron con un MOI de 0,5. La purificación de la quinasa marcada usada en el ensayo fue análoga a la descrita para KDR.

Producción y Purificación de Tirosina Quinasa Flt-1 Humana

Se usó el vector de expresión baculovírica pVL 1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA). Una secuencia de nucleótidos que codificaba poly-His6 se introdujo 5' en la región de nucleótidos que codifica todo el dominio intracelular quinasa de la Flt-1 humana (aminoácidos 786-1338). La secuencia de nucleótidos que codifica el dominio quinasa se generó por PCR usando bibliotecas de ADNc aisladas de células HUVEC. Los restos histidina permitieron la purificación por afinidad de la proteína de forma análoga a la de KDR y ZAP70. Se infectaron células de insectos SF-9 con una multiplicidad de 0,5 y se recogieron 48 horas después de la infección.

Fuente de la Tirosina Quinasa EGFR

La EGFR se compró en Sigma (Cat Nº E-3641; 500 unidades/50 \mul) y el ligando EGF se adquirió en Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat Nº PF011-100).

Expresión de ZAP70

Se usó el vector de expresión baculovírica pVL 1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA). La secuencia de nucleótidos que codificaba los aminoácidos M(H)6 LVPR_{9}S se introdujo 5' en la región de nucleótidos que codifica todo el ZAP70 (aminoácidos 1-619). La secuencia de nucleótidos que codifica la región de codificación de ZAP70 se generó por PCR usando bibliotecas de ADNc aisladas de células-T Jurkat inmortalizadas. Los restos histidina permitieron la purificación por afinidad de la proteína (vide infra). El puente LVPR_{9}S constituye una secuencia de reconocimiento para la escisión proteolítica con trombina, permitiendo la retirada del marcador de afinidad de la enzima. Se infectaron células de insectos SF-9 con una multiplicidad de 0,5 y se recogieron 48 horas después de la infección.

Extracción y Purificación de ZAP70

Las células SF-9 se lisaron en un tampón consistente en Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 137 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%, PMSF 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina y ortovanadato sódico 1mM. El lisado soluble se aplicó a una columna HiTrap de sepharose quelante (Pharmacia) equilibrada en HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,3 M. La proteína de fusión se eluyó con imidazol 250 mM. La enzima se almacenó en tampón que contenía HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM y DTT 5 mM.

Fuente de Lck

La Lck o formas truncadas de Lck pueden obtenerse en el mercado (por ejemplo, en Upstate Biotechnology Inc. (Saranac Lake, N.Y.) y Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)) o purificarse a partir de fuentes naturales o recombinantes usando métodos convencionales.

Fuente de Cdc2

La enzima recombinante y el tampón de ensayo pueden obtenerse en el mercado (New England Biolabs, Beverly, MA. USA) o purificarse a partir de fuentes naturales o recombinantes usando métodos convencionales.

Ensayo Cdc2

El protocolo usado fue el proporcionado por los reactivos comprados con modificaciones menores. En resumen, la reacción se realizó en un tampón que consistía en Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EGTA 1 mM, DTT 2 mM, 0,01% Brij, 5% DMSO y MgCl_{2} 10 mM (tampón comercial) suplementado con ATP 300 \muM (31 \muCi/ml) y 30 \mug/ml de histona tipo IIIss en concentraciones finales. Un volumen de reacción de 80 \mul, que contenía unidades de la enzima, se ensayó durante 20 minutos a 25 grados C en presencia o ausencia de inhibidor. La reacción se terminó por adición de 120 \mul de ácido acético al 10%. El sustrato se separó del marcador uniincorporado extendiendo la mezcla en papel de fosfocelulosa, seguido de 3 lavados de 5 minutos cada uno con ácido fosfórico 75 mM. Las cuentas se realizaron con un betacounter en presencia de líquido escintilante.

Ciertos compuestos de esta invención inhiben significativamente cdc2 en concentraciones por debajo de 50 \muM.

