WO2001062963A2 - Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung lehrt ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren an einer Oberfläche eines nichtporösen organischen Polymerwerkstoffs, welcher keine primären und/oder sekundären Amingruppen trägt, mit den folgenden Verfahrensstufen: (a) es wird eine wässrige Lösung enthaltend eine Nukleinsäure sowie ein gelöstes Salz, wobei das Kation des Salzes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Natrium, Magnesium und Mischungen dieser Kationen", hergestellt, (b) die Lösung aus Stufe (a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert, (c) nach oder gleichzeitig mit Stufe (b) wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt.

Description

Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren an einer Oberfläche eines organischen Polymerwerkstoffs mit den folgenden Verfahrensstufen: a) es wird eine wäßrige Lösung enthal- tend eine Nukleinsäure hergestellt, b) die Lösung aus Stufe a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert, c) nach oder gleichzeitig mit Stufe b) wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt, ein Immobilisat, .erhältlich mittels eines solchen Verfahrens, sowie die Verwendung eines solchen Immobilisats .

Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.

In vielen Bereichen der Biochemie ist es erforderlich, Nukleinsäuren, insbesondere kurze Oligonukleotide mit 20 bis 200 Nukleotiden, durch Bindung an einem Sub- strat zu immobilisieren. Ein typischer Anwendungsbereich ist durch die sogenannten Nukleinsäurechips gegeben, bei welchen verschiedene Nukleinsäuren in verschiedenen Arealen, mit entsprechender Zuordnung, einer Oberfläche eines Substrates bzw. Trägerbauteiles gebunden sind. Eine Bindung einer Nukleinsäure an eine Oberfläche eines Festkörpers kann grundsätzlich beispielsweise adsorptiv, durch Physisorption oder Chemisorption, erfolgen. Wünschenswerter ist jedoch eine covalente Bindung, da diese vergleichsweise fest ist und ein störendes Herunterwaschen von gebundenen Nukleinsäuren in subsequenten Prozessierungs- oder Analysestufen unter üblichen Bedingungen zuverlässig verhindert.

Die Literaturstelle Nagata et al., FEBS Letters 183:379-382, 1985, beschreibt die Adsorption geklönter DNA mit ca. 40 kB an Polystyrol. Hierbei wurde in PBS (8 mM Na₂PO„, 1,5 mM KH,P0₄, 137 M NaCl, 2,7 mM KC1) mit 0,1 M MgCl₂ gearbeitet und erst nach Aspirieren mit UV bestrahlt. Ähnliches ist in den Literaturstellen FR2663040, US5510085 und Nikiforov et al . , PCR Methods Applic. 3:285-291, 1994, beschrieben. Die Lit- eraturstelle Keller et al . , J. Clin. Microbiol. 29: 638-641, 1991, beschreibt die Adsorption von Phagen DNA mit ca. 7 kB an Plastikmaterialien. Die Literaturstelle Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22: 4167-4175, 1994 beschreibt die Adsorption von Oli- gonukleotiden über eine über kationische Detergenzien vermittelte Bindung. In diesem Stand der Technik handelt es sich bei den Nukleinsäuren typischerweise um längere DNA Fragmente mit meist bedeutend mehr als einigen kB.

Chemisch aktivierte Substratoberflächen aus Polymerwerkstoffen, einschließlich Polystyrol, sowie zur covalenten Bindung daran geeignete biologisch aktive Substanzen sind beispielsweise in den Literaturstellen US4736019, US4657873, US4654299, US4419444 und

US4081329 beschrieben. Eine chemische Funktionalis- ierung von Polystyrol ist auch in den Literaturstellen US3956219, US3886486, US3974110, US3995094 und US4226958 beschrieben.

Die Literaturstelle Church et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1991-1995, 1984, beschreibt eine fotochemische Methode zum Vernetzen genomischer DNA Fragmente auf Nylon Membranen. Aus der Literaturstelle Saito et al., Tetrahedron Lett., 22: 3265-3268, 1981, ist es bekannt, daß primäre Amingruppen mit lichtak- tiviertem Thymidin hochreaktiv sind, und dieser Prozeß wird als Grundlage des Mechanismus der covalenten Bindung von Nukleotiden an Membranen angenommen. Die Literaturstelle W08911548 beschreibt ein Verfahren sowie Reagenzien für die Immobilisierung von Oligonuk- leotiden durch Bindung eines Polynukleotids, vorzugsweise eines Abstandshälters aus poly-dT, an eine Nukleinsäure Probe und Fixierung des Abstandshalters an einem Substrat mit primären oder sekundären Anim- gruppen, beispielsweise Nylon) mittels UV-Bestrahlung. Der Abstandshalter ist länger als die Nukleinsäure- probe.

Im Rahmen der Maßnahmen des Standes der Technik ist es regelmäßig erforderlich, eine Aktivierung der Ober- fläche eines organischen Polymerwerkstoffes für eine Reaktion mit einem Oligonukleotid durchzuführen und/oder einen Polymerwerkstoff einzusetzen, welcher primäre und/oder sekundäre Amingruppen trägt. Ersteres ist störend aufwendig. In beiden Fällen stört zudem eine verbleibende Reaktivität der Oberfläche aufgrund von nicht abgebundenen reaktiven Öberflächensites. Weiterhin handelt es im Rahmen der Maßnahmen des Standes der Technik meist um lange DNA Fragmente, welche immobilisierbar sind, während kurze Nukleinsäuren unter vergleichbaren Bedingungen offenbar nicht adsorbiert werden. Schließlich bieten die bekannten Maßnahmen eine lediglich adsorptive Bindung, welche 5.für verschiedene Anwendungen nicht ausreichend stabil ist .

