DE68928929T2 - L-apfelsäure abbauende hefe zur weinherstellung - Google Patents
L-apfelsäure abbauende hefe zur weinherstellungInfo
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Description
- Beschreibung zum Erfindungspatent "L-Apfelsäure abbauende Hefe für die Weinherstellung".
- Diese Erfindung befasst sich mit einer neuen, durch Fusion von Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe erhaltene Hefe (MB7TCα), die die Fähigkeit besitzt, Apfelsäure abzubauen, und mit einer weiteren neuen, durch Retrofusion des obigen Fusionsprodukts und des elterlichen Stammes Saccharomyces cerevisiae erhaltenen Hefe sowie auch mit neuen, durch Fusion des Produkts MB7TC und einer Hefe mit dem Killer-Phänotyp bzw. einer anderen, Pektinase erzeugenden Saccharomyces cerevisiae erhaltenen Hefen, die alle in der Lage sind. L-Apfelsäure abzubauen.
- Diese neuen Hefen erhielten die Bezeichnungen MB7TCα, MBII, MBK bzw. MBO.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verminderung der Apfelsäure-Azidität in der Weinherstellung.
- Ein Wein wird als sauer betrachtet, wenn er eine erhöhte Konzentration von L-Apfelsäure enthält, die ihrerseits durch Gärung von Mosten aus nicht vollständig reifen Trauben erzeugt wird. Die L-Apfelsäure ist eine der in Mosten und Weinen gegenwärtigen Säuren, und zwar zusammen mit Weinsäure, Zitronensäure und viel kleineren Mengen von Oxalsäure, Uronsäure; Bernsteinsäure, Milchsäure, Essigsäure, Glyoxalsäure, Glycerinsäure, Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, α-Ketoglutarsäure usw.
- Die beiden bezüglich ihrer Konzentration wichtigsten Säuren, Weinsäure und Apfelsäure, werden im Verlauf der Reifung der Trauben am Weinstock zu Zucker umgewandelt. Am Ende der Reifung erleidet die Apfelsäure den schnelleren Abbau, indem ihre Konzentrationen von 200 meq/l auf weniger als 50 meq/l absinken, während die Weinsäure von 150-200 meq/l auf 100 - 150 meq/l absinkt. Der Weinsäuremetabolismus führt fast einen Monat vor der vollen Traubenreife zu ihren niedrigsten Konzentrationen, während der Apfelsäureabbau noch bis zur vollen Traubenreife zunimmt. Wie schon erwähnt, ergeben sich saure Moste bei der Ernte von Trauben, die nicht den vollen Reifeprozess durchlaufen haben. Bei der Gärung ergeben daher diese Moste auch saure Weine.
- Da im Most vorhandene Weinsäure gegenüber der Wirkung von Bakterien und Hefen stabil ist, beschränkt sich die Milderung der Azidität in Weinen durch biologische Prozesse auf den Apfelsäureabbau. Der mikrobielle Abbau von Apfelsäure kann entweder durch die Wirkung von Bakterien der Gattungen Pediococcus, Lactobacillus und Leuconostoc über Apfelsäure-Milchsäure-Gärung unter Bildung von Milchsäure oder durch die Wirkung von Hefen, die Apfelsäure-Alkohol-Gärung bewirken, durch einen Abbau zu Ethanol erfolgen.
- Die Apfelsäure-Milchsäure-Gärung erfolgt vor allem in Weinen mit Aziditäten von weniger als 1 g/l Weinsäure und pH- Werten über 3, 1. Die Gärung mit homoenzymatischen Bakterien, die für Wein am interessantesten ist, sollte bei pH-Werten zwischen 3,2 und 3, 3 erfolgen (A. A. Mendoza und J. C. Rodriguez (1981), Valor Enologico de la Acidez Total de Valoracion, pH y Estado Fisioquimico de los Acidos en el Vino [Die önologische Bedeutung der analytischen Gesamtazidität, pH-Wert und physikochemischer Zustand der Säuren im Wein], in: Erstes Symposium über Önologie und Weinbau, herausgegeben von der Universität von Caxias do Su1, Caxias do Su1, Brasilien, 106 Seiten).
