DE69126563T2 - Verwendung einer Mischung von Peptiden and Aminosäuren für die Prophylaxis oder Behandlung von Dementia - Google Patents

Description

• Auf der Basis der Erkenntnisse, wonach die vorliegende Erfindung sich auf eine bioaktive Substanz bezieht, die eine Aktivität zur Förderung der Neuroaxonbildung auf Ganglionzellen zeigt, werden neue pharmazeutische Anwendungen geschaffen. Im speziellen wurde gefunden, daß ein Gemisch aus Peptiden, das durch kontrollierten enzymatischen Abbau der Schweinehirn-Proteinfraktion hergestellt worden ist, und von Aminosäuren eine Aktivität zur Förderung der Neuroaxonbildung auf Ganglionzellen aufweist. Darüber hinaus zeigt diese bioaktive Substanz Aktivität als ein Nervennährfaktor gegenüber den zentralen Nervenzellen, insbesondere cholinreaktiven Nervenzellen. Im speziellen wurde gefunden, daß das Gemisch von Peptiden und Aminosäuren, das durch kontrollierten enzvmatischen Abbau der Schweinehirn- Proteinfraktion erhältlich ist, eine Aktivität als Nervennährfaktor für zentrale Nervenzellen, die mit Dementia in engem Zusammenhang stehen, ausübt, insbesondere gegenüber cholinreaktiven Nervenzellen, und zwar über Verabreichungswege, die für klinische Anwendungen leicht zugänglich sind, d. h. intravenös, oral, intramuskulär oder subkutan.
• Das Gemisch aus Peptiden und Aminosäuren in der vorliegenden Erfindung enthält etwa 5 % Peptide mit einem Molekulargewicht von 10.000 oder darunter und etwa 85 % freie Aminosäuren. Dieses Gemisch steht in Österreich bereits in praktischer Anwendung für die Behandlung von zerebraler vaskulärer Metabolismusinsuffizienz, leichter infantiler Atelencephalie, zerebraler Apoplexie, zerebraler Contusion usw. Es handelt sich um ein Gemisch aus Peptiden und Aminosäuren wie Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Trypthophan, Cystein, Valin und Thyrosin.
• Wenn Änderungen in Nervenzellen auftreten, die die Zerebrumfunktionen unterstützen, sowie in deren faserigen Verbindungen, treten Symptome von Dementia auf. Es wird angenommen, daß Dementia durch die Faktoren der Verringerung der Nerventransmissionssubstanzen induziert wird, wie Acetylcholin, Serotinin und Noradrenalin, durch Anderungen in den Neurofibrilen und durch das Verschwinden von Nervenzellen.
• Es ist bekannt, daß dann, wenn Nervenzellen in Temporallappen, Parietallappen und Frontallappen verringert werden und wenn in dem Dendriten bezeichneten Teil feststellbare Änderungen auftreten, welche die Stimuh unterhalten, die Synapse, die Verbindung, an welche Fasern von anderen Nervenzellen geknüpft sind, verringert wird. Solche Faktoren, wie eine Zunahme von Acetylcholin und ein gesteigertes Nervenwachstum, insbesondere eine Neuroaxonbildung, kann zu einer Inhibierung des Auftretens von Dementia führen.
• Zur Zeit ist die Etiologie von Dementia noch nicht aufgeklärt. Versuche stehen in Bedrängnis hinsichtlich der Behandlung von Parkinson-Krankheit mittels der ergänzenden Verabreichung von Nerventransmissionssubstanzen und hinsichtlich der Behandlung von Dementia mittels Inhibitoren gegen Enzyme, die Nerventransmissionssubstanzen zersetzen.
• Vor diesem Hintergrund stand ein Nervennährfaktor einschließlich Neuroaxonwachstumsfaktor (neuroaxon growth factor, NGF) kürzlich im Rampenlicht, in dem Maße, daß er sogar als ein Hauptforschungsthema für eine Studie über Antidementiamittel angenommen werden würde.
