DE60312128T2

DE60312128T2 - Verfahren zum Immobilisieren eines Biomoleküls auf einem Träger

Info

Publication number: DE60312128T2
Application number: DE60312128T
Authority: DE
Inventors: Ryuichi Chiba-shi ODA; Naoki Chiba-shi Kimura
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc; Nisshin Spinning Co Ltd
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2023-02-01
Also published as: CA2474091A1; DK1471355T3; EP1471355A1; EP1471355B1; ATE355524T1; JP3888947B2; JP2003294751A; US20060051750A1; DE60312128D1; EP1471355A4; WO2003065040A1

Description

Technisches Feld
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Immobilisieren einer Nukleinsäure auf einem Träger. Dass erfindungsgemäße Verfahren ist für auf Hybridisierung basierenden Analysemethoden von Nukleinsäuren usw. nützlich.
Stand der Technik
Bei auf Hybridisierung basierenden Analysen von Nukleinsäuren, Immunoassays etc. wurden bereits Techniken zur Immobilisierung von Nukleinsäuren oder Proteinen auf einem Träger wie Membranen und Platten konventionell verwendet. Zur Immobilisierung von Biomolekülen sind die folgenden Verfahren für Nukleinsäuren bekannt:

(1) Ein Verfahren, bei dem eine mit einer Modifizierungsgruppe eingeführte Nukleinsäure chemisch gebunden wird, wie Immobilisierung mittels einer Disulfidbindung zwischen einer Nukleinsäure mit einer Thiolgruppe am 5'-Ende und einem kugelartigen Basismaterial mit Thiolgruppen (P. J. R. Day, P. S. Flora, J. E. Fox, M. R. Walker, Biochem J., 278, 735-740 (1991));
(2) Ein Verfahren zur Immobilisierung einer Nukleinsäure mittels Adsorption auf einem Träger wie Nitrocellulose, einer Nylonmembran oder einem mit einem Kationpolymer wie Poly-L-Lysin beschichtetem Glas mittels Bestrahlung mit ultraviolettem Licht (UV) oder durch Hitzebehandlung (J. Sambroock, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Auflage, S. 2.109-2.113 und 9.34-9.46; Internationale Patentveröffentlichung auf japanisch (Kohyo) Nr. 10-503841);
(3) Ein Verfahren zum Erzielen einer Immobilisierung auf der Basis physikalischer Adsorption, die erzielt wird, indem eine Nukleinsäure in Vertiefungen einer mit einer Polylysinlösung behandelten Mikroplatte injiziert wird und die Platte auf 37 °C erhitzt wird (G. C. N. Perry und A. D. B. Malcom, Biochem. Soc. Trans., 17, 230-231 (1989));
(4) Ein Verfahren zur Synthese von DNS auf einem Basismaterial unter Verwendung von an das Basismaterial bindenden Nukleotiden (WO97/10365);
(5) Ein Verfahren zur Immobilisierung einer Nukleinsäure auf einem Basismaterial wie Glas, das eine Polymerverbindung mit Carbodiimidgruppen trägt (Japanische Patentoffenlegungsnummer 8-23975); und
(6) Ein Verfahren zur Immobilisierung einer Nukleinsäure auf einem polymeren Material unter Verwendung von UV-Strahlung mit einer Wellenlänge von 220 nm bis 380 nm (europäische Patentanmeldung EP-A-1130121) oder von 1 nm bis 480 nm (WO01/62963).

Diese Verfahren leiden jedoch unter Nachteilen. So benötigt man für das Verfahren nach (1) eine äußerst spezielle Vorrichtung und Reagenzien.
Weiterhin lösen sich bei den Verfahren nach (2) und (3) Nukleinsäuren während der Hybridisierung, insbesondere während der Handhabung, von den Trägern, so dass auf diese Weise die Nachweisempfindlichkeit verringert werden kann oder keine Reproduzierbarkeit zu erzielen ist. Weiterhin leiden diese Verfahren unter einem anderen Nachteil, nämlich dass – obwohl eine lange Nukleinsäure immobilisiert werden kann – eine kurze Nukleinsäure in Länge von etwa einem 50-mer oder kürzer wie Oligomere nicht effizient immobilisiert werden kann. Bei diesen Verfahren beträgt die UV-Dosis etwa mehrere 10 mJ/cm². Weiterhin erfordert das Verfahren nach (4) ebenfalls zur Synthese von DNS auf einem Basismaterial eine extrem spezielle Vorrichtung und Reagenzien und die Nukleinsäure, die synthetisiert werden kann, ist auf ein 25-mer oder kürzer beschränkt. Darüber hinaus ist beim Verfahren nach (5) das Material des Basismaterials eingeschränkt und ein Schritt der Beschichtung der Oberfläche nötig.
Inzwischen wurde über eine Technik berichtet, bei der die Oberfläche eines Polystyrolfilms mittels Bestrahlung der Oberfläche mit einem UV-Strahl im Vakuum hydrophiliert wurde (Hozumi et al., „Hyomen Gijutsu (Surface Techniques), Band 52, Nr. 12, S. 97-98, 2001). Es wurde jedoch nicht offenbart, dass mittels Bestrahlung mit einem UV-Strahl mit einer Wellenlänge von etwa 280 nm eine Nukleinsäure auf einem Träger aus Kunstharz immobilisiert werden kann.
Offenbarung er Erfindung
Im Hinblick auf die vorgenannten technischen Voraussetzungen der konventionellen Techniken ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur bequemen und effizienten Iqmmobilisierung einer Nukleinsäure auf einem Träger zur Verfügung zu stellen, insbesondere einer kurzkettigen Nukleinsäure.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten zahlreiche Untersuchungen durch, um den vorgenannten Gegenstand zu erzielen. Als Ergebnis fanden sie, dass eine Nukleinsäure auf einem Träger effizient immobilisiert werden kann, indem eine Lösung der Nukleinsäure auf einen aus einem Kunstharz bestehenden Träger gesprenkelt wird und der Träger dann mit einem UV-Strahl bestrahlt wird, und sie haben so die vorliegende Erfindung gemacht.
So stellt die vorliegende Erfindung Folgendes zur Verfügung:

(1) Ein Verfahren zum Immobilisieren einer Nukleinsäure auf einem Träger, das folgende Schritte umfasst: das Sprenkeln einer Lösung der Nukleinsäure auf den Träger und das Bestrahlen des mit der Nukleinsäurelösung besprenkelten Trägers mit einem Ultraviolettstrahl, der eine Komponente aufweist, die eine Wellenlänge von 280 nm aufweist, wobei der Träger aus einem Kunstharz besteht.
(2) Ein Verfahren nach (1), bei dem das Kunstharz aus thermoplastischen Harzen, in Wärme aushärtenden Harzen und Copolymeren ausgewählt ist.
(3) Ein Verfahren nach (2), bei dem das Kunstharz aus Polycarbonat, Polymethylmethacrylat, Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymer, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polyphenol, Polystyrol, Polyacrylnitirl, Polyvinylchlorid und Aramid ausgewählt ist.
(4) Ein Verfahren nach irgendeinem der Verfahren nach (1) bis (3), bei dem die Bestrahlungsdosis des Ultraviolettstrahls 100 mJ/cm² oder größer ist.
(5) Ein Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit immobilisierter Nukleinsäure, bei dem eine Nukleinsäure auf einem Träger immobilisiert wird, das folgende Schritte umfasst: das Sprenkeln einer Lösung der Nukleinsäure auf den Träger und das Bestrahlen des mit der Nukleinsäurelösung besprenkelten Trägers mit einem Ultraviolettstrahl, der eine Komponente aufweist, die eine Wellenlänge von 280 nm aufweist, um die Nukleinsäure auf dem Träger zu immobilisieren.
(6) Ein Verfahren nach (5), wobei der Träger mit immobilisierter Nukleinsäure zur Analyse der Nukleinsäure mittels Hybridisierung verwendet wird.