- Schizosaccharomyces pombe-Hefen sind zur Verminderung der Apfelsäure in Wein eingesetzt worden von T. Castelli (1969), 11 Vino al Microscopio [Der Wein im Mikroskop], Verlag Luigi Scialpi, Rom, 248 Seiten; T. Castelli und S. Haznedari (1971), Considerazioni sulla Fermentazione Maloalcolica. Risultati Ottenuti nel Quadriennio [Betrachtungen zur Apfelsäure-Alkohol- Gärung, Ergebnisse von vier Jahren], Atti accad. Ital. Vite e Vino, Band 23, Seiten 177-202; I. Benda und A. Schmitt (1966), Önologische Untersuchungen zum biologischen Säureabbau in Most durch Schizosaccharomyces pombe, Weinberg- und Keller-Band 13, Seiten 129-253: I. Benda (1974), Les Schizosaccharomyces et leur effet desacidifiant en vinification [Die Schizosaccharomyces und ihre säuresenkende Wirkung bei der Weinherstellung], Vignes et Vins, Sonderheft zum Internationalen Önologie-Kolloquium von Arc und Senans, Seiten 31-36; P. Huglin, J. P. Meyer und A. Schaeffer (1976), Elaboration de concentrés de mouts de raisin peu acides à l'aide de levures du genre Schizosaccharomyces [Herstellung wenig saurer Traubenmostkonzentrate mit Hilfe von Hefen der Schizosaccharomyces-Art], C. R. Séances Acad. Agr. France, Band 6. Seiten 412-419; J. P. Gallander (1977), Deacidification of eastern table wines with Schizosaccharomyces pombe [Entsäuerung ostamerikanischer Tafelweine mit Schizosaccharomyces pombe], Am. J. Enol. Viticult., Band 28, Seiten 65-68; und J. L. Carrau (1981), Schizosaccharomyces pombe: Condiçoes para sua Utilizaçao a Nivel Industrial [Schizosaccharomyces pombe: Bedingungen für ihre industrielle Nutzung], in: Erstes Symposium über Önologie und Weinbau, herausgegeben von der Universität von Caxias do Su1, Caxias do Su1, Brasilien, 106 Seiten. Auf Grund von Problemen mit der Wachstumsgeschwindigkeit der Schizosaccharomyces pombe, die grosse Inokula für die Weingärung erfordern (J. L. Carrau, J. L. Azevedo, P. Sudery und D. Campbell (1982), Methods for Recovering Fusion Products Among Oenological Strains of Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe [Methoden für die Gewinnung von Fusionsproduk ten unter önologischen Stämmen von Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe], Rev. Brasil. Genet., Band 5, Heft 1, Seiten 221-226), ist der Einsatz dieser Hefe für den Apfelsäureabbau für die allgemeine Anwendung in Weinkellereien unzweckmässig. Es war tatsächlich eines der Ziele der vorliegenden Erfindung, Hefen durch Fusion von Sphäroplasten von Saccharomyces cerevisiae Montrachet (mit einer höheren Wachstumsgeschwindigkeit) und Schizosaccharomyces pombe Benda I aufzubauen. Diese Hefen können die oben angeführten Probleme lösen, weil ihre Wachstumsgeschwindigkeit höher als die des elterlichen Stammes Saccharomyces pombe ist und sie die Fähigkeit haben, L-Apfe 1 säure abzubauen, und zwar zusätzlich dazu, dass sie einen Teil des Genoms der Hefen, das herkömmlicherweise in der Weingärung verwendet wird, aufweisen.
- Eine Verminderung der Apfelsäurekonzentration begünstigt auch die natürliche Entwicklung der Apfelsäure-Milchsäure- Gärung, die als bestimmender Faktor in der biologischen Stabilisierung von Weinen bekannt ist.
