DE68913393T2 - Methode zur Trennung von Hydroxy-Cyclopentenonen unter Verwendung einer Lipase und Transacylierungsagenzien. - Google Patents

Methode zur Trennung von Hydroxy-Cyclopentenonen unter Verwendung einer Lipase und Transacylierungsagenzien.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine enzymatische Spaltungsmethode zur Herstellung von chiralen Hydroxycyclopentenonen durch lipasekatalysierte irreversible Umesterung unter Verwendung von Enolestern als Transacylierungsreagentien.
  • Hydrolytische Enzyme, wie Lipasen, Esterasen und Proteasen, sind ausgiebig verwendet worden als Katalysatoren in enantioselektiven Synthesen Whitesides, G.M., Wong, C-H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 24 (1985) 617; Jones, J.B. Tetrahedron 42 (1986); Roberts, S.M. Chem. Br. (1987) 127; Akiyama, A., Bednarski, M., Kim, M.J., Simon, E.S., Waldman, H.I., Witesides, G.M. Ibid. (1987) 645. Wegen ihrer relativ hohen Stabilität in organischem Medium können viele hydrolytische Enzyme außerdem verwendet werden in organischen Lösungsmitteln für bestimmte Arten von Umwandlungen, die schwierig in Wasser durchzuführen sind. Die üblichsten Reaktionen sind esterase- und lipasekatalysierte stereoselektive Veresterungen und Umesterungen. Klibanov, A.M. CHEMTECH (1986) 354-9; Klibanov, A.M., Cambou, B. J. Am. Chem. Soc. 106 (1984) 2687-92, Chen, C-S., Wu, S-H., Girdaukas, G., Sih, C.J. J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 2812-17; Guo, Z.W., Sih, C.J. Ibid. 110 (1988) 1999-2001; Gil, G., Ferre, E., Meou. A., Petit, J.L, Triantaphylides, C. Tetrahedron Lett. 28 (1987) 1647; Yokozeki, K., Yamanaka, S., Takinami, K., Hirose, Y., Tanaka A., Sonomoto, K., Fukui, S. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnicol 14 (1982) 1; Tambo, G.M.R., Schar, H-P., Busquets, X.F., Ghisalba, O. Tetrahedron Lett. 27 (1986) 5705-10; Belan, A., Bolte, J., Fauve, A., Gourey, J.G., Veschambre, H. J. Org. Chem. 52, 256-60. Langrand, G., Baratti, J., Buono, G., Triantaphylides, C. Tetrahedron Lett. 27 (1986) 29-32.
  • Ein Nachteil von enzymkatalysierten hydrolytischen Reaktionen besteht darin, daß sie sehr langsam sind, verglichen mit einfachen Hydrolysen. Langrand, G., Baratti, J., Buono, G., Triantaphylides, C. Tetrahedron Lett. 27 (1986) 29-32). Außerdem müssen durch enzymatische Hydrolysen hergestellte Produkte sehr oft von anderen Nebenprodukten getrennt werden (insbesondere Alkohol, der vom Acylierungsreagens gebildet wird). Aufgrund der reversiblen Natur dieser Reaktionen und aufgrund der gleichen Stereoselektivität der Enzymkatalyse in beide Richtungen verringert sich die optische Reinheit der erzielten Produkte mit Fortschreiten der Umkehrreaktion. Diese Situation wird erläutert in Fig. 1, wo ein racemischer Alkohol zu spalten ist auf dem Weg über eine enzymatische Veresterung (R" = H) oder Umesterung. FIG. 1 (bedeutend) (unbedeutend)
  • Wie aus FIG. 1 ersichtlich ist, wird, wenn das D-Isomer ein besseres Substrat ist als das L-Isomer für das Enzym, die Akkumulierung des D-Esters und des unreaktiven L-Alkohols beobachtet werden. In der umgekehrten Reaktion jedoch ist der D-Ester ein besseres Substrat und wird zum D-Alkohol umgewandelt. Der enantiomere Überschuß von beiden, dem D-Ester und dem L-Alkohol, wird sich somit progressiv verringern, wenn sich das Ausmaß der Umkehrreaktion verringert. Dieses Umkehrreaktionsproblem ist klar in der kinetischen Spaltung von Menthol erläutert worden, Chen, C-S., Wu, S-H., Girdaukas, G., Sih, C.J. J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 2812-17; Guo, Z.W., Sih, C.J. Ibid. 110 (1988) 1999-2001, und kann beobachtet werden in der enantioselektiven Veresterung oder Umesterung von Mesoverbindungen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Das erfindungsgemäße Verfahren blockiert das Fortschreiten der Umkehrreaktion. Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren für die irreversible regio- und stereoselektive enzymkatalysierte Acylierung von Alkoholen unter Verwendung von Enolestern als Acylierungsreagenzien. Die vorliegende Erfindung gestattet die selektive Modifizierung von Hydroxylgruppen von chiralen Hydroxycyclopentenonen.
  • Die Einfachheit dieser irreversiblen Umesterung macht diese Arbeitsweise geeignet für die Herstellung von chiralen Alkoholen oder Estern, die durch andere Maßnahmen schwierig hergestellt werden können.
    • Enzymatische Spaltung von Hydroxycyclopentenonen unter Verwendung von Lipase
  • Lipasekatalysierte Reaktionen wurden bei der Spaltung von Hydroxycyclopentenonen als Erläuterung in den folgenden Reaktionsschemen verwendet, wobei spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erläutert werden.
  • Unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens wurde die Spaltung von Hydroxycyclopentenonen erzielt. Insbesondere sind Hydroxyalkyl-carbonylalkyl-, -alkenyl- oder -alkinylcyclopentenone, die wahlweise ein Heteroatom in der Seitenkette enthalten, zur Durchführung der beschriebenen Methode geeignet. Die Verbindungen können durch die Formel erläuternd beschrieben werden:
  • worin X Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, das wahlweise ein Heteroatom, nämlich S oder O, in der 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9-Position aufweisen kann; und R CH&sub2;OR bedeutet, worin R Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Tetrahydropyranyl, Ethoxyethyl, Acyl oder CO&sub2;R&sub2; oder (R&sub3;)&sub3;Si bedeutet, worin R&sub2; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und R&sub3; Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aryl bedeutet.
  • In der Praxis und im vorliegenden bevorzugte Ausführungsformen der Methode werden in nachstehenden Beispielen beschrieben.