Fuente de Quinasa PKC

La subunidad catalítica de PKC puede obtenerse en el mercado (Calbiochem)

Ensayo con Quinasa PKC

Se empleó un ensayo radioactivo con quinasa siguiendo un procedimiento publicado (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y. Biochemical and Biophysical Research Communication 3:166, 1220-1227 (1990)). En resumen, todas las reacciones se realizaron en un tampón quinasa consistente en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2mM, EGTA 1mM, ATP 100 \muM, péptido 8 \muM, 5% DMSO y ^{33}P ATP (8Ci/mM). El compuesto y la enzima se mezclan en el recipiente de reacción y la reacción se inicia por adición de la mezcla de ATP y sustrato. Después de la terminación de la reacción por adición de 10 \mul de tampón de parada (ATP 5 mM en ácido fosfórico 75 mM), una porción de la mezcla se extendió en filtros de fosfocelulosa. Las muestras extendidas se lavaron 3 veces en ácido fosfórico 75 mM a temperatura ambiente durante 5 a 15 minutos. La incorporación del radiomarcador se cuantificó por recuento por escintilación líquida.

Fuente de la Enzima Erk2

La enzima murina recombinante y el tampón del ensayo pueden obtenerse en el mercado (New England Biolabs, Beverly MA, USA) o purificarse a partir de fuentes naturales o recombinantes usando métodos convencionales.

Ensayo con enzima Erk2

En resumen, la reacción se realizó en un tampón consistente en Tris 50 mM pH 7,5, EGTA 1 mM, DTT 2 mM, 0,01% Brij, 5% DMSO y MgCl_{2} 10 mM (tampón comercial) suplementado con ATP 100 \mum fresco (31 \muCi/ml) y 30 proteína básica de mielina 30 \muM en las condiciones recomendadas por el fabricante. Los volúmenes de reacción y el método de análisis de la radioactividad incorporada fueron los descritos para el ensayo con PKC (vide supra).

C. Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA)

Pueden usarse ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para detectar y medir la presencia de actividad tirosina quinasa. El ELISA puede realizarse de acuerdo con protocolos conocidos que se describen, por ejemplo, en Voller y col., 1980, "Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay", en: Manual of Clinical Immunology, 2º ed, editado por Rose y Friedman, pág. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

El protocolo descrito puede adaptarse para determinar la actividad con respecto a una RTK específica. Por ejemplo, a continuación se proporcionan los protocolos preferidos para realizar los experimentos ELISA para KDR. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de otros miembros de la familia RTK, así como de tirosina quinasas no receptoras, forman parte de la capacidad de los especialistas en la técnica.

ELISA In Vitro para KDR

El siguiente procedimiento se usó para evaluar el efecto inhibidor de los compuestos de esta invención en la actividad de la tirosina quinasa KDR.

Tampones y Soluciones

PGT: Poly (Glu, Tyr) 4:1

Almacenar polvo a -20ºC. Disolver el polvo en tampón de solución salina fosfatada (PBS) en solución 50 mg/ml. Almacenar alícuotas de 1 ml a -20ºC. Al preparar las placas, diluir a 250 \mug/ml en Gibco PBS.

Tampón de Reacción

Hepes 100 mM, MgCl_{2} 20 mM, MnCl_{2} 4 mM, DTT 5 mM, 0,02% VS, NaVO_{4} 200 \muM, pH 7,10

ATP

Almacenar alícuotas de 100 mM a -20ºC. Diluir a 20 \muM en agua.

Tampón de Lavado

PBS con 0,1% de Tween 20

Tampón de Dilución de Anticuerpos

Albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1% en PBS

Sustrato TMB

Mezcla sustrato TMB y soluciones 9:1 de peróxido justo antes de usar o usar K-Blue Substrate de Neogen.

Solución de Parada

Ácido fosfórico 1M.

Procedimiento 1. Preparación de Placa

Diluir solución madre PGT (50 ml/ml, congelada) en PBS a 250\mug/ml. Añadir 125 \mul por pocillo en placas ELISA de alta afinidad con fondo liso modificado de Corning (Corning #25805-96). Añadir 125 \mul de PBS a los pocillos vacíos. Cubrir con cinta aislante e incubar durante una noche a 37ºC. Lavar 1x con 250 \mul de tampón de lavado y secar durante aproximadamente 2 horas en un incubador seco a 37ºC.