Im Folgenden wird die Erfindung im Detail beschrieben.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Träger ist zum Immobilisieren einer Nukleinsäure und er ist dadurch gekennzeichnet, dass er aus Kunstharz besteht. Das Kunstharz ist nicht besonders beschränkt, solange ein Kunstharz gewählt wird, dass das Immobilisieren einer Nukleinsäure mittels UV-Bestrahlung erlaubt. Spezielle Beispiele schließen thermoplastische Harze, in Wärme aushärtende Harze und Copolymere usw. ein.
Genauer schließen Beispiele für die thermoplastischen Harze Ionomere (Stryrolarten, Olefinarten), Polynorbonene, Polyacetale, Polyallylate, Polyetheretherketone, Polyethylenoxide, Polyoximethylene, Polyethylentherephthalate, Polycarbonate, Polystyrole, Polysulfone, Polyparamethylstyrole, Polyallylamine, Polyphenylenether, Polyphenylensulfide, Polybutadiene, Polybutylenterephthalate, Polypropylene, Polymethylpentene, Polyethersulfone, Polyphenylensulfide, Polyoxibenzoyle, Polyoxiethylene, Celluloseacetate, Polydimethylsiloxane, Polyisobutylene, Cellulosetriacetate, Poly-p-phenylentherephthalamide, Polyisoprene, Polyacrylnitrile, Polymethylpentene, chlorierte Kunststoffe (Polyvinylchloride, Polyethylenchloride, chlorierte Polypropylene, Polyvinylidenchloride), fluorierte Kunststoffe (Polytetrafluoroethylene, Polychlortrifuorethylene, Polyvinylienfluoride), Polyamide (Nylon-6, Nylon-66), Polyamidimide, Polyimide (thermoplastische Polyimide, Polyetherimide), Polyethylenkunststoffe (chloriert, Polyethylen hoher und niedriger Dichte), Polyvinylkunststoffe (Polyvinylchlorid, Polyvinylacetate, Polyparavinylphenole, Polyvinylalkohole, Polyvinylether, Polyvinylbutyrale, Polyvinylformale, Flüssigkristallpolymere (Flüssigkristallpolymere vom Polyethertyp, Acrylatkunststoffe (Aminopolyacrylamide, Polymethylacrylate, Polymethylmethacrylate, Ethylpolymethacrylate, Butylpolymethacrylate, thermoplastische Elastomere (Styroltypen, Olefintypen, Urethanarten, Polyesterarten, Polyamidarten, 1,2-Polybutadienarten, Vinylchloridarten, fluorierte arten, polyionomere Arten, chlorierte Polyethylenarten, Siliconarten) usw..
Beispiele für in Wärme aushärtende Harze schließen Epoxiharze, Polyxylene, Polyguanamine, Polydiallylphthalate, Polyvinylester, Polyphenole, ungesättigte Polyester, Polyfurane, Polyimide, Polyurethane, Polymaleate, Melaminharze, Harnstoffharze, Alkydharze, Benzoguanaminharze, Polycyanate, Polyisocyanate usw, ein.
Beispiele für die Copolymere schließen Isobutylen/Maliensäureanhydrid-Copolymere, Acrylnitril/Acrylat/Styrol-Copolymere, Acrylnitril/EPDM/Styrol-Copolymere, Acrylnitril/Styrol-Copolymere, Acrylnitril/Butadien/Styrol-Copolymere, Butadien/Stryrol/Methylmethacrylat-Copolymere, Ethylen/Vinylchlorid-Copolymere, Ethylen/Vinylacetat-Copolymere, Ethylen/Ethylacrylat-Copolymere, Acrylnitil/Butadien/Styrol-Copolymere, Polyetheretherketon-Copolymere, fluorierts Ethylen/Polypropylen-Copolymere, Tetrafluorethylen/Perfluoralkylvinylether-Copolymere, Tetrafluorethylen/Ethylen-Copolymere etc. ein.
Unter den vorgenannten Kunstharzen sind besonders bevorzugt: Polycarbonate, Polymethylmethacrylate, Acrylnitril/Butadienl/Styrol-Copolymere, Polyethylene, Polyethylenterephthalat, Polyphenole, Polystyrole, Polyacrylnitrile, Polyvinylchloride, Aramide etc.
Darüber hinaus kann als vorgenanntes Kunstharz ein Kunstharz, dem ein Farbstoff, Färbemittel, Weichmacher, Pigment, Polymerisierungsinhibitor, oberflächenmodifizierender Wirkstoff, Stabilisator, Haftvermittler, Wirkstoff zum Aushärten in der Wärme, Dispergiermittel, Mittel zum Verhindern der Zersetzung durch UV-Strahlung etc. soweit nötig zugesetzt ist, verwendet werden. Weiterhin kann das vorgenannte Kunstharz aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Arten der vorgenannten Kunstharze bestehen, die zur Stabilisierung der Form laminiert sind, oder es kann aus einer einzigen Kunstharzart bestehen. Weiterhin kann das Kunstharz aus einer Polymerlegierung bestehen, die durch Vermischen von zwei oder mehr Arten der vorgenannten Kunstharze erhalten wurde. Weiterhin kann das vorgenannte Kunstharz mit Fasern wie Pflanzenfasern, Fruchtfasern, Fasern aus Tierhaar, Kokoonfasern, Fasern aus Federn, Chitinfasern, Chitosanfasern und Asbestfasern vermischt sein.
Die Form des vorgenannten Trägers ist nicht besonders eingeschränkt, und Beispiele für die Form schließen Fasern, Platten, Filter, Kugeln usw. ein.
Weiterhin kann er die Form einer Mikrotiterplatte haben. Um die Konservierung des erhaltenen Ergebnisses zu erleichtern, kann z.B. die Rückseite einer Platte oder Ähnlichem verwendet werden oder es kann mit einem als Dichtung verwendbarem Material oder Ähnlichem beschichtet werden (Klebstoffe etc.), so dass das Material als Dichtung verwendet werden kann.
Eine Lösung einer Nukleinsäure wird auf vorbestimmte Stellen des vorgenannten Trägers gesprenkelt.
Die Nukleinsäure unterscheidet sich nicht besonders von einer gewöhnlichen auf einer festen Phase immobilisierten Nukleinsäure, die zur Hybridisierung von Nukleinsäuren unter Verwendung einer auf fester Phase immobilisierten Nukleinsäure verwendet wird, und sie ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie eine Nukleinsäure ist, die Hybridisierung ermöglicht. Sie kann z.B. eine natürlich vorkommende oder synthetische DNS sein (einschließlich Oligonukleotiden) oder RNS (einschließlich Oligonukleotiden). Darüber hinaus kann sie einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die Kettenlänge der Nukleinsäure ist auch nicht besonders eingeschränkt, solange sie Hybridisierung ermöglicht. Sie liegt jedoch gewöhnlich bei etwa 5 bis 50 000 Nukleotiden, vorzugsweise 20 bis 10 000 Nukleotiden. Weiterhin kann die Nukleinsäure ein Polymer aus Oligonukleotiden mit einer Gruppe am 5' oder 3'-Ende haben, die unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht reaktiv wird, wie Thymidin oder Ähnliches.
Das Lösungsmittel zum Lösen der Nukleinsäure ist auch nicht besonders eingeschränkt, und Beispiele schließen destilliertes Wasser, Puffer, die gewöhnlich zur Herstellung einer Nukleinsäurelösung verwendet werden, z.B. ein Tris-Puffer wie ein TE-Puffer (10 mM Tris/Salzsäure, pH 8,0, 1 mM EDTA), eine Natriumchlorid enthaltende Lösung, eine ein Salz einer Carboxisäure enthaltende Lösung (Natriumcitrat, Ammoniumcitrat, Natriumacetat, etc.), eine ein Sulfonsäuresalz enthaltende Lösung (Natriumdodecylsulfat, Ammoniumdodecylsulfat, etc.), eine ein Phosphorsäuresalz enthaltende Lösung (Natriumphosphat, Ammoniumphosphat, etc.) usw. ein. Beispiele schließen weiter kommerziell erhältliche Lösungsmittel wie die Microspotting-Lösung (TeleCHem International, Inc.) ein. Weiterhin beträgt die Konzentration der Nukleinsäurelösung, obwohl auch sie nicht besonders eingeschränkt ist, gewöhnlich 1 mmol/mL bis 1 fmol/mL, vorzugsweise 100 pmol/mL bis 100 fmol/ml.