  • Es wurden verschiedene Lipasen verwendet, die im Handel erhältlich sind, nämlich Candida cylindracea (CC), Pseudomonas Species (P.Sp.), Schweinepankreas-Lipase (PPL), alle von Sigma Chemical, und Amano P, ANL, Aspergilus Niger, ChE, Cholesterolesterase, alle von Amano Co. Die Rolle des Lösungsmittels mit Bezug auf Reaktionsgeschwindigkeit und Ausmaß der kinetischen Spaltung wurde ebenfalls studiert. Die Umwandlungen wurden aufgezeichnet unter Verwendung von Normalphasen-HPLC an Silicagel (Zorbax sil), und die optischen Reinheiten der Produkte wurden analysiert unter Verwendung von HPLC an chiraler stationärer Phase (Chiracel OD-Säule). Schema 1 Schema 2 Lipase Vinylacetate Guanidine Diethylazodicarboxylat Triphenylphosphin Ameisensäure Neutrales Alumina
  • Eine bevorzugte Lipase unter den vorstehend genannten ist Schweinepankreas-Lipase oder Amano P.
  • Bevorzugte Acylierungsmittel sind Isopropenylacetat, Isopropenylvalerat, Vinylacetat, Vinylpropionat und Vinylvalerat und unter diesen insbesondere Isopropenylacetat oder Vinylacetat.
  • Außerdem ist die Methode besonders geeignet wenn Schweinepankreas (PPL) die Lipase ist, Vinylacetat die Acylierungsverbindung ist und die Verbindung für die Spaltung
  • Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat (1S),
  • Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4-heptenoat (4),
  • 3-(3-Hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)propyn (5),
  • Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-5Z-heptenoat (6) oder
  • Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-heptenoat (7) ist, oder am meisten bevorzugt Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat ist.
  • Außerdem kann die Lipase an einem Träger immobilisiert sein.
  • Bevorzugte Lösungsmittel, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Toluol, t-Butylmethylether, Tetrahydrofuran, Diethylether, Hexan und am meisten bevorzugt CHCl&sub3;, Benzol.
  • Zwei kritische Forderungen sind zu berücksichtigen: a) Enon (1S), das die unerwünschte (S)-Konfiguration aufweist, muß invertiert werden mit hoher Stereospezifität, um das erforderliche (R)-Enon (1R) zu ergeben; b) über die Hälfte des Produktes von der Lipasereaktion war 11-OAc-enon (2R), das vorwiegend (94%) das (R)-Isomer war. Eine Methode zur Anreicherung dieses Materials für eine brauchbare optische Reinheit (d.h. 98%) war wünschenswert.
  • Mit Bezug auf den ersten Punkt wurde gefunden, daß Enon (1S) umgewandelt werden konnte zu (1R) auf dem Weg über die Mitsunobu-Chemie.
  • Im vorliegenden Fall wurde, wenn (15) von 99,9% (S) Reinheit den Mitsunobu-Bedingungen unterworfen wurde (Bull. Chem. Soc. Japan 44 3427, 1971), unter Verwendung von Ameisensäure als Nucleophil und dann unmittelbarer Hydrolyse des Formatesterzwischenproduktes, eine 91-94%ige chromatographierte Ausbeute von invertiertem Enon (1R) erhalten wurde, das 99,2-99,6% (R)-Isomer war. Somit erfolgte nur maximal eine 0,3-0,5%ige Racemisierung. Dieses Produkt wurde dann umgewandelt in sein Triethylsilylderivat (3) in 94%iger Ausbeute nach Chromatographie. Wiederum zeigte HPLC-Analyse an chiraler OD-Säule, daß dieses Material von identischer optischer Reinheit gegenüber seinem Vorläufer (99,3% R) war.
  • Diese enzymatische Spaltungsmethode, verbunden mit der Mitsunobu-Alkoholinversionstechnologie, wie sie hier beschrieben wird, ermöglicht die Herstellung von jeweiligen gewünschten Antipoden des optisch reinen Alkohols.
  • Die nachstehend wichtigen Eigenschaften des beschriebenen Verfahrens sollten zur Kenntnis genommen werden. Für die Lipase-Reaktionen sind keine speziellen Apparaturen oder inerte Atmosphäre erforderlich, da alle Reaktionen in organischen Lösungsmitteln in Abwesenheit von Wasser durchgeführt wurden. Eine kinetische Spaltung in der Größenordnung von 0,1-0,2 kg von racemischem Enon wurde leicht im Labor durchgeführt. Die vier vorstehend gezeigten Hydroxyenone wurden außerdem enzymatischer Spaltung unterworfen, unter Verwendung von PPL in Vinylacetat, wie für Verbindung (1) beschrieben. Mehr als 92% ee (nichtoptimiert) wurde in allen Fällen nach 4 Tagen Reaktionszeit erzielt. Chromatographie ist ein notwendiges Reinigungsverfahren für jede Hydroxy-zu-Acetat- Transformierung, da die Unterlassung der quantitativen Entfernung von Acetat vom Alkohol zu effektiver Racemisierung führen wird. Alle chemischen und enzymatischen Reaktionen erfolgen hochgradig stereoselektiv und in hoher Ausbeute. Drei Chargen von Ziel-Triethylsilyl (3) wurden hergestellt: 40,25 g (99,3 % R), 6,59 g (99,7 % R) und 8,90 g (99,4 % R).
  • Man fand, daß aile Lipasen selektiv waren bei der Acylierung des R-Isomers der Ausgangsenonverbindung (1). Amano-P-Lipase ist der aktivste Katalysator. Unter Verwendung von Amano-P als Enzymquelle wurden relative Reaktionsgeschwindigkeiten in fünf Lösungssystemen geprüft unter Verwendung von Isopropenylacetat als Acylierungsmittel. Die Verwendung von t-Butylmethylether (TMBE) und aromatischen Lösungsmitteln ergaben die höchsten Geschwindigkeiten. Außer der Lipase-PPL wurden Candida cylindracea (CC)-Lipase und eine Pseudomonas Sp. (Amano-P) untersucht, sowohl als deren freie Pulver als auch immobilisiert an Amberlit XAD-8-Harz, SIGMA Chem Co.. In allen Fällen war die Reaktion bei Raumtemperatur oder 50ºC extrem langsam, gewöhnlich weniger als 10% Umwandlung nach 5 Tagen. Jedoch wurde mit PPL, immobilisient an XAD-8-Harz, eine 25%ige Umwandlung nach 5 Tagen bei Raumtemperatur erzielt. Optimale Bedingungen wurden erzielt, wenn überschüssiges Vinylacetat verwendet wurde anstelle von Isopropenylacetat und kein Lösungsmittel verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen konnten die Reaktionen bei Raumtemperatur durchgeführt werden, wobei sie viel schneller waren und leicht in 3 bis 5 Tagen erfolgten. Außerdem wurden die Nebenprodukte vermieden, wenn Isopropenylacetat als Acylierungsmittel verwendet wurde (aufgrund des Eingreifens durch Methylester). Die Lebensfähigkeit des Verfahrens wurde an einem 100g-Maßstab demonstriert.
