DE69004613T2 - Wirkstoff für die Verminderung der Störung durch Ascorbinsäure in Testsystemen mit flüssiger oder trockener Phase und zugehöriges Verfahren. - Google Patents

Wirkstoff für die Verminderung der Störung durch Ascorbinsäure in Testsystemen mit flüssiger oder trockener Phase und zugehöriges Verfahren.

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DE69004613T2
DE69004613T2 DE90106247T DE69004613T DE69004613T2 DE 69004613 T2 DE69004613 T2 DE 69004613T2 DE 90106247 T DE90106247 T DE 90106247T DE 69004613 T DE69004613 T DE 69004613T DE 69004613 T2 DE69004613 T2 DE 69004613T2
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Description

    Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft allgemein ein Abfangsystem, das eine Störung durch Ascorbinsäure in einer großen Anzahl von Flüssig- und Trockenphasen-Assaysystemen entfernen kann, insbesondere von Assaysystemen, die auf einer Oxidase-Peroxidase gekoppelten Reaktion basieren, wie z.B. herkömmliche Assays die zum Nachweis von okkultem Blut, Cholesterin, Triglyceriden, Harnsäure und dergleichen in Körperflüssigkeiten verwendet werden. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein Mittel, das schnell und selektiv Ascorbat (die Ionenform der Ascorbinsäure) in einer analytischen Probe, wie z.B. Urin, oxidiert, bevor das Ascorbat in der Lage ist, ein Assayreagentiensystem zu stören.
    • Erörterung des Stands der Technik
  • Die gebräuchlichste Form der Ascorbinsäure betrifft typischerweise Vitamin C. Dieses Vitamin ist ein lebenswichtiger Nährstoff und wird in zahlreichen, natürlich vorkommenden Lebensmitteln gefunden, wie z.B. Früchten und Gemüsen. Vitamin C kann auch synthetisiert werden und ist daher als Zusatzstoff für Lebensmittel oder in Tablettenform erhältlich.
  • Der gesundheitliche Nutzen des Vitamin C ist seit einiger Zeit bekannt geworden. Vor über einem Jahrhundert entdeckten Seeleute, daß sie auf langen Reisen schwer erkrankten, wenn sie nicht bestimmte, an diesem Vitamin reiche Nahrungsmittel aßen. Neuere medizinische Untersuchungen haben darauf schließen lassen, daß große Dosen an Vitamin C bei der Behandlung einer gewöhnlichen Erkältung therapeutisch sein können. Als Folge davon ist das Vitamin C ein verhältnismäßig verbreiteter Nährstoff und daher ein verbreiteter Nahrungsmittelzusatz und ein verbreiteter Bestandteil von Vitaminpillen und dergleichen.
  • Jedoch absorbiert der Körper des Menschen im allgemeinen Vitamin C nur in dem Maße, das erforderlich ist, um den Kurzzeitbedarf des Körpers zu decken. Das Vitamin wird im allgemeinen im Körper nicht gespeichert und überschüssiges Vitamin C wird typischerweise mit Hilfe des Harn-Systems des Körpers ausgeschieden. Als Folge davon wird Vitamin C für gewöhnlich in Urinproben gefunden, die für medizinische Analysen und dergleichen verwendet werden.
  • Die Urinanalyse ist ein wichtiger Teil in der modernen Gesundheitsvorsorge und betreffend die physiologische Kondition eines Patienten können wesentliche Kenntnisse durch Überwachen der Urinbestandteile, wie z.B. Glucose, okkultes Blut, Cholesterin, Triglyceride oder Harnsäure erhalten werden. Jedoch werden viele, allgemein bekannte Urinassaysysteme durch Ascorbinsäure in einem gewissen Grade nachteilig beeinflußt.
  • Ascorbat ist ein Reduktionsmittel, das das Reagenssystem eines Assays stören kann. Viele Assays haben Redox-Indikatorsysteme, die die Farbe ändern, wenn der Indikator von einem reduzierten in einen oxidierten Zustand auf Grund des Vorhandenseins eines Oxidationsmittels wechselt. In einem typischen Assay ist das Reagenssystem so ausgelegt, daß es die Oxidation eines Redox-Indikators im Verhältnis der Analytmenge in einer Probe verursacht. Da Ascorbat ein Reduktionsmittel ist, kann es bei solchen Systemen stören.
  • Jedoch kann Ascorbat oxidiert werden, und wenn Ascorbat oxidiert ist, bevor es ein Assaysystem stört, kann das Ascorbat nicht als Reduktionsmittel wirken und daher keine Störung verursachen.
  • Es ist eine Zahl von Systemen bekannt, die auf die Oxidation von Ascorbat abzielen. Pecht, I. et al., "The Copper-Poly-L- Histidine Complex: I. The Environmental Effect of the Polyelectrolyte on the Oxidase Activity of Copper Ions", J. Am. Chem. Soc., 89: 1587, (1968) zeigen, daß Ascorbat mittels Sauerstoff und eines Kupferkatalysators oxidiert werden kann. Es wird auch gezeigt, daß Polyhistidin (PLH) die katalytische Wirksamkeit von Kupfer (II) auf negativ geladene und neutrale Substrate, wie z.B. Ascorbat, verstärkt.
  • Vengerova, N.A., Kirsh, Y.E. und Kabanov, V.A., "The ascorbate-oxidase activity of the Cu&spplus;²-poly-4-vinylpyridine complex alkylated with bromoacetic acid" Vysokomol. soyed., A 13, Nr. 11, S. 2509-2517 (1971) (übersetzt von K.A. Allen) zeigen ein Verfahren zum Synthetisieren von Carboxymethylderivaten von Poly-4-vinylpyridin und zeigen, daß ein Cu(II)polymer-Komplex die Aktivität zum Oxidieren des Ascorbats erhöht, im Vergleich zu Kupferionen allein.