Technisches Problem der Erfindung 0

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, eine Verfahren zur Herstellung eines Immobilisats mit an einem polymeren Werkstoff fest gebundenen Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotiden, anzugeben,5 welches weder eine Aktivierung der Oberfläche des, Werkstoffes^' mittels Aktivierungsreagentien oder dergleichen, noch einen per se aufgrund von primären und/oder sekundären Amingruppen reaktiven Werkstoff erfordert . 0

Grundzüge der Erfindung.

Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er-5 findung ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren mit weniger als 300 Basenpaaren an einer Oberfläche eines vorzugsweise nicht-porösen organischen Polymerwerkstoffs, welcher keine primären und/oder sekundären Amingruppen trägt, mit den fol-0 genden Verfahrensstufen: a) es wird eine wäßrige

Lösung enthaltend eine Nukleinsäure sowie ein gelöstes Salz hergestellt, b) die Lösung aus Stufe a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert, c) es wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt. Nach der Stufe c) sind die Nukleinsäuren immobilisiert und die Lösung kann abgezogen werden. Die Stufe c) kann gleichzeitig oder unmittelbar nach der Stufe b) durchgeführt werden. Wenn die Stufe c) ^' unmittelbar nach der Stufe b) durchgeführt wird, so ist damit eine beispielsweise manipulationsbedingte Zeitspanne gemeint, welche typischerweise unter 30 min., meist unter 5 min., besser unter 1 min., liegt. Die Nukleinsäure kann weniger als 200, insbesondere weniger als 100 Basenpaare aufweisen.

Überraschenderweise gelingt die Immobilisierung an Oberflächen von Polymerwerkstoffen, und zwar, an nicht -- zuvor chemisch oder physikalisch aktivierten Oberflächen allein durch Vermittlung des in der die Nukleinsäure enthaltenden Lösung vorliegenden Salzes in Verbindung mit der UV-Licht Bestrahlung, und zwar ohne daß vorher eine Adsorptionsverfahrenstufe und/oder Aspiration durchgeführt wird. Offenbar findet eine direkte, nicht-adsorptive Immobilisierung statt. Die Nukleinsäure läßt sich nach der Immobilisierung unter für die Prozessierung und/oder Analyse typischen Bedingungen nicht mehr von der Oberfläche ablösen. Die Bindung der Nukleinsäure an der Oberfläche ist offenbar covalent.

Die Erfindung lehrt weiterhin ein Immobilisat mit einem Polymerwerkstoff und einer an eine Oberfläche des Polymerwerkstoffes gebundenen Nukleinsäure, erhältlich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Oberfläche planar oder die Mantelfläche einer Polymerfaser ist, sowie die Verwendung eines solchen Immobilisats in einem Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren, wobei die an der Oberfläche des Polymerwerkstoffes immobilisierte Nukleinsäure eine Hybridisierungsregion aufweist, mit den folgenden Verfahrensstufen: a) die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats wird mit einer die Benetzung der Oberfläche fördernden Lösung behandelt, b) ein Teil der die Nukleinsäure tragenden Oberfläche des Immobilisats wird dann mit einer Hybridisierung- slösung kontaktiert, wobei die Hybridisierungslösung die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats selbsttätig vollständig benetzt. Im Benetzten Bereich erfolgt dann die Hybridisierung und ggf. deren Detektion auf übliche Weise. Bei. letztgenanntem Aspekt der Erfindung sind ein Detergenz und Salz an der Immobilisat Oberfläche gebunden (beispielsweise durch Block-Schritt) . Die Hybridisierungslösung enthält Target und weist die Besonderheit auf, daß sie sehr wenig Ionen enthält (beispielsweise weniger als 100 mM Salz Gesamtkonzentration) und darüber hinaus alkalisch ist (pH 8 - 14) . Dadurch liegen doppelsträngige DNA/RNA Targets als Einzelstrang vor, der erst durch Einwirkung der an der Oberfläche des Immobilisats gebun- denen Detergenzien und/oder Salze bindefähig wird. Bei den eingesetzten Ionenstärken der Hybridisierungslösung tritt eine Hybridisierung an sich nämlich nicht auf. In diesem Zusammenhang ist ebenso wichtig, daß die Hybridisierungslösung mit nur kleinem Volumen aufgebracht wird und sich als Kapillarfilm entlang der Oberfläche verteilt. Die vorstehende Verwendung ist, bezogen auf den Einsatz einer die Benetzung fördernden Lösung, von selbstständiger Bedeutung, und zwar unabhängig von dem Einsatz des erfindungsgemäßen Immobilisats . Der Ein- satz von die Benetzung einer Oberfläche fördernden Lösung im Zusammenhang mit Immobilisaten läßt sich nämlich grundsätzlich bei beliebigen Immobilisaten enthaltend biologisch aktive Substanzen bzw. Material, also auch beispielsweise solchen mit Proteinen, Pep- tiden und/oder Zuckern einsetzen. In jedem Falle wird erreicht, daß eine auf das Immobilisat aufgegebene Lösung, enthaltend einen Bindungspartner oder prospek- tiven Bindungspartner für das immobilisierte biologisch aktive Material, sich selbsttätig praktisch über die Oberfläche des Immobilisats, einen Kapillarfilm bildend, ausbreitet. Hierdurch wird weniger der aufzugebenden Lösung benötigt. Zudem wird bei Einsatz einer gleichen Menge einer Verbindung in der aufgegebenen Lösung ein stärkeres Signal bei Bindung erhal- ten, weil das Verhältnis Grenzfläche Lösung/Immobili- sat zu Volumen der aufgegebenen Lösung aufgrund der Ausbildung eines Kapillarfilmes erhöht wird. Die Analytik wird somit letztendlich empfindlicher.