  • Ein Zweistufenverfahren, worin das Acetat durch rein chemische Maßnahmen entfernt wurde und der gewonnene Alkohol dann wieder den Lipase-Acylierungsbedingungen unterworfen wurde, wurde als am vorteilhaftesten empfunden.
  • Bezugnehmend auf Schema 2, wenn (2R) mit 2 Äquivalenten Guanidin in CH&sub3;OH behandelt wurde, wurde eine sehr schnelle saubere Umwandlung zum gewünschten Produkt (1R) beobachtet in weniger als 5 Minuten bei 0ºC. Tatsächlich war, wenn nur 0,25 Äquivalent Guanidin verwendet wurde, das Reaktionsprofil und Geschwindigkeit identisch zum stöchiometrischen Fall, und Verbindung (1R) (93% R) wurde gewonnen in 75-77 % Ausbeute nach Chromatographie. Wenn dieses Material wieder der Wirkung von PPL in Vinylacetat 2 Tage lang unterworfen wurde, wurde eine 90%-Ausbeute der Verbindung (2R) erzielt mit einem enantiomeren Überschuß von 99,6 % (dies bedeutet eine 98%-Umwandlung von verfügbarem (R)-Alkohol (1R). Die Entacylierung über Guanidin in Methanol, wie vorstehend beschrieben, lieferte das Ziel-(R)-Enon (1R). HPLC zeigte keine Racemierung wieder während der Entfernung des Acetats. Diese Ergebnisse gestatten die vollständige Umwandlung von beiden Antipoden von (SC-37321) in chirale Enone, und alle gewonnenen nichtangereicherten Zwischenprodukte können zu hoch optischer Reinheit rückgeführt werden (siehe Schema 2).
    • Versuchsabschnitt
  • Säulenchromatographische Trennungen wurden durchgeführt unter Verwendung von Merck SiO&sub2; 60-Silikagel mit Ethylacetat/Hexan-Gemischen als Eluierungsmittel. TLC-Analysen wurden durchgeführt an Merck SiO&sub2; 60 F254-vorbeschichteten Glasplatten und wurden sichtbar gemacht durch Putzen mit Phosphomolybdänsäure in Ethanol. Die Schmelzpunkte (Differential-Scanningcalorimetrie) wurden erhalten an einem Dupont 9900-Thermal- Analyzer. NMR wurde aufgezeichnet bei Raumtemperatur in CDCl&sub3; unter Verwendung eines General Electric QE-300- oder Varian XL-400-Spektrometers mit TMS als inneren Standard. HPLC-Analysen wurden durchgeführt an Chiralcel OD-, OA- oder OC-Säulen unter Verwendung einer chiralen stationären Phase (Daicel Chemical Industries) an einem Waters Associates Modell 590-Lösungsmittel-Spendersystem mit Waters Intelligent-Sample-Prozessor (WISP). Die optischen Drehungen wurden gemessen mit einem Perkin-Elmer 241-Polarimeter. IR-Spektren wurden aufgezeichnet (als Lösungen in Chloroform) an einem Perkin-Elmer 681-Spektrometer. CD-Spektren wurden aufgezeichnet an einem JASCO-J-20-ORD/CD-Spektropolarimeter. UV-Spektren wurden aufgezeichnet (in CH&sub3;OH) an einem Beckman-DU-7HS- UV-Vis-Spektrophotometer.
  • Diethylazodicarboxylat, Triphenyl phosphin, Ameisensäure, Guanidincarbonat, Triethylsilylchlorid, Natriumkügelchen wurden geliefert von Aldrich und ohne Reinigung verwendet. Lipasen: Candida cylindracea (CC), Schweinepankreas-Lipase (PPL), Pseudomonas species (PSp.) wurden geliefert von SIGMA Chemical Co. Amano-P-Lipase wurde geliefert von Amano Co. Isopropenylacetat und Vinylacetat wurden geliefert von Aldrich und fraktioniert destilliert vor der Verwendung Alle Lösungsmittel wurden geliefert von Burdich and Johnson und waren reagenzrein. CH&sub3;OH wurde destilliert von Mg; DMF wurde destilliert bei vermindertem Druck von Magnesiumsulfat, Benzol und Toluol wurden azeotrop destilliert, Chloroform wurde destilliert von P&sub2;O&sub5; und t-Butylmethylether wurde destilliert von Benzophenonketyl (alle unter inerter Atmosphäre).