Almacenar las placas cubiertas en una bolsa cerrada herméticamente a 4ºC hasta su uso.

2. Reacción con Tirosina Quinasa

- Preparar soluciones de inhibidor a concentración 4x en DMSO al 20% en agua.

- Preparar tampón de reacción

- Preparar solución de enzima de forma que se tengan las unidades deseadas en 50 \mul, por ejemplo para KDR hacer 1 ng/\mul para un total de 50 ng por pocillo en las reacciones. Almacenar en hielo.

- Preparar solución de ATP 4x a 20 \muM con solución madre 100 mM en agua. Almacenar en hielo.

- Añadir 50 \mul de la solución de enzima por pocillo

- Añadir 25 \mul de inhibidor 4x

- Añadir 25 \mul de ATP 4x para ensayo de inhibidor

- Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente

- Parar la reacción añadiendo 50 \mul de HCl 0,05N por pocillo.

- Lavar la placa

** Concentraciones Finales para la Reacción

ATP : 5 \muM

DMSO 5%

3. Unión a Anticuerpos

- Diluir un alícuota de 1 mg/ml de anticuerpo PY20-HRP (Pierce) a 50 ng/ml en BSA al 0,1% en PBS mediante una dilución en dos etapas (100x, después 200x).

- Añadir 100 \mul de Ab por pocillo. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Incubar 1 hora a 4ºC.

- Lavar la placa 4x.

4. Reacción de Color

- Preparar sustrato TMB y añadir 100 \mul por pocillo

- Observar la OD a 650 nm hasta que se alcanza 0,6

- Parar con ácido fosfórico 1M. Agitar en un lector de placas.

- Leer OD inmediatamente a 450 nm.

Los tiempos óptimos de incubación y condiciones de reacción enzimáticas varían ligeramente con las preparaciones de enzimas y se determinan empíricamente para cada lote.

Para Lck, el Tampón de Reacción utilizado fue MOPSO 100 mM, pH 6,5, MnCl_{2} 4 mM, MgCl_{2} 20 mM, DTT 5 mM, BSA al 0,2% NaVO_{4} 200 mM, en condiciones de ensayo análogas.

Los compuestos de fórmula I pueden tener utilidad terapéutica en el tratamiento de enfermedades que implican tirosina quinasas identificadas, incluyendo aquellas no mencionadas en este documento y tirosina quinasas no identificadas que se inhiben con compuestos de fórmula I. Todos los compuestos ejemplificados en este documento inhiben significativamente la KDR quinasa a concentraciones de 50 mM o menor. Algunos compuestos de esta invención también inhiben significativamente otras PTK tales como lck a concentraciones de 50 mM o menos.

Resultados

Se obtuvo la siguiente concentración inhibidora de un compuesto representativo:

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Estos resultados demuestran que los compuestos de la presente invención tienen una actividad inhibidora notable de la tirosina quinasa KDR así como de otras quinasas.

Modelos de Activación de Células T In Vitro

Tras la activación con mitógeno o antígeno, se induce a las células T a secretar IL-2, un factor de crecimiento que apoya su posterior fase proliferativa. Por lo tanto, se puede medir la producción de IL-2 o la proliferación celular de células T primarias o líneas de células T apropiadas como sustitutas de la activación de células T. Ambos ensayos están descritos en la literatura y sus parámetros bien documentados (en Current Protocols of Immunology, Vol 2, 7.10.1-7.11.2)