Erfindungsgemäße Immobilisate lassen sich sowohl zur eigentlichen Analyse (Analysatcharakterisierung) als auch zur Vorbereitung einer Probe verwenden, beispielsweise zur Abtrennung von spezifischen Analysat- bestandteilen durch Festphasenbindung aus einem komplexen Gemisch, z.B. von genomischer DNA aus Blutproben oder RNA, etc, oder beispielsweise zur Anreicherung an der festen Phase, z.B. durch enzymatische Verfahren. Für letzteres kann z.B. eine Bindungsstelle für ein Enzym, wie T7 DNA Polymerase, in das immobilisierte Oligonukleotid eingebaut werden,

Bevorzugte Ausführungformen der Erfindung

Nach der Verfahrenstufe c) kann eine Waschver- fahrensstufe durchgeführt werden. Hiermit werden nicht (covalent) gebundene Nukleinsäuremoleküle gleichsam abgewaschen bzw. desorbiert. Nach der Verfahrenstufe c) oder nach der Waschverfahrenstufe kann eine Spülverfahrenstufe mit einer wäßrigen Lösung enthaltend ein Detergenz durchgeführt werden. Mittels des Detergenz werden eventuelle reaktive Oberflächensites, welche unbesetzt geblieben sind, abgesättigt bzw. blockiert, aber auch die Adhäsionskräfte zwischen einer subsequent aufgegebenen Lösung und dem Immobilisat gegenüber den Cohäsionskräften in der subsequent aufgegebenen Lösung erhöht und so die Benetzbarkeit des Immobilisats erhöht, bis zu vollständigen

Selbstbenetzung bzw. selbstständiger Ausbildung eines Kapillarfilmes .

Der Polymerwerkstoff kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Polyethylen (PE) , Polycarbonat (PC), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol (PS), Poly- therephthalat (PETP) , Polyethersulfon (PES) , Poly- etheretherketon (PEEK) , Polyphenylenoxid (PPO) , Polyphenylensulfid (PPS), Polybuthylenterephthalat (PBT, Polyoxymethylen (POM), Polysulfon (PSU), Poly- etherimid (PEI), Polyamid (PA) und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere", insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Polycarbonat (PC), Polyvinylchlorid (PVC) , Polystyrol (PS)' und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere".

Die Konzentration der Nukleinsäure in der Lösung kann-^' im Bereich von 0,0001 bis 1000 nM, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 nM, liegen. Es versteht sich, daß auch verschiedene Nukleinsäuren eingesetzt werden können, jeweils in Konzentrationen, wie angegeben.

Die Gesamtkonzentration des gelösten Salzes in der Lösung liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0,1 bis 6 M, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 3 M. Das Salz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "MgCl₂, CaCl₂, NaCl, KCl, LiCl, NH₄HC0₃, NaHC0₃, Na₂C0₃, NH₄C1, NaHP0₄, NaPi, NH₄Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base, KHS0₄, K₂S₂0₅, Tetraethylammoniumchlorid, MOPS, HEPES, Bernsteinsäure, Diethanolamin, Ethanola- min, NaHC0₃/NaCl/EDTA, PBS, TAE, Bisulfit, NaBorat, und Mischungen dieser Stoffe". Als Salz ist ein Stoff bezeichnet, welcher in wäßriger Lösung in zumindest ein Anion und zumindest ein Kation dissoziiert. Das UV-Licht sollte eine Wellenlänge im Bereich 1 nm bis 480 nm, insbesondere 100 nm bis 300 nm, aufweisen. Die Bestrahlungsdauer beträgt typischerweise 1 s bis 100 min, vorzugsweise 10 s bis 10 min., beispielsweise 0,5 bis 2 min.. Eine Strahlungsleistung, wie von einer 60 W UV-Lampe über 2 min. bei einem Abstand von 15 cm geliefert, ist durchaus ausreichend.

Das Detergenz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarko- sysl, und Mischungen solcher Substanzen". In der Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Immobilisats, wobei die Oberfläche die Mantelfläche einer Polymerfaser ist, sind eine Vielzahl von solchen Po- lymerfasern parallel oder mit in Richtung der Längserstreckung sich^' vergrößerndem Abstand zueinander angeordnet und fixiert, wobei die Mantelflächen benachbarter Polymerfasern einander nicht oder nur mit Punkt- oder Linienkontakt berühren und wobei die Zwischenräume zwischen den Polymerfasern so eng bemessen sind, daß sich in den Zwischenräumen eine Kapil- laraszension subsequenz aufgegebener Lösungen von zumindest 0,1 mm einstellt.

