Anwendungsgebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Wärmebehandlung von Lactoferrin oder Lactoferrin
enthaltenden Substanzen ohne Verlust ihrer physiologischen
Aktivitäten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Wärmebehandlung von Lactoferrin oder
Lactoferrin enthaltenden Substanzen unter pH-Wert-Bedingungen zwi
schen 1,0 und 6,5 bei einer Temperatur oberhalb von 60 ºC.
Ausgangssituation der Erfindung
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Lactoferrin ist als ein eisenbindendes, in Tränen,
Speichel, peripherem Blut, Milch u.dgl. auftretendes Protein
bekannt. Es ist bekannt, daß Lactoferrin verschiedene
physiologische Aktivitäten aufweist, beispielsweise
antibakterielle Aktivität gegen schädliche Bakterien (B. J.
Nennecke und K. L. Smith, Journal of Dairy Science, Bd. 67,
S. 3, 1984), Aktivität zur Förderung der Eisenabsorption im
Darm (G. B. Fransson et al., Journal of Pediatric
Gastroenteorology and Nutrition, Bd. 2, S. 693, 1983),
entzündungshemmende Aktivität (J. V. Bannister et al.,
Biochimica et Biophysica acta, Bd. 715, S. 116, 1982) usw.
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Der Zusatz von Lactoferrin zu Nahrungsmitteln,
haltbargemachten Nahrungsmitteln, Medikamenten, Kosmetika
u.dgl. ist daher wünschenswert.
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Lactoferrin ist jedoch gegenüber einem Erhitzen in der
Nähe eines neutralen pH-Werts unstabil, so daß die
Wärmebehandlung von Lactoferrin zu einer Denaturierung des
Lactoferrins führen kann. Nach Veröffentlichungen gehen die
physiologischen Aktivitäten des Lactoferrins durch Erhitzen
bei 62,5 ºC für 30 Minuten zumeist verloren, wobei eine
vollständige Denaturierung beim Erhitzen auf 70 ºC für 15
Minuten auftritt (J. E. Ford et al., Journal of Pediatrics,
Bd. 90, S. 29; 1977). Eine kennzeichnende Bedingung ist in
diesem Zusammenhang die traditionelle thermische
Sterilisation der Milch durch Erhitzen auf 63 ºC für 30 Minuten.
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Oftmals ist das Erhitzen von Nahrungsmitteln,
Futtermitteln, Medikamenten, Kosmetika zur Pasteurisierung,
Sterilisierung oder zum Kochen erforderlich, wobei jedoch eine
ausreichende Wärmebehandlung bei Lactoferrin oder
Lactoferrin als einen Bestandteil enthaltenden Substanzen
für die Nutzung seiner physiologischen Aktivitäten nicht
angewendet werden kann.
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Mit der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren zur
Wärmebehandlung von Lactoferrin oder Lactoferrin
enthaltenden Substanzen ohne Verlust ihrer physiologischen
Aktivitäten entwickelt und festgestellt, daß beim Erhitzen
von Lactoferrin oder Lactoferrin enthaltenden Substanzen
unter sauren Bedingungen deren physiologische Aktivitäten,
wie beispielsweise antibakterielle Aktivität, eisenbindende
Aktivität, Antigenität, kaum beeinträchtigt werden. Die
vorliegende Erfindung beruht auf dieser Entdeckung.
Aufgabe der Erfindung
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die
Gewährung eines Verfahrens zur Wärmebehandlung von
Lactoferrin oder Lactoferrin enthaltenden Substanzen ohne Verlust
ihrer physiologischen Aktivitäten.
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Eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist
die Gewährung eines Verfahrens zum Pasteurisieren,
Sterilisieren oder Kochen durch Erhitzen von Lactoferrin
oder Lactoferrin enthaltenden Substanzen ohne Verlust ihrer
physiologischen Aktivitäten.
Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Lactoferrin
oder Lactoferrin enthaltende Substanzen bei einer Temperatur
oberhalb von 60 ºC unter pH-Wert-Bedingungen zwischen 1,0
und 6,5 erhitzt.
