WO2001062963A2 - Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren Download PDF

Info

Publication number
WO2001062963A2
WO2001062963A2 PCT/DE2001/000812 DE0100812W WO0162963A2 WO 2001062963 A2 WO2001062963 A2 WO 2001062963A2 DE 0100812 W DE0100812 W DE 0100812W WO 0162963 A2 WO0162963 A2 WO 0162963A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solution
nucleic acid
polymer material
group
mixtures
Prior art date
Application number
PCT/DE2001/000812
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2001062963A3 (de
Inventor
Derya ÖZKAN
Original Assignee
Variom Biotechnology Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10053393A external-priority patent/DE10053393A1/de
Application filed by Variom Biotechnology Ag filed Critical Variom Biotechnology Ag
Priority to EP01929225A priority Critical patent/EP1305444A2/de
Priority to AU2001256106A priority patent/AU2001256106A1/en
Priority to US10/220,331 priority patent/US20040023226A1/en
Publication of WO2001062963A2 publication Critical patent/WO2001062963A2/de
Publication of WO2001062963A3 publication Critical patent/WO2001062963A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/7703—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator using reagent-clad optical fibres or optical waveguides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
    • G02B6/02—Optical fibres with cladding with or without a coating
    • G02B6/02033—Core or cladding made from organic material, e.g. polymeric material
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B6/00—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings
    • G02B6/04—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings formed by bundles of fibres
    • G02B6/06—Light guides; Structural details of arrangements comprising light guides and other optical elements, e.g. couplings formed by bundles of fibres the relative position of the fibres being the same at both ends, e.g. for transporting images

Definitions

  • the invention relates to a method for immobilizing nucleic acids on a surface of an organic polymer material with the following process steps: a) an aqueous solution containing a nucleic acid is prepared, b) the solution from step a) is contacted with the surface of the polymer material, c) after or at the same time as stage b), the surface of the polymer material which is in contact with the solution is irradiated with UV light, an immobilizate, obtainable by means of such a method, and the use of such an immobilizate.
  • nucleic acids In many areas of biochemistry, it is necessary to immobilize nucleic acids, in particular short oligonucleotides with 20 to 200 nucleotides, by binding to a substrate.
  • a typical area of application is given by the so-called nucleic acid chips, in which different nucleic acids are bound in different areas, with corresponding assignment, to a surface of a substrate or carrier component.
  • a nucleic acid can in principle be bound to a surface of a solid, for example, by adsorption, by physisorption or chemisorption. However, it is more desirable a covalent bond, since it is comparatively firm and reliably prevents unwanted washing down of bound nucleic acids in subsequent processing or analysis steps under normal conditions.
  • nucleic acids are typically longer DNA fragments with mostly significantly more than a few kB.
  • Literature reference W08911548 describes a method and reagents for the immobilization of oligonucleotides by binding a polynucleotide, preferably a spacer made of poly-dT, to a nucleic acid sample and fixing the spacer to a substrate with primary or secondary anime groups, for example nylon) by means of UV radiation.
  • the spacer is longer than the nucleic acid sample.
  • the invention is based on the technical problem of specifying a method for producing an immobilizate with nucleic acids, in particular oligonucleotides, firmly bound to a polymeric material, 5 which neither activates the surface of the 'material ' by means of activating reagents or the like, nor does it per se due to primary and / or secondary amine groups requires reactive material.
  • the invention teaches a method for immobilizing nucleic acids with less than 300 base pairs on a surface of a preferably non-porous organic polymer material which does not carry any primary and / or secondary amine groups, with the following process steps : a) it becomes an aqueous one
  • Step c) the nucleic acids are immobilized and the solution can be drawn off.
  • Step c) can be carried out simultaneously or immediately after step b). If stage c) 'is carried out immediately after stage b), this means a period of time caused by manipulation, for example, which is typically less than 30 minutes, usually less than 5 minutes, better less than 1 minute.
  • the nucleic acid can have less than 200, in particular less than 100, base pairs.
  • the immobilization on surfaces of polymer materials succeeds, namely, on surfaces which have not been previously chemically or physically activated, solely by mediating the salt present in the solution containing the nucleic acid in connection with UV light irradiation, and without an adsorption process step beforehand and / or aspiration is performed.
  • the nucleic acid can no longer be detached from the surface under conditions typical for processing and / or analysis.
  • the binding of the nucleic acid to the surface is apparently covalent.
  • the invention further teaches an immobilizate with a polymer material and a nucleic acid bound to a surface of the polymer material, obtainable by means of the method according to the invention, the surface being planar or the outer surface is a polymer fiber, and the use of such an immobilizate in a method for hybridizing nucleic acids, the nucleic acid immobilized on the surface of the polymer material having a hybridization region, with the following process steps: a) the surface of the immobilizate carrying the nucleic acid is wetted the surface-promoting solution is treated, b) part of the surface of the immobilizate carrying the nucleic acid is then contacted with a hybridization solution, the hybridization solution automatically completely wetting the surface of the immobilizate carrying the nucleic acid.
  • the hybridization and, if necessary, its detection then take place in the usual way in the wetted area.
  • a detergent and salt are bound to the immobilizate surface (for example by a block step).
  • the hybridization solution contains target and has the peculiarity that it contains very little ions (for example less than 100 mM salt total concentration) and is also alkaline (pH 8-14).
  • double-stranded DNA / RNA targets are present as a single strand which only becomes capable of binding through the action of the detergents and / or salts bound to the surface of the immobilized product.
  • the ionic strengths used in the hybridization solution hybridization per se does not occur.
  • the hybridization solution is applied with only a small volume and is distributed as a capillary film along the surface.
  • the above use is of independent importance, based on the use of a wetting-promoting solution, regardless of the use of the immobilizate according to the invention.
  • the use of a solution promoting the wetting of a surface in connection with immobilizates can in principle be used with any immobilisates containing biologically active substances or material, that is to say, for example, those with proteins, peptides and / or sugars.
  • a solution applied to the immobilizate containing a binding partner or prospective binding partner for the immobilized biologically active material, automatically spreads practically over the surface of the immobilizate, forming a capillary film.
  • a stronger signal is obtained when bound, because the ratio of solution / immobilized surface area to the volume of the applied solution is increased due to the formation of a capillary film.
  • the analytics ultimately become more sensitive.