    • BEISPIEL 1 Herstellung von Methyl-7-[3R-(acetyloxy)-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl]-4Z-heptenoat (2R) und Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-yl)-4Z-heptenoat (15) auf dem Weg über enzymatische Spaltung
  • Ein Gemisch aus 100,0 g (0,42 Mol) ±-Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)- 4Z-heptenoat (1), 100 g Schweinepankreas-Lipase (14 M-Einheiten) und 2,5 l destilliertes Vinylacetat wurden heftig bei Raumtemperatur 4 Tage lang gerührt. Eine weitere 50 g-Portion Schweinepankreas-Lipase wurde zugesetzt und das Gemisch einen weiteren Tag gerührt. Der Verlauf der Reaktion wurde beobachtet über HPLC an Chiralcel OD unter Verwendung von 93:7 Hexan:Isopropanol als Eluierungsmittel bis der enantiomere Überschuß von nicht-umgesetztem 3(S)-Alkohol > 99,8 % betrug. Das rohe Gemisch wurde dann mit 50 g Diatomeenerde behandelt und durch ein Bett van Diatomeenerde filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 1,5 l Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingeengt unter vermindertem Druck unter Bildung von etwa 11 9 g des Produktgemischs, das in der Hauptsache 3(R)-Acetat und 3(S)-Alkohol enthielt, mit Rf-Werten von 0,25 bzw. 0,49 an TLC unter Verwendung von 80% Ethylacetat/Hexan. Das Produkt wurde an Silicagel chromatographiert unter Verwendung eines Lösungsgradienten von 50% bis 100% Ethylacetat/Hexan unter Bildung von 50,5 g (43%) (R)-angereichertem Methyl-7-[(3R-Acetyloxy)-5-oxo-1-cyclpenten-1-yl]- 4Z-heptenoat (2R); ¹H NMR /CDCl&sub3;): δ 7,10 (m, 1H, C&sub2;H), 5,67 (m, 1H, C&sub3;H), 5,30 (m, 2H, olefinisches H) 3,68 (S, 3H, OCH&sub3;), 2,86 (dd, 1H, C4βH) J=6,5, 18,5 Hz, 2,36 (dd, 1H. C4α H), J=2,1, 18,5 Hz, 2,4-2,25 (m, 8H, CH&sub2;); ¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 204,3, 173, 1, 170,3, 151,8, 148,8, 129,4, 128,6, 71,3, 51,3, 41,3, 33,7, 24,7, 24,3, 22,6, 20,7 ppm; IR (CHCl&sub3;) 3030, 3010, 1735, 1720, 1440, 1370, 1230 cm&supmin;¹; [α]D20 +45,5º (-634,30 bei 365 nM) (c 1,080 g/dl, CHCl&sub3;); UV (CH&sub3;OH) Vmax = 220 nM; Analyse berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub0;O&sub5; = C 64,27; H 7,19; Gefunden: C 64,24; H 7,32 und 35,1 g (35%) Methyl-7-(3S-hydroxy-5- oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4H-heptenoat (1R) ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,10 (m, 1H, C&sub2;H), 5,24 (m, 2H, olefinisch), 4,93 (m, C&sub3;H, 1H), 4,05 (b, 1H, OH), 3,68 (S, 3H, OCH&sub3;), 2,80 (dd, 1H, C4βH) J = 6,0; 18,5 Hz, 2,4-2,2 (m, C4α H + CH&sub2;'S, 9H); ¹³C NMR δ 207,1, 174,1, 157,6, 146,9, 130,1, 128,8, 68,5, 51,9, 45,1, 34,2, 25,4, 24,6, 23,0 ppm; IR (CHCl&sub3;) 3610, 3480 (breit, 3030, 3010, 1715 (Schulter bei -1730), 1440, 1230 cm&supmin;¹; [α]D20 -13,3º (c 0,867 g/dl, CH&sub3;Cl&sub3;) (+1202º bei 365 nM); UV (CH&sub3;OH) λ max = 221 NM, OD [ν]²&sup5; (nM) -11900 (320), +64909 (223) (CH&sub3;CH); Analyse berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub8;O&sub4;: C 65,52; H 7,61; Gefunden: O 64,78; H 7,74. HPLC (Chiralcel OD unter Verwendung von 93:7 Hexan in Isopropanol als Eluierungsmittel) zeigte an, daß das gereinigte Acetat (2R) 92%ee in R-Isomer war und daß der gewonnene Alkohol (1S) 99,5%ee in S-Isomer war.
    • BEISPIEL 2 Mitsunobu-Inversion von Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z- heptenoat (1S)
  • Ein Gemisch aus 7,14 g (30,0 mMol) des Titelalkohols und 15,70 g (60,0 mMol) Triphenylphosphin in THF (100 ml) unter Argon wurde mit Ameisensäure mit Hilfe einer Spritze versetzt. Die Lösung wurde auf -10ºC in einem Eisbad gekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde auf ≤15ºC gehalten, während 10,44 g (9,49 ml, 60,0 mMol) Diethylazodicarboxylat tropfenweise mit Hilfe einer Spritze zugesetzt wurde. Die blaßgelbe Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. TLC (80% Ethylacetat/Hexan an Silicagel) zeigte vollständigen Verbrauch des Ausgangsalkohols. Die Lösungsmittel wurden bei vermindertem Druck entfernt unter Bildung eines viskosen Öls. Dieses wurde in 200 ml t-Butylmethylether (TBME) gelöst und dazu 400 ml Hexan langsam zugesetzt und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Das Gemisch wurde filtriert. Das Filterkissen wurde mit zwei 100 ml-Portionen 1:1 TBME:Hexan gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden bei vermindertem Druck eingeengt unter Bildung von 12,80 g eines bernsteinfarbigen Öles, das in 300 ml absolutem Methanol gelöst und mechanisch gerührt wurde. Dazu wurden nach und nach 200 g Woelm Super 1 (neutral)-Tonerde zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt, um den Ameisensäureester unmittelbar zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde durch einen Glasfrittentrichter filtriert und der Filterkuchen mit 300 ml- Portionen CH&sub3;OH gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden bei vermindertem Druck eingeengt unter Bildung von etwa 12 g Rückstand, der durch Schnellchromatographie an Silicagel gereinigt wurde, unter Anwendung von Gradienteneluierung (30-75% Ethylacetat in Hexan) unter Bildung von 8,22 g des Produktes, das noch 6-10% 1,2-Dicarbethoxyhydrazin enthielt (bestimmt durch ¹H NMR), das in der nachfolgenden Stufe entfernt wurde. Eine Analysenprobe wurde durch PTLC an 2000u-Silicagelplatten erhalten unter Anwendung von 2 Eluierungen von 65% Ethylacetat in Hexan Die zweifach gereinigte Probe war identisch mit 3S-Alkohol gemäß Normalphasen-HPLC, TLC, ¹H und ¹³C NMR, UV und IR-Spektroskopie. [α]D25 + 16,6ºC (c 1,024 g/dl, CHCl&sub3;) (-1174º bei 365 nM), CD [ν]²&sup5; (nM) -11900 (320) (negativ Maximum), +64909 (224) (positiv Maximum) (CH&sub3;OH). HPLC an Chiralcel OD unter Verwendung 93/7 Hexan/Isopropanol als Eluierungsmittel zeigte an, daß das Verhältnis von 3R- zu 3S-Alkoholen 99,4/0,6 betrug.