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Es zeigen:
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Fig. 1 eine graphische Darstellung der Beziehungen
zwischen Erwärmungstemperatur und Erwärmungsdauer in bezug
auf Proben von Lactoferrin mit unterschiedlichem pH, um
nicht-denaturierte Anteile von mehr als 60 % zu
gewährleisten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Das hierin verwendete Wort "Lactoferrin" umfaßt
Lactoferrin, das aus ausnahmslos allen Ausgangsstoffen von
Lactoferrin abgeleitet werden kann, wie beispielsweise Milch
der Säugetiere (beispielsweise Milch des Menschen sowie die
von Kühen, Schafen, Ziegen, Pferden u.dgl.), und zwar in
jeder beliebigen Laktationsstufe (z.B. Kolostralmilch,
Übergangsmilch, Reifemilch, Milch der späteren Laktation),
verarbeitete Milch- und Nebenprodukte der Milchverarbeitung,
wie beispielsweise Magermilch, Molke u.dgl. (nachfolgend
allgemein als Milch u.dgl. bezeichnet).
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Das hierin verwendete Wort "Lactoferrin" umfaßt
ausnahmslos alle Lactoferrinsubstanzen, wie beispielsweise
kommerzielles Lactoferrin, natives Lactoferrin, das
unmittelbar nach der herkömmlichen Methode (z.B.
Ionenaustausch-Chromatographie) von ausnahmslos allen
Ausgangsstoffen des Lactoferrins isoliert wurde, durch Entfernen von
Eisen aus nativem Lactoferrin mit Hilfe von Salzsäure,
Citronensäure u.dgl. gewonnenes Apolactoferrin, durch
Chelatbildung von Apolactoferrin mit Metall, wie
beispielsweise Eisen, Kupfer, Zink, Mangan u.dgl., erhaltenes
metallgesättigtes Lactoferrin, oder deren geeignete
Mischungen (sie sind nachfolgend allgemein mit LF
abgekürzt).
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Die hierin verwendeten Worte "Lactoferrin enthaltende
Substanzen" umfassen ausnahmslos alle Substanzen, in denen
LF enthalten ist, und alle beliebigen und sämtliche
Substanzen, in denen LF zugesetzt wurde. Beispielsweise
können Lactoferrin enthaltende Substanzen Nahrungsmittel,
Futtermittel, Kosmetika und Medikamente u.dgl. umfassen, die
LF enthalten. Aus Gründen der Einfachheit werden Lactoferrin
und Lactoferrin enthaltende Substanzen nachfolgend allgemein
als LF-Substanzen bezeichnet.
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Normalerweise wird die Wärmebehandlung von LF-
Substanzen in flüssiger Phase ausgeführt, allerdings
befinden sich LF-Substanzen nicht notwendigerweise in der
flüssigen Phase, sondern müssen Lactoferrin in einem Zustand
oder einer Phase enthalten, in dem/der sich das 1LF unter pH-
Wertbedingungen innerhalb des beschriebenen Bereichs
befinden muß. Beispielsweise können LF-Substanzen grobe
Feststoffsubstanzen umfassen, denen LF zugemischt ist oder
an denen es in Form einer Flüssigkeit, Aufschlämmung oder
Paste haftet.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden LF-
Substanzen durch Zusatz anorganischer Säure (beispielsweise
Salzsäure, Phosphorsäure u.dgl.) und/oder organischer Säure
(beispielsweise Essigsäure, Citronensäure u.dgl.) zunächst
auf ihren pH-Wert in einem Bereich von 1,0 ... 6,5,
vorzugsweise 2,0 ... 6,0, eingestellt. Natürlich ist die
Einstellung des pH-Werts nicht erforderlich, wenn LF-
Substanzen von sich aus einen innerhalb des beschriebenen
Bereichs liegenden pH-Wert aufweisen, jedoch wird noch die
Einstellung des pH-Werts der LF-Substanzen je nach der
anzuwendenden Aufheizbedingung (Erwärmungstemperatur und
Erwärmungsdauer) und dem Zweck der Wärmebehandlung
(beispielsweise Sterilisierung, Kochen u.dgl.) auf den optimalen pH-
Wert bevorzugt.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die
Wärmebehandlung bei einer Temperatur oberhalb von 60 ºC. Der
Temperaturbereich der Wärmebehandlung ist hauptsächlich für
die Sterilisierung vorgesehen, jedoch erfolgt die Festlegung
unter Berücksichtigung der praktischen Wärmebehandlung in
der Nahrungsmittelindustrie. Das Erwärmen der LF-Substanzen
kann mehr oder weniger zu einer Denaturierung von LF und zur
Beeinträchtigung ihrer physiologischen Aktivitäten führen.