Die die Benetzung fördernde Lösung kann ein Detergenz ausgewählt aus ^'der Gruppe, wie im vorstehenden Absatz beschrieben, enthalten. Die Hybridisierungslösung weist vorzugsweise einen pH von 7 bis 9 auf. Die Einstellung des pH kann durch Einsatz von NaOH erfolgen.

Die Erfindung kann außer bei den üblichen planaren Biochips insbesondere im Zusammenhang mit besonderen Bauteilen eingesetzt werden mit folgendem Aufbau.

Das besondere Bauteil weist eine Mehrzahl von

Fiberelementen (Fasern) und an den Fiberelementen immobilisierte Probenmoleküle selektierter Probenmolekülspezies oder selektierter Probenmolekülspezies- gruppen auf, wobei jedem Fiberelement eine spezifische Probenmolekülspezies oder Proben olekülspeziesgruppe zugeordnet ist, und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probenmoleküle an Zylindermantelflächen der Fiberelemente immobilisiert sind, und daß die Fiberelemente mittels eines Tragelements in radialer Richtung, bezogen auf die Fiberelemente, gegeneinander beabstandet fixiert oder in Linienkontakt miteinander gebündelt sind. Die Fiberelemente können parallel zue- inander als Fiberelementebündel angeordnet sein. Die Fiberelemente können optische Fiberelemente sein. Die Stirnflächen zumindest eines Endes der Fiberelemente, vorzugsweise beider Enden, können optisch kontaktier- bar sein. Alternativ oder zusätzlich ist eine elektri- sehe Kontaktierung möglich, beispielsweise zur Messung von Impedanzen bzw. Impedanzänderungen. Auch Auswertungen über Oberflächenplasmonenresonanz und Streuprozesse ist möglich. Die Fiberelemente können einen Durchmesser im Bereich von 0,01 μm bis 1000 μm und/oder eine Länge im Bereich von 0,1 μm bis 100 mm aufweisen. Die Fiberelemente können in einer Dichte von 1 bis 10⁷ Fibern/cm², bezogen auf eine radiale Querschnittsebene der Fiberelemente, gepackt sein. Das Verhältnis Durchmesser zu Länge kann im Bereich 100 bis 10^"4 liegen. Das Tragelement kann an einem Ende der Fiberelemente angeordnet und die Enden der Fiberelemente umfassend ausgebildet sein, wobei die Stirnflächen der umfaßten Fiberelemente direkt oder indirekt optisch und/oder elektrisch kontaktierbar sind. An beiden Enden der Fiberelemente kann jeweils ein Tragelement angeordnet sein. Ein Tragelement kann aber auch zwischen den beiden Enden der Fiberelemente, beispielsweise mittig, angeordnet sein. Das Tragelement kann als Lochplatte oder als Wickeltragband ausgebildet sein. Das Tragelement kann schließlich aus Bereichen der Fiberelemente ausgebildet sein durch Verschweißen, Verschmelzen, Verkleben oder dergleichen. Die Probenmolekülspezies oder Probenmolekülspeziesgruppe kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "DNA, RNA, PNA und Mischungen dieser Nukleinsäuren". Jedes Fiberelement kann Probenmoleküle einer jeweils selektierten, unterschiedlichen Probenmolekülpezies tragen. Es können auch auf einem Fiberelement verschiedene Felder mit verschiedenen Nukleinsäurespezies vorgesehen sein. Jedes Fiberelement kann aber auch Probenmoleküle einer jeweils selektierten, unterschiedlichen Probenmolekülspezies- gruppe tragen, wobei die Gruppenelemente jeder Probenmolekülspeziesgruppe gemeinsam unter Ausbildung von kooperativen Effekten an ein definiertes Targetmolekül binden. Jede Probenmolekülspeziesgruppe kann zwei Gruppenelemente enthalten. Ein solches besonderes Bau- teil ist herstellbar in einem Verfahren mit den folgenden Verfahrensstufen: a) es werden eine Mehrzahl von Endlosfibern hergestellt, b) jede Endlosfiber wird durch jeweils ein Fluid enthaltend eine selektierte Probenmolekülspezies oder eine selektierte Proben- molekülspeziesgruppe geleitet, c) die Probenmoleküle der Probenmolekülspezies oder der Probenmolekülspeziesgruppe werden an den Endlosfibern (erfindungsgemäß) immobilisiert, d) optional werden die Endlosfibern zumindest einer Waschverfahrensstufe zugeführt, e) jeder Endlosfiber wird die jeweils in Stufe c) an der Fiber immobilisierte Probenmolekülspezies oder Probenmolekülspeziesgruppe direkt oder indirekt zugeordnet, f) von verschiedenen Endlosfibern wird jeweils ein Fiberelement abgeschnitten und die Fiberelemente ver- schiedener Endlosfibern werden mit einem Tragelement verbunden oder in Linienkontakt zueinander gebündelt und fixiert. Die Zuordnung kann dabei durch Zwischenschaltung einer Codierung der Endlosfibern beispielsweise durch Einmischung von Quantum Spots oder Farbstoffen in die Rohmasse der Endlosfibern vor der Extrusion erfolgen. Dann erfolgt die Zuordnung der Nukleinsäurenspezies-/-gruppe zur Position eines Fiberelements in einem fertigen Bauteil erst nach ort- ^■ saufgelöster Bestimmung der Codierung. Damit ist eine- exakte Positionierung der Fiberelemente bei der Herstellung des Bauteils obsolet. Solche Bauteile sind beispielsweise verwendbar in einem Verfahren zur De- tektion von Targetmolekülen, wobei optisch kontaktier- bare Stirnflächen der Fiberelemente optisch beispielsweise mit einem CCD Array oder über Mikrospiegel mit einem Photomultiplier verbunden sind, welche sensitiv für optische Strahlung einer Nach- weiswellenlänge ist, und wobei Sensorelemente des CCD Arrays bzw. Mikrospiegel oder deren Positionen jeweils den Fiberelementen zugeordnet sind, mit folgenden Verfahrenstufen: a) dem Biochip wird eine Lösung mit prospektiven Targetmolekülen zugeführt unter Bedingun- gen, bei welchen Targetmoleküle an Probenmoleküle binden, b) gleichzeitig mit Stufe a) oder hieran anschließend wird der Biochip mit einer eine Nachweiswellenlänge anregende Primärstrahlung bestrahlt, c) gleichzeitig mit Stufe b) oder hieran anschließend erfolgt eine Auslesung der Signale der Sensorelemente des CCD Arrays oder des Photomultipliers und Aufbereitung sowie Abspeicherung der Signale.

