CN109486692A - 双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母及其制备方法 - Google Patents

双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母及其制备方法 Download PDF

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CN109486692A CN201811441241.4A CN201811441241A CN109486692A CN 109486692 A CN109486692 A CN 109486692A CN 201811441241 A CN201811441241 A CN 201811441241A CN 109486692 A CN109486692 A CN 109486692A
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Abstract

本发明涉及双亲灭活原生质体融合法构建枸杞酿酒酵母及其制备方法，融合菌株枸杞酿酒酵母保藏编号为CGMCC16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心。安琪酵母发酵枸杞能力较强，但发酵后酒体较平淡，香气不足；而BY酵母酒香浓郁、酒体丰满，但发酵枸杞能力差，发酵周期长、酒精度不高。本发明应用热‑紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内，融合后得到一株酵母，同时具有二者的优点，即获得新的具有发酵枸杞能力较强且酒香浓郁的融合菌株。融合菌株发酵的枸杞酒，在果香、花香等方面明显高于安琪酵母发酵生产的枸杞酒。

Description

双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母
背景技术
枸杞子药食同源的历史悠久，是驰名中外的名贵中药材，早在《神农本草经》中就被列为上品，称其为“久服轻身不老、耐寒暑”；有延衰抗老的功效，又名“却老子”。适合所有人食用，含有丰富的营养成分和药理活性成分，具有较高的食用价值，是理想的健身佳品。宁夏是枸杞的主产区，利用枸杞发展枸杞酒酿造业有着很好的发展前景，以枸杞等水果为原料酿造的果酒，酒度低，酒质沮和爽口，果香味浓，营养价值高，基本保持了水果中的天然营养成分，并且富含人体所需的各种氨基酸，多种维生素及矿物质，是所有酒品中具有很大发展前途的酒种。发酵型枸杞酒是集天然、营养、滋补于一体的高品位功能性保健饮品，具有巨大的经济价值和市场潜力。
酿造枸杞酒所使用酵母多为葡萄酒酵母，并不真正适宜发酵枸杞，虽有些关于发酵型枸杞酒酵母选育的报道，但多是从耐酒精度、耐糖、起酵速度快等方面出发的，没有考虑如何提高发酵后酒的香气，对酒的品质没有明显提高。
因此，需要制备一种适宜发酵枸杞的酵母菌种。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株及其制备方法和应用。本发明运用双亲灭活原生质体融合技术构建优良菌株，在发酵枸杞汁实验中分别筛选出两株酵母，一株适宜发酵枸杞，另一株产香性能好，酒香、果香浓郁，将这两株选出的酵母进行原生质体融合，得到一株同时具有两株酵母优点的酵母菌。融合子发酵的枸杞酒，在果香、花香等方面明显高于安琪酵母发酵生产的枸杞酒；但草药味略有增加，而脂肪味却明显减少。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株，所述融合菌株为枸杞酿酒酵母-18(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC 16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供了双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，包括以下步骤：
(1)两亲本菌体的制备：将安琪酵母和BY酵母接种到斜面完全培养基，活化后立即取菌一环株于100ml麦芽汁培养基中培养至对数期，制得两亲本菌体；
(2)两亲本原生质体的制备：向步骤(1)中制备的安琪酵母亲本菌体和BY酵母亲本菌体分别添加1％质量浓度蜗牛酶酶解，作用时间30min，温度30℃。分别制得含有安琪酵母原生质体和BY酵母原生质体的悬浮液；
(3)两亲本原生质体的融合：取步骤(2)中制备的安琪酵母原生质体悬浮液采用紫外灯照射，使安琪酵母原生质体完全被灭活；取步骤(2)中制备的BY酵母原生质体悬浮液加热处理，使BY酵母原生质体完全被灭活；取灭活的两亲株原生质体,融合条件为PEG(分子量6000)浓度35％、CaC12浓度10mmol/l、作用时间20-30min、作用温度35℃得到融合的原生质体；
(4)融合子的再生：取步骤(3)中融合后的原生质体涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养4d，得到再生的融合子；
(5)融合子的筛选：融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养2-3天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落，然后再将选出的菌培养2-3天后再用重氮染色平板法筛选出颜色浅的菌株，复筛选出枸杞发酵能力强且产酒香物质多的稳定融合子。
优选的，所述TTC平板法为：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的再生的融合子用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，30℃倒置培养2-3天后，选择菌落数为300的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温2-3小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。
优选的，所述重氮染色平板法为：将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养箱内培养48小时，待长出小菌落后将含有0.25％的1-乙酸萘酯、0.25％固蓝盐B和1.5％琼脂的0.50mol/L，pH为4.0的醋酸盐缓冲液倾注于平板上，选取乙酸异戊酯产量高的颜色浅的菌株。
优选的，步骤(1)中，麦芽汁培养基中培养条件为，28℃，200rpm培养24-48小时。
优选的，步骤(2)中，添加蜗牛酶酶解条件为：温度30℃，作用时间20-30min。
优选的，步骤(3)中，紫外灭火的条件为：在10W功率的紫外灯照射6-8min，垂直照射距离为20cm，使安琪酵母原生质体完全被灭活。