Die Stärke der physiologischen Aktivitäten von LF hängt im
allgemeinen von der Konzentration des LF ab. Um daher die
physiologischen Aktivitäten von LF zu nutzen, wird
angestrebt, daß in den erhitzten LF-Substanzen so viel
nicht-denaturiertes LF wie möglich ist. Vom praktischen
Gesichtspunkt wird der nicht-denaturierte Anteil von LF in
LF-Substanzen in der vorliegenden Erfindung auf mehr als 60
% gehalten, obgleich dies nicht entscheidend ist. Die hierin
verwendeten Worte "nicht-denaturierter Anteil" bedeuten den
Anteil der Menge an nicht-denaturiertem LF in den LF-
Substanzen nach dem Erwärmen, bezogen auf denjenigen vor dem
Erwärmen.
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Um schließlich einen nicht-denaturierten Anteil von
mehr als 60 % zu erzielen, wird die Wärmebehandlung der LF-
Substanzen in einem pH-Wert-Bereich von 1,0 bis 6,5 bei
einer geeigneten Kombination einer Temperatur oberhalb von
60 ºC und einer geeigneten Zeitspanne durchgeführt.
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Durch Erwärmen behandelte LF-Substanzen werden nach
einem konventionellen Verfahren gekühlt, im Bedarfsfall in
Behälter gefüllt und verschlossen, um auf diese Weise LP-
Produkte zu erhalten, die physiologische Aktivitäten
aufweisen. Durch Erwärmen behandelte LF-Substanzen können
getrocknet werden, um pulverförmige Produkte zu erhalten. In
diesem Zusammenhang kann jedes beliebige herkömmliche
Trocknungsverfahren angewendet werden, sofern LF nicht
weiter denaturiert wird. Typische Trocknungsverfahren sind
das Vakuumtrocknen, Gefriertrocknen und Sprühtrocknen u.a.
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Es wird davon ausgegangen, daß die durch
Wärmebehandlung erhaltenen LF-Substanzen als Nahrungsmittel,
Futtermittel, Kosmetika, Medikamente u.dgl. je nach den
übrigen darin enthaltenen Bestandteilen angewendet werden
können, wie sie sind, und zu frischen oder haltbar gemachten
Lebensmitteln oder Futtermitteln oder Erzeugnissen davon
sowie Medikamenten oder Kosmetika oder Erzeugnissen davon
zugesetzt werden können.
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Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung
werden nachfolgend einige beispielhafte Tests beschrieben.
TEST 1
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Die Aufgabe dieses Tests besteht in der
Veranschaulichung der Beziehungen zwischen den Bedingungen
der Wärmebehandlung und dem Grad der Beeinträchtigung der
physiologischen Aktivitäten von LF.
1) Methode
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Es wurde handelsübliches LF (von der Oleofina, Belgien)
in gereinigten Wasser in einer Konzentration von 5 %
(Gewichtsprozent, sofern nicht anders angegeben) aufgelöst
und die resultierende Lösung zu je 10 ml in 66 Reagenzgläser
verteilt. Die LF-Lösung in den Reagenzgläsern wurde auf den
in Tabelle 1 angegebenen pH-Wert-Bereich von 1 bis 11
eingestellt, um Proben von elf Gruppen zu erhalten, von
denen jeweils 6 Proben den gleichen pH-Wert haben. Die zu
jeder Gruppe gehörenden 6 Proben wurden bei sechs
verschiedenen Temperaturen von 60 ºC bis 120 ºC für 5
Minuten entsprechend Tabelle 1 erhitzt.
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Um die Koagulation von LF festzustellen, wurde nach dem
Erhitzen das Aussehen der Proben mit dem bloßen Auge
untersucht und sodann der Anteil an denaturiertem LF in
jeder Probe unter Verwendung von Asahi-Pack C4P-50
(Warenzeichen von der Asahi Kasei) mit Hilfe der Umkehrphasen-HPL-
Chromatographie mit einem linearen Gradienten von 0,5 M
Natriumchlorid enthaltenes Acetonitril gemessen.
2) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Mit den
Werten in Tabelle 1 werden die nicht-denaturierten Anteile
angegeben, d.h. der Wert von 100 % bedeutet, daß LF nicht
denaturiert ist. Es wird davon ausgegangen, daß LF gegenüber
dem Erwärmen unter sauren Bedingungen sehr stabil ist.