Definitionen.

Als Bauteil ist eine Anordnung bezeichnet, welche in diskreten und definierten Flächenbereichen, den Probenmolekülfeldern, Probenmoleküle einer Probenmolekülspezies oder Probenmolekülspeziesgruppe trägt. In der Regel wird jeder Probenmolekülfeld eines Bauteils eine andere Probenmolekülspeziesgruppe tragen. Die Probenmolekülfelder sind adressierbar in dem

Sinne, daß eine direkte oder indirekte Zuordnung getroffen ist/wird zwischen jedem Probenmolekülfeld bzw. seiner geometrischen Lage im Rahmen des Bauteils und der von dem Probenmolekülfeld getragenen Probenmolekülspeziesgruppe.

Probenmoleküle sind Moleküle, welche mit Targetmolekülen eine spezifische Wechselwirkung eingehen können. Beispiele für solche Wechselwirkungen sind: Protein-Aptamer, Nukleinsäure-Nukleinsäure

(Crick/Watson oder nicht-Crick/Watson) , Nukleinsäure- Ribozym, usw.

Targetmoleküle sind Moleküle, auf welche eine zu analysierende Probe, welche dem Biochip aufgegeben wird, untersucht wird.

Eine Probenmolekülspezies enthält Probenmoleküle ausschließlich einer Struktur, beispielsweise einer Sequenz im Falle von Nukleinsäuren oder Proteinen oder Peptiden.

Eine Probenmolekülspeziesgruppe enthält als Gruppenelemente zumindest zwei Probenmolekülspezies. Hier- bei kann es bei den Probenmolekülspezies um gleichartige oder verschiedenartige Probenmolekültypen handeln. Kooperative Effekte zwischen Molekülen mehrerer Probenmolekülspezies bzw. Elementen einer Probenmolekülspeziesgruppe und einer Targetmolekülspezies sind dadurch gekennzeichnet, daß der energetische Gewinn durch simultane Wechselwirkung zwischen jeweils den Molekülen der verschiedenen Probenmolekülspezies einerseits und den zwischen den verschiedenen Probenmolekülspezies und dem Targelmolekül insgesamt anderseits größer ist als die Summe der energetischen Gewinne der Wechselwirkungen eines Moleküls jeweils einer Probenmolekülspezies mit einem Molekül der Targetmolekülspezies. Der zusätzlich Energiegewinn rührt also von der Kooperation zwischen den Probenmolekülen verschiedener Probenmolekülspezies im Bindungsfalle der Probenmoleküle mit dem Targetmolekül. Im Falle der Nukleinsäuren als Probenmoleküle und Targetmoleküle ist beispielhaft Stacking zu nennen. Der Stacking Effekt ist ein Energiegewinn durch Wechselwirkungen, nämlich Delokalisation der π-Elektronen der hydro- phoben Ringstrukturen benachbarter Basen in doppel- strängigen Nukleinsäuren. Der Stacking Effekt tritt dabei zwischen den Enden der Probennukleinsäuren ein, wenn eine Bindung an ein Targetmolekül derartig stattfindet, daß die Enden der Probennukleinsäuren benachbart zueinander gebunden werden. Im Falle der Proteine können kooperative Effekte aus speziellen Ξekundärstrukturen miteinander wechselwirkender Proteine resultieren. Generell wird mit kooperativen Effekten eine höhere Spezifität einer Bindung zwischen Probenmolekülen und einem Targetmolekül erreicht.