• Im Hinblick auf die Tatsache, daß cholinreaktive Nervenzellen im Vorderhirn-Basalganglion stark mit der Gedächtnisfunktion in Verbindung stehen, daß bei der Alzheimer Krankheit eine bemerkenswerte Degeneration und Abnahme dieser Zellen beobachtet wird und daß Dementia möglicherweise dadurch verursacht werden kann, könnte der Schutz von cholinreaktiven Nervenzellen im Vorderhirn-Basalganglion durch eine Verabreichung der Nervennährf aktoren einschließlich NGF die Therapie zur direkten Eliminierung der Ursache von Dementia sein, ungleich der palliativen antisymptomatischen Therapie. Im Hinblick auf das zunehmende Alter der Gesellschaft sollte die Entwicklung von Arzneimitteln mit solchen Aktivitäten eine dringende Aufgabe von hoher Priorität sein.
• Eine Studie über NGF ist derzeit schon weit fortgeschritten. Die bei seiner Verabreichung in den Zerebralventrikel bisher erzielten Ergebnisse zeigten, daß NGF eine Aktivität zum Schützen der Septalzellen bei einer Ratte aufweist, bei welcher das Corpus fimbriatum inzisiert worden ist, daß er eine Aktivität zur Herbeiführung einer Besserung in Labyrinthtests aufweist und daß er eine Aktivität zur Verbesserung der Gedächtnisfuhktion bei einer alten Ratte in dem Maße zeigt, daß keine Abnormalität auftritt.
• Das Molekulargewicht von NGF ist jedoch so groß, daß er das Hirninnere auf üblichen Verabreichungswegen nicht erreichen kann. Die vorstehend angeführten Aktivitäten können nur dann auftreten, wenn NGF einen unmittelbaren Zugang zum Hirninneren hat, und eine derartige Verabreichungsmethode darf in der klinischen Praxis nicht angewandt werden.
• Unter diesen Umständen besteht ein Bedarf nach einem Arzneimittel mit einem Nervennährfaktor, das für die klinische Behandlung nützlich sein kann.
• Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, nachzuweisen, daß neue Anwendungen für ein bekanntes Produkt geschaffen werden können, das bereits in klinischer Verwendung steht. Die neuen Anwendungen zielen auf die Prophylaxe oder Behandlung von Dementia auf der Basis der neuen Erkenntnisse, daß dieses bekannte Produkt Aktivitäten zur Steigerung von Acetylcholin, einer Nerventransmissionssubstanz, und zur Neuroaxonvermehrung hat. Darüber hinaus wird die klinische Anwendung des bekannten Produktes durch einfache Verabreichungswege zum Schützen von acetylcholinreaktiven Nervenzellen im Gehirn, die eine enge Verknüpfung mit dem Gedächtnis haben, und zur Aufrechterhaltung der Gedächtnisfunktion ermöglicht. Darüber hinaus wird auf der Basis der neuen Erkenntnisse, daß eine Degeneration und ein Abbau von acetylcholinreaktiven Nervenzellen im Gehirn eines Tieres mit experimentell induzierter Dementia verhindert werden kann, die Anwendung des bekannten Produktes zur Vermeidung und Behandlung von Dementia indiziert sein.
• Es ist allgemein bekannt, daß die Nervenzellen in Meinnert's Basalnudeus, Septalnudeus und Hippocampus durch das Kommunikationsnetzwerk mit dem Gehirn in enger Verbindung zur Gedächtnisfunktion stehen. Besonders sei darauf hingewiesen, daß der Abbau dieser cholinreaktiven Nervenzellen in Dementia-Fällen vom Alzheimer-Typ bemerkenswert ist. Es ist äußerst wichtig, diese Nervenzellen durch die Anwendung von Nervennährfaktoren aufrechtzuerhalten, um Dementia zu verhindern, doch ist eine derartige Therapie bisher nicht bekannt gewesen.
• Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Anwendung zur Verfügung.
• Die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung wurde im Vergleich mit NGF (Neuroaxonwachstumsfaktor) und anderen Substanzen ermittelt.
• Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung wurde intravenös auf intraperitonealem Wege in die Septalnudeus-Zellen verabreicht, wobei die Zufuhr von NGF (ein Neuroaxonwachstumsfaktor: einer der Nervennährfaktoren) vom Hippocampus durch Inzision der Fimbria fornix zwischen dem Hippocampus und dem Septalnudeus unterbrochen war, und als Ergebnis wurde eine Verbesserung in der Degeneration und dem Abbau von Septalnudeus-Zellen beobachtet.
• Die in der vorliegenden Erfindung verwendete bioaktive Substanz, die durch enzymatische Hydrolyse von Schweinehirn- Proteinfraktion erhalten wird, kann von der Patentinhaberin unter der Handelsbezeichnung Cerebrolysin bezogen werden. Ein ml dieses Arzneimittels enthält 3,00 mg Alanin, 0,25 mg Arginin, 3,00 mg Asparaginsäure, 0,06 g Cystin, 4,30 mg Glutaminsäure, 1,50 mg Glycin, 1,30 mg Histidin, 2,00 mg Isoleucin, 6,00 mg Leucin, 0,50 mg Methionin, 2,00 mg Phenylalanin, 2,00 mg Prolin, 0,30 g Serin, 0,30 g Threonin, 0,50 g Tryptophan und 2,00 mg Thyrosin als Aminosäuren sowie als Peptide mit einem Molekulargewicht von 10.000 oder darunter; vergleiche Erika Bayer (1980), Medizinische Welt, Band 31, Nr. 17, Seiten 636-637 und Chemical Abstracts Band 103, 1985, Seite 94, Referat 103:135149w.
• Das Ganglion in der hinteren Wurzel des Spinalnervs von Hühnerembryos wurde aus 10-12 Tage alten Eiern entnommen und in einer Phosphorsäurepufferlösung (PBS) suspendiert, die keine Ca²&spplus;- und keine Mg²&spplus;-Ionen enthielt. Es wurde mit 0,1 % Trypsin etwa 40 Minuten bei 37ºC behandelt und 5 Minuten lang bei 1500 UpM zentrifugiert. Zu den so gesammelten Zellen wurde Eagle- MEM-Medium zugesetzt, der Überstand wurde entfernt und das Gemisch wurde pipettiert, um die Zellen zu verteilen. Die so erhaltenen Zellensuspensionen wurden durch ein Nylonmaschenfilter filtriert, in eine Kunststoffschale transferiert und etwa 2 Stunden lang in einem 5 % CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC bebrütet. Dann wurden nichtanhaftende Zellen für einen Versuch gesammelt.
• Die bioaktive Substanz Cerebrolysin wurde in einer Phosphorsäurepufferlösung (PBS) in einem Verhältnis von 10:100, 20:100, 40:100 und 80:100 verdünnt. Zu Vergleichszwecken wurde der Neuroaxiswachstumsfaktor (NGF) in Konzentrationen von 12,5 ng/100 µl, 25,0 ng/100 µl und 50,0 ng/100 µl bereitet, und ebenso wurde jede in Cerebrolysin enthaltene Aminosäure im Phosphorsäurepuffer (eine Aminosäurelösung) in den gleichen Konzentrationen wie Cerebrolysin suspendiert. Zusätzlich wurde Solcoseryl (Taiho Pharmaceutical) verwendet, verdünnt in PBS in einem Verhältnis von 10:100, 20:100, 40:100 und 80:100.
• Dieses Arzneimittel wird übrigens in einer Menge von 1-30 ml direkt auf intravenösem Weg oder als intravenöse Tropflösung zusammen mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einer Nährlösung wie einer Glucose enthaltenden Lösung verabreicht.
• In einem anderen Versuch wurden betäubte Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g am Hirnfixierungsstand fixiert und die Fimbria fornix wurde an beiden Seiten abgesaugt, um den Weg zwischen dem Hippocampus und dem Septalnudeus zu unterbinden.