Ebenfalls wird davon ausgegangen, daß es merkliche Abstände
zwischen den nicht-denaturierten Anteilen von auf 80 ºC
erhitzten Proben von pH 6 und 7, denen von auf 90 ºC
erhitzten Proben mit pH 6 und 7 und denen von auf 100 ºC
erhitzten Proben mit pH 5 und 6 gibt. Um die Werte zwischen
den Abständen zu interpolieren und die bevorzugten
Bedingungen der Wärmebehandlung unter den praktischen
Temperaturen herauszufinden, wurden ähnliche Tests an den
Proben mit kleinerer Differenz der pH-Werte durchgeführt.
Insbesondere wurden Proben mit pH 6,5 auf 80 0c bzw. 90 0c
und eine Probe mit pH 5,5 bei 100 ºC für 5 Minuten erhitzt.
In den Ergebnissen betrugen deren nicht-denaturierte Anteile
67,3 % (Probe mit pH 6,5 bei 80 ºC erhitzt), 45,0 % (Probe
mit pH 6,5 bei 90 ºC erhitzt) bzw. 63,4 % (Probe mit pH 5,5
bei 100 ºC erhitzt).
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Folgende bevorzugte Kombinationen von
Erwärmungstemperatur und pH-Wert, bei denen ein nicht-denaturierter
Anteil von über 60 % erhalten wurde, wurden festgestellt:
bei 60 ºC mit pH 8 oder weniger, bei 70 ºC mit pH 7 oder
weniger, bei 80 ºC mit pH 6,5 oder weniger, bei 90 ºC mit pH
6,0 oder weniger und bei 100 ºC mit pH 5,5 oder weniger.
Tabelle 1
Temp. Test (ºC) Pos.
pH der LF-Lösung
koagul.
nicht-denat.
Hinweis: Beobachtung mit bloßem Auge
+: vollständig koaguliert ±:
nicht koaguliert,jedoch halbtransparent
-: nicht koaguliert und transparent
nicht-denaturierter Anteil anhand der Flüssigchromatographie:
Zahlenwerte: prozentualer Peak von erhitztem LF
bezogen auf den Peak von nichterhitztem LF im Chromatogramm
x: aufgrund der Koagulation nicht meßbar.
TEST 2
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Die Aufgabe dieses Tests besteht in der Bestimmung der
geeigneten Kombinationen von Erwärmungstemperatur und
Erwärmungsdauer mit verschiedenen pH-Werten, um einen nicht-
denaturierten Anteil von mehr als 60 % zu erzielen.
1) Methode
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Es wurden in der gleichen Weise wie in Test 1 neun
Gruppen von Proben von LF-Lösungen mit verschiedenen pH-
Werten, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 6,5, 7,0 und
8,0, hergestellt. Die resultierenden Lösungen wurden bei
einer Temperatur zwischen 60 ºC und 120 ºC für 100 Minuten
erhitzt. Der nicht-denaturierte Anteil wurde für die
jeweiligen Proben in der gleichen Weise gemessen wie in Test
1, indem ein von ihnen regelmäßig entnommener Anteil
verwendet und gekühlt wurde. Die Intervalle für die Entnahme
der jeweiligen Anteile der Proben betrugen 30 Sekunden
während 1 bis 10 Minuten nach Beginn des Erhitzens, 1 Minute
während 10 bis 20 Minuten bzw. 10 Minuten währen 20 bis 100
Minuten nach Beginn des Erhitzens.
2) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, worin
Kombinationen von Erwärmungstemperatur und Erwärmungsdauer,
bei denen sich ein nicht-denaturierter Anteil von 60 %
ergeben hatte, in bezug auf jede der Proben mit pH 1,0
(dargestellt durch die Linie x - x, mit pH 2,0, dargestellt
durch Δ - Δ,
mit pH 3,0, dargestellt - , mit pH 4,0,
dargestellt durch O - O, mit pH 5,0, dargestellt
durch -, mit pH 6,0, dargestellt durch - , mit pH 6,5,
dargestellt durch - , mit pH 7,0, dargestellt
durch -, und pH 8,0, dargestellt durch - , aufgetragen wurden
und worin die Ordinate die Erwärmungszeit entsprechend der
logarithmischen Einteilung und die Abzisse die
Erwärmungstemperatur zeigen.
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Jede der Kombinationen von Temperatur und Zeit in den
Bereichen unterhalb der jeweiligen Linien in Fig. 1 kann für
die entsprechenden LF-Substanzen mit dem entsprechenden pH
einen nicht-denaturierten Anteil von mehr als 60 % ergeben.