    • BEISPIEL 3 Herstellung von Methyl-7-(3-R-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat (1R) aus Methyl-7-[3R-(acetyloxy)-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl]-4Z-heptenoat (2R) aufdem Wegüber die Deacylierung
  • Eine Vorratslösung von 0,5 M Guanidin in CH&sub3;OH wurde hergestellt durch Zugabe von 1,78 g (77,4 mMol) von dreimal mit Hexan gewaschenen Natriumkügelchen zu eisgekühltem CH&sub3;OH (154 ml) unter Argonatmosphäre. Nachdem das gesamte Natrium umgesetzt worden war, wurden 14,22 g (79,0 mMol) Guanidincarbonat zugesetzt. Dies wurde bei Raumtemperatur 25 Minuten lang gerührt, und man ließ das Gemisch stehen, damit ausgefallene Salze sich absetzen konnten. In einen getrennten Kolben wurden 12,8 g (45,6 mMol) eines ungefähr 93:7-Gemischs von R:S-Alkoholen in 50 ml absolutem CH&sub3;OH unter Argon getan. Dies wurde in einem Eisbad auf 0ºC gekühlt und mit Hilfe einer Spritze mit 100 ml 0,5M Guanidin in CH&sub3;OH, wie vorstehend hergestellt, binnen ungefähr 5 Minuten versetzt. Dieses Gemisch wurde 5 Minuten lang bei etwa 10ºC gerührt. TLC (80% Ethylacetat in Hexan an Silicagel) zeigte vollständigen Verbrauch des Acetats. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 2,86 ml (3,0 g, 50,0 mMol) Eisessig versetzt um das Guanidin zu neutralisieren. Nach 5minütigem Rühren wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt unter Bildung einer dicken Schlämme. Der Rückstand wurde zwischen 100 ml Wasser und 100 ml 1:1 Toluol:Ethylacetat aufgeteilt. Die wäßrige Schicht wurde weiter extrahiert mit zwei 50 ml-Portionen Ethylacetat. Die vereinigten organischen Schichten wurden gewaschen mit zwei 50 ml-Portionen Wasser, 50 ml Salzlösung und über Natriumsulfat getrocknot Die Entfernung dos Lösungsmittels bei vermindertem Druck ergab ein tiefbernsteinfarbiges Öl, das durch Schnellchromatographie an Silicagel mit 50% Ethylacetat in Hexan gereinigt wurde, unter Bildung von 8.06 g (1R) (77 %) nach erschöpfender Entfernung des Lösungsmittels. ¹H und ¹³C NMR zeigten den zuvor isolierten puren 3S-Alkohol (1S) an. HPLC an Chiralcel OD unter Verwendung von 93/7 Hexan/Isopropanol als Eluierungsmittel zeigte ein 93:7 R:S-Gemisch von Alkoholen an, was zeigte, daß keine Racemisierung während der Deacylierung stattgefunden hatte.
    • BEISPIEL 4 Enzymatische optische Anreicherung von Methyl-7-(3R-hvdroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl) 4Z-heptenoat (1R)
  • Ein Gemisch aus 7,50 g (31,5 mMol) 93:7 R:S-Alkoholen, 7,50 g (99,750 Einheiten) Schweinepankreas-Lipase in 180 ml destilliertem Vinylacetat wurde heftig bei Raumtemperatur 45 Stunden lang gerührt. HPLC einer aliquoten Menge an Chiralcel OD unter Verwendung von 93:7 Hexan:Isopropanol zeigte ausgezeichnete Umwandlung von R-Alkohol (1R) zum entsprechenden Acetat (2R). Tatsächlich waren 98 % des verfügbaren R-Alkohols verbraucht worden, um R-Acetat mit mehr als 98,8%ee zu ergeben. Das Gemisch wurde durch Diatomeenerde filtriert und der Filterkuchen mit zwei 100 ml-Portionen Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck eingeengt unter Bildung von 8,90 g Rückstand, der durch Chromatographie an Silicagel mit 20% Ethylacetat in Hexan als Eluierungsmittel gereinigt wurde. Durch diese Technik wurden 7,53 g (85%) 98,8%ee R-Acetat (2R) erhalten, das identisch war mit dem vorher isolierten R-Acetat gemäß ¹H und ¹³C NMR, HPLC und TLC.
    • BEISPIEL 5 Deacylierung von optisch angereichertem Methyl-7-(3R-acetyloxy-5-oxo-1-cyclopenten-1yl)-4Z-heptenoat (2R)
  • Eine bei Raumtemperatur gehaltene Lösung von 7,47 g (26,6 mMol) 98,8%ee 3R-Acetat (2R) in 25 ml absolutem Methanol unter Argon wurde tropfenweise mit Hilfe einer Spritze mit 5,2 ml (2,6 mMol) der vorstehend hergestellten Vorratslösung von 0,5 M Guanidin in Methanol versetzt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. TLC an Silicagel mit 80% Ethylacetat in Hexan zeigte vollständige Umwandlung von Acetat zu freiem Alkohol. Die Reaktion wurde abgeschreckt durch Zugabe von 314 ul (5,5 mMol) Eisessig. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand zwischen 150 ml 1:1 Toluol/Ethylacetat und 50 ml Wasser aufgeteilt. Die wäßrige Schicht wurde weiter extrahiert mit 50 I Ethylacetat. Die vereinigten organischen Schichten wurden gewaschen mit zwei 25 ml-Portionen Wasser, 25 ml Kochsalzlösung und über Natriumsulfat getrocknet unter Bildung von 6,25 g des rohen Rückstands. Dieser wurde durch Schnellchromatographie an Silicagel gereinigt mit Gradienteneluierung mit 50:75 % Ethylacetat in Hexan unter Bildung von 4,89 g (77%) R-Alkohol (1R). HPLC an Chiralcel OD unter Verwendung von 93:7 Hexan:Isopropanol als Eluierungsmittel zeigte eine 98,8%ee für das gewünschte Produkt an. Dieses Produkt war identisch mit dem vorher hergestellten 3R-Alkohol gemäB HPLC, ¹H und ¹³C NMR und TLC.