• Die so behandelten Tiere wurden hinsichtlich der Cerebrolysin-Verabreichungsdauer in 5 Gruppen unterteilt: die 0-Wochengruppe, die 1-Wochengruppe, die 2-Wochengruppe, die 3-Wochengruppe und die 4-Wochengruppe. Nachdem die so vorgesehene Verabreichung in jeder Gruppe vollendet war, wurde durch das Herz eine Kanüle eingeführt. Das Blut wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung entfernt und dann, bei fixiertem Gehirn, mit einer 4 %igen Paraformaldehyd-Phosphorsäurepuffer-physiologischen Kochsalzlösung refluxiert. Das Gehirn wurde dann über Nacht an einem kühlen Platz in einer 10 %igen Saacharoselösung aufbewahrt. Es wurde ein 40 µm starker Dünnschnitt bereitet und auf eine Glasplatte aufgebracht.
• Der so erhaltene Schnitt wurde mit einer Anticholinacetyltransferase behandelt und nach der ABC-Methode angefärbt. Nach der Aufnahme einer photographischen Abbildung wurde die Zahl der angefärbten Nervenzellen gezählt und die Größe dieser Zellen wurde gemessen.
• Dieses Arzneimittel kann so formuliert werden, daß es unmittelbar intravenös in einer Menge von 1-30ml injiziert werden kann, oder daß es zusammen mit einer physiologischen Kochsalzlösung oder einer Glucoselösung eingetropft werden kann, oder daß es intramuskulär in einer Menge von 1-5 ml injiziert werden kann.
• Für eine deutlichere Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Beispiele angeführt.
Beispiel 1:
• Das Ganglion in der hinteren Wurzel des Spinalnervs wurde aus zwei 10-12 Tage alten Hühnerembryos herausgeschnitten und in 2 ml PBS (Phosphorsäurepufferlösung, die keine Ca²&spplus;-und Mg²&spplus;-Ionen enthält) gesammelt. Das so gesammelte Ganglion wurde in 5ml PBS transferiert, die 0,1 % Trypsin enthielt, 20 Minuten auf 37ºC erwärmt und dann mit Eagle MEM-Medium gewaschen, das 10 % Semifötusserum (FOS) enthielt. Zu dem so behandelten Ganglion wurden 10 ml Bagle MEM-Medium zugesetzt und das Gemisch wurde vorsichtig 10-20-mal pipettiert, um Zelisuspensionen zu bereiten. Dann wurden 5 ml der Suspension in 60x15 mm große Kunststoffschalen eingebracht und 3 Stunden lang auf 37ºC erwärmt. Der vorsichtig gesammelte Überstand wurde als die Ganglionzellen in der hinteren Wurzel des Spinalnervs von Hühnerembryo (DGC) verwendet. DGC wurde mit 500 Zellen/0,9 ml bereitet und auf eine 24-Loch mit Gelatine behandelte Mikroplatte in einer Menge von 0,9 ml für jede Vertiefung aufgebracht. Dann wurden jeweils Cerebrolysin, NGF, Solcoseryl, gemischte Aminosäurelösung, Dihydroergotinmethylat, Cyticholin, Calciumhopatenat, Dopamin und Epinephrin, deren Konzentrationen jeweils zuvor eingestellt worden waren, dem DGC zugesetzt. Als Leerprobe wurden 100 µl PES verwendet. Diese Proben wurden 12 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 96 Stunden in einem 5 % CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC bebrütet, und eine Beobachtung wurde unter Verwendung eines Phasenmikroskops unter 200-facher Vergrößerung vorgenommen. Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
• Im Falle der Behandlung mit Cerebrolysin, der bioaktiven Substanz der vorliegenden Erfindung, in einem Konzentrationsbereich von 10 µl/ml - 80 µl/ml, ergab sich eine Neuroaxonbildung aus DGC. Speziell im Bereich von 10 µl/ml - 20 µl/ml war das Neuroaxonwachstum konzentrationsabhängig. Im Gegensatz hiezu wurde im Falle der Behandlung mit Solcoseryl, gemischter Aminosäurelösung, Dihydroergotinmethylat, Calciumhopatenat, Cyticholin, Dopamin und Epinephrin kein Zeichen einer Neuroaxonbildung beobachtet. Bei NGF wurde zwar eine Neuroaxonbildung festgestellt, sie war aber dem durch die vorliegende Erfindung gebildeten Neuroaxon hinsichtlich des Wachstumsmodus (Zeit und Dicke) unterlegen. Es wird daher geschlossen, daß das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Cerebrolysin einen Nervennährfaktor innerhalb von Nervenzellen synthetisiert und daß es zur Neuroaxonbildung und -vermehrung beiträgt.