Ein Hybridisierungbereich ist ein Sequenzbereich einer Probennukleinsäure, welche mit einer Targetnukleinsäure hybridisieren .kann. Ein Spacerbereich oder Abstandshalterbereich ist eine an einem Ende der Probennukleinsäure gebundene Gruppe, welche mit einer zweiten Bindungsstelle an dem Proben- molekülfeld gebunden ist. Ein Spacerbereich ist zweckmäßigerweise so gestaltet, daß eine Bindung bzw. Hybridisierung mit einem Targetmolekül nicht stattfinden kann. Ein Spacerbereich kann beispielsweise aus einem nicht-hybridisierenden Oligonukleotid gebildet sein. Mit einem Spacerbereich wird erreicht, daß einerseits der Hybridisierungsbereich in ausreichendem Abstand zur Oberfläche des Probenmolekülfeldes angeordnet wird und andererseits der Hybridisierungsbereich gleichsam flexibilisiert wird und fol- glich ohne sterische bzw. konformationsbedingte Restriktionen an ein Targetmolekül binden kann.

Als Fiberelemente sind von einer Endlosfiber abgeschnittene Stücke bezeichnet. In der Regel wird der Schnitt in einer Ebene orthogonal zur Längserstreckung der Endlosfiber ausgeführt sein, es ist jedoch selbstverständlich auch eine demgegenüber weniger als 90° abgewinkelte Schnittebene möglich.

Eine Endlosfiber ist ein stabartiges oder fadenartiges Gebilde, mit gegenüber der Länge von Fiberelementen großer Längserstreckung, welches typischerweise mittels Ziehtechnologien, Blastechnologien und/oder Ex- trusionstechnologien hergestellt und auf Trommeln oder dergleichen aufgewickelt und bevorratet sein können.

Eine Endlosfiber und/oder ein Fiberelement kann in einer zur Längserstreckung orthogonalen Querschnitts- ebene die verschiedensten Querschnittsformen aufweisen. Lediglich bevorzugt ist ein im wesentlichen kreisförmiger Querschnitt. Insofern umfaßt der Begriff der Zylindermantelfläche im Rahmen der Erfindung auch Mantelflächen im Falle nicht-kreisförmiger Querschnitte. Insofern bezeichnet der Begriff der radialen Richtung im Rahmen der Erfindung alle Richtungen in einer Querschnittsebene. Insofern bezeichnet schließlich der Durchmesser im Rahmen der Erfindung d = 2 * (F/2π)⁰'⁵, wobei F die Querschnittsfläche (beliebiger Form) ist.

Die Stirnfläche eines Fiberelementes ist durch einen Schnitt durch eine Endlosfiber gebildet.

Beabstandung der Fiberelemente meint, daß die Mantelflächen benachbarter Fiberelemente einander nicht berühren oder über Nasen gegeneinander abgestützt sind. Die Kontaktflächen liegen jedenfalls unterhalb von 1% der Gesamtoberfläche der Fiberelemente.

Ein Fiberelementebündel weist in der Regel zueinander coplanare Stirnflächen der gebündelten Fiberelemente auf. Es ist aber auch möglich, innerhalb eines Fiberelementebündels Gruppen von Fiberelementen mit jeweils coplanaren Strinflächen auszubilden, wobei die Strinflächen von Fiberelementen unterschiedlicher Gruppen zueinander nicht coplanar sind.

Optische Fiberelemente sind optisch transparent für elektromagnetische Strahlung zumindest in einem Teilbereich der Bereiche IR, sichtbares Licht und/oder UV. Optisch transparent meint, daß die Dämpfung der elektromagnetischen Strahlung ausreichend gering ist, um eine Detektion an einem Ende eines Fiberelements erzeugter elektromagnetischen Strahlung an dem gegenüberliegenden Ende des Fiberelementes mittels üblicher Detektionstechnologien zu erlauben.

Der Begriff der optischen Kontaktierbarkeit bezeichnet eine Aufbereitung einer Teilfläche eines Fiberelementes, welche die Emission von elektromagnetischer Strahlung aus dem Fiberelement heraus durch die

Teilfläche erlaubt. Eine starke Streuung ist möglichst zu vermeiden. Ggf. können die Teilflächen auf geeignete Weise bearbeitet, beispielsweise geglättet oder poliert werden. .

Ein nicht-poröser Werkstoff weist einen Porositätsgrad (offene Porosität) , meßbar mittels der Xylol-Methode, von weniger als 1%, vorzugsweise weniger als 0,1%, noch besser weniger als 0,01%, auf (Porenvolumen/Ge- samtvolumen Werkstück) .

Detergenzien sind Grenzflächenspannungen herabsetzende Substanzen, insbesondere Tenside, ionisch, nichtionisch oder ampholytisch.