    • BEISPIEL 6 Herstellung von Methyl-7-[5-oxo-3R-[(triethylsilyl)oxy]-cyclopenten-1-yl]-4Z- heptenoat (3)
  • Eine bei 10ºC gehaltene Lösung von 34,6 g (0,136 Mol) 94% reinem 3R-Alkohol (1R), 34,3 g (0,34 Mol) Triethylamin, 4,76 g (0,07 Mol) Imidazol in 100 ml DMF unter Stickstoff wurde tropfenweise mit Hilfe einer Spritze mit 24,0 g (26,7 ml, 0,16 Mol) Triethylsilylchlorid versetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang auf Raumtemperatur erwärmt. TLC (Silicagel mit 1:1 Ethylacetat:Hexan als Eluierungsmittel) zeigte vollständige Umwandlung des Alkohols (Rf = 0,60). Das Gemische wurde in 300 ml 1:1 Toluol:Hexan gegossen und mit 300 ml Wasser, anschließend 3 x 100 ml-Portionen Wasser, dann mit 50 ml Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei vermindertem Druck und anschließende Behandlung im Vakuum bei 2 x 10&supmin;² Torr bei 50º 2 Stunden lang ergab 4,76 g Rohprodukt, das durch Chromatographie an Silicagel gereinigt wurde unter Verwendung eines Stufengradienten von 10:20% Ethylacetat in Hexan. 40,25 g (84%) gereinigtes TES-Enon wurde auf diese Weise erhalten. HPLC an Chiralcel OD unter Verwendung von 93:7 Hexan:Isopropanol zeigte ein Enantiomerverhältnis (R/S) von 99,3:0,7 an. ¹H NMR (CDCl&sub3;): δ 7,04 (m, 1H, C&sub2;H), 5,34 (m, 2H, cis-Olefin), 4,90 (m, 1H, C&sub3;H), 3,68 (S, 3H, OCH&sub3;), 2,75 (dd, 1H, C4βH) J = 6,0, 18,0 Hz, 2,29 (dd, 1H, C4α H) undeutlich, 2,4-2,2 (m, 8H, CH&sub2;), 1,0 (t, 9H, 3CH&sub3;) J = 3,0 Hz 0,67 (q, 6H, 3CH&sub2;) J = 8 Hz; ¹³C NMR (CDCl&sub3;): δ 206,3, 173,7, 157,3, 146,8, 130,3, 129,0, 69,1, 51,9, 45,9, 34,4, 25,4, 24,8, 23,2, 7,1, 5,1 ppm; IR (CHCl&sub3;): 3020, 3010, 1735, 1710, 1440, 1355, 1235, 1080 CM&supmin;¹; UV (CH&sub3;OH) λ max = 222 nM; [α]D20 + 12,3º (c 0,814 g/dl, CHCl&sub3;) (-1018,4º bei 365 nM); CD [ν]²&sup5; (nM) -12166 (315) (negativ Maximum); +66507 (224) (positiv Maximum) (CH&sub3;OH); Analyse berechnt für C&sub1;&sub9;H&sub3;&sub2;O&sub4;Si: O 64,75; H 9,15; Gefunden: O 64,67; H 9,20.
    • BEISPIEL 7 Enzymatische Spaltung von Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cylopenten-1-yl)-heptenoataufdem Weg über PPL in Vinylacetat (7)
  • Ein Gemisch aus 240 mg (1,0 mMol) des Titel-Enons, 42 mg (3192 Einheiten) Schweinepankreas-Lipase in 3 ml destilliertem Vinylacetat wurde versiegelt und bei Raumtemperatur insgesamt 9 Tage lang gerührt. Analyse an HPLC unter Verwendung von Chiralcel OC bei 50ºC unter Verwendung von 90:10 Hexan:Isopropanol als Eluierungsmittel zeigte an, daß der zurückbteibende Alkohol > 99,8% S-Isomer war. Die Spaltung des entsprechenden Acetats war unter einer Vielzahl von Bedingungen nicht möglich Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Bett aus Diatomeenerde filtriert und der Filterkuchen mit Methylenchlorid gespült. Die vereinigten Filtrate wurden bei vermindertem Druck eingeengt unter Bildung von 69 mg des rohen Rückstands, der gereinigt wurde durch PTLC an Silicagel (2000 u) unter Verwendung von 65% Ethylacetat in Hexan als Eluierungsmittel (Rf (ROH) = 0,30 und Rf (ROAc) = 0,61). Auf diese Weise wurden 130 mg (46%) Methyl-7-(3R-Acetyloxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)- heptanoat isoliert: ¹H NMR (CDCl&sub3;): 6 7,10 (m, C&sub2;H, 1H), 5,66 (dm, C&sub3;H, 1H), 3,68 (s, OCH&sub3;, 3H), 2,87 (dd, C4βH, 1H) J=6, 19,0 Hz, 2,38 (dd, C4α H, 1H), J=2,0, 19 Hz, 2,31 (t, CH&sub2;, 2H) J = 7,5 Hz, 2,21 (bt, 2H) J = 7,5 Hz, 2,10 (s, OAc, 3H), 1,62 (m, 2H), 1,35 (m, 4H); ¹³C NMR (CDCl&sub3;) δ 204,5, 173, 8, 170,3, 151,4, 149,6, 70,2, 51,2, 41,3, 33,7, 28,7, 28,5, 26,9, 24,5, 24,3, 20,6 ppm; IR (CHCl&sub3;) 3020, 3010, 1715 (Schulter bei 1735), 1435,1370,1240, 1025 cm&supmin;¹, UV (CH&sub3;OH) λ max = 221 NM; [α]D20 +47,6º (c 0,871 g(dl, CHCl&sub3;) (-649,3º bei 365 nM); CD [ν]²&sup5; (nM) .7556 (315) (negativ Maximum), +49533 (224) (positiv Maximum); Analyse berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;O&sub5; = C 63,80; H 7,86; Gefunden: C 63,32; H 7,91 und dann 99 mg (41%) Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1- cyclopenten-1-yl)-heptanoat, Schmelzpunkt = 60,1º (DSC), dessen ¹H und ¹³C NMR, IR und UV-Spektren identisch waren mit dem racemischen Alkohol, [α]D20 -9,8º (c 1,072 g/dl, CHCl&sub3;) (+1216,5º bei 365 nM); CD[φ]²&sup5; (nM) -7556 (315) (negativ Maximum), +49533 (224) (positiv Maximum) (CH&sub3;OH); Analyse berechnet für C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub0;O&sub4;: C 64,98; H 8,39; Gefunden: C 64,78; H 8,52.
    • BEISPIEL 8 Enzymatische Spaltung von Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4-heptynoat auf dem Weg über PPL in Vinylacetat (4)
  • Ein Gemisch aus 116 mg (0,49 mMol) der Titelverbindung, 116 mg (1543 Einheiten) Schweinepankreas-Lipase (PPL) in 3 ml destilliertem Vinylacetat wurde versiegelt und bei Raumtemperatur 7 Tage lang gerührt. Aliquote Mengen wurden alle 24 Stunden entfernt für die HPLC-Analyse an Chiralcel OC bei 50ºC unter Verwendung von 90/10 Hexan/Isopropanol als Eluierungsmittel. Nach 4 Tagen zeigte HPLC, daß der restliche S-Alkohol 96% ee im S-Isomer betrug. Das Produktacetat konnte unter diesen Bedingungen nicht gespalten werden. Das rohe Reaktionsgemisch wurde durch Diatomeenerde filtriert und das Filterkissen mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingeengt bei vermindertem Druck unter Bildung von 128 mg rohem Rückstand. Reinigung durch PTLC an 2000 u-Silicaplatten (Rf (ROAc) = 0,55 und Rf (ROH) = 0,28) unter Verwendung von 65% Ethylacetat/Hexan als Eluierungsmittel ergab 58 mg (43%) Methyl-7-(3R-acetyloxy-5-oxo-1- cycloprenten-1-yl)-4-heptynoat; ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,25 (m, C&sub2;H, 1H), 5,80 (dm, C&sub3;H, 1H), 3,70 (s, OCH&sub3;, 3H), 2,88 (dd, C4βH, 1H) J = 65, 19 Hz, 2,55-2,3 (m, 4CH&sub2; + C4αH, 9H), 2,10 (S, OAc, 3H); ¹³C NMR (CDCl&sub2;) δ 204,7, 172,4, 170,5, 152,8, 147,8, 79,4, 79,4, 70,4, 41,7, 41,4, 337, 24,1, 20,9, 16,8, 14,6 ppm; IR (CHCl&sub3;) 3020, 3010, 1735, 1717, 1437, 1370,1240, 1027 cm&supmin;¹ [α]D20 +410 (c 0,976 g/dl, OHCl&sub3;) (-606,4º bei 365 nM); CD [ν]²&sup5; (nM) -6022 (315) (negativ Maximum), +4668 (220 nM) (positiv Maximum) und 51 mg (45%) Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopentenyl)-4-heptynoat, dessen TLC, ¹H und ¹³C NMR, IR identisch waren mit racemischem Alkohol; [α]D20 -16,7º (c 0,927 g/dl, CHCl&sub3;) (+984,4º bei 365 nM); CD [ν]25 (nM) 7690 (312), -55275 (225) (CH&sub3;CH).