  • Es ist auch bekannt, daß ein Histaminlatex synthetisiert werden und zu CuSO&sub4; hin zugegeben werden kann, um den Komplex Latex-Histamin-Cu(II) zu bilden. Der Komplex verhält sich wie ein Michael-Menten Katalysator und es wurde gefunden, daß er stabil und als Katalysator für die Ascorbinsäureoxidation wiederverwendbar ist. Siehe allgemein, Sun, Z. Jan, C. und Ketano, H., "Studies on Functional Latices: Catalytic Effects of Histamine-containing Polymer-latex-copper (II) Complex on the Oxidation of Ascorbic Acid." Macromolecules, 19: 984-987 (1986).
  • Es ist auch bekannt, daß Ascorbinsäure mit molekularem Sauerstoff, der durch einen Komplex aus Kupfer II und Poly-4-vinylpyridin katalysiert wird, oxidiert werden kann. Der Mechanismus umfaßt die Wechselwirkung von Kupfer II mit dem Ascorbatanion, um Kupfer I Ionen zu ergeben. Ein weiterer Schritt der katalytischen Wirkung ist die Oxidation des Kupfer I durch molekularen Sauerstoff. Siehe allgemein, Skurlator, Y.I. et al., "The Mechanism of Ascorbic Acid Oxidation by Cu(II)-poly-4-vinyl-Pyridine Complexes. European Polymer Journal, 15: 811-815 (1979).
  • Auch die europäische Patentanmeldung 0 037 056 beschreibt die Verwendung von Iodat in diagnostischen Verfahren um die Störung durch Reduktionsmittel, einschließlich Ascorbinsäure, zu vermeiden. US 4 288 541, Magers, "Ascorbate Resistant Composition Test Device and Method for Detecting a Component in Liquid Test Sample", offenbart die Verwendung von einem Quecksilberionen-Komplex als Abfangsystem für die Entfernung von Ascorbinsäure in einer Testvorrichtung für Glucose im Urin.
  • EP 123 115 beschreibt gegen Ascorbatstörung resistente Zusammensetzungen, indem ein Metallchelat verwendet wird, worin das Metall Fe³&spplus; ist. Es gibt weder irgendeinen Hinweis noch irgendeinen Vorschlag zur Verwendung von Cu²&spplus;, um einen Kupfer/Ligand Komplex zu erhalten.
  • Viele der oben genannten Zitate betreffen die Oxidation des Ascorbats durch Reduzieren von Cu&spplus;² zu Cu&spplus;¹. Jedoch ist Cu&spplus;¹ auch ein Reduktionsmittel und stört daher einen Assay in ähnlicher Weise, wie nicht oxidiertes Ascorbat. Die Vengerova Literatur reoxidiert Cu&spplus;¹ zu Cu&spplus;² mittels Sauerstoff. Jedoch kann Sauerstoff ein sehr ungeeignetes Reagens sein, da es bei Raumtemperatur ein Gas ist. Weiter sind alle der in den oben erwähnten Artikeln beschriebenen, das Ascorbat oxidierende Substanzen, in Wasser und organischen Lösungsmitteln unlöslich. Daher wäre es sehr schwierig, die Substanzen als einheitlichen Überzug auf einer Folie anzubringen, und daher würden sie für ein Trockenreagenssystem nicht geeignet sein, wie z.B. einem herkömmlichen Tauch- und-Ablese-System mit Reagensteststreifen. Weiter haben die Substanzen nach dem Stand der Technik keine ausreichende Reaktionsfähigkeit, um Ascorbat mit einer Geschwindigkeit zu entfernen (abzufangen), die ausreicht, um eine ungewollte Störung mit einem herkömmlichen Redox-Indikatorsystem zu vermeiden.
  • Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das in einem Assaysystem zur Oxidation (zum Abfangen) von Ascorbat mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um eine ungewollte Störung durch Ascorbat zu vermeiden, verwendet werden kann.
  • Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist, ein Abfangsystem für Ascorbat zur Verfügung zu stellen, das in einen herkömmlichen "Tauch-und Ablese" Reagensteststreifen eingearbeitet werden kann.
    • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Beseitigen einer Ascorbinsäurestörung in Assaysystemen, insbesondere in Assaysystemen, die auf Oxidase-Peroxidase gekoppelten Reaktionen beruhen. Wenn in einer Probe Ascorbinsäure enthalten ist, kann diese als Reduktionsmittel wirken und das Assayreagenssystem stören. Die vorliegende Erfindung beseitigt diese Störung durch schnelles Oxidieren des Ascorbats, wobei Ascorbat gehindert wird, wie ein ungewolltes Reduktionsmittel zu wirken. Das Ascorbat wird unter Verwendung eines zweifachen Oxidationssystems oxidiert, das ein wasserlösliches Polymer, das an Cu&spplus;² gebunden ist und ein organisches oder anorganisches Oxidans, wie z.B. Chromat, Peroxid oder ein N-Halogen-Derivat, umfaßt. Diese Erfindung ist erstaunlich selektiv und stört im allgemeinen selbst nicht in dem Assayreagenssystem. Weiter ist die vorliegenden Erfindung so schnell und wirksam, daß sie in eine geeignete Form, wie z.B. ein herkömmliches "Tauch-und-Ablese" Reagensstreifensystem, eingearbeitet werden kann.
    • Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein zweifaches Oxidationsmittelsystem, das eine Ascorbatstörung in vielen Assaysystemen beseitigt, ohne selbst irgendeine signifikante Assaystörung zu verursachen. Oxidans I ist ein wasserlösliches Polymer, das an Cu&spplus;² (je wasserlöslicher das Polymer ist, desto bevorzugter ist es für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung) gebunden ist. Der Polymer-Cu&spplus;² Komplex wird vorzugsweise zu einem homogenen, gelähnlichen Komplex in wäßriger Lösung, wenn er an Cu&spplus;² gebunden ist.