En resumen, las células T pueden activarse por cocultivo con células alogénicas estimuladoras, un proceso denominado reacción de linfocitos mixtos de un sentido. Las células mononucleares de sangre periféricas de respuesta y de estimulación se purifican con un gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células de estimulación se inactivan mitóticamente por tratamiento con mitomicina C (Sigma) o irradiación gamma. Las células de respuesta y de estimulación se co-cultivan con una relación de dos a una en presencia o ausencia de compuesto de prueba. Típicamente, se mezclan 10^{5} células de respuesta con 5 x 10^{4} células de estimulación y se introducen en placas (volumen de 200 \mul) en placas de microtitulación con fondo en forma de U (Costar Scientific). Las células se cultivan a RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor (Hyclone Laboratories) o suero humano AB de donantes masculinos, 5 x 10^{-5}M 2-mercaptoetanol y 0,5% de DMSO. Los cultivos se someten a impulsos con 0,5 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham) un día antes de la recogida (típicamente día tres). Los cultivos se recogen (Betaplate harvester, Wallac) y la absorción de isótopo se evalúa por escintilación líquida (Betaplate, Wallac). El mismo cultivo puede usarse para evaluar la activación de células T para la medición de la producción de IL-2. De dieciocho a veinticuatro horas después del inicio del cultivo, los sobrenadantes se retiran y la concentración de IL-2 se mide por ELISA (Sistemas D y R) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Modelos de Activación de Células T In Vivo

La eficacia in vivo de los compuestos puede probarse en modelos animales que se conoce que miden la activación de las células T o para los cuales las células T han demostrado ser eficaces. Las células T pueden activarse in vivo por unión de la porción constante del receptor de la célula T con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Ab). En este modelo, se administra a ratones BALB/c 10 \mug de ani-CD3 ab intraperitonealmente dos horas antes de la exsanguinación. Los animales que reciben un fármaco de prueba se pretratan con una única dosis del compuesto una hora antes de la administración de anti-CD3 Ab. Los niveles en suero de las citoquinas proinflamatorias interferon-\gamma (IFN-\gamma) y factor-\alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha), indicadores de la activación de las células T, se miden con ELISA. Un modelo similar emplea cebadores de célula T in vivo con un antígeno específico tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) seguido de un ensayo secundario in vitro de células de nodos linfáticos de drenaje con el mismo antígeno. Como se ha indicado anteriormente, la medición de la producción de citoquina se usa para evaluar la activación de las células cultivadas. En resumen, los ratones C57BL/6 se inmunizan de forma subcutánea con 100 \mug de KLH emulsionada en adyuvante de Freund completo (CFA) en día cero. Los animales se pretratan con el compuesto un día antes de la inmunización y posteriormente en los días uno, dos y tres después de la inmunización. Los nodos linfáticos de drenaje se recogen el día 4 y sus células se cultivan con una concentración de 6 x 10^{6} por ml en medio de cultivo de tejido (RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor (Hyclone Laboratories), 5 x 10^{-5}M 2-mercaptoetanol y 0,5% de DMSO) durante veinticuatro y cuarenta y ocho horas. Los sobrenadantes del cultivo se evalúan posteriormente para medir los niveles del factor de crecimiento autocrino de célula T Interleuquina-2 (IL-2) y/o IFN-\gamma mediante ELISA.

Los compuestos de plomo también pueden ensayarse en modelos animales de enfermedades humanas. Estos se ejemplifican con la encefalomielitis auto-inmune experimental (EAE) y artritis inducida con colágeno (CIA). Los modelos de EAE que imitan aspectos de la esclerosis múltiple humana se han descrito en ratas y ratones (revisado FASEB J. 5:2560-2566, 1991; modelo murina: Lab. Invest. 4(3):278, 1981; modelo en roedores: J. Immunol 146(4):1163-8, 1991). En resumen, las ratas o ratones se inmunizan con una emulsión de proteína básica de mielina (MBP) o derivados de péptidos neurogénicos de la misma, y CFA. Las enfermedades agudas pueden inducirse con la adición de toxinas bacterianas tales como bordetella pertussis. La enfermedad recurrente/remitente se induce por la transferencia inductiva de células T de animales inmunizados con MBP/péptido.

La CIA puede inducirse en ratones DBA/1 por inmunización con colágeno de tipo II (J. Immunol:142(7):2237-2243). Los ratones desarrollarán signos de artritis tan pronto como en diez días después del ensayo con antígeno y puede apreciarse hasta noventa días después de la inmunización. En ambos modelos de EAE y CIA, puede administrarse un compuesto profilácticamente o en el momento de aparición de la enfermedad. Los fármacos eficaces deberían reducir la gravedad y/o incidencia.