  • Immobilisates according to the invention can be used both for the actual analysis (analysis characterization) and for preparing a sample, for example for separating specific analyte components by solid phase binding from a complex mixture, for example genomic DNA from blood samples or RNA, etc., or for example for enrichment the solid phase, for example by enzymatic processes.
  • a complex mixture for example genomic DNA from blood samples or RNA, etc.
  • enrichment the solid phase for example by enzymatic processes.
  • Binding site for an enzyme, such as T7 DNA polymerase are incorporated into the immobilized oligonucleotide,
  • a washing process step can be carried out. In this way, non-(covalently) bound nucleic acid molecules are washed away or desorbed, as it were.
  • a rinsing process step can be carried out with an aqueous solution containing a detergent. The detergent saturates or blocks any reactive surface sites that have remained unoccupied, but also increases the adhesive forces between a subsequently applied solution and the immobilized product compared to the cohesive forces in the subsequent applied solution, thus increasing the wettability of the immobilized product up to complete
  • the polymer material can be selected from the group consisting of "polyethylene (PE), polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), polystyrene (PS), polyththalate (PETP), polyether sulfone (PES), polyether ether ketone (PEEK),” Polyphenylene oxide (PPO), polyphenylene sulfide (PPS), polybutylene terephthalate (PBT, polyoxymethylene (POM), polysulfone (PSU), polyetherimide (PEI), polyamide (PA) and mixtures and copolymers of the monomers of such polymers ", in particular selected from Group consisting of "Polycarbonate (PC), polyvinyl chloride (PVC), polystyrene (PS) 'and mixtures and copolymers of the monomers of such polymers”.
  • PE polyethylene
  • PC polycarbonate
  • PVC polyvinyl chloride
  • PS polystyrene
  • PEEK polyether ether
  • the concentration of nucleic acid in the solution can- 'in the range of 0.0001 to 1000 nM, preferably in the range of 1 to 100 nM, are. It goes without saying that different nucleic acids can also be used, each in concentrations as indicated.
  • the total concentration of the dissolved salt in the solution is advantageously in the range from 0.1 to 6 M, preferably in the range from 0.1 to 3 M.
  • the salt can be selected from the group consisting of "MgCl 2 , CaCl 2 , NaCl, KCl, LiCl, NH 4 HC0 3 , NaHC0 3 , Na 2 C0 3 , NH 4 C1, NaHP0 4 , NaPi, NH 4 Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base, KHS0 4 , K 2 S 2 0 5 , Tetraethylammonium chloride, MOPS, HEPES, succinic acid, diethanolamine, ethanolamine, NaHC0 3 / NaCl / EDTA, PBS, TAE, bisulfite, NaBorat, and mixtures of these substances ".
  • a salt is a substance that dissociates in aqueous solution into at least one anion and at least one cation.
  • the UV light should have a wavelength in the range from 1 nm to 480 nm, in particular 100 nm to 300 nm.
  • the irradiation time is typically 1 s to 100 min, preferably 10 s to 10 min., For example 0.5 to 2 min.
  • a radiation power, such as from a 60 W UV lamp, over 2 min. delivered at a distance of 15 cm is quite sufficient.
  • the detergent can be selected from the group consisting of "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarkosysl, and mixtures of such substances".
  • a plurality of such polymer fibers' increasing distance are parallel or in the direction of the longitudinal extent relative to one another and fixed, wherein the lateral surfaces of adjacent polymer fibers do not each other or with Touch point or line contact and the gaps between the polymer fibers are dimensioned so closely that a capillary ascension of at least 0.1 mm of subsequent solutions appears in the gaps.
  • the wetting-promoting solution can be a detergent selected from 'the group as described in the preceding paragraph, included.
  • the hybridization solution preferably has a pH of 7 to 9. The pH can be adjusted by using NaOH.
  • the invention can be used in particular in connection with special components with the following structure.
  • the special component has a plurality of
  • Fiber elements and sample molecules immobilized on the fiber elements of selected sample molecule species or selected sample molecule species groups, each fiber element being assigned a specific sample molecule species or sample olecule species group, and is characterized in that the sample molecules are immobilized on the cylindrical lateral surfaces of the fiber elements, and that Fiber elements are fixed in a radial direction relative to the fiber elements, spaced apart from one another or bundled in line contact with one another by means of a support element.
  • the fiber elements can be arranged in parallel as a bundle of fiber elements.
  • the fiber elements can be optical fiber elements.
  • the end faces of at least one end of the fiber elements, preferably both ends, can be optically contactable.
  • the fiber elements can have a diameter in the range from 0.01 ⁇ m to 1000 ⁇ m and / or a length in the range from 0.1 ⁇ m to 100 mm.
  • the fiber elements can be packed in a density of 1 to 10 7 fibers / cm 2 , based on a radial cross-sectional plane of the fiber elements.
  • the ratio of diameter to length can be in the range 100 to 10 "4.
  • the support element can be arranged at one end of the fiber elements and the ends of the fiber elements can be of extensive design, the end faces of the enclosed fiber elements being directly or indirectly optically and / or electrically contactable.
  • a support element can be arranged at both ends of the fiber elements, but a support element can also be arranged between the two ends of the fiber elements, for example in the middle.
  • the support element can be designed as a perforated plate or as a winding support tape.
  • the support element can finally be formed from areas of the fiber elements by welding, fusing, gluing or the like.
  • the sample molecule species or Sample molecule species group can be selected from the group consisting of "DNA, RNA, PNA and mixtures of these nucleic acids".
  • Each fiber element can carry sample molecules of a respectively selected, different sample molecule species. Different fields with different nucleic acid species can also be provided on a fiber element. However, each fiber element can also carry sample molecules of a respectively selected, different sample molecule species group, the group elements of each sample molecule species group binding together to form a defined target molecule with the formation of cooperative effects. Each sample molecule species group can contain two group elements.
  • Such a special component can be produced in a process with the following process stages: a) a plurality of continuous fibers are produced, b) each continuous fiber is passed through a fluid containing a selected sample molecule species or a selected sample molecule species group, c) the Sample molecules of the sample molecule species or of the sample molecule species group are immobilized on the continuous fibers (according to the invention), d) the continuous fibers are optionally fed to at least one washing process step, e) each continuous fiber is directly or indirectly assigned to the sample molecule species or sample molecule species group immobilized on the fiber in step c), f ) A fiber element is cut off from different continuous fibers and the fiber elements of different continuous fibers are connected with a support element or bundled and fixed in line contact with one another.