  • Der am meisten bevorzugte Kupfer-Ligand-Komplex (Oxidans I) umfaßt einen Histamin oder Pyridin Ligand, der mit Cu&spplus;² komplexiert ist, wobei der Kupfer-Ligand-Komplex ein wasserlösliches Polymergerüst der Formel hat:
  • worin:
  • n&sub1; = 0 bis 3
  • n&sub2; = 1 bis 3
  • R&sub1; = Imidazolyl oder Pyridyl
  • R&sub2; = H oder Carboxyl oder Alkoxy
  • R&sub3; = H oder Carboxyl oder Alkoxy
  • X&sub1; = -O- oder -NR&sub4;-, wobei R&sub4; H oder ein Niederalkyl von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, oder H
  • X&sub2; = H oder Carboxyl
  • X&sub3; = -CONH- oder -(CH&sub2;)n&sub3;-NH-, worin n&sub3; 0 bis 3 ist
  • oder
  • worin
  • n&sub4;, n&sub5; und n&sub6; = 1 bis 3
  • R&sub1; = Imidazolyl oder Pyridyl ist.
  • Das zweite Oxidans (Oxidans II) kann ein anorganisches Oxidans, organisches Peroxid oder organisches N-Halogen- Derivat sein. Beispiele anorganischer Oxidantien umfassen Chromat, Bromat, Iodat, Quecksilber-, Thallium(III)-, Cer(IV)- und Mangan(III)-Verbindungen, wovon Chromat, Bromat und Iodat am meisten bevorzugt sind.
  • Beispiele der organischen Peroxide umfassen Diisopropylbenzoldihydroperoxid (DBDH), Diisopropylbenzolmonohydroperoxid, Phenylcyclohexanhydroperoxid, p-(α-Hydroperoxyisopropyl)benzoesäure, p-(Bromisopropyl)benzolhydroperoxid und p-(α-Hydroxy-α'-hydroperoxyisopropyl)benzol, worin DBDH am meisten bevorzugt ist. Ein Beispiel einer organischen N-Halogenverbindung ist 1-Halogenbenzotriazol.
  • Der Cu&spplus;² Polymer-Komplex des Oxidans I wird selektiv durch Ascorbat zu Cu&spplus;¹ reduziert und Oxidans II reoxidiert kontinuierlich und selektiv das Kupfer (I) zu der Cu&spplus;² Form.
  • Obwohl das jeweilige Oxidans allein keine ausreichende eaktionsfähigkeit bereitstellt, um das Ascorbat wirkungsvoll bei dem höchsten Konzentrationsspiegel, der im allgemeinen im Urin erwartet wird, d.h. 200 mg/dl (oder 11 mM), zu oxidieren, beseitigt die Kombination der Oxidantien die Ascorbatstörung wirkungsvoll in vielen Assaysystemen, sogar bei Ascorbatkonzentrationen, die größer als 200 mg/dl (Milligramm pro Deziliter) sind.
  • Da das Oxidans II verwendet wird, um das reduzierte Cu (I):Polymer in das ursprüngliche Cu (II): Polymer zurückzuüberführen, sollte Oxidans II in einer zu der Menge der vorhandenen Ascorbinsäure überschüssigen Menge vorhanden sein.
  • Theoretisch kann das Cu (II):Polymer in katalytischen Mengen (weniger als äquimolar zur Ascorbinsäure) vorhanden sein, um die gesamte Ascorbinsäure zu oxidieren, so lange das Oxidans II in einem Überschuß vorhanden ist. In der Praxis ist die Geschwindigkeit der Ascorbinsäureoxidation proportional zur Konzentration sowohl des Oxidans I als auch des Oxidans II. Die praktische Obergrenze der Konzentration des Oxidans I und Oxidans II wird durch Löschkeitseinschränkungen oder konkurrierende Säurereaktionen bestimmt.
  • Ein bevorzugtes Verhältnis des Oxidans II zu Oxidans I liegt im Bereich von 1:1 bis 10:1 und ein besonders bevorzugtes Verhältnis ist etwa 2:1.
  • Im allgemeinen wird bei der Anwendung dieser Reagentien auf die Festphase das Oxidans I in einer wäßrigen Lösung und Oxidans II in einem nicht wäßrigen, getrennten Schritt angewandt.
  • Das Abfangsystem für Ascorbat dieser Erfindung ist spezifisch. Das System kann ohne nachteilige Beeinflussung des Assayreagenssystems, besonders eines Assays mit Redox-Indikatorsystem, oder anderweitige Hemmung irgendwelcher Enzyme, die in einem Assay oder einer Probe gefunden werden, Ascorbinsäure abfangen.
  • Das System arbeitet auch schnell. Die Oxidationsgeschwindigkeit ist sowohl in Lösung als auch in der Festphase ausreichend schnell, so daß das System beim Entfernen der Ascorbinsäurestörung sogar wirkungsvoll ist, obwohl die Reaktion der Farbentwicklung des Assays als Antwort auf einen interessierenden Analyten, wie z.B. Glucose, auch verhältnismäßig schnell ist und auch auf einer Oxidationsreaktion basiert.
  • Das wasserlösliche Polymer besteht aus zwei Teilen: Der erste Teil ist das wasserlösliche Polymergerüst, wie z.B.
  • (1) die hydrolysierte Form von Gantrez (Poly[methylvinylether/Maleinsäure]) (Gantrez ist das Warenzeichen eines Produkts der GAF Corporation , New York, New York)
  • (2) Polyacrylsäure (3) Polyasparaginsäure
  • Der zweite Teil sind die geforderten Liganden, um mit Cu zu coordinieren, wie z.B. Imidazol, Pyridin oder 2,2'-Bipyridin.