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Es wurde festgestellt, daß LF-Substanzen unter sauren
pH-Wert-Bedingungen zwischen 1,0 und 6,5, insbesondere
zwischen 2,0 und 6,0, stabil sind und daß, selbst wenn LF-
Substanzen auf eine verhältnismäßig höhere Temperatur
erhitzt werden, die Denaturierung von LF bei einem relativ
niedrigen Wert gehalten werden kann, wenn die
Erwärmungsdauer verkürzt wird. Wenn beispielsweise eine LF-
Substanz mit pH 4,0 bei 120 ºC erhitzt wird, kann ein nicht-
denaturierter Anteil von mehr als 60 % durch Einschränkung
der Erwärmungsdauer auf 3 Minuten oder weniger erhalten
werden, obgleich der nicht-denaturierte Anteil 0 % betrug,
wenn die LF-Substanz bei 120 ºC für 5 Minuten (siehe Tabelle
1) erhitzt wurde. Es wird davon ausgegangen, daß bei
Erhitzen einer LF-Substanz mit pH 2,0 bei 100 ºC für 5
Minuten der nicht-denaturierte Anteil kleiner ist als 60 %
(25,7 % in Tabelle 1), der nicht-denaturierte Anteil von
mehr als 60 % jedoch erhalten werden kann, wenn die
Erwärmungsdauer weniger als 2 Minuten beträgt (siehe Fig. 1).
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Es wird davon ausgegangen, daß, um einen nicht-
denaturierten Anteil von mehr als 60 % zu erzielen, jede
Kombination einer Erwärmungstemperatur, einer
Erwärmungsdauer und eines pH-Werts in dem Bereich unterhalb der
Linie gewählt werden kann, die dem angenommenen pH-Wert
einer LF-Substanz unter Berücksichtigung der Aufgabe der
Wärmebehandlung entspricht.
TEST 3
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Die Aufgabe dieses Tests ist die Bestimmung der
Beeinträchtigung der antibakteriellen Aktivität von LF durch
die Wärmebehandlung.
1) Methode
1-1) Herstellung des Kulturmediums und der Vorkultur
1-1-1) Herstellung der Vorkultur
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Von der Stammkultur von Escherichia coli wurden mit
einer Platinöse Bakterienzellen entnommen und auf einer
Agar-Auszählplatte (von Nissui Seiyaku) ausgestrichen,
gefolgt von einer stationären Inkubation bei 35 ºC für 16
Stunden (unter aerober Bedingung). Die auf der Oberfläche
gewachsenen Kolonien der Kultur wurden mit einer Platinöse
aufgenommen und in pasteurisierter physiologischer
Kochsalzlösung zur Herstellung einer Vorkultur suspendiert, die eine
mit einem Spektrophotometer (von Hitachi Saisakusho)
gemessene optische Dichte von 1,0 (bei 660 nm) hatte.
1-1-2) Herstellung von basischem Kulturmedium
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Basisches Kulturmedium (flüssiges Kulturmedium) wurde
durch Auflösen von Bactocasiton (von Difco) in gereinigtem
Wasser mit einer Konzentration von 1 % unter Einstellung des
pH-Werts der resultierenden Lösung auf 7,0 mit Hilfe von 1 M
Natriumhydroxid zubereitet und sodann bei 115 ºC für 15
Minuten pasteurisiert.
1-1-3) Herstellung von Testkulturmedium
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Eine auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellte LF-Lösung
wurde auf 100 ºC für 5 Minuten (zum Pasteurisieren) in der
gleichen Weise wie im Test 1 erhitzt, um eine Testprobe von
erhitzter LF-Lösung herzustellen. Eine Menge der
resultierenden erhitzten LF-Lösung wurde zu einem Teil des
basischen Kulturmediums zugesetzt, um ein Testkulturmedium
herzustellen, das 1.000 ppm erhitztes LF enthielt.
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Die auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellte LF-Lösung
wurde mit einem Membranfilter (von Advantec) filtriert, um
darin verunreinigte etwaige mikrobielle Zellen zu entfernen
und nichterhitzte LF-Lösung herzustellen. Eine Menge der
resultierenden nichterhitzten LF-Lösung wurde zu einem Teil
des basischen Kulturmediums zugesetzt, um ein
Testkulturmedium herzustellen, das 1.000 ppm nichterhitztes LF
enthielt.
1-1-4) Herstellung von Kontrollkulturmedium
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Zu einem Teil des basischen Kulturmediums wurde die
gleiche Menge sterilisiertes Wasser wie die der LF-Lösungen
zur Herstellung der Testkulturmedien zugegeben, um ein
Kontrollkulturmedium herzustellen, das kein LF enthielt.