Beispiele für das Verfahren zum Sprenkeln der Nukleinsäurelösung auf den Träger schließen ein Verfahren ein, bei dem die Nukleinsäurelösung mit einer Pipette auf den Träger getropft wird, ein Verfahren unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Besprenklers, usw. Obwohl die Form des Sprenkels und die Menge der zu sprenkelnden Lösung nicht besonders eingeschränkt sind, solange die Stelle, auf die die Nukleinsäurelösung gesprenkelt wurde, nachgewiesen werden kann, ist die Form vorzugsweise punktförmig oder kreisförmig. Die Menge zu sprenkelnder Lösung beträgt vorzugsweise 10 nL bis 10 mL. Die Nukleinsäurelösung wird vorzugsweise auf eine oder zwei oder mehr Stellen auf dem Träger gesprenkelt. Es kann eine Art von Nukleinsäurelösung oder zwei oder mehrere Arten gesprenkelt werden. Eine markierte Nukleinsäureart kann als positive Kontrolle immobilisiert werden und die Immobilisierung der Nukleinsäure auf dem Träger anzeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nachdem die Nukleinsäure auf den Träger gesprenkelt wurde, mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm bestrahlt. Die Nukleinsäurelösung kann nach dem Besprenkeln und vor dem Bestrahlen mit UV-Strahlung getrocknet werden. Was Verfahren zum Trocknen der Nukleinsäurelösung betrifft, so kann spontan getrocknet werden oder Mittels Erhitzen getrocknet werden. Wenn erhitzt wird, liegt die Erwärmungstemperatur gewöhnlich zwischen 30 °C bis 100 °C, vorzugsweise 35 °C bis 45 °C.
Dann wird mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm zumindest an der Stelle oder den Stellen des Trägers, an denen die Nukleinsäure immobilisiert worden war, bestrahlt. Speziell kann der UV-Strahl ein UV-Strahl mit einer breiten Wellenform sein, der eine Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm enthält. Die Bestrahlungsdosis beträgt gewöhnlich als kumulierte Bestrahlungsdosis 100 mJ/cm² oder mehr, vorzugsweise 200 mJ/cm².
Durch das oben beschriebene Immobilisieren einer Nukleinsäure auf einem Träger wird ein Träger mit einer immobilisierten Nukleinsäure hergestellt. Der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Träger mit einer immobilisierten Nukleinsäure kann z.B. zur auf Hybridisierung basierenden Analyse von Nukleinsäuren verwendet werden. Weil die durch das erfindungsgemäße Verfahren auf dem Träger immobilisierte Nukleinsäure sich unter den Bedingungen gewöhnlicher Hybridisierung kaum vom Träger löst, können, verglichen mit dem Fall, bei dem die UV-Bestrahlung nicht durchgeführt wird, bessere Nachweisempfindlichkeit und Reproduzierbarkeit erhalten werden. Die Hybridisierung und ihr Nachweis können auf dieselbe Weise durchgeführt werden wie die Hybridisierung unter Verwendung einer gewöhnlichen, auf einer festen Phase immobilisierten Nukleinsäure.
Weil als Träger zum Immobilisieren bei der vorliegenden Erfindung ein preiswertes Kunstharz verwendet wird, können die Kosten reduziert werden. Weiterhin ist es einfach, weil ein Kunstharz geringe Dichte hat und leicht geformt werden kann, DNS-Mikroarrays in unterschiedlichen Formen herzustellen. Darüber hinaus kann es über einen langen Zeitraum gelagert werden und es hat hervorragende Lagerungsstabilität. Zusätzlich erfordert das erfindungsgemäße Verfahren keinen Schritt, die dem die Oberfläche des Trägers beschichtet wird und somit ist das Verfahren einfach.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 (Foto) zeigt das Ergebnis einer Hybridisierung unter Verwendung der im Beispiel hergestellten Platte mit immobilisiertem Oligonukleotid. A: Beispiel 1, B: Vergleichbeispiel 1, SEQ I: SEQ ID Nr. 1, SEQ 2: SEQ ID Nr. 2. Die gestrichelte Linie stellt die Bereiche dar, in denen die Oligonukleotide immobilisiert worden waren, und die Bereiche, auf die 1 × TE Pufferlösung als Kontrolle gesprenkelt worden war.
Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Im Folgenden wird die Erfindung mittels Beispielen spezieller beschrieben
Beispiel 1: Immobilisierung von Nukleinsäure auf einer Platte
Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 1 und 2, respektive (21-mere) wurden auf konventionelle Art unter Verwendung einer Oligonukleotidvorrichtung (Perkin Elmer Applied Biosystems) synthetisiert. Weiterhin wurde auch eine DNS mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 3 (262 BP) als Sonde hergestellt. Das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 und die Sonde wurden an den 5'-Enden biotinyliert. Das Oligonukleotid mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 war zur biotinylierten Sonde komplementär. Diese Oligonukleotide wurden in 1 × TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,1 mM EDTA) auf eine Konzentration von 1 pmol/μL gelöst.
Jede der vorgenannten Oligonukleotidlösungen wurde auf eine kommerziell erhältliche Polymethylmethacrylat-Platte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt ( 1). Für das Besprenkeln wurde jeweils eine Menge von 0.5 μL Lösung verwendet. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 200 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 80 Sekunden. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 1
Die Polymethylmethacrylat-Platte wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 200 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 1 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Polymethylmethacrylat-Platte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt (1). Für das Besprenkeln wurde eine jeweils Menge von 0.5 μL Lösung verwendet und die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 1 mm. Die Bestrahlungsdauer betrug 80 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 2: Hybridisierung und ihr Nachweis
(1) Hybridisierung
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 1 und dem Vergleichsbeispiel 1 wurden 60 μL einer Hybrisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.), die 3 pmol der biotinylieren Sonde (262 BP) enthielt, gegeben, und die Platten wurden in ein vor Wasser geschütztes Gehäuse (HybriCasette) gegeben, mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
(2) Posthybridisierung
Nach der Hybridisierung wurde unter den folgenden Bedingungen zur Posthybridisierung gewaschen, um die Sonde zu entfernen, die nicht-spezifisch an den Platten mit den immobilisierten Oligonukleotiden adsorbiert war.
[Bedingungen des Posthybridisierungswaschens]