  • the assignment can be done by interposing a coding of the endless fibers for example by mixing quantum spots or dyes into the raw mass of the continuous fibers before extrusion. Then, the assignment of the nucleic acid species is carried out - / - group the position of a fiber element in a finished component after spot sauffrieder ⁇ determining the coding. This means that exact positioning of the fiber elements in the manufacture of the component is obsolete.
  • Such components can be used, for example, in a method for the detection of target molecules, with optically contactable end faces of the fiber elements being optically connected, for example, to a CCD array or via a micromirror to a photomultiplier which is sensitive to optical radiation of a detection wavelength, and sensor elements of the CCD array or micromirror or their positions are each assigned to the fiber elements, with the following process stages: a) a solution with prospective target molecules is fed to the biochip under conditions in which target molecules bind to sample molecules, b) simultaneously with stage a ) or thereafter, the biochip is irradiated with primary radiation that excites a detection wavelength, c) simultaneously with stage b) or thereafter the signals from the sensor elements of the CCD array or the photomultiplier are read out and the signs are processed and stored ale.
  • sample molecule fields sample molecules of a sample molecule species or sample molecule species group carries.
  • each sample molecule field of a component will carry a different sample molecule species group.
  • the sample molecule fields are addressable in the
  • Sample molecules are molecules that can have a specific interaction with target molecules. Examples of such interactions are: protein aptamer, nucleic acid-nucleic acid
  • Target molecules are molecules on which a sample to be analyzed, which is placed on the biochip, is examined.
  • sample molecule species contains sample molecules exclusively of one structure, for example a sequence in the case of nucleic acids or proteins or peptides.
  • a sample molecule species group contains at least two sample molecule species as group elements.
  • the sample molecule species can be of the same or different types of sample molecules.
  • Cooperative effects between molecules of several sample molecule species or elements of a sample molecule species group and a target molecule species are characterized in that the energy gain through simultaneous interaction between the respective molecules of the different sample molecule species on the one hand and between the different sample molecule species and the target molecule on the other hand is greater than the sum of the energetic gains of the interactions of a molecule of a sample molecule species with a molecule of the target molecule species.
  • the additional energy gain thus comes from the cooperation between the sample molecules of different sample molecule species in the case of binding of the sample molecules with the target molecule.
  • the stacking effect is an energy gain through interactions, namely delocalization of the ⁇ electrons of the hydrophobic ring structures of neighboring bases in double-stranded nucleic acids.
  • the stacking effect occurs between the ends of the sample nucleic acids when binding to a target molecule takes place in such a way that the ends of the sample nucleic acids are bound adjacent to one another.
  • cooperative effects can result from special secondary structures of interacting proteins. In general, a higher specificity of a bond between sample molecules and a target molecule is achieved with cooperative effects.
  • a hybridization area is a sequence area of a sample nucleic acid which is associated with a Target nucleic acid can hybridize.
  • a spacer area is a group attached to one end of the sample nucleic acid, which is attached to the sample molecule field with a second binding site.
  • a spacer area is expediently designed in such a way that binding or hybridization with a target molecule cannot take place.
  • a spacer region can be formed, for example, from a non-hybridizing oligonucleotide.
  • the hybridization area is arranged at a sufficient distance from the surface of the sample molecule field and on the other hand the hybridization area is made more flexible and can consequently bind to a target molecule without steric or conformational restrictions.
  • Pieces cut from an endless fiber are referred to as fiber elements.
  • the cut will be made in a plane orthogonal to the longitudinal extension of the endless fibers, but it is of course also possible to have a cutting plane that is angled less than 90 °.
  • An endless fiber is a rod-like or thread-like structure with a longitudinal extension that is large in relation to the length of fiber elements, which can typically be produced by means of drawing technologies, blowing technologies and / or extrusion technologies and wound up and stored on drums or the like.
  • An endless fiber and / or a fiber element can have a cross-sectional shape orthogonal to the longitudinal extension. plane have a wide variety of cross-sectional shapes.
  • An essentially circular cross section is only preferred.
  • the term cylindrical surface area in the context of the invention also includes surface areas in the case of non-circular cross sections.
  • the term radial direction in the context of the invention denotes all directions in a cross-sectional plane.
  • the end face of a fiber element is formed by a cut through an endless fiber.
  • Spacing of the fiber elements means that the outer surfaces of adjacent fiber elements do not touch each other or are supported against one another by noses.
  • the contact areas are in any case below 1% of the total surface of the fiber elements.
  • a fiber element bundle generally has coplanar end faces of the bundled fiber elements.
  • Optical fiber elements are optically transparent to electromagnetic radiation at least in a partial area of the areas IR, visible light and / or UV.
  • Optically transparent means that the damping of the electromagnetic radiation is sufficiently low to permit detection of electromagnetic radiation generated at one end of a fiber element at the opposite end of the fiber element by means of conventional detection technologies.
  • optical contactability refers to the preparation of a partial surface of a fiber element, which emits electromagnetic radiation from the fiber element through the
  • Partial area allowed. Strong scatter should be avoided if possible. Possibly. the partial surfaces can be processed in a suitable manner, for example smoothed or polished. ,
  • a non-porous material has a degree of porosity (open porosity), measurable by means of the xylene method, of less than 1%, preferably less than 0.1%, more preferably less than 0.01% (pore volume / total volume Workpiece).
  • Detergents are substances that reduce interfacial tension, in particular surfactants, ionic, nonionic or ampholytic.
  • a surface wetting solution typically contains one or more detergents. Whether a solution fulfills the criterion of promoting the use can be determined by producing two defined capillaries from the polymer material, one of the capillaries being treated with the solution and the second not. Then the capillary ascension for both capillaries determined with, for example, a hybridization solution under the same conditions. If the capillary ascension in the treated capillaries is larger than in the untreated one, the solution used promotes wetting.
  • Example 1 Immobilization of a nucleic acid
  • An aqueous solution was prepared containing an oligonucleotide with the sequence (T) 20-ATT CTA GCT AGT TCA ACT TC (10 nM), MgCl 2 (0.2 M), NaCl (1.0 M) and Tris (0, 1 M), whereby a pH of 8 was set. 1 ul of this solution was applied onto a polycarbonate plate and the polycarbonate plate with the 'applied solution for 1 min. irradiated with 254 nm UV light. The plate was then rinsed with a detergent-containing solution.