Ciertos compuestos de esta invención que inhiben una o más PTK receptoras angiogénicas y/o una proteína quinasa tal como lck implicada en la mediación de respuestas inflamatorias puede reducir la gravedad e incidencia de artritis en estos modelos.

Los compuestos también pueden probarse en modelos de implantes en ratones, de piel (revisado en Ann. Rev. Immunol., 10:333-58, 1992; Transplantation: 57 (12): 1701-17D6, 1994) o corazón (Am. J. AM Nat.:113:273, 1963). En resumen, se transplantan implantes de piel de espesor completo de ratones C57BL/6 a ratones BALB/C. Los implantes se examinan diariamente, comenzando el día seis, para detectar evidencia de rechazo. En el modelo de transplante de corazón en ratones neonatales, los corazones neonatales se transplantan ectópicamente de ratones C57BL/6 en el pabellón auditivo de ratones CBA/J adultos. Los corazones comienzan a latir de cuatro a siete días después del transplante y el rechazo puede evaluarse visualmente usando un microscopio de disección para detectar el cese del
latido.

Ensayos de PTK del Receptor Celular

El siguiente ensayo celular se usó para determinar el nivel de actividad y el efecto de los distintos compuestos de la presente invención en KDR/VEGFR2. Pueden diseñarse ensayos con PTK del receptor similares que emplean un ligando específico en la misma línea para otras tirosina quinasas usando técnicas conocidas en la técnica.

Fosforilación de KDR Inducida con VEGF en Células Endoteliales de la Vena Umbilical Humana (HUVEC) Medida por Transferencias Western.

1. Se adquirieron células HUVEC (de un grupo de donantes) en Clonetics (San Diego, CA) y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para este ensayo, sólo se usaron los primeros pases (3-8). Las células se cultivaron en platos de 100 mm (Falcon para tejido de cultivo; Becton Dickinson; Plymouth, England) usando medio EBM completo (Clonetics).

2. Para evaluar la actividad inhibidora de un compuesto, las células se tripsinizaron y sedimentaron a 0,5-1,0 x 10^{5} células/pocillo en cada pocillo de placas cluster de 6-pocillos (Costar; Cambridge, MA).

3. 3-4 días después de la sedimentación, las placas eran confluentes al 90-100%. El medio se retiró de todos los pocillos, las células se aclararon con 5-10 ml de PBS y se incubaron 18-24 horas con 5 ml de medio base EBM sin suplementos añadidos (es decir, privación de suero).

4. Se añadieron diluciones en serie en 1 ml de medio EBM (concentraciones finales de 25 \muM, 5 \muM o 1\muM) a las células y se incubaron durante una hora a 37ºC. Después se añadió VEGF_{165} recombinante humano (R&D Systems) a todos los pocillos en 2 ml de medio EBM en concentraciones finales de 50 ng/ml y se incubaron a 37ºC durante 10 minutos. Se usaron células de control no tratadas o tratadas solo con VEGF para evaluar la fosforilación en background y la inducción de la fosforilación de VEGF. Todos los pocillos se aclararon con 5-10 ml de PBS frío que contenían Ortovanadato Sódico 1 mM (Sigma) y las células se lisaron y rasparon en 200 \mul de tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM) pH 7, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,25% de desoxicolato sódico, EDTA 1 mM) que contiene inhibidores de proteasa (PMSF 1 mM, aprotinina 1 \mug/ml, pepstatina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml, vanadato sódico 1 mM, fluoruro sódico 1 mM) y 1 \mug/ml de Dnasa (todos los productos químicos de Sigma Chemical Company, St Louis, MO). El lisado se centrifugó a 14.000 rpm durante 30 minutos para eliminar los núcleos

Posteriormente precipitaron cantidades iguales de proteínas por adición de etanol frío (-20ºC) durante un mínimo de 1 hora o un máximo de una noche. Los gránulos se reconstituyeron en tampón de muestra Laemli que contenía \beta-mercaptoetanol al5% (BioRad; Hercules, CA) e hirvieron durante 5 minutos. Las proteínas se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida (6%, 1,5 mm, Novex, San Diego, CA) y se traspasaron a una membrana de nitrocelulosa usando el sistema Novex. Después de bloquear con albúmina de suero bovino (3%), las proteínas se sondearon durante una noche con anticuerpo policlonal anti-KDR (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) o con anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina (4G10, Upstate Biotechnology; Lake Placid, NY) a 4ºC. Después de lavar e incubar durante 1 hora con F(ab)_{2} conjugado con HRP de IgG de cabra anti-conejo o cabra-anti-ratón las bandas se visualizaron usando el sistema de quimioluminiscencia por emisión (ECL) (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).