1) 2 × SSC, 0,1 % SDS; Raumtemperatur, 5 Minuten, 2 Mal
2) 0,2 × SSC, 0,1 % SDS; 40 °C, 5 Minuten, 2 Mal
3) 2 × SSC; Raumtemperatur, 1 Minute, 1 Mal

(3) Nachweis von auf der Platte immobilisierten Oligonukleotiden und Hybridisierung
Auf die Bereiche der Platten, auf die die Hybridisierungslösung gegeben worden war, wurden 1,5 mL einer Milchproteine enthaltenden Blockerlösung (BlockAce, Snow Brand Milk Products) gegeben, um 30 Minuten lang bei Raumtemperatur Blocken durchzuführen. Nachdem die Blockierlösung entfernt worden war, wurden 1,5 mL Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugatlösung (Vector) aufgetragen und man ließ 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren. Dann wurden die Platten in TBST-Lösung getaucht (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20) und 5 Minuten geschüttelt, um das Konjugat, das nicht reagiert hatte, zu entfernen. Schließlich wurden 1,5 mL einer Substratlösung (TMB) auf die Bereiche aufgegeben, auf die die Hybridisierungslösung aufgegeben worden war, und man ließ 30 Minuten stehen, um eine Anfärbereaktion durchzuführen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 1 dargestellt. Die in Tabelle 1 verwendeten Symbole haben dieselben Bedeutungen auch in Tabelle 2 und den später erwähnten Tabellen. Die Signale der Positionen, an denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 immobilisiert worden war, machen Mengen immobilisierter Oligonukleotide erkennbar, und die Signale der Positionen, an denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 immobilisiert worden war, kennzeichnen die Intensität der Hybridisierung. Tabelle 1

:: Die meisten Signale erschienen extrem klar mit extrem hoher Empfindlichkeit
o:: Die meisten Signale erschienen klar mit hoher Empfindlichkeit
Δ:: Ein Teil der Signale erschien unklar oder mit geringer Empfindlichkeit
X:: Die meisten Signale erschien unklar oder mit geringer Empfindlichkeit, oder er erschien überhaupt kein Signal.