- Die vorliegende Erfindung gründet sich auf den Einsatz der mikrobiellen Genetik, deren Verfahren in den 70er Jahren durch Protoplastenfusion erweitert wurden. Dieses Verfahren gestattet den Austausch genetischen Materials zwischen Zellen, die für eine Kreuzung nicht verträglich sind. Bei Hefen werden in der Protoplastenfusion lytische Enzyme aus dem Verdauungssaft von Helix aspersa benutzt, die zur Bildung von voll (Protoplasten) oder teilweise (Sphäroplasten) wandlosen Zellen führen. Sowohl Protoplasten wie auch Sphäroplasten können in Gegenwart von Polyethylenglycol leicht verschmelzen, wie zuerst von P. von Solingen und J. R. von der Plaat (1 977), Fusion of Yeast Spheroplasts [Fusion von Hefe-Sphäroplasten], J. Bacteriol., Band 130, Seiten 946-947, beobachtet. Die Fusionsprodukte werden sodann Bedingungen unterworfen, die zur erneuten Bildung der Zellenwan dungen führen. Diese Bedingungen schliessen ein Regeneriermedium mit Ca&spplus;&spplus; und einer hohen osmotischen Konzentration ein, wobei Animpfen auf Aufgussplatten den höchsten Prozentsatz an Regenerierung ergibt. Diese Technik ist früher dazu eingesetzt worden, Fusionsprodukte von technischem Interesse zu erhalten (I. Russell und G. G. Stewart (1979), Spheroplast Fusion of Brewer's Yeast Strain [Sphäroplastenfusion eines Brauereihefestammes], J. Inst. Brew., Band 85, Seiten 95-98; R. S. Tubb (1979), Applying Yeast Genetics in Brewing, A Current Assessment [Hefegenetik-Anwendungen in der Brauerei, Heutige Einschätzung], J. Inst. Brew., Band 85, Seiten 286-289). Moderne Weinerzeugungsausrüstungen verwenden ausgewählte Hefen, die unter Verwendung von Starterkulturen für die Gärung eingesetzt werden. Carrau (1982), ebenda, berichtete über die Befähigung von sechs verschiedenen Stämmen von Schizosaccharomyces pombe zum Apfelsäureabbau; diese Stämme bauten 55 bis 75% der Apfelsäure innerhalb von 24 Stunden und 83,8 bis 98,8% der Apfelsäure nach 72 Stunden ab. Auf Grund dieser Fähigkeit der Schizosaccharomyces pombe, Apfelsäure abzubauen, schlug Carrau (1981), ebenda, Gärungen im grossen Massstab unter Anwendung dieser Hefe für den Abbau der Apfelsäure im Wein vor. Dieses Verfahren würde Inokula von 500 · 10&sup5; Zellen von Schizosaccharomyces pombe verwenden, um einen teilweisen Apfelsäureabbau während der Weingärung zu erreichen.
- Die die Erfindungen darstellenden Methodiken werden, hierunter aufgeführt:
- Ein Stamm der Schizosaccharomyces pombe mit der Bezeichnung Benda I wurde als die Hefe mit der ausgeprägtesten Fähigkeit für Apfelsäureabbau ausgewählt. Den Stamm Saccharomyces cerevisiae mit der Bezeichnung Montrachet wählten wir als eine Hefe zum önologischen Gebrauch aus, die in Weinen gute organoleptische Eigenschaften hervorbringt.
- Der Stamm Schizosaccharomyces pombe wächst nicht auf Galactose als einziger Kohlenstoffquelle, während sein Wachstum auf WLN (Difco) zu grünlichen Kolonien führt. Der Montrachet-Stamm von Saccharomyces cerevisiae bildet weisse Kolonien, wenn er in WLN-Medien wächst.
- Diese Erfindung beruht auf der Technik von Goodey (1980), ebenda, ausser dass 0,8 M KCl statt 1 M Sorbit als osmotischer Puffer eingesetzt wurde.
- Nach dem Auftreten von Sphäroplastenniveaus von über 85 in den beiden Aufschlämmungen wurden letztere durch Zentrifugieren aufkonzentriert, die Kügelchen wurden in einem einzigen Röhrchen zusammengenommen und mit 2 ml einer Lösung von 37 Polyethylenglycol 4000 behandelt (Goodey (1980), ebenda).
- Nach der Fusionsbehandlung wurden die Zellen in einem Regeneriermedium (6,67 g YNB, 20 g Glucose, 180 g Sorbit, 1,11 g CaCl&sub2; mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt) regeneriert.
- Die gebildeten Kolonien wurden mikroskopisch untersucht, um das Vorkommen von Kolonien mit unregelmässigen Rändern, "behaarte" Kolonien genannt, festzustellen. Die Färbung der Kolonien wurde in WLN-Medium beobachtet, und Kolonien mit unregelmässigen Rändern, die in WLN auch Farbtöne aufwiesen, die sich von denen der elterlichen Stämme unterschieden, wurden auf ihre Fähigkeit, Apfelsäure abzubauen, untersucht.
- Um den genotypischen Beitrag der Saccharomyces zu den Fusionsprodukten zu steigern, wurde der Stamm MB7TC mit den Stämmen O Mendoza und KI, beide Saccharomyces cerevisiae, sowie auch mit dem elterlichen Stamm Montrachet verschmolzen.
- Die Methoden, die zur Gewinnung der neuen Fusionsprodukte eingesetzt wurden, waren die selben wie die für MB7TC beschriebenen.