优选的，步骤(3)中，加热灭活的条件为：在55℃水浴中处理10-12min时，使BY酵母原生质体完全被灭活
优选的，双亲灭活酵母原生质体融合菌株在枸杞酒发酵中的应用。
发明原理：本发明应用热-紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内，获得新的具有发酵枸杞能力较强且酒香浓郁的融合菌株。
有益效果
本发明通过利用双亲灭活酵母原生质体的方法，制备出一株同时具有两株酵母优点的酵母菌。在遗传性上比较稳定，并且融合子发酵的枸杞酒，酒精度高，草药味略有增加，脂肪味明显减少。在果香、花香等方面明显高于安琪酵母发酵生产的枸杞酒。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法：
(1)两亲本菌株的培养
斜面上各挑取一环亲本菌株于麦芽汁培养基中培养，28℃，200rpm培养至对数期。
(2)两亲本菌株原生质体的制备
用麦芽汁培养基培养至对数期后的酵母，添加1％质量浓度蜗牛酶，温度30℃，作用时间20min。
热灭活：取原生质体悬液，在55℃下作用不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经热处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养4d，当BY酵母的原生质体悬浮液在55℃水浴中处理10min时，其灭活率可达到100％。
紫外线灭活：取原生质体悬液，置于紫外灯(功率：10W；灯距：20cm)下照射不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经紫外线处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养4d，计算原生质体的存活率。紫外灯照射8min，安琪酵母原生质体的灭活率可达到100％；
(3)两亲本菌株原生质体的融合
融合条件为PEG(分子量6000)浓度30％、CaC12浓度10mmol/L，添加量为1wt％，作用时间20min、作用温度35℃，融合后涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养4d。将紫外线灭活的安琪酵母原生质体和热灭活的BY酵母原生质体，按上述条件进行融合，结果原生质体的融合率为2.2×10-5。
(4)融合子的筛选及验证
TTC平板法筛选产酒精能力强的酵母：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的酵母用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，30℃倒置培养2天后，选择菌落数为200的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温2小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。
重氮染色平板法再筛选产酒香物质多的酵母：
将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养箱内培养48小时，待长出小菌落后将含有0.25％的1-乙酸萘酯、0.25％固蓝盐B和1.5％琼脂的0.50mol/L，pH为4.0的醋酸盐缓冲液倾注于平板上。乙酸异戊酯水解酶催化平板上的1-乙酸萘酯生成萘酚，后者与偶氮盐(固蓝盐B)反应，生成偶氮色素呈红色。当底物(1-乙酸萘)浓度一定时，酯酶活力越高，产物萘酚的量越大，生成的偶氮色素越多，颜色越深。因此颜色浅的菌株乙酸异戊酯产量越高。
融合子的筛选及验证的具体结果为：融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养2天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落5株，每个菌培养2天后再用重氮染色平板法筛选出3株分别记为枸杞-1、枸杞-2和枸杞-3，将这3个菌接入枸杞浆中发酵，待后发酵结束，气相色谱法测定酒精、果香以及异戊醇与乙酸异戊酯的比值(EER)。
本实例筛选出三个融合子枸杞-1，枸杞-2，枸杞-3，其中枸杞-3果香虽然没有BY酵母高，但是比安琪酵母高，酒精度方面高于BY酵母和安琪酵母，EER值最接近BY酵母，说明融合子很好的表达了亲本菌株的独特优势，高产酒精又产香浓郁。
气相色谱条件：
色谱柱：1993-3SC AF酒柱20m×0.53mm；柱温为75℃，进样室温度为120℃，检测器温度为135℃；
载气(高纯氮气)：柱前压为20kPa，柱体积流速为2.96mL/min；氢气：30mL/min，空气：300mL/min，尾吹：30mL/min；
进样方式：顶空进样，不分流；
测定方法：采用保留时间法定性分析和内标法定量分析异戊醇和乙酸异戊酯，其中内标物为正丁醇。
GC-MS分析条件：
进样方式：固相微萃取；
HP-INNOWAX柱(30m×250μmid×0.25μmdf)；
进样口温度250℃；
程序升温：50℃(2min)，240℃(15min)；
氦气流速：1mL/min，进样量：1μL，分流比：10：1；
气相定量用乙酸异丁酯作为内标物。
质谱实验条件：
EI源电子能量70ev，电子倍增器电压1650V，质量扫描范围：30-550AMU，
离子源温度230℃，四极杆温度130℃；
对采集到的质谱图利用Nist02谱库进行检索。
实施例2
一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法：
(1)两亲本菌株的培养
斜面上各挑取一环亲本菌株于麦芽汁培养基中培养，28℃，200rpm培养至对数期。
(2)两亲本菌株原生质体的制备
用麦芽汁培养基培养至对数期后的酵母，添加1.0％质量浓度蜗牛酶，温度30℃，作用时间25min。
热灭活：取原生质体悬液，在55℃下作用不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经热处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养3d，当BY酵母的原生质体悬浮液在55℃水浴中处理11min时，其灭活率可达到100％。
紫外线灭活：取原生质体悬液，置于紫外灯(功率：10W；灯距：20cm)下照射不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经紫外线处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养3d。紫外灯照射6min，安琪酵母原生质体的灭活率可达到100％；
(3)两亲本菌株原生质体的融合