  • Example 3 Hybridization of the Immobilisate from the. Examples 1 and 2.
  • the platelets were each introduced into a hybridization solution containing an oligonucleotide labeled with biotin with the sequence GCT GAA ATG " GCA ATG GAA GTT GAA CTA GCT and incubation was carried out for 10 min at 20 ° C. Then was followed with a solution According to the hybridization solution, but without the oligonucleotide, the mixture was then examined for hybridization using a streptavidin-peroxidase conjugate and a colorimetric substrate.
  • the plate from example 1 shows a discoloration, which indicates the coupling of the oligonucleotide as part of the measures of Example 1.
  • the plate from Example 2 showed no discoloration, so that the oligonucleotide had not bound to the surface without irradiation.
  • Example 4 Investigation of the binding strength of the oligonucleotide in the plate from example 1.
  • Example 6 Application of a self-wetting solution.
  • An immobilizate was produced according to Example 1, with the difference that the polymer material was polystyrene and was shaped into a micro test plate (MTP).
  • MTP micro test plate
  • the MTP was then treated with a self-promoting wetting solution containing NaCl (0.75 M), sodium citrate (0.075 M), Tween ® 20 (0.05 wt .-%, based on the total weight of solution) and, optionally, sodium azide (0.05 % By weight, based on the total weight of solution).
  • Example 7 Immobilization with different salts at different concentrations.
  • Binding was found for the following salts at different pH values: MgCl ,, CaCl 2 , NaCl, KCl, LiCl, NH 4 HC0 3 , NaHC0 3 , Na 2 C0 3 , NH 4 C1, NaHP0 4 , NaPi, NH 4 Ac , NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base, KHS0 4 , K 2 S 2 0 5 , tetraethylammonium chloride, MOPS, HEPES, Succinic acid, diethanolamine, ethanolamine, NaHC0 3 / NaCl / EDTA, PBS, TAE, bisulfite and NaBorat.
  • a concentration of 100 mM was set. - Some of these salts were examined for their concentration dependency. NaCl, NH 4 C1 and NaPi caused 100% binding down to 10 mM, 80% binding at 5 mM and 0% binding at 1 M and less. NaHC0 3 behaved only with only 60% binding at 5 mM. MgCl 2 showed 100% binding up to 10 mM, followed by 80% binding down to 0.1 mM. KHS0 4 showed 100% binding down to 5 mM, 80% binding at 1 mM and 0.5 mM and 60% binding at 0.1 mM. NH 4 Ac showed 100% binding up to 10 mM, 80% binding up to 1 mM and 40% binding up to 0.1 mM. It can be assumed that the other salts also show at least 80% binding down to 5 mM, at least 100 mM 100% binding.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Die Erfindung lehrt ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren an einer Oberfläche eines nichtporösen organischen Polymerwerkstoffs, welcher keine primären und/oder sekundären Amingruppen trägt, mit den folgenden Verfahrensstufen: (a) es wird eine wässrige Lösung enthaltend eine Nukleinsäure sowie ein gelöstes Salz, wobei das Kation des Salzes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Natrium, Magnesium und Mischungen dieser Kationen", hergestellt, (b) die Lösung aus Stufe (a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert, (c) nach oder gleichzeitig mit Stufe (b) wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt.

Description

Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren an einer Oberfläche eines organischen Polymerwerkstoffs mit den folgenden Verfahrensstufen: a) es wird eine wäßrige Lösung enthal- tend eine Nukleinsäure hergestellt, b) die Lösung aus Stufe a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert, c) nach oder gleichzeitig mit Stufe b) wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt, ein Immobilisat, .erhältlich mittels eines solchen Verfahrens, sowie die Verwendung eines solchen Immobilisats .
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik.
In vielen Bereichen der Biochemie ist es erforderlich, Nukleinsäuren, insbesondere kurze Oligonukleotide mit 20 bis 200 Nukleotiden, durch Bindung an einem Sub- strat zu immobilisieren. Ein typischer Anwendungsbereich ist durch die sogenannten Nukleinsäurechips gegeben, bei welchen verschiedene Nukleinsäuren in verschiedenen Arealen, mit entsprechender Zuordnung, einer Oberfläche eines Substrates bzw. Trägerbauteiles gebunden sind. Eine Bindung einer Nukleinsäure an eine Oberfläche eines Festkörpers kann grundsätzlich beispielsweise adsorptiv, durch Physisorption oder Chemisorption, erfolgen. Wünschenswerter ist jedoch eine covalente Bindung, da diese vergleichsweise fest ist und ein störendes Herunterwaschen von gebundenen Nukleinsäuren in subsequenten Prozessierungs- oder Analysestufen unter üblichen Bedingungen zuverlässig verhindert.
Die Literaturstelle Nagata et al., FEBS Letters 183:379-382, 1985, beschreibt die Adsorption geklönter DNA mit ca. 40 kB an Polystyrol. Hierbei wurde in PBS (8 mM Na2PO„, 1,5 mM KH,P04, 137 M NaCl, 2,7 mM KC1) mit 0,1 M MgCl2 gearbeitet und erst nach Aspirieren mit UV bestrahlt. Ähnliches ist in den Literaturstellen FR2663040, US5510085 und Nikiforov et al . , PCR Methods Applic. 3:285-291, 1994, beschrieben. Die Lit- eraturstelle Keller et al . , J. Clin. Microbiol. 29: 638-641, 1991, beschreibt die Adsorption von Phagen DNA mit ca. 7 kB an Plastikmaterialien. Die Literaturstelle Nikiforov et al., Nucleic Acids Res. 22: 4167-4175, 1994 beschreibt die Adsorption von Oli- gonukleotiden über eine über kationische Detergenzien vermittelte Bindung. In diesem Stand der Technik handelt es sich bei den Nukleinsäuren typischerweise um längere DNA Fragmente mit meist bedeutend mehr als einigen kB.