    • Synthese von Polymer-Cu-Komplexen (1) Poly[2-Carboxyl-1-(2-Imidazol-4'-yl-ethyl)carbamoyl-3-methoxy-butylen/1,2-Dicarboxy-3-methoxybutylen] Histamin-Gantrez
  • Unter Argon wurde Gantrez AN-119 (12,48 g, 80 mMol Anhydrid, MG= 19 000, GAF Corporation New York, New York) in 200 ml wasserfreiem DMF in einem Ölbad von 65 ºC gelöst. Dann wurde eine Lösung von Histamin (8,88 g, 80 mMol, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wisconsin, USA) und Triethylamin (11,12 ml, 80 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc.) in 200 ml wasserfreiem DMF tropfenweise während 25 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann 20 Stunden in einem 65 ºC Ölbad gerührt, 400 ml Wasser wurden hinzugefügt, und die resultierende Mischung wurde etwa 5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann in einem Eisbad auf Raumtemperatur abgekühlt, und der pH (9,6) wurde mit 3 N HCl auf 6,4 eingestellt. An diesem Punkt schied sich ein braunes gummiartiges Material ab. Der Überstand wurde dekantiert und das gummiartige Material sehr schnell zweimal mit Wasser gewaschen, dann mit Aceton gemischt und bei Raumtemperatur 20 Stunden stehengelassen. Das gummiartige Material verfestigte sich und wurde zu feinem Pulver gemahlen und gründlich mit THF und Aceton gewaschen und dann im Vakuum getrocknet, um 13,5 g eines beigen Feststoffs zu geben. (Ausbeute 63%)
  • IR (KBr) cm&supmin;¹: 3450; 2900; 1702; 1650; 1572; 1453; 1384; 1087; 695.
  • Analyse: Berechnet für x=90%, y=10% oder Histamin/COOH = 45/55. C, 53,54; H, 6,37; N, 14,66
  • Gefunden: C, 53,25; H, 6,48; N, 14,64
    • Cu-Histamin-Gantrez-Komp1ex
  • Zu einer Lösung von Histamin-Gantrez (4 g, etwa 15 mMol) in 100 ml Wasser wurden 15 ml einer 0,5 M CuSO&sub4; Lösung (7,5 mMol) gegeben. Ein blauer Niederschlag schied sich sofort ab. Nach 10 Minuten Mischen wurde der Feststoff filtriert und mit 100 ml Wasser gewaschen, bis das Filtrat farblos war (etwa dreimal). Der Feststoff wurde dann in 100 ml Wasser resuspendiert und lyophilisiert, wobei er 3 g eines blauen Feststoffs gab, der sehr leicht in einer wäßrigen Lösung suspendiert werden kann.
    • (2) Poly[Nβ-(2-imidazol-4'-yl-ethyl)-asparagin/Nβ-(3-Carboxypropyl)-asparagin]
  • Histamin-Polyasparaginsäure
  • Unter Argon wurde Histamin (3,42 g, 30,9 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc.), 4-Aminobuttersäure (3,18 g, 30,9 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc.) und Triethylamin (4,3 ml, 30,9 mMol) in 40 ml Wasser und 30 ml DMF gelöst. Dann wurde eine warme Lösung von Polysuccinimid (3 g, 30,9 mMol, mittleres MG = 30 000) in 30 ml wasserfreiem DMF hinzugefügt und die resultierende Reaktionsmischung wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung gegen 3,8 1 Wasser 3 Tage dialysiert, wobei in diesem Zeitraum dreimal täglich durch frisches Wasser ausgetauscht wurde. Die Polymerlösung wurde dann konzentriert, um einen honiggelben gummiartigen Rückstand zu geben, der mehrere Male mit THF zerrieben wurde, um 2,7 g eines beigen Feststoffs zu geben.
  • Etwa 1 g der rohen Histamin-Polyasparaginsäure wurde in 3 ml Wasser gelöst, und der pH der Lösung (7,4) wurde mit 3 N HCl auf 5,4 eingestellt. Die Lösung wurde auf eine Bio-Gel P6DG (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) Säule (2,5 x 60 cm) geladen und mit Wasser eluiert. Fraktionen, die nur das Polymer enthielten, wie durch TLC festgestellt wurde, (CHCl&sub3;/MeOH/NH&sub3;, 50/40/4, Vol/Vol/Vol, gefolgt von Ansprühen mit 12) wurden vereinigt und lyophilisiert, um 0,7 g eines beigen Feststoffs zu geben.
  • IR (KBr) cm&supmin;¹: 3400 (br) ; 1630; 1520; 1380
  • Analyse: Berechnet für M. 1/2 H&sub2;O, wobei x=51% oder Histamin/COOH=51/49 ist; C, 47,58; H, 6,15; N, 19,83
  • Gefunden: C, 47,63; H, 5,90; N, 20,13
    • Cu-Histamin-Polyasparaginsäure-Komplex
  • Der Cu-Histamin-Popyasparaginsäure-Komplex wurde durch Mischen von 20 mM CuSO&sub4; und 40 mM Histamin-Polyasparaginsäure-Lösung hergestellt.
    • (3) Poly[N-(2-imidazol-4'-yl-ethyl)acrylamid/Acrylsäure]
  • Histamin-Polyacrylsäure
  • Unter Argon wurde Polyacrylsäure (2,52 g, 35 mMol, mittleres MG= 2000,Aldrich Chemical Company, Inc.), in 75 ml warmem, wasserfreien DMF gelöst. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann eine Lösung von N-Hydroxysuccinimid (2,6 g, 45 mMol, Aldrich themical Company, Inc.) in 12 ml wasserfreiem DMF, eine Lösung von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid (4,65 g, 45 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc.) in 12 ml wasserfreiem DMF und Triethylamin (4,85 ml, 35 mMol) hinzugefügt, und die resultierende Reaktionsmischung wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine große Menge Harnstoff schied sich ab und wurde abfiltirert, um eine sehr hell gelbe Lösung von NOS aktivierter Po1yacrylsäure zu ergeben.
  • Unter Argon wurde zu einer Lösung von Histamin (2,5 g, 22,5 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc.) in 50 ml wasserfreiem DMF tropfenweise in einem Zeitraum von 10 Minuten die Lösung der NOS aktivierten Polyacrylsäure hinzugegeben, und die resultierende Reaktionsmischung wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 60 ml Wasser hinzugegeben und die Mischung 5 Stunden gerührt, der pH wurde mit 3 N HCl auf neutral eingestellt und die Lösung konzentriert, um eine viskose Flüssigkeit zu ergeben. Auf Hinzufügen eines gleichen Volumens Acetons schied sich ein gummiartiges Material ab, der Überstand wurde dekantiert und der Rückstand schnell zweimal mit Wasser gespült. Das gummiartige Material wurde dann zweimal mit Aceton zerrieben, um einen harten Feststoff zu geben, der zu einem feinen Pulver gemahlen und mit Aceton und THF gewaschen wurde, um einen weißen Feststoff von roher Histamin-Polyacrylsäure zu geben.