融合条件为PEG(分子量6000)浓度40％、CaC12浓度10mmol/L，添加量为1wt％、作用时间20min、作用温度35℃，融合后涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养。将紫外线灭活的安琪酵母原生质体和热灭活的BY酵母原生质体，按上述条件进行融合，结果原生质体的融合率为1.6×10--4。
(4)融合子的筛选及验证
用TTC法筛选菌株的产酒精能力，筛选出产酒精高、发酵能力好的菌株后，再用重氮染色平板法检测乙酸异戊酯水解酶活力。将筛选出的菌株接入调整好的枸杞浆中发酵，待后发酵结束，测定酒样中的枸杞香气物质。
TTC平板法筛选产酒精能力强的酵母：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的酵母用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，30℃倒置培养2天后，选择菌落数为300的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温2小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。
重氮染色平板法再筛选产酒香物质多的酵母：
将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养箱内培养48小时，待长出小菌落后将含有0.25％的1-乙酸萘酯、0.25％固蓝盐B和1.5％琼脂的0.50mol/L，pH为4.0的醋酸盐缓冲液倾注于平板上。乙酸异戊酯水解酶催化平板上的1-乙酸萘酯生成萘酚，后者与偶氮盐(固蓝盐B)反应，生成偶氮色素呈红色。当底物(1-乙酸萘)浓度一定时，酯酶活力越高，产物萘酚的量越大，生成的偶氮色素越多，颜色越深。因此颜色浅的菌株乙酸异戊酯产量越高。
融合子的筛选及验证的具体结果为：融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养3天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落7株，每个菌培养3天后再用重氮染色平板法筛选出5株，分别记为枸杞-4至枸杞-8，将这5个菌接入枸杞浆中发酵，待后发酵结束，气相色谱法测定酒精、果香以及异戊醇与乙酸异戊酯的比值(EER)，测试条件同实施例1。
本实例筛选出5个融合子，其中枸杞-7在EER值，果香和酒精度上均表现了亲本的优良特性，而且除枸杞-8，其他融合子的果香均高于安琪酵母，而酒精度均没有高于安琪酵母，说明双亲灭火酵母原生质体方法具有较强的可行性，并且效果显著。本发明的保藏的菌种就对应于上述的枸杞-7，即枸杞酿酒酵母-18(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC 16558。
实施例3
一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法：
(1)两亲本菌株的培养
斜面上各挑取一环亲本菌株于麦芽汁培养基中培养，28℃，200rpm培养至对数期。
(2)两亲本菌株原生质体的制备
用麦芽汁培养基培养至对数期后的酵母，添加1.0％质量浓度蜗牛酶，温度30℃，作用时间20min。
热灭活：取原生质体悬液，在55℃下作用不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经热处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养5d，当BY酵母的原生质体悬浮液在55℃水浴中处理12min时，其灭活率可达到100％。
紫外线灭活：取原生质体悬液，置于紫外灯(功率：10W；灯距：20cm)下照射不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经紫外线处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养5d，紫外灯照射7min，安琪酵母原生质体的灭活率可达到100％；
(3)两亲本菌株原生质体的融合
融合条件为PEG(分子量6000)浓度40％、CaC12浓度10mmol/L，添加量为1wt％、作用时间30min、作用温度35℃，融合后涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养。将紫外线灭活的安琪酵母原生质体和热灭活的BY酵母原生质体，按上述条件进行融合，结果原生质体的融合率为6.7×10-5。
(4)融合子的筛选及验证
用TTC法筛选菌株的产酒精能力，筛选出产酒精高、发酵能力好的菌株后，再用重氮染色平板法检测乙酸异戊酯水解酶活力。将筛选出的菌株接入调整好的枸杞浆中发酵，待后发酵结束，测定酒样中的枸杞香气物质。
TTC平板法筛选产酒精能力强的酵母：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的酵母用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，30℃倒置培养3天后，选择菌落数为100的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温3小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。
重氮染色平板法再筛选产酒香物质多的酵母：
将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养箱内培养48小时，待长出小菌落后将含有0.25％的1-乙酸萘酯、0.25％固蓝盐B和1.5％琼脂的0.50mol/L，pH为4.0的醋酸盐缓冲液倾注于平板上。乙酸异戊酯水解酶催化平板上的1-乙酸萘酯生成萘酚，后者与偶氮盐(固蓝盐B)反应，生成偶氮色素呈红色。当底物(1-乙酸萘)浓度一定时，酯酶活力越高，产物萘酚的量越大，生成的偶氮色素越多，颜色越深。因此颜色浅的菌株乙酸异戊酯产量越高。
融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养3天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落5株，每个菌培养2天后再用重氮染色平板法筛选出4株分别记为枸杞-9至枸杞-12，将这4个菌接入枸杞浆中发酵，待后发酵结束，气相色谱法测定酒精、果香以及异戊醇与乙酸异戊酯的比值(EER)，测试条件同实施例1。
本实例筛选出4个融合子，从EER值可以看出枸杞-10比BY酵母小，而酒精度和果香指标均表示枸杞-10充分表达了两亲本的优点。
以上实施例均证明，经过本发明的制备方法，可以有效制备表达了两亲本的优点，酒精度和果香优异的融合菌株。