Ciertos ejemplos de la presente invención inhiben significativamente la fosforilación celular de la KDR tirosina quinasa inducida con VEGF en concentraciones menores de 50 \muM.

Modelo In Vivo de Edema Uterino

Este ensayo demuestra la capacidad de los compuestos para inhibir le aumento agudo en el peso del útero de ratones que tiene lugar en las primeras horas después de la estimulación con estrógenos. Se conoce que la pronta aparición de aumento de peso uterino se debe a un edema causado por la mayor permeabilidad de la vasculatura uterina. Cullinan-Bove y Koss (Endocrinology (1993), 133:829-837) demostraron una relación temporal cercana del edema uterino estimulado con estrógenos con la mayor expresión de ARNm de VEGF en el útero. Estos resultados se han confirmado con el uso de anticuerpo monoclonal neutralizante para VEGF, lo que redujo significativamente el aumento agudo en el peso del útero después de la estimulación con estrógenos (WO 97/42187). Por tanto, este sistema puede servir como modelo para la inhibición in vivo de la señalización de VEGF y la hiperpermeabilidad y edema asociados.

Materiales: Todas las hormonas se compraron en Sigma (St. Louis, MO) o Cal Biochem (La Jolla, CA) en forma de polvos liofilizados y se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los componentes del vehículo (DMSO, Cremaphor EL) se compraron en Sigma (St. Louis, MO).

Los ratones (Balb/C, 8-12 semanas) se compraron en Taconic (Germantown, NY) y se alojaron en instalaciones para animales sin patógenos de acuerdo con las Pautas del Comité para el Uso y Cuidado de los Animales.

Método:

Día 1: Se administra a los ratones Balb/c una inyección intraperitoneal de 12,5 unidades de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG)

Día 3: Los ratones recibieron 15 unidades de gonadotropina coriónica humana (hCG) i.p.

Día 4: Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos de 5-10. Los compuestos de prueba se administran por vía i.p, i.v. o p.o. dependiendo de la solubilidad y vehículo en dosis en el intercalo de 1-00 mg/kg. El grupo de control con vehículo recibió solo vehículo y dos grupos se dejaron sin tratar.

Treinta minutos después, a los grupos experimentales, vehículo y a 1 de los no tratados se les dio una inyección i.p. de 17\beta-estradiol (500 \mug/kg). Después de 2-3 horas, los animales se sacrificaron por inhalación de CO_{2}. Después de realizar una incisión en la línea media, cada uno de los úteros se aisló y retiró cortando justo por debajo del cérvix y en las uniones del útero y los oviductos. El tejido graso y conectivo se retiró tomando precauciones para no romper la integridad del útero antes de pesarlo. Los pesos medios de los grupos tratados se compararon con los grupos no tratados o tratados con vehículo. La significancia se determinó mediante un análisis de t de Student. El grupo de control no estimulado se usó para controlar la respuesta con estradiol.

Los resultados demuestran que ciertos compuestos de la presente invención inhiben la formación de edema cuando se administran sistémicamente por distintas vías.