- Die durch Sphäroplastenfusion erhaltenen Klone wurden in Prüfröhrchen und in 1000-ml-Erlenmeyerkolben mit Traubenmost untersucht. Ein racemisches Apfelsäuregemisch (10 g/l) wurde den Mosten für die Untersuchung der Befähigung zum Apfelsäureabbau zugesetzt. Die Ergebnisse für Klon MB7TC bezüglich der Gärfähigkeit, die durch CO&sub2;-Freisetzung unter Benutzung von Müllerschen Ventilen mit dem Verfahren von Castelli (1969), ebenda, bestimmt wurde, sowie die Ergebnisse bezüglich des Apfelsäureabbaus werden in Fig. 1 bzw. Tabelle 1 vorgestellt. Es ist ersichtlich, dass die Gärgeschwindigkeit mit MB7TCα höher ist als die mit dem elterlichen Schizosaccharomyces pombe-Stamm, und weiter, dass die Apfelsäure senkende Fähigkeit gut ausgeprägt ist.
- Bei der Weinherstellung erreichen die Konzentrationen nativer Hefezellen nach der Extraktion des Traubensaftes oft Werte von mehr als 10&sup6; Zellen/ml, was besagt, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Hefen in ähnlichen Konzentrationen inokuliert werden müssen, damit ihre Befähigung zum Apfelsäureabbau zum Ausdruck kommt. Die vorliegende Erfindung schlägt ein Weinherstellungsverfahren vor, das Inokula von 100 · 10&sup5; Zellen/ml an Fusionsprodukten zu Beginn der Gärung einsetzt, um Wein mit teilweisem Abbau der L-Apfelsäure zu erhalten. Tabelle 1: Apfelsäureabbau durch das Fusionsprodukt MB7TCα und die elterlichen Stämme Montrachet und Benda I in meq/l und in Gesamt-%
- Fig. 1: Gärungsgeschwindigkeit der Hefe MB7TCα, verglichen mit der Gärungsgeschwindigkeit der elterlichen Stämme Montrachet und Benda I
Claims (7)
1. Hefen, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Fusion
von Saccharomyces cerevisiae (Montrachet) und
Schizosaccharomyces pombe (Benda I) erhalten werden, dass sie schneller als
der elterliche Stamm Schizosaccharomyces pombe wachsen, dass sie
einen Teil des Genoms der herkömmlicherweise bei der Weingärung
verwendeten Hefen aufweisen und dass sie die Fähigkeit besitzen,
L-Apfelsäure abzubauen.
2. Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Fusion
einer Hefe nach Anspruch 1 und des elterlichen Stamms
Saccharomyces cerevisiae (Montrachat) erhalten wird, dass sie schneller
als der elterliche Stamm Schizosaccharomyces pombe wächst, dass
sie einen Teil des Genoms der herkömmlicherweise bei der
Weingärung verwendeten Hefen aufweist und dass sie die Fähigkeit
besitzt, L-Apfelsäure abzubauen.
3. Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Fusion
einer Hefe nach Anspruch 1 und einer Saccharomyces cerevisiae-
Hefe mit Killer-Phänotyp erhalten wird, dass sie schneller als
der elterliche Stamm Schizosaccharomyces pombe wächst, dass sie
einen Teil des Genoms der herkömmlicherweise bei der Weingärung
verwendeten Hefen aufweist und dass sie die Fähigkeit besitzt,
L-Apfelsäure abzubauen.
4. Hefe, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch Fusion
einer Hefe nach Anspruch 1 und einer O Mendoza genannten
Saccharomyces cerevisiae-Hefe erhalten wird, dass sie schneller als
der elterliche Stamm Schizosaccharomyces pombe wächst, dass sie
einen Teil des Genoms der herkömmlicherweise bei der Weingärung
verwendeten Hefen aufweist und dass sie die Fähigkeit besitzt,
L-Apfelsäure abzubauen.
5. Hefe gemäss einem beliebigen der vorangehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in
Weinherstellungsverfahren verwendet wird.
6. Verfahren zur Verminderung der Apfelsäure-Azidität in
der Weinherstellung, dadurch gekennzeichnet, dass es Hefen
verwendet, die gemäss einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4
erhalten wurden.
7. Verfahren zur Verminderung der Apfelsäure-Azidität
gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es
Konzentrationen von 100 · 10&sup5; Zellen einer beliebigen Hefe nach den
vorangehenden Ansprüchen als ein dem Most zu Beginn der Gärung
hinzuzufügendes Inokulum verwendet.
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