Eine die Benetzung einer Oberfläche fördernde Lösung enthält typischerweise ein oder mehrere Detergenzien. Ob eine Lösung das Kriterium der Förderung der Bentzung erfüllt läßt sich feststellen, indem zwei definierte Kapillaren aus dem Polymerwerkstoff hergestellt werden, wobei ein der Kapillaren mit der Lösung behandelt wird und die zweite dagegen nicht. Dann wird für beide Kapillaren die Kapillaraszension mit beispielsweise einer Hybridisierungslösung unter gleichen Bedingungen bestimmt. Wenn die Kapillaraszen- sion in der behandelten Kapillaren größer ist als in der unbehandelten, so ist die eingesetzte Lösung die Benetzung fördernd.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1: Immobilisierung einer Nukleinsäure

Es wurde eine wäßrige Lösung hergestellt enthaltend ein Oligonukleotid mit der Sequenz (T)20-ATT CTA GCT AGT TCA ACT TC (10 nM) , MgCl₂ (0,2 M) , NaCl (1,0 M) und Tris (0,1 M) , wobei ein pH von 8 eingestellt war. 1 μl dieser Lösung wurde auf ein Polycarbonat Plättchen aufgebracht und das Polycarbonat Plättchen mit der ^'aufgebrachten Lösung für 1 min. mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm bestrahlt. Das Plättchen wurde anschließend mit einer Detergens-haltigen Lösung gespült.

Beispiel 2: Immobilisierung einer Nukleinsäure

(Vergleichsbeispiel)

Es wurde wie in Beispiel 1 vorgegangen mit dem Unterschied, daß eine Bestrahlung mit UV-Licht nicht durch- geführt wurde. Beispiel 3: Hybridisierung der Immobilisate aus den. Beispielen 1 und 2.

Die Plättchen wurden jeweils in eine Hybridisierungs- lösung enthaltend ein mit Biotin markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz GCT GAA ATG^" GCA ATG GAA GTT GAA CTA GCT eingebracht und es wurde eine Inkubation über 10 min. bei 20 °C durchgeführt. Dannach wurde mit einer lösung gemäß der Hybridisierungslösung, jedoch ohne das Oligonukleotid nachgespült. Sodann erfolgte eine Untersuchung auf Hybridisierung mittels eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats und einem col- orimetrischen Substrat. Das Plättchen aus Beispiel 1 zeigt eine Verfärbung, was die Koppelung des Oligonuk- leotids im Rahmen der Maßnahmen des Beispiels 1 belegt. Das Plättchen aus Beispiel 2 zeigte dagegen keine Verfärbung; eine Bindung des Oligonukleotids an der Oberfläche hatte also ohne Bestrahlung nicht stattgefunden .

Beispiel 4: Untersuchung der Bindungsfestigkeit des Oligonukleotids bei dem Plättchen aus Beispiel 1.

Versuche zur Ablösung des Oligonukleotids von der Oberfläche des Plättchens mit Lösungen enthaltend SDS, IM NaOH und/oder chaotropen Reagenzien bei 100 °C und über 2 h in wäßriger Lösung zeigten, daß das Oligonuk- leotid fest gebunden bleibt. Solche Bedingungen wären geeignet nicht-covalente Wechselwirkungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Plättchen aufzuheben. Beispiel 5: Versuche mit anderen Polymerwerkstoffen.

Die Versuche aus den .Beispielen 1 bis 4 wurden wieder- holt mit dem Unterschied, daß das Plättchen anstatt aus Polycarbonat aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid bestand. Diese beiden Polymere enthalten ebenfalls keine primären oder sekundären Amingruppen. In allen Versuchen wurde Ergebnisse entsprechend der Beispiel 1 bis 4 erhalten.

Beispiel 6: Anwendung einer die Selbstbenetzung fördernden Lösung.

Es wurde ein Immobilisat gemäß dem Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, daß der Polymerwerkstoff Polystyrol und zu einer Mikrotestplatte (MTP) geformt war. Die MTP wurde dann mit einer die Selbstbenetzung fördernden Lösung enthaltend NaCl (0,75 M) , Natriumeitrat (0,075 M) , Tween^® 20 (0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht Lösung) und optional Natriumazid (0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht Lösung) gespült .

Sodann wurden zur Hybridisierung in einem Kapillarfilm 5 μl einer 10 mM NaOH enthaltend 1 pM eines mit Biotin markierten Oligonukleotids mit der Sequenz GCT GAA ATG GCA ATG GAA GTT GAA CTA GCT in die Vertiefung der MTP eingebracht.

Aufgrund der Kombination oberflächengebundenes Deter- gens und leicht alkalische Hybridisierungslösung erfolgte nicht nur eine Benetzung der gesamten Vertiefung der MTP durch einen Kapillarfilm, sondern gleichzeitig eine Stabilisierung und Hybridisierung des Targe-ts an die immobilisierten Nukleinsäuren. Nach 15 min. Inkubation bei 20 °C konnte eine Hybridisierung mittels eines Streptavidin Peroxidase Konjugats sowie eines colorimetrischen Substrats nachgewiesen werden.

Kontrollvertiefungen, welche mit einem höheren Volumen (10 bis 200 μl) beschickt wurden, zeigten eine abnehmende Signalstärke.

Weitere Versuche zeigten, daß die Bindung von Deter- genzien an die Oberfläche wichtig ist, einerseits zur Erzeugung eines Kapillarfilmes und andererseits um eine Stabilisierung/Hybridisierung vorher denaturierter Nukleinsäuren direkt an der Oberfläche zu bewirken. Eine Nukleinsäure, welche in einer neutralen oder alkalischen Lösung (entsprechend 1 bis 200 mM NaOH) denaturiert vorliegt, wird somit ausschließlich bei Kontakt mit der Oberfläche hybridisierungsfähig gemacht .