1-2) Test auf antibakterielle Aktivität
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Jedes der Test- und Kontrollkulturmedien wurde mit der
Vorkultur in einer Konzentration von 1 % beimpft, gefolgt
von einer Inkubation bei 35 ºC für 15 Stunden. Durch
regelmäßiges Messen der optischen Dichte der Nährböden nach 5,
10 und 15 Stunden nach Beginn der Inkubation wurde die
Wachstumshemmrate in der gleichen Weise wie vorstehend
beschrieben bestimmt und entsprechend der folgenden Formel
berechnet.
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Wachstumshemmrate (%) = 100 - (A / B x 100)
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(darin bezeichnet A die Differenz der entsprechenden
optischen Dichten des Testkulturmediums nach 5, 10 und 15
Stunden Inkubation und diejenige vor der Inkubation, während
B die Differenz der entsprechenden optischen Dichten des
Kontrollkulturmediums nach 5, 10 bzw. 15 Stunden
Inkubation sowie diejenige vor der Inkubation angibt).
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Vor und nach der Zugabe von LF-Lösungen oder
sterilisiertem Wasser zum basischen Kulturmedium gab es bei
der Herstellung des Test- und Kontrollkulturmediums keine
wesentlichen Änderungen der pH-Werte.
2) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Es wird
festgestellt, daß die antibakterielle Aktivität von
erhitztem LF und nichterhitztem LF überwiegend die gleiche ist.
Tabelle 2
Probe
Proliferationsinhibitionsrate (%) nach Std.
Kontrolle
nichterhitztes LF
erhitztes LF
TEST 4
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Die Aufgabe dieses Tests ist die Bestimmung des
Einflusses der Wärmebehandlung auf die LF-Eigenschaft der
Eisenbindung.
1) Methode
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Es wurden in der gleichen Weise wie in Test 1 erhitzte
LF-Lösung (pH 4,0 erhitzt auf 100 ºC für 5 Minuten) und
nichterhitzte LF-Lösung hergestellt. Die Eigenschaft der
Eisenbindung der resultierenden LF-Lösungen wurde nach der
Methode von Baer et al. (A. Baer et al., Journal of Dairy
Research, Bd. 46, S. 83, 1979) bestimmt und der prozentuale
Anteil der gebundenen Eisenmenge an erhitztem LF bezogen auf
die an nichterhitztem LF gebundene Eisenmenge berechnet.
2) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die
Eigenschaft der Eisenbindung von erhitztem LF und
nichterhitztem LF ist überwiegend die gleiche, wobei
festgestellt wurde, daß es durch Wärmebehandlung im
wesentlichen keinen Einfluß auf die Eigenschaft der
Eisenbindung des LF gibt.
Tabelle 3
Probe
Eigenschaft derEisenbindung
nichterhitztes LF
erhitztes LF
TEST 5
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Die Aufgabe dieses Tests ist die Bestimmung des
Einflusses der Wärmebehandlung auf die Antigenität von LF.
1) Methode
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Die Antigenität der Proben von erhitztem LF und
nichterhitztem LF, die in der gleichen Weise wie in Test 4
(pH 4,0, erhitzt auf 100 ºC für 5 Minuten) hergestellt
wurden, wurde nach der Methode von Laurell (C. B. Laurell,
Analytical Biochemistry, Bd. 15, S. 45, 1966) gemessen und
der prozentuale Wert der Antigenität von erhitztem LF
bezogen auf den von nichterhitztem LF berechnet.
2) Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Es wurde
festgestellt, daß die Antigenität von erhitztem LF und
nichterhitztem LF überwiegend die gleiche ist, so daß es
keinen wesentlichen Unterschied gibt.
Tabelle 4
Probe
Antigenität (%)
nichterhitztes LF
erhitztes LF
TEST 6
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Die Aufgabe dieses Tests ist die antibakterielle
Aktivität von erhitztem LF bei seinem Zusatz zur Milch zu
veranschaulichen.