  • Die rohe Histamin-Polyacrylsäure wurde durch Lösen in 5 ml Wasser und dann durch Aufgeben auf eine Bio-Gel P6DG (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) Säule (2,5 x 60 cm) und Eluieren mit Wasser gereinigt. Fraktionen, die nur das Polymer enthielten, wie durch TLC festgestellt wurde (CHCl&sub3;/MeOH/NH&sub3;, 50/40/4, Vol/Vol/Vol, gefolgt von Ansprühen mit 12), wurden vereinigt und lyophilisiert, um 0,5 g eines weißen Feststoffs zu geben.
  • IR (KBr) cm : 3426; 1637; 1562; 1546; 1403
  • Analyse: Berechnet für M. 1/10 H2O, wobei x=35% oder Histamin/COOH=35/65 ist. C, 53,59; H, 6,30; N, 13,81
  • Gefunden: C, 53,54; H, 6,41; N, 14,21
    • Cu-Histamin-Polyacrylsäure-Komplex
  • Der Cu-Histamin-Polyacrylsäure-Komplex wurde durch Mischen von 20 mMol CuSO&sub4; und 40 mMol Histamin-Polyacrylsäure-Lösung hergestellt.
    • (4) Poly[2-Carboxy-3-methoxy-1-(pyrid-4-yl-methyl) carbamoylbutylen/1, 2-Dicarboxy-3-methoxybutylen]
  • Pyridin-Gantrez
  • Unter Argon wurde Gantrez AN-119 (6,24 g, 40 mMol, MG 19 000, GAF Corporation New York, New York) in 100 ml wasserfreiem DMF bei 40 ºC gelöst. Dann wurde Triethylamin (5,6 ml, 40 mMol) hinzugefügt. Eine Lösung von 4-Aminomethylpyridin (4,32 g, 49 mMol, Aldrich Chemical Company, Inc.) in 100 ml wasserfreiem DMF wurde dann in einem Zeitraum von 12 Minuten tropfenweise hinzugefügt, und die resultierende Reaktionsmischung wurde 20 Stunden bei 40 ºC gerührt. Wasser (110 ml) wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde 3 Stunden gerührt. Der pH der Mischung (8,8) wurde dann mit 3 N HCl auf 4,9 eingestellt. Eine große Menge gummiartigen Materials schied sich ab. Der Überstand wurde dekantiert und die Masse schnell zweimal mit Wasser gespült. Das gummiartige Material wurde dann mit Aceton und THF zerrieben und im Vakuum getrocknet, um 4,26 g eines weißen Feststoffs zu geben.
  • Analyse: Berechnet für x=76% oder pyridin/COOH=38/62. C, 57,22; H, 6,05; N, 8,78
  • Gefunden: C, 57,56; H, 6,14; N, 8,55
    • Cu-Pyridin-Gantrez
  • Zu einer Lösung von Pyridin-Gantrez (1 g, 4 mMol) in 25 ml Wasser wurden 4 ml 0,5 M CuSO&sub4; Lösung hinzugegeben. Nach mehreren Minuten Mischen wurde die Mischung filtriert, mehrere Male mit Wasser gewaschen, in 30 ml Wasser resuspendiert und lyophilisiert, um 1,4 g eines blauen Feststoffs, der leicht in wäßriger Lösung suspendiert werden kann, zu geben.
    • Beispiele Beispiel 1
  • Eine Reagensmatrix wurde durch Herstellen einer Folie aus mikroporösem Polyurethan geschaffen, die durch Naßgießen der Polymermischung auf einen nicht porösen Kunststoffträger erhalten war, gefolgt von einer Koagulation im wasserbad und anschließendem Trocken. Das mikroporöse Polyurethan bestand aus der folgenden Lösung:
  • 3,2% KBH 672 Polyurethan
  • 0,9% Dralon U
  • 5,3% Mowilith
  • 4,3% KPK Pt 144 Kationische Polyurethan Dispersion
  • 18,2% Talkum AT1
  • 0,4% Dodecylbenzolsulfonat in Dimethylformamid.
  • Die Suspension wurde auf Hostaphan (polyethylenterephthalat) unter Verwendung einer Walzenrakeltechnik gegossen. Das Material wurde durch ein Wasserbad geleitet und bei 50 ºC getrocknet. Das resultierende Polyurethanterephthalat (PET) ist folglich der nicht poröse Kunststoffträger.
  • Eine Lösung, bestehend aus 100 mMol (millimolar) 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin (TMB) und 50 mM Aerosol OT in 1-Methoxy-2-propanol, wurde auf die Matrix als Beschichtung mit Hilfe eines Mayer-Stabrakels aufgebracht. Nach 10 Minuten Trocknen bei 50 ºC, wurde die Matrix mit einer zweiten Lösung behandelt, die aus 10 mg/ml (Milligramm pro Milliliter) Peroxidase, 5 mg/ml Glucoseoxidase und 1% Triton X-100 in 0,2 M Phosphat (pH 7,0) besteht. Die Matrix wurde 10 Minuten bei 50 ºC getrocknet. Zum Schluß wurde eine Lösung, die aus 20 mM CuSO&sub4;, 40 mM Histamin-Gantrez und 20 mM Kaliumchromat in 0,2 M Phosphat (ph 7,0) besteht, auf die Matrix aufgebracht, und die Matrix wurde 10 Minuten bei 50 ºC getrocknet. Die Reagentien-behandelte Matrix wurde mit doppelseitigem Klebstoff beschichtet, in 0,5 Zentimeter breite Streifen geschnitten, an der Schmalseite mit einer weißen Polystyrolschicht versehen und zerschnitten, um einzelne Reagensstreifen zu geben.