    • BEISPIEL 9 Enzymatische Spaltung von 3-(3-Hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-propyn auf dem Weg über PPL in Vinylacetat (5)
  • Ein Gemisch aus 166 mg (1,22 mMol) des Titelalkohols, 166 mg (2208 Einheiten) Schweinepankreas-Lipase in 4 ml destilliertem Vinylacetat wurde versiegelt und bei Raumtemperatur insgesamt 7 Tage lang gerührt. Aliquote Mengen wurden periodisch entfernt zur Untersuchung an Chiralcel OA bei 50ºC unter Verwendung von 96/4 Hexan/Isopropanol als Eluierungsmittel. Nach 7 Tagen zeigte HPLC an, daß verbleibender S-Alkohol 96 % ee betrug und daß das Produktacetat R/S-Isomeren wieder ungespalten waren. Das Reaktionsgemisch wurde durch Diatomeenerde filtriert und der Filterkuchen mit Methylenchlorid gewaschen.
  • Die vereinigten Filtrate wurden eingeengt bei vermindertem Druck unter Bildung von 205 mg des rohen Rückstands, der durch PTLC gereinigt wurde an 2000 u-Silicagelplatten unter Verwendung von 65% Ethylacetat in Hexan als Eluierungsmittel (Rf (ROAc) = 0,60 und Rf (ROH) = 0,37). Auf diese Weise wurden 76 mg (35%) 3-(3R-Acetyloxy-5-oxo-1-cyclopenten- 1-yl)propyn isoliert: ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7.44 (q, C&sub2;H, 1H) J = 2.1 Hz, 5.75 (m, C&sub3;H, 1H). 2.13 (q, CH&sub2;, 2H) J = 2.1 Hz, 2.93 (dd, C4βH, 1H) J = 2.2, 19.0 Hz, 2.21 (t, C C-H, 1H) J = 5.3 Hz, 2.11 (s, OAc, 3H); 120 NMR (CDCl&sub3;) δ 202.6, 170.2, 153.5, 144.7, 78.8, 71.2, 69.8, 41.6, 20.7, 15.2 ppm; IR (CHCl&sub3;): 3300, 3020, 3010, 1740, 1720, 1640, 1410, 1370, 1240, 1025 cm&supmin;¹; UV (CH&sub3;CH) λmax = 219 nM; [α]D20 52.2º (c 0.928 g/dL, CHCl&sub3;) (-713º bei 365 nM); CD [ν]²&sup5; (nM) -3968(319), +27494 (216) (CH&sub3;OH), keine Elementaranalyse; und 65 mg (48%) von 3 (3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)propyn, dessen ¹H, NMR, IR und UV identisch waren mit racemischem Alkohol; [α]D20 -8,7º (c 0,863 g/dl, CHCl&sub3;) (+1693º bei 365 nM; OD [ν]²&sup5; (nM) +9923 (318 nM), -50781 (224) (CH&sub3;OH).
    • BEISPIEL 10 Enzymatische Spaltung von Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)5Z-heptenoat auf dem Weg über PPL in Vinylacetat (6)
  • Ein Gemisch aus 83 mg (0,35 mMol) des Titelalkohols, 83 mg (1104 Einheiten) Schweinepankreas-Lipase in 3,0 ml destilliertem Vinylacetat wurde versiegelt und bei Raumtemperatur insgesamt 7 Tage lang gerührt. Aliquote Mengen wurden alle 24 Stunden entfernt für HPLC-Analyse and Chiralcel OD unter Verwendung von 97/3 Hexan/Isopropanol als Eluierungsmittel. Nach 7 Tagen zeigte HPLC an, daß der verbliebene Alkohol ein 96/4 S/R- Isomerverhältnis hatte und daß dieses Verhältnis sich noch verbesserte. Trotzdem wurde das Gemisch durch ein Bett aus Diatomeenerde filtriert und das Filterkissen mit Methylenchlorid gespült. Die vereinigten Filtrate wurden eingeengt bei vermindertem Druck unter Bildung von 86 mg rohem Rückstand. PTLC an 2000 u-Silicagelplatten unter Verwendung von 65% Ethylacetat in Hexan als Eluierungsmittel ergab 45 mg (Rf = 0,61, 46 %) Methyl-7. (3R-acetyloxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-5Z-heptenoat: ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,12 (m, C&sub2;H, 1H), 5,72 (dm, C&sub3;H, 1H), 5,47 (m, olefinisch H, 2H), 3,68 (s, OCH&sub3;, 3H), 2,96 (m, bis-allylisch CH&sub2;), 2,89 (dd, C4βH, 1H) J = 6,5, 19,0 Hz, 2,48 (dd, C4α H, 1H) J = 6,5, 19,0 Hz, 2,48 (dd, C4αH, 1H) J = 2,1, 19,0 Hz, 2,31 (t, CH&sub2;CO&sub2;, 2H) J = 10,1 Hz, 2,10 (m, 2H), 2,10 (s, OAc, 3H), 1,70 (quint, isoliert CH&sub2;, 2H) J = 7,5 Hz; IR (CHCl&sub3;) 3020, 3010, 1715 (Schulter bei ungefähr 17,35), 1435, 1370. 1240, 1025 cm&supmin;¹; [α]D20 +47,10 (c 0,935 g/dl, CHCl&sub3;) (-649,2º bei 365 nM); UV (CH&sub3;OH) λ max = 218 nM; CD [ν]²&sup5; (nM) -7556 (315)) +49533 (224) (CH&sub3;OH); Analyse berechnet für C&sub1;&sub5;H&sub2;&sub0;O&sub5;: O 63,81; H 7,14; Gefunden: C 63,65; H 7,04 und dann 33 mg (Rf = 0,34, 40%) Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-5Z-heptenoat, dessen ¹H NMR, IR, TLC identisch waren mit dem racemischen Alkohol; [α]D20 -19,9º (c 0,627 g/dl, CHCl&sub3;) (+1031º bei 365 nM); OD [ν]²&sup5; (nM) +24731 (314), -175176 (225) (CH&sub3;OH), keine Elementaranalyse.