Beispiel 7: Immobilisierung mit verschiedenen Salzen bei verschiedenen Konzentrationen.

Bindung wurde festgestellt für jeweils die folgenden Salze bei verschiedenen pH Werten: MgCl,, CaCl₂, NaCl, KCl, LiCl, NH₄HC0₃, NaHC0₃, Na₂C0₃, NH₄C1, NaHP0₄, NaPi, NH₄Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base, KHS0₄, K₂S₂0₅, Tetraethylammoniumchlorid, MOPS, HEPES, Bernsteinsäure, Diethanolamin, Ethanolamin, NaHC0₃/NaCl/ EDTA, PBS, TAE, Bisulfit und NaBorat . Dabei war eine Konzentration von 100 mM eingestellt. - Einige dieser Salze wurden auf konzentrationsabhäng.ig- keit untersucht. NaCl, NH₄C1 und NaPi bewirkten bis hinunter zu 10 mM 100% Bindung, bei 5 mM 80% Bindung und bei 1 M und weniger 0% Bindung. NaHC0₃ verhielt sich gleich nur mit lediglich 60% Bindung bei 5 mM. MgCl₂ zeigte bis 10 mM 100% Bindung, gefolgt von 80% Bindung bis hinunter zu 0,1 mM. KHS0₄ zeigte 100% Bindung bis hinunter zu 5 mM, 80% Bindung bei 1 mM und 0,5 mM sowie 60% Bindung bei 0,1 mM. NH₄Ac zeigte bis 10 mM 100% Bindung, bis 1 mM 80% Bindung und bis 0,1 mM 40% Bindung. Es ist davon auszugehen, daß auch die weiteren Salze jedenfalls bis hinunter zu 5 mM zumindest 80% Bindung zeigen, jedenfalls bei 10 mM 100% Bindung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren mit weniger als 300 Basenpaaren an einer Oberfläche eines organischen Polymerwerkstoffs, welcher keine primären und/oder sekundären Amingruppen trägt, mit den folgenden Verfahrensstufen:

a) es wird eine wäßrige Lösung enthaltend eine Nukleinsäure sowie ein gelöstes Salz hergestellt,

b) die Lösung aus Stufe a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert,

c) es wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach der Verfahrenstufe c) eine Waschverfahrensstufe durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei nach der Verfahrenstufe c) oder nach der Waschverfahrenstufe eine Spülverfahrenstufe mit einer wäßrigen Lösung enthaltend ein Detergens durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Polymerwerkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Polyethylen (PE) , Polycarbonat (PC) , Polyvinylchlorid (PVC) , Polystyrol (PS), Polythere- phthalat (PETP) , Polyethersulfon (PES) , Polyethere- therketon (PEEK) , Polyphenylenoxid (PPO) , Polyphenylensulfid (PPS) , Polybuthylenterephthalat (PBT), Polyoxymethylen (POM), Polysulfon (PSU), Polyetherimid (PEI) , Polyamid (PA) und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere", insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Polycarbonat (PC), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere". .

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration der Nukleinsäure in der Lösung im Bereich von 0,0001 bis 1000 nM, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 nM, liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Gesamtkonzentration des gelösten Salzes in der Lösung im Bereich von 0,1 mM bis 6 M, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 3 M, insbesondere 0,1 bis 0,2 M, liegt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "MgCl_2/ CaCl₂, NaCl, KCl, LiCl, NH₄HCO,, NaHC0₃, Na₂C0₃, NH₄C1, NaHP0₄, NaPi, NH₄Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base,- KHS0₄, K,S,0₅, Tetraethy- lammoniumchlorid, MOPS, HEPES, Bernsteinsäure, Di- ethanola in, Ethanola in, NaHC0₃/NaCl/EDTA, PBS, TAE, Bisulfit, NaBorat, und Mischungen dieser Stoffe".

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das UV-Licht eine Wellenlänge im Bereich 1 nm bis 480 nm, insbesondere 100 nm bis 300 nm, aufweist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das Detergenz ausgewählt ist aus der Gruppe beste- hend aus "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarko- sysl, und Mischungen solcher Substanzen".

10. Immobilisat mit einem Polymerwerkstoff und einer an eine Oberfläche^' des Polymerwerkstoffes gebundenen Nukleinsäure, erhältlich mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Oberfläche planar oder die Mantelfläche einer Polymerfaser ist.

11. Verwendung eines Immobilisats nach Anspruch 10 in einem Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren, wobei die an der Oberfläche des Po- lymerwerkstoffes immobilisierte Nukleinsäure eine Hybridisierungsregion aufweist, mit den folgenden Verfahrensstufen: a) die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats wird mit einer die Benetzung der Oberfläche fördernden Lösung behandelt,

b) ein Teil der die Nukleinsäure tragenden Oberfläche des Immobilisats wird dann mit einer Hybridisierungslösung kontaktiert, wobei die Hybridisierungslösung die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats selbsttätig vollständig benetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die die

Benetzung fördernde Lösung ein Detergenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarkosysl, und Mischungen solcher Substanzen" enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Hybridisierungslösung einen pH von 6,5 bis 11, vorzugsweise 7 bis 9, aufweist.