  • Um die Wirksamkeit der Abfangschicht zu testen, wurde ein Vergleich zwischen Systemen mit unterschiedlichen Mengen an dem Abfangmittel durchgeführt. Zuerst wurden die Reagensstreifen in Urinstandards getaucht, die 0, 20, 40, 60, 80 oder 100 mg/dl Glucose enthielten und nach 60 Sekunden wurde das Reflexionsvermögen der Auflage unter Verwendung eines Schnellscanners zwischen 400-700 nm (Nanometer) nachgewiesen. Die Reflexionsmessungen bei 660 nm (die Wellenlänge der maximalen Reflexionsänderung) wurden verwendet, um eine Standardkurve von K/S bei 660 nm gegen die Glucosekonzentration in mg/dl zu erstellen. Als nächstes wurden die Streifen in Urinstandards getaucht, die 100 mg/dl Glucose und jeweils 50, 100 oder 200 mg/dl Ascorbinsäure enthielten. Die Messung der Reflexion der Auflage nach 60 Sekunden Ablesezeit wurde verwendet, um die beobachtete Glucosebewertung für jene Urine zu bestimmen, die Ascorbinsäure enthielten, indem die Glucosespiegel aus der Glucosestandardkurve abgelesen wurden.
  • Das K/S-Verhältnis leitet sich von dem Kubelka-Munk Modell ab, das zur Erklärung der Streulichteigenschaften gefärbter Schichten erstellt wurde. Im allgmeinen ist das K/S-Verhältnis eines gefärbten Bestandteils eine Funktion der Konzentration. Nach der Kubelka-Munk-Theorie ist:
  • worin:
  • R∞ die Reflexion einer Schicht ist, die so dick ist, daß eine weitere Erhöhung der Dicke keine Änderung der Reflexion erzeugt;
  • K der Absorptionskoeffizient und ein Maß für den in der Elementarschicht absorbierten Lichtstromanteil ist; und
  • S der Streukoeffizient und der Lichtstromanteil, der durch Umkehr seiner Richtung verlorengegangen ist. Tabelle I Ascorbat-Abfangsysteme pH vorhandene Glucose (mg/dl) Ascorbinsäure (Mg/dl( beobachtete Glucose (mg/dl) Kontrolle (kein Abfangmittel 10 mM Cu(II)-Histamin-Gantrez plus 10 mM K&sub2;CrO&sub4; 20 mM Cu(II)- Histamin-Polyacrylsäure plus 20 mM K&sub2;CrO&sub4; 20 mM Cu(II)-Histamin-Polyasparaginsäure plus 20 mM K&sub2;CrO&sub4;
  • Die Ergebnisse in Tabelle I zeigen, daß die Genauigkeit der Testergebnisse besonders stark verbessert wird, wenn das Abfangsystem vorhanden ist, im Vergleich zu denjenigen ohne Abfangsystem. Außerdem zeigt Tabelle I, daß mehrere Histamin-derivatisierte Polymere wirkungsvoll verwendet werden können, einschließlich Histamin-Polyacrylsäure und Histamin- Polyasparaginsäure.
    • Beispiel 2 Beispiel eines Ascorbat-resistenten Urin-Glucosestreifens unter Verwendung von DBDH plus Cu(II)-Histamin-Gantrez
  • Es wurde ein Experiment unter Verwendung von Diisopropylbenzoldihydroperoxid (DBDH) als Co-Oxidans in einem System durchgeführt, das Kupfer(II)-Histamin-Gantrez als Katalysator verwendet. Die Reagensstreifen wurden, wie unten beschrieben wird, hergestellt und auf Farbentwicklung als Antwort auf Glucose im Urin und auf Wiederstandsfähigkeit gegen Störung durch Ascorbinsäure getestet.
  • Die Ausgangsmatrix bestand aus einer Folie von mikroporösem Polyurethan, die von einer nicht porösen Polycarbonatverstärkung getragen wurde. Die Matrix wurde mit den Reagentien unter Verwendung der Mayer-Stabrakelbeschichtungstechnik behandelt. Die zuerst angewandte Beschichtungslösung bestand aus folgendem: Erste Anwendungsformulierung Peroxidase Glucoseoxidase 0,5 MPhosphat (pH 7,0) Triton X-100 FD&C Gelb #5 Cu(II) Histamin-Gantrez (20 mM am Ende) H2O
  • Die Matrix wurde 10 Minuten bei 50 ºC getrocknet. Dann wurde die Matrix unter Verwendung derselben Technik mit einer zweiten Anwendungslösung behandelt, die aus folgendem bestand: Zweite Anwendungslösung 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Aerosol OT DBDH (20 mM am Ende) 1-Methoxy-22-propanol
  • Die Matrix wurde 10 Minuten bei 50 ºC getrocknet. Das Material wurde mit doppelseitigem Klebstoff verstärkt, wobei das mikroporöse Polyurethan außen lag, in 0,5 Zentimeter breite Streifen geschnitten, an der Schmalseite mit einer weißen Polystyrolschicht versehen und zerschnitten, um einzelne Reagensstreifen zu ergeben.
  • Die Reagensstreifen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgewertet. Die Ergebnisse in Tabelle II unten zeigen, daß die Genauigkeit der Testergebnisse verbessert ist, wenn die Streifen DBDH plus Cu(II)-Histamin-Gantrez enthalten, im Vergleich zu denjenigen ohne vorhandenes Abfangsystem. Tabelle II Glucosespiegel im Urin (mg/dl) Ascorbinsäurespiegel beobachteter Glucosespiegel Formulierung Kontrolle (kein Abfangmittel) Test (20 mM Cu(II)-Histamin-Gantrez) 20 mM DBDH
  • Ähnliche Experimente wurden unter Verwendung anderer Hydroperoxide durchgeführt, einschließlich Cyclohexylbenzolhydroperoxid (CBH) und Isopropylbenzoesäurehydroperoxid (IBH). Diese waren ebenso in der festen Phase wirksam.
    • Beispiel 3 Verwendung von Cu(II)-Pyridin-Gantrez plus K&sub2;CrO&sub4; als Abfangsystem für Ascorbinsäure.