Chemisch aktivierte Substratoberflächen aus Polymerwerkstoffen, einschließlich Polystyrol, sowie zur covalenten Bindung daran geeignete biologisch aktive Substanzen sind beispielsweise in den Literaturstellen US4736019, US4657873, US4654299, US4419444 und
US4081329 beschrieben. Eine chemische Funktionalis- ierung von Polystyrol ist auch in den Literaturstellen US3956219, US3886486, US3974110, US3995094 und US4226958 beschrieben.
Die Literaturstelle Church et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1991-1995, 1984, beschreibt eine fotochemische Methode zum Vernetzen genomischer DNA Fragmente auf Nylon Membranen. Aus der Literaturstelle Saito et al., Tetrahedron Lett., 22: 3265-3268, 1981, ist es bekannt, daß primäre Amingruppen mit lichtak- tiviertem Thymidin hochreaktiv sind, und dieser Prozeß wird als Grundlage des Mechanismus der covalenten Bindung von Nukleotiden an Membranen angenommen. Die Literaturstelle W08911548 beschreibt ein Verfahren sowie Reagenzien für die Immobilisierung von Oligonuk- leotiden durch Bindung eines Polynukleotids, vorzugsweise eines Abstandshälters aus poly-dT, an eine Nukleinsäure Probe und Fixierung des Abstandshalters an einem Substrat mit primären oder sekundären Anim- gruppen, beispielsweise Nylon) mittels UV-Bestrahlung. Der Abstandshalter ist länger als die Nukleinsäure- probe.
Im Rahmen der Maßnahmen des Standes der Technik ist es regelmäßig erforderlich, eine Aktivierung der Ober- fläche eines organischen Polymerwerkstoffes für eine Reaktion mit einem Oligonukleotid durchzuführen und/oder einen Polymerwerkstoff einzusetzen, welcher primäre und/oder sekundäre Amingruppen trägt. Ersteres ist störend aufwendig. In beiden Fällen stört zudem eine verbleibende Reaktivität der Oberfläche aufgrund von nicht abgebundenen reaktiven Öberflächensites. Weiterhin handelt es im Rahmen der Maßnahmen des Standes der Technik meist um lange DNA Fragmente, welche immobilisierbar sind, während kurze Nukleinsäuren unter vergleichbaren Bedingungen offenbar nicht adsorbiert werden. Schließlich bieten die bekannten Maßnahmen eine lediglich adsorptive Bindung, welche 5.für verschiedene Anwendungen nicht ausreichend stabil ist .
Technisches Problem der Erfindung 0
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, eine Verfahren zur Herstellung eines Immobilisats mit an einem polymeren Werkstoff fest gebundenen Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotiden, anzugeben,5 welches weder eine Aktivierung der Oberfläche des, Werkstoffes' mittels Aktivierungsreagentien oder dergleichen, noch einen per se aufgrund von primären und/oder sekundären Amingruppen reaktiven Werkstoff erfordert . 0
Grundzüge der Erfindung.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er-5 findung ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren mit weniger als 300 Basenpaaren an einer Oberfläche eines vorzugsweise nicht-porösen organischen Polymerwerkstoffs, welcher keine primären und/oder sekundären Amingruppen trägt, mit den fol-0 genden Verfahrensstufen: a) es wird eine wäßrige
Lösung enthaltend eine Nukleinsäure sowie ein gelöstes Salz hergestellt, b) die Lösung aus Stufe a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert, c) es wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt. Nach der Stufe c) sind die Nukleinsäuren immobilisiert und die Lösung kann abgezogen werden. Die Stufe c) kann gleichzeitig oder unmittelbar nach der Stufe b) durchgeführt werden. Wenn die Stufe c) ' unmittelbar nach der Stufe b) durchgeführt wird, so ist damit eine beispielsweise manipulationsbedingte Zeitspanne gemeint, welche typischerweise unter 30 min., meist unter 5 min., besser unter 1 min., liegt. Die Nukleinsäure kann weniger als 200, insbesondere weniger als 100 Basenpaare aufweisen.
Überraschenderweise gelingt die Immobilisierung an Oberflächen von Polymerwerkstoffen, und zwar, an nicht -- zuvor chemisch oder physikalisch aktivierten Oberflächen allein durch Vermittlung des in der die Nukleinsäure enthaltenden Lösung vorliegenden Salzes in Verbindung mit der UV-Licht Bestrahlung, und zwar ohne daß vorher eine Adsorptionsverfahrenstufe und/oder Aspiration durchgeführt wird. Offenbar findet eine direkte, nicht-adsorptive Immobilisierung statt. Die Nukleinsäure läßt sich nach der Immobilisierung unter für die Prozessierung und/oder Analyse typischen Bedingungen nicht mehr von der Oberfläche ablösen. Die Bindung der Nukleinsäure an der Oberfläche ist offenbar covalent.
Die Erfindung lehrt weiterhin ein Immobilisat mit einem Polymerwerkstoff und einer an eine Oberfläche des Polymerwerkstoffes gebundenen Nukleinsäure, erhältlich mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die Oberfläche planar oder die Mantelfläche einer Polymerfaser ist, sowie die Verwendung eines solchen Immobilisats in einem Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren, wobei die an der Oberfläche des Polymerwerkstoffes immobilisierte Nukleinsäure eine Hybridisierungsregion aufweist, mit den folgenden Verfahrensstufen: a) die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats wird mit einer die Benetzung der Oberfläche fördernden Lösung behandelt, b) ein Teil der die Nukleinsäure tragenden Oberfläche des Immobilisats wird dann mit einer Hybridisierung- slösung kontaktiert, wobei die Hybridisierungslösung die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats selbsttätig vollständig benetzt. Im Benetzten Bereich erfolgt dann die Hybridisierung und ggf. deren Detektion auf übliche Weise. Bei. letztgenanntem Aspekt der Erfindung sind ein Detergenz und Salz an der Immobilisat Oberfläche gebunden (beispielsweise durch Block-Schritt) . Die Hybridisierungslösung enthält Target und weist die Besonderheit auf, daß sie sehr wenig Ionen enthält (beispielsweise weniger als 100 mM Salz Gesamtkonzentration) und darüber hinaus alkalisch ist (pH 8 - 14) . Dadurch liegen doppelsträngige DNA/RNA Targets als Einzelstrang vor, der erst durch Einwirkung der an der Oberfläche des Immobilisats gebun- denen Detergenzien und/oder Salze bindefähig wird. Bei den eingesetzten Ionenstärken der Hybridisierungslösung tritt eine Hybridisierung an sich nämlich nicht auf. In diesem Zusammenhang ist ebenso wichtig, daß die Hybridisierungslösung mit nur kleinem Volumen aufgebracht wird und sich als Kapillarfilm entlang der Oberfläche verteilt. Die vorstehende Verwendung ist, bezogen auf den Einsatz einer die Benetzung fördernden Lösung, von selbstständiger Bedeutung, und zwar unabhängig von dem Einsatz des erfindungsgemäßen Immobilisats . Der Ein- satz von die Benetzung einer Oberfläche fördernden Lösung im Zusammenhang mit Immobilisaten läßt sich nämlich grundsätzlich bei beliebigen Immobilisaten enthaltend biologisch aktive Substanzen bzw. Material, also auch beispielsweise solchen mit Proteinen, Pep- tiden und/oder Zuckern einsetzen. In jedem Falle wird erreicht, daß eine auf das Immobilisat aufgegebene Lösung, enthaltend einen Bindungspartner oder prospek- tiven Bindungspartner für das immobilisierte biologisch aktive Material, sich selbsttätig praktisch über die Oberfläche des Immobilisats, einen Kapillarfilm bildend, ausbreitet. Hierdurch wird weniger der aufzugebenden Lösung benötigt. Zudem wird bei Einsatz einer gleichen Menge einer Verbindung in der aufgegebenen Lösung ein stärkeres Signal bei Bindung erhal- ten, weil das Verhältnis Grenzfläche Lösung/Immobili- sat zu Volumen der aufgegebenen Lösung aufgrund der Ausbildung eines Kapillarfilmes erhöht wird. Die Analytik wird somit letztendlich empfindlicher.