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Zu 10 kg sterilisierter Milch (sterilisiert bei 70 ºC
für 30 Minuten mit nachfolgendem Kühlen) wurden 500 g
erhitzte LF-Lösung, hergestellt in der gleichen Weise wie in
Beispiel 3 (Bedingungen der Wärmebehandlung: pH 5,0, bei 70
ºC für 30 Minuten), aseptisch zur Herstellung einer
Testprobe zugegeben (Probe Nr. 1). Die resultierende
Testprobe wurde mit jeweils 200 ml in Flaschen gegeben und
verschlossen. Es wurden hergestellt: eine Kontrollprobe
(Probe Nr. 2), die aus sterilisierter Milch bestand, der
kein LF zugesetzt wurde (Bedingungen der Sterilisierung
waren die gleichen wie bei der zur Herstellung der Testprobe
Nr. 1 verwendeten Milch); eine Kontrollprobe (Probe Nr. 3),
die aus sterilisierter Milch bestand (Bedingungen der
Sterilisierung waren die gleichen wie die bei der zur
Herstellung der Testprobe Nr. 1 verwendeten Milch) und
sterilisiertes LF (deaktiviert) in der Milch (die LF-
Konzentration war die gleiche wie bei Probe Nr. 1).
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Die resultierenden Proben wurden bei 25 ºC haltbar
gemacht, um mit dem bloßen Auge etwaige Veränderungen im
Aussehen zu beobachten und die Aktivität des zugesetzten LF
zu bestimmen.
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Sämtliche Proben Nr. 2 und 3 wurden nach dem zweiten
Tag nach Beginn der Haltbarmachung koaguliert, während bei
der Probe Nr. 1 nach dem fünften Tag nach Beginn der
Haltbarmachung keine Koagulation beobachtet wurde.
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Es wird davon ausgegangen, daß Koagulation von Milch
Säuerung oder Fermentation der Milch bedeuten. Anhand der
Ergebnisse wurde festgestellt, daß antibakterielle Aktivität
von erfindungsgemäß erhitztem LF zur Haltbarmachung der
Milch wirksam ist. Die Ergebnisse dieses Tests legen die
Annahme nahe, daß erfindungsgemäß erhitztes LF auch zur
Haltbarmachung jeder beliebigen und aller anderen Substanzen
außer Milch wirksam ist, wenn das erhitzte LF in der
gleichen Weise zugesetzt wird. Es ist ebenfalls
offensichtlich, daß andere physiologische Aktivitäten des
erhitzten LF, wie sie durch die erwähnten Tests
veranschaulicht wurden, in der Testprobe erhalten bleiben
(Probe Nr. 1).
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Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung
werden nachfolgend einige Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
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In 29,7 kg gereinigten Wassers wurden 300 g
handelsübliches LF (von der Oleofina, Belgien) aufgelöst und
der pH-Wert der resultierenden Lösung sodann mit Hilfe von 1
M Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Die resultierende Lösung
wurde auf 70 ºC für 3 Minuten erhitzt und sodann bei 130 ºC
für 2 Sekunden unter Verwendung des
UHT-Sterilisationssystems (von der Morinaga Engineering) sterilisiert, wonach
auf 15 ºC abgekühlt wird und etwa 30 kg erhitzte LF-Lösung
erhalten werden.
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Der nicht-denaturierte Anteil der resultierenden LF-
Lösung betrug 99 % und wurde nach der gleichen Methode wie
im Test 1 (Flüssigkeitschromatographie) gemessen. Im
Verlaufe der Wärmebehandlung gab es kein Verbrennen und kein
Anhaften von LF an dem Sterilisationssystem. Die
resultierende LF-Lösung kann als ein Medikament in der Form
verwendet werden, wie sie ist, und kann als ein Bestandteil
von pharmazeutischen Zubereitungen oder Kosmetika verwendet
werden sowie als ein Additiv für Nahrungsmittel oder
Futtermittel.
Beispiel 2
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In 20 kg Orangenjuice mit den in Tabelle 5 angegebenen
Bestandteilen wurde 1 kg handelsübliches LF (von der
Oleofina, Belgien) aufgelöst. Die resultierende Lösung wurde
für 15 Minuten bei 80 ºC erhitzt und danach abgekühlt,
aseptisch zu je 200 ml in Gasflaschen gegeben, verschlossen
und auf diese Weise 95 Flaschen Orangenjuice erzeugt. Der
nicht-denaturierte Anteil des erhitzten LF im Orangenjuice
betrug 99,6 % und wurde nach der gleichen Methode wie im
Test 1 gemessen (Flüssigkeitschromatographie).
Tabelle 5
Zucker
Aroma (Orange)
Citronensäure
Natriumcitrat
Kohlensäurewasser
insgesamt
Hinweise:
Beschaffenheit der Mischung: pH 4,5, flüssig, transparent
und orange Färbung.