    • BEISPIEL 11 Immobilisierung von PSL unter Verwendung von XAD-8-Harz
  • Eine Lösung von PSL (100 mg) in 10 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH = 7,0) wurde mit 10 g Polystyrolkügelchen (XAD-8 von Sigma) vermischt. Die Suspension wurde über Nacht bei 8ºC gerührt. Der größte Teil des Wassers wurde durch Pipette entfernt, der Rückstand wurde über einer Vakuumpumpe (RT, 24 Stunden) getrocknet unter Bildung des immobilisierten Enzyms, das direkt für die Umesterung verwendet wurde.

Claims (18)

1. Ein Verfahren zur Aufspaltung einer Verbindung der Formel:
worin X Alkyl, Alkenyl oder Atkinyl mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt, das gegebenenfalls in der 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9-Position ein S- oder O-Atom enthält, und R -CH&sub2;OR&sub1; bedeutet, worin R&sub1; Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Tetrahydropyranyl, Ethoxyethyl, Acyl oder -CO&sub2;R&sub2; oder (R&sub2;)&sub3;Si bedeutet, worin R&sub3; unabhängig voneinander Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstaffatomen oder Aryl bedeutet, worin R&sub2; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wobei dieses Verfahren folgende Stufen umfaßt:
Vermischen dieser Verbindung mit einer Lipase in Gegenwart eines Acylierungsmittels, wobei man den entsprechenden S-Alkohol und das R-Acetat erhält, und Behandlung dieses S-Alkohols mit Diethylazocarboxylat, Triphenylphosphin und Ameisensäure mit anschließender Hydrolyse des Zwischenprodukt-Ameisensäureesters mit neutraler Tonerde und Methanol unter Erzielung des entsprechenden R-Alkohols mit im wesentlichen vollständiger Inversion.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Isopropenylacetat, Isopropenylvalerat, Vinylacetat, Vinylpropionat und Vinylvalerat.
3. Das Verfahren nach Anspruch 2, worin die Lipase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas-Spezies (PSL, Typ XIII) Porcin-Pancreas (PPL, Typ II), Candida cylindracea (CCL, Typ VII), Amano P, ANL, Aspergillus niger oder ChE-Cholesterinesterase.
4. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lipase Porcin-Pancreas (PPL, Typ II) oder Amano P ist.
5. Das Verfahren nach Anspruch 4, worin das Acylierungsmittel Isopropenylacetat oder Vinylacetat ist.
6. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lipase Porcn-Pancreas (PPL), das Acylierungsmittel Vinylacetat und die Verbindung
Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat (1S),
Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4-heptenoat (4),
3-(3-Hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl-propyn (5),
Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-5Z-heptenoat (6) oder
Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-heptenoat (7) ist.
7. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin diese Verbindung Methyl-7-(3S-hydroxy-5- oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat ist.
8. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin die Lipase auf einem Träger immobilisiert ist.
9. Ein Verfahren zur Aufspaltung einer Verbindung der Formel:
worin X Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen darstellt, das gegebenenfalls in der 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9-Position ein S- oder O-Atom enthält und R -CH&sub2;OR&sub1; bedeutet, worin R&sub1; Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Tetrahydropyranyl, Ethoxyethyl, Acyl oder -CO&sub2;R&sub2; bedeutet, worin R&sub2; Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, wobei dieses Verfahren folgende Stufen umfaßt:
Mischen dieser Verbindung mit einer Lipase in Gegenwart eines Acylierungsmittels, wobei man den entsprechenden S-Alkohol oder das R-Acetat erhält;
Behandlung dieser R-Acetatverbindung mit Guanidin und einem Alkohol unter Erzielung des entsprechenden R-Alkohols;
Mischen dieses R-Alkohols mit einer Lipase in Gegenwart eines Acylierungsmittels unter Erzielung des entsprechenden R-Acetats und
Behandeln dieses R-Acetats mit Guanidin und einem Alkohol unter Erzielung der optisch reinen R-Alkoholverbindung.
10. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin das Acylierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Isopropenylacetat, Isopropenylvalerat, Vinylacetat, Vinylpropionat und Vinylvalerat.
11. Das Verfahren nach Anspruch 10, worin die Lipase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas-Spezies (PSL, Typ XIII), Porcin-Pancreas (PPL, Typ II), Candida cylindracea (CCL, Typ VII) und Amano P.
12. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin die Lipase Porcin-Panreas (PPL, Typ II) oder Amano P. ist.
13. Das Verfahren nach Anspruch 12, worin das Acylierungsmittel Isopropenylacetat oder Vinylacetat ist.
14. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin die Lipase Porcin-Pancreas (PPL), das Acylierungsmittel Vinylacetat und die Verbindung
Methyl-7-(3S-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat (1S),
Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4-heptenoat (4),
3-(3-Hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-propyn (5),
Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-5Z-heptenoat (6) oder
Methyl-7-(3-hydroxy-5-oxo-1-cyclopenten-1-yl)-heptenoat (7) ist.--
15. Das Verfahren nach Anspruch 14, worin diese Verbindung Methyl-7-(3S-hydroxy-5 oxo-1-cyclopenten-1-yl)-4Z-heptenoat ist.
16. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin die Lipase auf einem Träger immobilisiert ist.
17. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lipase mit dem Acylierungsmittel in Gegenwart eines Lösungsmittels vermischt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHCl&sub3;, Benzol, Toluol, t-Butylmethylether, Tetrahydrofuran, Diethylether oder Hexan.
18. Das Verfahren nach Anspruch 9, worin die Lipase mit dem Acylierungsmittel in Gegenwart eines Lösungsmittels vermischt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CHCl&sub3;, Benzol, Toluol, t-Butylmethylether, Tetrahydrofuran, Diethylether oder Hexan.
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