Erfindungsgemäße Immobilisate lassen sich sowohl zur eigentlichen Analyse (Analysatcharakterisierung) als auch zur Vorbereitung einer Probe verwenden, beispielsweise zur Abtrennung von spezifischen Analysat- bestandteilen durch Festphasenbindung aus einem komplexen Gemisch, z.B. von genomischer DNA aus Blutproben oder RNA, etc, oder beispielsweise zur Anreicherung an der festen Phase, z.B. durch enzymatische Verfahren. Für letzteres kann z.B. eine Bindungsstelle für ein Enzym, wie T7 DNA Polymerase, in das immobilisierte Oligonukleotid eingebaut werden,
Bevorzugte Ausführungformen der Erfindung
Nach der Verfahrenstufe c) kann eine Waschver- fahrensstufe durchgeführt werden. Hiermit werden nicht (covalent) gebundene Nukleinsäuremoleküle gleichsam abgewaschen bzw. desorbiert. Nach der Verfahrenstufe c) oder nach der Waschverfahrenstufe kann eine Spülverfahrenstufe mit einer wäßrigen Lösung enthaltend ein Detergenz durchgeführt werden. Mittels des Detergenz werden eventuelle reaktive Oberflächensites, welche unbesetzt geblieben sind, abgesättigt bzw. blockiert, aber auch die Adhäsionskräfte zwischen einer subsequent aufgegebenen Lösung und dem Immobilisat gegenüber den Cohäsionskräften in der subsequent aufgegebenen Lösung erhöht und so die Benetzbarkeit des Immobilisats erhöht, bis zu vollständigen
Selbstbenetzung bzw. selbstständiger Ausbildung eines Kapillarfilmes .
Der Polymerwerkstoff kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Polyethylen (PE) , Polycarbonat (PC), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol (PS), Poly- therephthalat (PETP) , Polyethersulfon (PES) , Poly- etheretherketon (PEEK) , Polyphenylenoxid (PPO) , Polyphenylensulfid (PPS), Polybuthylenterephthalat (PBT, Polyoxymethylen (POM), Polysulfon (PSU), Poly- etherimid (PEI), Polyamid (PA) und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere", insbesondere ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Polycarbonat (PC), Polyvinylchlorid (PVC) , Polystyrol (PS)' und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere".
Die Konzentration der Nukleinsäure in der Lösung kann-' im Bereich von 0,0001 bis 1000 nM, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 nM, liegen. Es versteht sich, daß auch verschiedene Nukleinsäuren eingesetzt werden können, jeweils in Konzentrationen, wie angegeben.
Die Gesamtkonzentration des gelösten Salzes in der Lösung liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0,1 bis 6 M, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 3 M. Das Salz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "MgCl2, CaCl2, NaCl, KCl, LiCl, NH4HC03, NaHC03, Na2C03, NH4C1, NaHP04, NaPi, NH4Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base, KHS04, K2S205, Tetraethylammoniumchlorid, MOPS, HEPES, Bernsteinsäure, Diethanolamin, Ethanola- min, NaHC03/NaCl/EDTA, PBS, TAE, Bisulfit, NaBorat, und Mischungen dieser Stoffe". Als Salz ist ein Stoff bezeichnet, welcher in wäßriger Lösung in zumindest ein Anion und zumindest ein Kation dissoziiert. Das UV-Licht sollte eine Wellenlänge im Bereich 1 nm bis 480 nm, insbesondere 100 nm bis 300 nm, aufweisen. Die Bestrahlungsdauer beträgt typischerweise 1 s bis 100 min, vorzugsweise 10 s bis 10 min., beispielsweise 0,5 bis 2 min.. Eine Strahlungsleistung, wie von einer 60 W UV-Lampe über 2 min. bei einem Abstand von 15 cm geliefert, ist durchaus ausreichend.
Das Detergenz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarko- sysl, und Mischungen solcher Substanzen". In der Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Immobilisats, wobei die Oberfläche die Mantelfläche einer Polymerfaser ist, sind eine Vielzahl von solchen Po- lymerfasern parallel oder mit in Richtung der Längserstreckung sich' vergrößerndem Abstand zueinander angeordnet und fixiert, wobei die Mantelflächen benachbarter Polymerfasern einander nicht oder nur mit Punkt- oder Linienkontakt berühren und wobei die Zwischenräume zwischen den Polymerfasern so eng bemessen sind, daß sich in den Zwischenräumen eine Kapil- laraszension subsequenz aufgegebener Lösungen von zumindest 0,1 mm einstellt.