Wie aus den in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 1 immobilisiert wurden als auf der mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 1. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 1 klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) überhaupt kein Signal.
Beispiel 3: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Oligonukleotide mit den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 4, 5 und 6, respektive, (31-mere) wurden auf konventionelle Art unter Verwendung einer Oligonukleotidsynthese-Vorrichtung (Perkin Elmer Applied Biosystems) synthetisiert. Das Oligonukleotid mit der SEQ ID Nr. 4 wurde am 5'-Ende biotinyliert. Die Oligonukleotide mit den SEQ ID Nr. 4 und 5 korrespondierten mit den in Beispiel 1 beschriebenen Oligonukleotiden mit den SEQ ID Nr. 1 und 2 mit zehn Thymidinresten an den 5'-Enden, respektive. Das Oligonukleotid mit der SEQ ID Nr. 5 war zu der vorgenannten biotinylierten Sonde komplementär und das Oligonukleotid mit den SEQ ID Nr. 6 war nicht komplementär, weil es sich vom Oligonukleotid mit der SEQ ID Nr. 5 durch ein Nukleotid unterschied. Diese Oligonukleotide wurden in 3 × SSC zu einer Konzentration von 100 pmol/mL gelöst.
Jede der vorgenannten Oligonukleotidlösungen wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine kommerziell erhältliche Polycarbonatplatte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,3 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 300 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 120 Sekunden. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 2
Die Polycarbonat-Platte wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 300 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 3 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Polycarbonat-Platte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) gesprenkelt. Die Bestrahlungsdauer betrug 120 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 4: Hybridisierung und ihr Nachweis
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit den immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 3 und dem Vergleichsbeispiel 2 wurden 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde (262 BP) enthielt, und diese Platten wurden in ein vor Wasser geschütztes Gehäuse (HybriCasette) gegeben, mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der auf den Platten immobilisierten Oligonukleotiden und der Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 2 dargestellt. Die Signale der Positionen, an denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 4 immobilisiert worden war, machen Mengen immobilisierter Oligonukleotide erkennbar, und die Signale der Positionen, an denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 5 immobilisiert worden war, kennzeichnen die Intensität der Hybridisierung. Tabelle 2
Wie aus den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 3 immobilisiert wurden, als auf der mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 2. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 3 auch klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) und der SEQ ID Nr. 6 überhaupt kein Signal.
Beispiel 5: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Jede der vorgenannten Oligonukleotidlösungen wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine Platte, die aus drei Lagen Aramid-Vliesstofffasern, Tetrontuch und Aramid-Vliesstofffasern bestand (die Oberfläche bestand aus Aramid-Vliesstofffasern, Sagami PCI) als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Tetron (eingetragenes Warenzeichen von Teijin Ltd.) besteht aus Polyethylenterephthalat. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,3 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 400 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 160 Sekunden. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 3
Die Platte, die aus drei Lagen Aramid-Vliesstofffasern, Tetrontuch und Aramid-Vliesstofffasern bestand (die Oberfläche bestand aus Aramid-Vliesstofffasern, Sagami PCI), wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 400 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 3 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Platte aus Aramid-Vliesstofffasern/Tetrontuch/Aramid-Vliesstofffasern als drei Flecken an vorbestimmten Stellen unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxisis 5500, CARTESIAN) gesprenkelt. Die Bestrahlungsdauer betrug 160 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 6: Hybridisierung und ihr Nachweis
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 5 und dem Vergleichsbeispiel 3 wurden 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde (262 BP) enthielt, und diese Platten wurden in ein vor Wasser geschütztes Gehäuse (HybriCasette) gegeben, mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung, der Nachweis der auf den Platten immobilisierten Oligonukleotide und die Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 3 dargestellt. Tabelle 3
Wie aus den in Tabelle 3 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 5 mobilisiert wurden als auf der mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 3. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 5 auch klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) und der SEQ ID Nr. 6 überhaupt kein Signal.
Beispiel 6: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Oligonukleotide mit den in Beispiel 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 und 2 wurden in 5 × wässriger SSC-Lösung zu einer Konzentration von 70 pmol/mL gelöst.
Jede der vorgenannten Oligonukleotidlösungen wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine kommerziell erhältliche Polyethylen-Platte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,2 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 250 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 100 Sekunden. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 4
Die Polyethylen-Platte wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 250 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Polyethylen-Platte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxisis 5500, CARTEAIAN) gesprenkelt. Die Bestrahlungsdauer betrug 100 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 7: Hybridisierung und ihr Nachweis
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 6 und dem Vergleichsbeispiel 4 wurden 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde enthielt, und diese Platten wurden in ein vor Wasser geschütztes Gehäuse (HybriCasette) gegeben, mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der auf den Platten immobilisierten Oligonukleotide und die Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 4 dargestellt. Die Signale der Positionen, an denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 immobilisiert worden war, machen Mengen immobilisierter Oligonukleotide erkennbar, und die Signale der Positionen, an denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 immobilisiert worden war, kennzeichnen die Intensität der Hybridisierung. Tabelle 4
Wie aus den in Tabelle 4 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 6 immobilisiert wurden als auf der mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 4. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 6 auch klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) überhaupt kein Signal.
Bespiel 8: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine kommerziell erhältliche Phenolharzplatte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,4 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 600 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 240 Sekunden. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 5
Die Phenolharz-Platte wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 600 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Polyethylen-Platte ((Anmerkung des Übersetzers: Vermutlich ist die oben im Absatz genannte Phenolharz-Platte gemeint)) als drei Flecken an vorbestimmten Stellen unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) gesprenkelt. Die Bestrahlungsdauer betrug 240 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 9: Hybridisierung und ihr Nachweis
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit den immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 8 und dem Vergleichsbeispiel 5 wurden 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde (262 BP) enthielt, und diese Platten wurden in ein vor Wasser geschütztes Gehäuse (HybriCasette) gegeben, mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der auf den Platten immobilisierten Oligonukleotiden und die Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 5 dargestellt. Tabelle 5
Wie aus den in Tabelle 5 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 8 immobilisiert wurden als auf der mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 5. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 8 auch klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) überhaupt kein Signal.
Beispiel 10: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine kommerziell erhältliche Polystyrolplatte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,4 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 600 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 240 Sekunden. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 6