Beispiel 3
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In 9,5 kg gereinigten Wassers wurden 500 g
handelsübliches LF (von der Oleofina, Belgien) aufgelöst.
Die resultierende Lösung wurde mit Hilfe von 1 M
Citronensäure auf pH 5,0 eingestellt. Die resultierende
Lösung wurde für 30 Minuten bei 70 ºC erhitzt und danach
gekühlt und so etwa 10 kg erhitzte LF-Lösung erhalten.
Beispiel 4
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Es wurde eine Mischung von
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Salatöl 6,8 kg
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Weinessig 1,4 kg
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Zitronensaft 0,13 kg
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Eigelb 1,37 kg
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Tafelsalz 0,06 kg
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Zucker 0,14 kg
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Senf 0,10 kg
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handelsübliches LF 0,1 kg (von Oleofina,
Belgien) ausreichend gerührt und die resultierende Mischung
danach 10 Minuten bei 60 ºC unter Rühren erhitzt, wonach man
abkühlen ließ und dadurch etwa 10 kg Majonäse (pH 4,0)
erhielt, die erhitztes LF enthielt.
Beispiel 5
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Es wurde eine Mischung von
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Wasser 2,9 kg
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handelsüblicher Apfelsaft 0,75 kg
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pulverförmiges Agar 0,05 kg
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mittelkörniger Kristallzucker 2,05 kg
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handelsübliches LF (von der Oleofina, Belgien) 50 g
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homogen gemischt, die resultierende Mischung (pH 5,0) für 20
Minuten bei 90 ºC erhitzt, die resultierende Lösung in eine
flache Pfanne gegossen, wonach man abkühlen ließ. Das
resultierende Gel wurde zu Würfeln von 2 cm geschnitten und
danach auf einem Sieb getrocknet, mit mittelkörnigem
Kristallzucker bestreut und dadurch 500 Stück Gelee erzeugt,
das erhitztes LF enthielt.
Beispiel 6
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In eine Säule mit einem Durchmesser von 10 cm wurden
500 ml eines Ionenaustauschharzes, CM-Toyopearl 650C
(Warenzeichen der TOSOH) eingefüllt und danach 2 l einer
10%igen NaCl-Lösung durch die Säule geleitet, mit Wasser
gewaschen und dadurch einen Ionenaustauschsäule vom Na-Typ
hergestellt. Durch die resultierende Säule wurden 60 l
Ziegenkäsemolke (pH 6,5) mit einer Durchflußrate von 4 l/h
bei 4 ºC durchgeleitet. Die an dem Kunstharz adsorbierten
Bestandteile wurden mit konventionellen Verfahren eluiert
und dadurch etwa 5 l des Eluats erhalten. Das resultierende
Eluat wurde gegen gereinigtes Wasser dialysiert, gefolgt von
einer Ultrafiltration mit einem Ultrafiltrations-Modul SEP-
1013 (von der Asahi Kasei), um das Eluat zu konzentrieren,
wodurch etwa 200 ml einer 1%igen Ziegen-LF-Lösung erhalten
wurden.
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Die resultierende LF-Lösung wurde durch Zusatz von 1 M
Salzsäure auf pH 4,5 eingestellt und für 15 Minuten bei 80
ºC erhitzt, wonach man auf 15 ºC abkühlen ließ und dadurch
etwa 200 ml Ziegen/erhitztes LF-Lösung erhielt.
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Der nicht-denaturierte Anteil des in der Lösung
enthaltenden LF betrug 99,7 % und wurde nach der gleichen
Methode wie in Test 1 gemessen
(Flüssigkeitschromatographie).
Ergebnisse der Erfindung
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Die Ergebnisse der Erfindung sind folgende:
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1) Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes erhitztes
LF läßt sich sicher für Nahrungsmittel, Futtermittel,
Medikamente und Kosmetika verwenden, da es eine natürliche
Substanz ist, die beispielsweise in Milch enthalten ist.
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2) Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet sich für
die Anwendung zur Herstellung und Verarbeitung, bei denen
eine Wärmebehandlung einbezogen wird, von Nahrungsmitteln,
Futtermitteln, Medikamenten und Kosmetika, die LF enthalten.
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3) Alle LF enthaltende Substanzen können durch Erhitzen
sterilisiert, pasteurisiert und gekocht werden, ohne die
physiologischen Aktivitäten von LF zu beeinträchtigen.