Die die Benetzung fördernde Lösung kann ein Detergenz ausgewählt aus 'der Gruppe, wie im vorstehenden Absatz beschrieben, enthalten. Die Hybridisierungslösung weist vorzugsweise einen pH von 7 bis 9 auf. Die Einstellung des pH kann durch Einsatz von NaOH erfolgen.
Die Erfindung kann außer bei den üblichen planaren Biochips insbesondere im Zusammenhang mit besonderen Bauteilen eingesetzt werden mit folgendem Aufbau.
Das besondere Bauteil weist eine Mehrzahl von
Fiberelementen (Fasern) und an den Fiberelementen immobilisierte Probenmoleküle selektierter Probenmolekülspezies oder selektierter Probenmolekülspezies- gruppen auf, wobei jedem Fiberelement eine spezifische Probenmolekülspezies oder Proben olekülspeziesgruppe zugeordnet ist, und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probenmoleküle an Zylindermantelflächen der Fiberelemente immobilisiert sind, und daß die Fiberelemente mittels eines Tragelements in radialer Richtung, bezogen auf die Fiberelemente, gegeneinander beabstandet fixiert oder in Linienkontakt miteinander gebündelt sind. Die Fiberelemente können parallel zue- inander als Fiberelementebündel angeordnet sein. Die Fiberelemente können optische Fiberelemente sein. Die Stirnflächen zumindest eines Endes der Fiberelemente, vorzugsweise beider Enden, können optisch kontaktier- bar sein. Alternativ oder zusätzlich ist eine elektri- sehe Kontaktierung möglich, beispielsweise zur Messung von Impedanzen bzw. Impedanzänderungen. Auch Auswertungen über Oberflächenplasmonenresonanz und Streuprozesse ist möglich. Die Fiberelemente können einen Durchmesser im Bereich von 0,01 μm bis 1000 μm und/oder eine Länge im Bereich von 0,1 μm bis 100 mm aufweisen. Die Fiberelemente können in einer Dichte von 1 bis 107 Fibern/cm2, bezogen auf eine radiale Querschnittsebene der Fiberelemente, gepackt sein. Das Verhältnis Durchmesser zu Länge kann im Bereich 100 bis 10"4 liegen. Das Tragelement kann an einem Ende der Fiberelemente angeordnet und die Enden der Fiberelemente umfassend ausgebildet sein, wobei die Stirnflächen der umfaßten Fiberelemente direkt oder indirekt optisch und/oder elektrisch kontaktierbar sind. An beiden Enden der Fiberelemente kann jeweils ein Tragelement angeordnet sein. Ein Tragelement kann aber auch zwischen den beiden Enden der Fiberelemente, beispielsweise mittig, angeordnet sein. Das Tragelement kann als Lochplatte oder als Wickeltragband ausgebildet sein. Das Tragelement kann schließlich aus Bereichen der Fiberelemente ausgebildet sein durch Verschweißen, Verschmelzen, Verkleben oder dergleichen. Die Probenmolekülspezies oder Probenmolekülspeziesgruppe kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus "DNA, RNA, PNA und Mischungen dieser Nukleinsäuren". Jedes Fiberelement kann Probenmoleküle einer jeweils selektierten, unterschiedlichen Probenmolekülpezies tragen. Es können auch auf einem Fiberelement verschiedene Felder mit verschiedenen Nukleinsäurespezies vorgesehen sein. Jedes Fiberelement kann aber auch Probenmoleküle einer jeweils selektierten, unterschiedlichen Probenmolekülspezies- gruppe tragen, wobei die Gruppenelemente jeder Probenmolekülspeziesgruppe gemeinsam unter Ausbildung von kooperativen Effekten an ein definiertes Targetmolekül binden. Jede Probenmolekülspeziesgruppe kann zwei Gruppenelemente enthalten. Ein solches besonderes Bau- teil ist herstellbar in einem Verfahren mit den folgenden Verfahrensstufen: a) es werden eine Mehrzahl von Endlosfibern hergestellt, b) jede Endlosfiber wird durch jeweils ein Fluid enthaltend eine selektierte Probenmolekülspezies oder eine selektierte Proben- molekülspeziesgruppe geleitet, c) die Probenmoleküle der Probenmolekülspezies oder der Probenmolekülspeziesgruppe werden an den Endlosfibern (erfindungsgemäß) immobilisiert, d) optional werden die Endlosfibern zumindest einer Waschverfahrensstufe zugeführt, e) jeder Endlosfiber wird die jeweils in Stufe c) an der Fiber immobilisierte Probenmolekülspezies oder Probenmolekülspeziesgruppe direkt oder indirekt zugeordnet, f) von verschiedenen Endlosfibern wird jeweils ein Fiberelement abgeschnitten und die Fiberelemente ver- schiedener Endlosfibern werden mit einem Tragelement verbunden oder in Linienkontakt zueinander gebündelt und fixiert. Die Zuordnung kann dabei durch Zwischenschaltung einer Codierung der Endlosfibern beispielsweise durch Einmischung von Quantum Spots oder Farbstoffen in die Rohmasse der Endlosfibern vor der Extrusion erfolgen. Dann erfolgt die Zuordnung der Nukleinsäurenspezies-/-gruppe zur Position eines Fiberelements in einem fertigen Bauteil erst nach ort- ■ saufgelöster Bestimmung der Codierung. Damit ist eine- exakte Positionierung der Fiberelemente bei der Herstellung des Bauteils obsolet. Solche Bauteile sind beispielsweise verwendbar in einem Verfahren zur De- tektion von Targetmolekülen, wobei optisch kontaktier- bare Stirnflächen der Fiberelemente optisch beispielsweise mit einem CCD Array oder über Mikrospiegel mit einem Photomultiplier verbunden sind, welche sensitiv für optische Strahlung einer Nach- weiswellenlänge ist, und wobei Sensorelemente des CCD Arrays bzw. Mikrospiegel oder deren Positionen jeweils den Fiberelementen zugeordnet sind, mit folgenden Verfahrenstufen: a) dem Biochip wird eine Lösung mit prospektiven Targetmolekülen zugeführt unter Bedingun- gen, bei welchen Targetmoleküle an Probenmoleküle binden, b) gleichzeitig mit Stufe a) oder hieran anschließend wird der Biochip mit einer eine Nachweiswellenlänge anregende Primärstrahlung bestrahlt, c) gleichzeitig mit Stufe b) oder hieran anschließend erfolgt eine Auslesung der Signale der Sensorelemente des CCD Arrays oder des Photomultipliers und Aufbereitung sowie Abspeicherung der Signale.