Ciertos compuestos de esta invención que son inhibidores de las tirosina quinasas receptoras angiogénicas también pueden mostrase activos en un modelo de implante de Matrigel de neovascularización. El modelo de neovascularización Matrigel implica la formación de nuevos vasos sanguíneos en un "mármol" transparente de matriz extracelular implantada subcutáneamente que se induce por presencia de un factor proangiogénico que produce células tumorales (como ejemplos véanse: Passaniti, A., y col., Lab. Investig. (1992), 67(4), 519-528; Anat. Rec. (1997), 249(1), 63-73; Int. J. Cancer (1995), 63(5), 694-701; Vasc. Biol. (1995), 15(11), 1857(6). El modelo se ensaya preferiblemente durante 3-4 días y los objetivos incluyen evaluación visual/macroscópica de neovascularización, determinaciones microscópicas de la densidad de microvasos y cuantificación de hemoglobina (método Drabkin) después de la retirada del implante frente a controles en animales no tratados con inhibidores. El modelo puede emplear alternativamente bFGF o HGF como estímulo.

Ciertos compuestos de esta invención que inhiben una o más proteínas quinasas oncogénicas, protooncogénicas o dependientes de la proliferación o PTK de receptores angiogénicos también inhiben el crecimiento de tumores de xenoimplantes primarios de ratón, ratas o humanos en ratones o inhiben la metástasis en modelos de ratón.

Equivalentes

Aunque la invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas de la misma, los especialistas en la técnica deben apreciar que pueden realizarse distintos cambios en la forma y en los detalles sin desviarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los especialistas en la técnica apreciarán o podrán reconocer sin usar más que experimentos rutinarios, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descrita específicamente en este documento. Se pretende que tales equivalentes estén incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (14)

1. El uso de un compuesto representado por una de las fórmulas:

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para la fabricación de un medicamento en concentración suficiente para inhibir una o más actividades proteína quinasa, donde

X es oxígeno o azufre;

el anillo A representa las estructuras:

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n es 1 ó 2;

Ar es

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y

R^{1} es hidrógeno, metilo, COR^{3} o SO_{2}R^{3};

R^{2} representa un halógeno que tiene un peso atómico de aproximadamente 19 a 36;

y

R^{3} es -CH_{3} o

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donde Y es hidrógeno, cloro o -CH_{3}.

2. El uso de la Reivindicación 1, en la que dicho compuesto está en forma estereoisomérica o es una mezcla de estereoisómeros.

3. El uso de la Reivindicación 1, en la que dicho compuesto está en mezcla con uno o más compuestos distintos.

4. El uso de la Reivindicación 1, en la que dicha proteína quinasa es una tirosina quinasa receptora o una tirosina quinasa no receptora.

5. El uso de la Reivindicación 4, en el que dicha tirosina quinasa se selecciona entre el grupo compuesto por KDR, Flt-1, TIE-2, Lck, Src, Fyn y yes.

6. El uso de la Reivindicación 1, en el que la actividad de dicha proteína quinasa afecta a la angiogénesis.

7. El uso de la reivindicación 6, donde la inhibición de dicha proteína quinasa es anti-angiogénica.

8. El uso de la Reivindicación 7, en el que dicha inhibición de dicha proteína quinasa inhibe la progresión de una enfermedad seleccionada entre el grupo compuesto por cáncer, artritis, aterosclerosis, psoriasis, hemangiomas, angiogénesis miocárdica, lesiones colaterales coronarias y cerebrales, angiogénesis isquémica en los miembros, enfermedad corneal, rubeosis, glaucoma neovascular, degeneración macular, curación de heridas, úlcera péptica, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas y fiebre por arañazo de gato.

9. El uso de la Reivindicación 1, en el que la actividad de dicha proteína quinasa afecta a la hiperpermeabilidad vascular o la producción de edema.

10. El uso de la Reivindicación 9, en el que la inhibición de dicha proteína quinasa es antiedematosa.

11. El uso de la Reivindicación 10, en el que la inhibición de dicha proteína quinasa inhibe la progresión de una enfermedad seleccionada entre el grupo compuesto por quemaduras, enfermedad crónica pulmonar, ataques, pólipos, psoriasis, inflamación alérgica, degeneración macular, retinopatía diabética, síndrome de hiperestimulación ovárica y edema cerebral asociado con tumor cerebral.

12. El uso de la Reivindicación 1, en el que dicha proteína quinasa es una serina quinasa.

13. El uso de la Reivindicación 1, en el que dicha proteína quinasa es una treonina quinasa.

14. El uso de la Reivindicación 1, en el que dicho compuesto es

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