Die Polystyrol-Platte wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 600 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Polyethylen-Platte ((Anmerkung des Übersetzers: Vermutlich ist die oben im Absatz genannte Polystyrol-Platte gemeint)) als drei Flecken an vorbestimmten Stellen unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) gesprenkelt. Die Bestrahlungsdauer betrug 240 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 11: Hybridisierung und ihr Nachweis
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 10 und dem Vergleichsbeispiel 6 wurden 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde (262 BP) enthielt, und diese Platten wurden in ein vor Wasser geschütztes Gehäuse (HybriCasette) gegeben, mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der auf den Platten immobilisierten Oligonukleotide und die Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 6 dargestellt. Tabelle 6
Wie aus den in Tabelle 6 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 10 immobilisiert wurden als auf der mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 6. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Platte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 10 auch klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) überhaupt kein Signal.
Beispiel 12: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Mikrotiter-Platte
Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf eine 24-Loch-Polystyrol-Mikrotiterplatte (NUNC) als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Menge an Lösung für jedes Besprenkeln betrug 0,5 mL und die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 1 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 1200 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 480 Sekunden. Dann wurde pro Stelle 1 mL Wasser auf die vorbestimmten Stellen der Mikrotiterplatte gegeben und die Platte wurde durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 7
Die 24-Loch-Polystyrol-Mikrotiterplatte (NUNC) wurde zuerst mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 1200 mJ/cm² bestrahlt. Jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde auf die Polystyrolplatte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Menge an Lösung für jedes Besprenkeln betrug 0,5 mL und die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 1 mm. Die Bestrahlungsdauer betrug 480 Sekunden. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde pro Stelle 1 mL Wasser auf die vorbestimmten Stellen der Mikrotiterplatte gegeben und die Platte wurde durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 13: Hybridisierung und ihr Nachweis
Auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Mikrotiterplatten mit den immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 12 und dem Vergleichsbeispiel 7 wurden 100 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde (262 BP) enthielt, ein Deckel wurde auf die Platte gelegt, um die Lösung vor Wasser zu schützen, und die Platte wurde in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der auf den Mikrotierplatten immobilisierten Oligonukleotiden und die Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 2 dargestellt. Tabelle 7
Wie aus den in Tabelle 7 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Mikrotiterplatte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 12 immobilisiert wurden als auf der Mikrotiterplatte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 7. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale auf der Mikrotiterplatte mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 12 auch klar. Zusätzlich erschien an den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) überhaupt kein Signal.
Beispiel 14: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf Polystyrolkugeln
Polystyrolkugeln (Dainippon Ink & Chemicals, Mitsubishi Chemical, etc.) wurden in eine Quarzzelle gegeben und jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen wurde in einem Volumen von 500 μL in die Zelle gegeben. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 480 Sekunden. Dann wurde zu den Kugeln Wasser gegeben und 30 Minuten geschüttelt, um die Kugeln zu waschen, und die Kugeln wurden dann getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren ähnliche Weise als Kontrolle unterzogen.
Vergleichsbeispiel 8
Die Polystyrolkugeln (Dainippon Ink & Chemicals, Mitsubishi Chemical, etc.) wurden in eine Quarzzelle gegeben und mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 1200 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 480 Sekunden Dann wurde jede der in Beispiel 6 beschriebenen Oligonukleotidlösungen in einem Volumen von 500 μL in die Zelle gegeben. Die Kugeln wurden aus der Zelle entnommen und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde zu den Kugeln Wasser gegeben und 30 Minuten geschüttelt, um die Kugeln zu waschen, und die Kugeln wurden dann getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren auf ähnliche Weise als Kontrolle unterzogen.
Beispiel 13: Hybridisierung und ihr Nachweis
Zu den Kugeln mit den immobilisierten Oligonukleotiden aus Beispiel 14 und dem Vergleichsbeispiel 8 wurden 100 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 3 pmol biotinylierter Sonde (262 BP) enthielt, ein Deckel wurde aufgelegt, um die Kugeln und die Lösung vor Wasser zu schützen, und sie wurden in ein Wasserbad getaucht und 2 Stunden lang auf 45 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der auf den Kugeln immobilisierten Oligonukleotide und die Hybridisierung auf dieselbe Art durchgeführt wie in Beispiel 2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammen mit den Ergebnissen des Vergleichsbeispiels 8 dargestellt. Die Signale der Kugeln, auf denen das Oligonukleotid mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 1 immobilisiert ist, zeigen die Menge an immobilisierten Oligonukleotiden an, und die Signale der Kugeln, auf denen das Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID Nr. 2 immobilisiert ist, zeigen das Maß der Hybridisierung an. Tabelle 8
Wie aus den in Tabelle 8 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die Oligonukleotide mit größerer Wahrscheinlichkeit auf den Kugeln mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 14 immobilisiert wurden als auf den Kugeln mit immobilisierten Oligonukleotiden des Vergleichbeispiels 8. Darüber hinaus erschienen die Hybridisierungssignale der Kugeln mit immobilisierten Oligonukleotiden des Beispiels 14 auch klar. Zusätzlich erschien bei den Kontrollkuglen (Kugeln die in eine Lösung getaucht worden waren, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) überhaupt kein Signal.
Beispiel 16: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Ein λDNS-Fragment (A) wurde auf konventionelle Weise angereichert, indem Oligonukleotide verwendet wurden, die als Primer die in den SEQ ID Nummern 7 und 8 gezeigten Nukleotidsequenzen haben. Das erhaltene Fragment wurde einer Elektrophorese in Agarose unterzogen und mittels Anfärben mit Ethidiumbromid nachgewiesen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass das Fragment eine Länge von etwa 300 b hatte. Weiterhin wurde auch ein λDNS-Fragment, das zum vorgenannten λDNS-Fragment nicht komplementär war, λDNS-Fragment (B) (etwa 300 b), auf ähnliche Weise angereichert.
Jede der vorgenannten λDNS wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine kommerziell erhältliche Polycarbonat-Platte als drei Flecken an vorbestimmte Stellen gesprenkelt. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,3 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 600 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 240 Sekunden. Dann wurde die Platte wurde durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 9
Jede der in Beispiel 16 beschriebenen λDNS-Lösungen (Konzentration; 1 pmol/μL) wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf die Polycarbonat-Platte als drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte wurde durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 17: Hybridisierung und ihr Nachweis
(1) Hybridisierung
Ein λDNS-Fragment (C) wurde angereichert, indem ein Oligonukleotid als Primer verwendet wurde, das die in der SEQ ID Nummern 7 gezeigte, am 5'-Ende mit Biotin markierte Nukleotidsequenz, und die in der SEQ ID. Nr. 8 gezeigte Nukleotidsequenz hatte. Die Sequenz dieses λDNS-Fragments (C) war die selbe, wie diejenige des in Beispiel 16 hergestellten λDNS-Fragments (A)
Die Platten mit immobilisierter λDNS aus Beispiel 16 und dem Vergleichsbeispiel 9 wurden in Wasser getaucht und 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt und in Wasser getaucht und 5 Minuten lang auf 4 °C gekühlt. Anschließend wurde auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit immobilisierter λDNS 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 1 pmol des vorgenannten biotinylierten λDNS-Fragment (C) enthielt, und die Platten wurden zum Schutz vor Wasser in ein Gehäuse gegeben (HybriCassette), mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und zwei Stunden lang auf 60 °C erwärmt.
(2) Posthybridisierung
Nach der Hybridisierung wurde unter den folgenden Bedingungen zur Posthybridisierung gewaschen, um die Sonde zu entfernen, die nicht-spezifisch an den Platten mit der immobilisierten λDNS adsorbiert war.
[Bedingungen des Posthybridisierungswaschens]