Claims (9)

1.一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株，其特征是：所述融合菌株为枸杞酿酒酵母-18(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC 16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）两亲本菌体的制备：将安琪酵母和BY酵母接种到斜面完全培养基，活化后立即用接种环取菌一环接种到100ml麦芽汁培养基中，28℃培养恒温摇床培养至对数期，制得两亲本菌体；
（2）两亲本原生质体的制备：向步骤（1）中制备的安琪酵母亲本菌体和BY酵母亲本菌体分别添加1％质量浓度蜗牛酶酶解，作用时间 20-30min，温度 30℃，分别制得含有安琪酵母原生质体和BY酵母原生质体的悬浮液；
（3）两亲本原生质体的融合：取步骤（2）中制备的安琪酵母原生质体悬浮液采用紫外灯照射，使安琪酵母原生质体完全被灭活；取步骤（2）中制备的BY酵母原生质体悬浮液加热处理，使BY酵母原生质体完全被灭活；取灭活的两亲株原生质体各5mL混合，4000rpm离心15min，弃上清液，再向沉淀液中加入PEG (分子量6000) 浓度 35wt％、CaC12浓度10mmol/L，作用时间 20 -30min，作用温度35℃得到融合的原生质体；
（4）融合子的再生：取步骤（3）中融合后的原生质体涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养4天，得到再生的融合子；
（5）融合子的筛选：融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养2-3天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落，然后再将选出的菌培养2-3天后再用重氮染色平板法筛选出颜色浅的菌株，复筛选出枸杞发酵能力强且产酒香物质多的稳定融合子。
3.根据权利要求2所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于，所述TTC平板法为：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的再生的融合子用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，28℃倒置培养2-3天后，选择菌落数为100-300的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温2-3小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。
4.根据权利要求3所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于，所述重氮染色平板法为：将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养箱内培养48小时，待长出小菌落后将含有0.25%的1-乙酸萘酯、0.25%固蓝盐B和1.5%琼脂的0.50 mol/L，pH为4.0的醋酸盐缓冲液倾注于平板上，选取乙酸异戊酯产量高的颜色浅的菌株。
5.根据权利要求2所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，麦芽汁培养基培养条件为，28℃，200rpm培养24-48小时。
6.根据权利要求2所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，添加蜗牛酶酶解条件为：1％质量浓度蜗牛酶，温度30℃，作用时间20-30min。
7.根据权利要求2所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，紫外灭活的条件为：在10W功率的紫外灯照射6-8min，垂直照射距离为20cm，使安琪酵母原生质体完全被灭活。
8.根据权利要求2所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，加热灭活的条件为：在55℃水浴中处理10-12min时，使BY酵母原生质体完全被灭活。
9.根据权利要求1所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的应用，其特征在于：双亲灭活酵母原生质体融合菌株在枸杞酒发酵中的应用。
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