  • Die Wirksamkeit von Cu(II)-Pyridin-Gantrez als Katalysator für die Oxidation von Ascorbinsäure wurde durch Untersuchungen in Flüssigkeiten bestimmt und mit derjenigen verglichen, die für Cu(II)-Histamin-Gantrez beobachtet wurde.
  • Es wurde ein Vorratspräparat entweder von Cu(II)-Histamin- Gantrez oder Cu(II)-Pyridin-Gantrez durch Suspendieren von 59,6 mg des lyophilisierten Pulvers in 1 ml destilliertem Wasser hergestellt. Dies gab eine Suspension von 100 mM an Kupfer II und 200 mM an Histamin oder Pyridin. Andere Vorratslösungen, die in diesem Experiment verwendet wurden, waren 0,5 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,1 M Natriumchromat, 2000 mg/dl Glucosestandard und 10% Ascorbinsäure in destilliertem Wasser.
  • Der Test auf die Beseitigung der Ascorbinsäurestörung durch das Abfangsystem wurde in 12 x 75 mm Glasröhrchen durchgeführt. Die Bestandteile der Reaktionsmischung wurden in den Mengen und der Reihenfolge zu den Röhrchen hinzugegeben, die in Tabelle III aufgelistet sind. 10 Sekunden nach dem Hinzufügen von Ascorbinsäure wurde das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Ascorbinsäure durch Eintauchen eines Teststreifens von C-STIX (Miles Inc., Elkhart, Indiana, USA) in die Testmischung nachgewiesen. Zur gleichen Zeit wurde die Fähigkeit, das Vorhandensein von 100 mg/dl Glucose zu bestimmen, nachgewiesen, indem Glucose-Teststreifen verwendet wurden, die keinerlei Reagens zum Abfangen von Ascorbinsäure enthielten. So würden, wenn Ascorbinsäure während der 10 Sekunden Inkubationszeit entfernt wurde, die Streifen sofort reagieren und eine blaue Farbe entwickeln.
  • Wenn Ascorbinsäure vorhanden war, würde der Teststreifen überhaupt keine Farbe entwickeln, oder erst nach einer Zeitverzögerung.
  • Die Ergebnisse in Tabelle IV zeigen, daß Cu(II)-Histamin- Gantrez plus Kaliumchromat oder Cu(II)-Pyridin-Gantrez plus Kaliumchromat bei der Entfernung der Ascorbinsäure vor dem Testen auf Glucose gleich wirksam sind. Andererseits, wenn entweder der Cu(II)-Ligand-Gantrez-Katalysator oder das Co-Oxidans fehlen, ist das C-STIX positiv, und es entwickelt sich keine Farbe (oder erst eine Farbe nach einer langen Verzögerung) auf den Glucose-Teststreifen. Tabelle III Kupfer-Polymer-System Puffer: Glucose: Ascorbinsäure: Oxidans 2: Konzentration des Oxidans 1: Phosphat Oxidans 1 Cu(II)-Histamin-Gantrez Cu(II)-Pyridin-Gantrez Cu(II)-Histamin-Polyasparaginsäure Cu (II)-Histamin-Polyacrylsäure Cu (II)-Carboxymethyl iertes Poly-4-vinylpyridin * kein Oxidans Reaktionsfahigkeit (heterogen)
  • * hergestellt gemäß dem oben beschriebenem Verfahren von Vengerova, Krish und Kabanov. Tabelle IV Cu(II)-Ligand-Polymer-Katalysator Ergebnisse Röhrchen Nr. H&sub2;O ml Phosphat Cu(II)-Histamin-Gantrez Cu(II)-Pyridin-Gantrez Glucose Ascorbinsäure Glucose-Streifen C-STIX blau lange Verzögerung schwache Farbe negativ positiv
    • Beispiel 4 Verwendung verschiedener Hvdroperoxide als Co-Oxidantien und Cu(II)-Histamin-Gantrez als Katalysator zur Beseitigung der Ascorbinsäurestörung vor dem Testen auf Glucose im Urin
  • Es wurde ein ähnlicher experimenteller Weg wie in Beispiel 3 verwendet, um die Wirksamkeit mehrerer verschiedener Hydroperoxide als Co-Oxidantien zusammen mit Cu(II)-Histamin- Gantrez zur Beseitigung der Ascorbinsäurestörung vor dem Testen auf Glucose im Urin zu zeigen. Es wurden Vorratslösungen in Ethanol hergestellt, die 100 mM Spiegel an Cyclohexylbenzolhydroperoxid (CBH), Diisopropylbenzoldihydroperoxid (DBDH), Isopropylbenzoesäurehydroperoxid (IBH) oder para-Bromisopropylbenzolhydroperoxid (BIPBH) enthielten. Die Bestandteile der Reaktionsmischung wurden in den Mengen und in der Reihenfolge, die in der folgenden Tabelle V aufgelistet sind, in ein 12 x 75 mm Röhrchen gegeben. 10 Sekunden nach dem Hinzufügen von Ascorbinsäure, wurde das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Ascorbinsäure mittels C-STIX nachgewiesen, und die Glucose wurde unter Verwendung von Glucose-Teststreifen wie vorher bestimmt.
  • Die Ergebnisse in Tabelle V zeigen, daß Cu(II)-Histamin- Gantrez plus 10 mM entweder von CBH, DBDH oder BIPBH bei der Entfernung von 100 mg/dl Ascorbinsäure innerhalb von 10 Sekunden wirksam ist. Die Hydroperoxide allein sind unwirksam (ohne hinzugefügtes Cu(II)-Histamin-Gantrez als Katalysator). Tabelle V Ergebnisse Röhrchen Nr. H&sub2;O ml Phosphat Cu(II)-Histamin-Gantrez Co-Oxidans Glucose Ascorbinsäure Glucose-Streifen C-STIX blau keine Farbe negativ positiv
    • Beispiel 5 Flüssigkeits-Assay zur Überprüfung der Oxidantien II
  • Die Oxidantien II wurden in einem Flüssigkeits-Assay auf ihre Reaktionsfähigkeiten als Ascorbinabfänger überprüft. Die allgemeinen Verfahren sind folgende:
  • 1. Die Oxidatien wurden mit Pufferlösung in 12 x 75 mm Teströhrchen gemischt.