• +: gebildet -: nicht gebildet
Beispiel 2:
• Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g unter Ketaminanästhesie mit einer Dosis von 5 mg/kg wurden an Hirnfixierungsständen fixiert. Die Kopfhaut wurde mit einer Schere weggeschnitten und es wurde mit Hibitan sterilisiert. Hierauf wurde der Schädel mit einem Bohrer geöffnet. Das Blut wurde elektrisch blockiert und das Gehirn wurde freigelegt. Die Fimbria fornix wurde abgesaugt, um den Weg zwischen dem Hippocampus und dem Septalnudeus zu unterbinden.
• Die so behandelten Tiere wurden nach der Verabreichungsdauer in 5 Gruppen unterteilt: die 0-Wochengruppe, die 1-Wochengruppe, die 2-Wochengruppe, die 3-Wochengruppe und die 4- Wochengruppe. Sowohl Cerebrolysin als auch eine physiologische Kochsalzlösung wurden intraperitoneal jeweils in einer Menge von 5 mg/kg einmal täglich an jede Gruppe während der vorgesehenen Dauer durch Injektion verabreicht.
• Nach Ablauf der vorgesehenen Verabreichungsdauer in jeder Gruppe wurde durch das Herz eine Kanüle eingeführt und das Blut wurde mit einer physiologischen Kochsalzlösung verdrängt. Dann wurde das Gehirn fixiert und mit einer 4 %igen Paraformaldehyd- Phosphorsäurepuffer-physiologischen Kochsalzlösung refluxiert. Der Cervikalteil wurde abgeschnitten, um das Hirn herauszunehmen, und es wurde dann an einem kühlen Ort über Nacht in einer 10 %igen Saccharoselösung aufbewahrt. Unter Verwendung eines Vibratoms wurde ein 40 µm starker Schnitt bereitet und auf eine Glasplatte aufgelegt.
• Der so erhaltene Schnitt wurde mit einer Anticholinacetyltransferase behandelt und nach der ABO-Methode angefärbt. Nach Aufnahme einer photographischen Abbildung wurde die Anzahl der angefärbten Nervenzellen gezählt und die Größe dieser Zellen wurde gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt:
• Wie in der angeschlossenen Figur 1 dargestellt, erwies sich die Aktivität zum Schutz der Septalzellen in der Cerebrolysingruppe der Kontrollgruppe in der zweiten Verabreichungswoche überlegen. Zum Zeitpunkt der Endbewertung überlebten die cholinreaktiven Nervenzellen in einem Ausmaß von 47 %; die Überlebensrate war ungefähr 20 % höher in der Cerebrolysingruppe als in der Kontrollgruppe.
• In Figur 1 ist übrigens das Überleben der cholinreaktiven Nervenzellen auf der Y-Achse als Prozentsatz der verletzten gegenüber den unverletzten Zellen angegeben.
• Bei der Bewertung der Zellengröße nach der Länge, wie in Tabelle 1 angegeben, zeigt sich, daß die Größe der Zellen in der Cerebrolysingruppe deutlich größer ist als in der Kontrollgruppe und daß kein besonderer Unterschied in der Zellengröße zwischen verletzten und unverletzten Zellen auftritt. Tabelle 1
• Cerebrolysin zeigte somit eine Aktivität als Nervennährfaktor bei intraperitonealer Verabreichung, die klinisch als gleichwertig der intravenösen Verabreichung angesehen wird, und schützte die Septalzellen, wodurch die Überlebensrate verbessert wurde.

Claims (1)

1. Verwendung einer wäßrigen Lösung des Gemisches aus Peptiden mit einem Molekulargewicht von 10.000 oder darunter und Aminosäuren, das durch enzymatischen Abbau der Schweinehirn-Proteinfraktion erhältlich ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung von Dementia-Fällen vom Alzheimer-Typ in Säugetieren.