1) 2 × SSC, 0,1 % SDS; Raumtemperatur, 5 Minuten, 2 Mal
2) 0,2 × SSC, 0,1 % SDS; 40 °C, 5 Minuten, 2 Mal
3) 2 × SSC; Raumtemperatur, 1 Minute, 3 Mal

(3) Nachweis der Hybridisierung
Auf die Bereiche der Platten, auf die die Hybridisierungslösung gegeben worden war, wurden 1,5 mL einer Milchproteine enthaltenden Blockierlösung (BlockAce, Snow Brand Milk Products) gegeben, um 30 Minuten lang bei Raumtemperatur Blocken durchzuführen. Nachdem die Blockierlösung entfernt worden war, wurden 1,5 mL Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugatlösung (Vector) aufgetragen und man ließ 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren. Dann wurden die Platten in TBST-Lösung getaucht (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween 20) und 5 Minuten geschüttelt, um das Konjugat, das nicht reagiert hatte, zu entfernen. Schließlich wurden 1,5 mL einer Substratlösung (TMB) auf die Bereiche der Platten aufgegeben, auf die die Hybridisierungslösung aufgegeben worden war, und man ließ 30 Minuten stehen, um eine Anfärbereaktion durchzuführen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9
Wie aus den in Tabelle 9 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die λDNS-Fragmente sicher auf der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Beispiels 16 immobilisiert wurden, weil die Hybridisierungssignale bei der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Beispiels 16 spezifisch und klar auftraten. Andererseits trat bei der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Vergleichsbeispiels 9 überhaupt kein Signal auf. Zusätzlich trat auch auf den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) bei der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Beispiels 16 und der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Vergleichsbeispiels 9 überhaupt kein Signal auf.
Beispiel 18: Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Platte
Jede der in Beispiel 16 beschriebenen Lösungen von λDNS wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf eine kommerziell erhältliche Polymethylmethacrylat-Platte drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Die Flecken hatten einen Durchmesser von etwa 0,3 mm. Diese Platte wurde in einen Trockner gegeben und 20 Minuten lang bei 42 °C getrocknet. Dann wurde mit einem UV-Strahl mit einer Komponente mit einer Wellenlänge von 280 nm unter Verwendung eines UV-Stratalinkers 2400 (STRATAGENE) mit einem Abstand von 16 cm mit 1200 mJ/cm² bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 240 Sekunden. Dann wurde die Platte wurde durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Vergleichsbeispiel 10
Jede der in Beispiel 16 beschriebenen λDNS-Lösungen (Konzentration; 1 pmol/μL) wurde unter Verwendung eines Besprenklers (Pyxsis 5500, CARTESIAN) auf die Methacrylat-Platte drei Flecken an vorbestimmten Stellen gesprenkelt. Diese Platte wurde in einen Trockner eingebracht und 20 Minuten lang bei 42 °C nm getrocknet. Dann wurde die Platte wurde durch 30 Minuten Schütteln in Wasser gewaschen und getrocknet.
Andererseits wurde auch eine Lösung, die keine Nukleinsäuren enthielt (1 × TE-Puffer) dem Immobilisierungsverfahren als Kontrolle unterzogen, indem sie auf ähnliche Weise auf die Platte gesprenkelt wurde.
Beispiel 19: Hybridisierung und ihr Nachweis
Die Platten mit immobilisierter λDNS aus Beispiel 18 und dem Vergleichsbeispiel 10 wurden in Wasser getaucht und 10 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, und dann in Wasser getaucht und 5 Minuten lang auf 4 °C gekühlt. Anschließend wurde auf die Bereiche mit den immobilisierten Nukleinsäuren der Platten mit immobilisierter λDNS 60 mL einer Hybridisierungslösung (Arrayit UniHyb, TeleCHem International, Inc.) gegeben, die 1 pmol der in Beispiel 17 beschriebenen biotinylierten λDNS (C) enthielt, und die Platten wurden zum Schutz vor Wasser in ein Gehäuse gegeben (HybriCassette), mit dem Gehäuse in ein Wasserbad getaucht und zwei Stunden lang auf 60 °C erwärmt.
Anschließend wurden die Posthybridisierung und der Nachweis der Posthybridisierung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 17 beschrieben, durchgeführt. Die
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10
Wie aus den in Tabelle 10 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird gezeigt, dass die λDNS-Fragmente sicher auf der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Beispiels 18 immobilisiert wurden, weil die Hybridisierungssignale bei der Platte spezifisch und klar auftraten. Andererseits trat bei der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Vergleichsbeispiels 10 überhaupt kein Signal auf. Zusätzlich trat auch auf den Kontrollstellen (Positionen, auf die eine Lösung gesprenkelt worden war, die keinerlei Nukleinsäure enthielt) bei der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Beispiels 18 und der Platte mit immobilisierten λDNS-Fragmenten des Vergleichsbeispiels 10 überhaupt kein Signal auf.
Industrielle Anwendbarkeit
Entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Nukleinsäure, insbesondere eine kurzkettige Nukleinsäure, bequem und effizient auf einem Träger aus Kunstharz immobilisiert werden.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zum Immobilisieren einer Nukleinsäure auf einem Träger, umfassend die Schritte des Sprenkelns einer Lösung der Nukleinsäure auf den Träger und des Bestrahlens des Trägers, der mit der Lösung der Nukleinsäure besprenkelt ist, mit einem Ultraviolettstrahl, der eine Komponente aufweist, die eine Wellenlänge von 280 nm aufweist, wobei der Träger aus einem Kunstharz oder einem Naturharz hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kunstharz aus thermoplastischen Harzen, aus in Wärme aushärtenden Harzen und aus Copolymeren ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Kunstharz aus Polykarbonat, Polymethylmethacrylat, Acrylonitril/Butadien/Styrol-Copolymer, Polyethylen, Polyethylenterephthalat, Polyphenol, Polystyrol, Polyacrylonitril, Polyvinylchlorid und Aramid ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Bestrahlungsdosis des Ultraviolettstrahls 100 mJ/cm² oder mehr ist.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers mit immobilisierter Nukleinsäure, bei dem eine Nukleinsäure auf einem Träger immobilisiert wird, umfassend die Schritte des Sprenkelns einer Lösung der Nukleinsäure auf den Träger und des Bestrahlens des Trägers, der mit der Lösung der Nukleinsäure besprenkelt ist, mit einem Ultraviolettstrahl, der eine Komponente aufweist, die eine Wellenlänge von 280 nm aufweist, um die Nukleinsäure auf dem Träger zu immobilisieren.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Träger mit immobilisierter Nukleinsäure zur Analyse der Nukleinsäure mittels Hybridisierung verwendet wird.