  • 2. Gluscose und Ascorbinsäurelösungen wurden hinzugefügt und die Mischung etwa 10 Sekunden gemischt.
  • 3. Glucosestreifen (TMB, Glucoseoxidase und Peroxidase enthaltend, die mit einer Lösung von 100 mM, 300 Einheiten/ml beziehungsweise 500 Einheiten/ml in MES Puffer (4-Morpholinethansulfonsäure), pH 6 getränkt waren; Papier: Whatman 54) wurden dann in die Mischung eingetaucht, und die Farbentwicklungsgeschwindigkeit wurde aufgezeichnet.
  • 4. Kontrollen, bei denen die Oxidantien oder Glocose oder Ascorbinsäure fehlte, wurden durchgeführt. Tabelle VI Kupfer Glucose Ascorbinsäure Oxidans I Löslichkeit von Oxidans I: unlöslich, homogen Phosphat 100 mg/dl Cu(II)-Histamin-Gantrez: 12,5 mM Oxidans II Konzentration mM Reaktionsfahigkeitb durchperlen durchperlen 1-Chlorbenzotriazol DBDH
  • a. Eine Kontrollreaktion wurde durchgeführt, bei der kein Cu(II)-Histamin-Gantrez vorhanden war, und die Reaktionsfähigkeit ist negativ, wodurch angezeigt wird, daß O&sub2; allein nicht genügend Aktivität aufweist, um die Ascorbinsäurestörung zu beseitigen.
  • b. Die Reaktionsfähigkeit wurde innerhalb 10 Sekunden nach dem Mischen gemessen.
  • c. ++++ bedeutet, daß die Reaktionsfähigkeit des Glucose- Teststreifens gleich derjenigen ist, die beobachtet wird, wenn der Streifen in die Kontrolle ohne Ascorbinsäure getaucht wird.
  • d. +++ bedeutet leicht verminderte Reaktionsfähigkeit.
  • e. ++ bedeutet geringere Aktivität als +++.
  • f. Die Reaktionsfähigkeit wurde nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur gemessen.
    • Beispiel 7 Beispiele verschiedener Konzentrationen von Oxidans I und Oxidans II
  • Die folgenden Verfahren waren die gleichen wie in Beispiel 5.
  • Puffer : Phosphat, 0,4 M, pH 7
  • Glucose : 100 mg/dl
  • Ascorbinsäure : 100 mg/dl
  • Oxidans 1 : Cu(II)-Histamin-Gantrez Konzentration von Oxidans I mM Verbindung Konzentration von Oxidans II mM Reaktionsfähigkeit
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert und die vorausgegangene Erörterung wurde nur gegeben, um die Ansprüche verstehen zu helfen und die zahlreichen möglichen Ausführungsformen der durch die Ansprüche definierten vorliegenden Erfindung zu verstehen. Die diese Erfindung festlegenden Begrenzungen sind ausdrücklich in den Ansprüchen dargestellt, und nichts in der vorausgegangenen Diskussion beabsichtigt, irgendwelche zusätzlichen Beschränkungen dort hinzuzufügen.

Claims (5)

1. System zum Abfangen von Ascorbat, wobei das System ein erstes Oxidans, umfassend ein wasserlösliches Polymer mit einem ersten Teil, der aus der Gruppe, die aus Polymethylvinylethermaleinsäure, Polyacrylsäure und Polyasparaginsäure besteht, ausgewählt ist und einem zweiten Teil, der aus der Gruppe, die aus Imidazol, Pyridin und 2,2'-Bipyridin besteht, ausgewählt ist, wobei das Polymer mit Cu&spplus;² komplexiert ist, um einen Kupfer/Ligand Komplex zu erhalten; und ein zweites Oxidans, das aus einem anorganischen Oxidans, organischen Peroxid oder 1-Halogenbenzotriazol besteht, umfaßt.
2. System nach Anspruch 1, worin das zweite Oxidans Chromat, Bromat, Iodat, Thallium(III), Cer(IV), Quecksilberverbindungen, Mangan(III)verbindungen, Diisopropylbenzoldihydroperoxid (DBDH), Phenylcyclohexanhydroperoxid, p-(α-Hydroperoxy-α'-hydroperoxyisopropyl)benzoesäure, p-(Bromisopropyl)benzolhydroperoxid oder 1-Halogenbenzotriazol ist.
3. Verfahren zum Abfangen von Ascorbat in einem Redoxreagenssystem, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt des Kombinierens eines ersten Oxidans, das ein wasserlösliches Polymer mit einem ersten Teil umfaßt, der aus der Gruppe, die aus Polymethylvinylethermaleinsäure, Polyacrylsäure und Polyasparaginsäure besteht, ausgewählt ist und einem zweiten Teil, der aus der Gruppe, die aus Imidazol, Pyridin und 2,2'-Bipyridin besteht, ausgewählt ist, wobei das Polymer mit Cu&spplus;² komplexiert ist, um einen Kupfer/Ligand Komplex zu erhalten, mit einem zweiten Oxidans, das aus einem anorganischen Oxidans, organischen Peroxid oder 1-Halogenbenzotriazol besteht, in einer Menge, die überschüssig zu der Menge der vorhandenen Ascorbinsäure ist, und des Kombinierens der resultierenden Mischung mit dem Redoxreagenssystem.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das zweite Oxidans Chromat, Bromat, Iodat, Thallium(III), Cer(IV), Quecksilberverbindungen, Mangan(III) verbindungen, Diisopropylbenzoldihydroperoxid (DBDH), Phenylcyclohexanhydroperoxid, p-(α-Hydroperoxy-α'-hydroperoxyisopropyl)benzoesäure, p-(Bromisopropyl)benzolhydroperoxid oder 1-Halogenbenzotriazol ist.
5. Assay-System, das auf Oxidase-Peroxidase gekoppelten Reaktionen basiert, das das System zum Abfangen von Ascorbat der Ansprüche 1 oder 2 umfaßt.
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