Definitionen.
Als Bauteil ist eine Anordnung bezeichnet, welche in diskreten und definierten Flächenbereichen, den Probenmolekülfeldern, Probenmoleküle einer Probenmolekülspezies oder Probenmolekülspeziesgruppe trägt. In der Regel wird jeder Probenmolekülfeld eines Bauteils eine andere Probenmolekülspeziesgruppe tragen. Die Probenmolekülfelder sind adressierbar in dem
Sinne, daß eine direkte oder indirekte Zuordnung getroffen ist/wird zwischen jedem Probenmolekülfeld bzw. seiner geometrischen Lage im Rahmen des Bauteils und der von dem Probenmolekülfeld getragenen Probenmolekülspeziesgruppe.
Probenmoleküle sind Moleküle, welche mit Targetmolekülen eine spezifische Wechselwirkung eingehen können. Beispiele für solche Wechselwirkungen sind: Protein-Aptamer, Nukleinsäure-Nukleinsäure
(Crick/Watson oder nicht-Crick/Watson) , Nukleinsäure- Ribozym, usw.
Targetmoleküle sind Moleküle, auf welche eine zu analysierende Probe, welche dem Biochip aufgegeben wird, untersucht wird.
Eine Probenmolekülspezies enthält Probenmoleküle ausschließlich einer Struktur, beispielsweise einer Sequenz im Falle von Nukleinsäuren oder Proteinen oder Peptiden.
Eine Probenmolekülspeziesgruppe enthält als Gruppenelemente zumindest zwei Probenmolekülspezies. Hier- bei kann es bei den Probenmolekülspezies um gleichartige oder verschiedenartige Probenmolekültypen handeln. Kooperative Effekte zwischen Molekülen mehrerer Probenmolekülspezies bzw. Elementen einer Probenmolekülspeziesgruppe und einer Targetmolekülspezies sind dadurch gekennzeichnet, daß der energetische Gewinn durch simultane Wechselwirkung zwischen jeweils den Molekülen der verschiedenen Probenmolekülspezies einerseits und den zwischen den verschiedenen Probenmolekülspezies und dem Targelmolekül insgesamt anderseits größer ist als die Summe der energetischen Gewinne der Wechselwirkungen eines Moleküls jeweils einer Probenmolekülspezies mit einem Molekül der Targetmolekülspezies. Der zusätzlich Energiegewinn rührt also von der Kooperation zwischen den Probenmolekülen verschiedener Probenmolekülspezies im Bindungsfalle der Probenmoleküle mit dem Targetmolekül. Im Falle der Nukleinsäuren als Probenmoleküle und Targetmoleküle ist beispielhaft Stacking zu nennen. Der Stacking Effekt ist ein Energiegewinn durch Wechselwirkungen, nämlich Delokalisation der π-Elektronen der hydro- phoben Ringstrukturen benachbarter Basen in doppel- strängigen Nukleinsäuren. Der Stacking Effekt tritt dabei zwischen den Enden der Probennukleinsäuren ein, wenn eine Bindung an ein Targetmolekül derartig stattfindet, daß die Enden der Probennukleinsäuren benachbart zueinander gebunden werden. Im Falle der Proteine können kooperative Effekte aus speziellen Ξekundärstrukturen miteinander wechselwirkender Proteine resultieren. Generell wird mit kooperativen Effekten eine höhere Spezifität einer Bindung zwischen Probenmolekülen und einem Targetmolekül erreicht.
Ein Hybridisierungbereich ist ein Sequenzbereich einer Probennukleinsäure, welche mit einer Targetnukleinsäure hybridisieren .kann. Ein Spacerbereich oder Abstandshalterbereich ist eine an einem Ende der Probennukleinsäure gebundene Gruppe, welche mit einer zweiten Bindungsstelle an dem Proben- molekülfeld gebunden ist. Ein Spacerbereich ist zweckmäßigerweise so gestaltet, daß eine Bindung bzw. Hybridisierung mit einem Targetmolekül nicht stattfinden kann. Ein Spacerbereich kann beispielsweise aus einem nicht-hybridisierenden Oligonukleotid gebildet sein. Mit einem Spacerbereich wird erreicht, daß einerseits der Hybridisierungsbereich in ausreichendem Abstand zur Oberfläche des Probenmolekülfeldes angeordnet wird und andererseits der Hybridisierungsbereich gleichsam flexibilisiert wird und fol- glich ohne sterische bzw. konformationsbedingte Restriktionen an ein Targetmolekül binden kann.
Als Fiberelemente sind von einer Endlosfiber abgeschnittene Stücke bezeichnet. In der Regel wird der Schnitt in einer Ebene orthogonal zur Längserstreckung der Endlosfiber ausgeführt sein, es ist jedoch selbstverständlich auch eine demgegenüber weniger als 90° abgewinkelte Schnittebene möglich.
Eine Endlosfiber ist ein stabartiges oder fadenartiges Gebilde, mit gegenüber der Länge von Fiberelementen großer Längserstreckung, welches typischerweise mittels Ziehtechnologien, Blastechnologien und/oder Ex- trusionstechnologien hergestellt und auf Trommeln oder dergleichen aufgewickelt und bevorratet sein können.
Eine Endlosfiber und/oder ein Fiberelement kann in einer zur Längserstreckung orthogonalen Querschnitts- ebene die verschiedensten Querschnittsformen aufweisen. Lediglich bevorzugt ist ein im wesentlichen kreisförmiger Querschnitt. Insofern umfaßt der Begriff der Zylindermantelfläche im Rahmen der Erfindung auch Mantelflächen im Falle nicht-kreisförmiger Querschnitte. Insofern bezeichnet der Begriff der radialen Richtung im Rahmen der Erfindung alle Richtungen in einer Querschnittsebene. Insofern bezeichnet schließlich der Durchmesser im Rahmen der Erfindung d = 2 * (F/2π)0'5, wobei F die Querschnittsfläche (beliebiger Form) ist.
Die Stirnfläche eines Fiberelementes ist durch einen Schnitt durch eine Endlosfiber gebildet.
Beabstandung der Fiberelemente meint, daß die Mantelflächen benachbarter Fiberelemente einander nicht berühren oder über Nasen gegeneinander abgestützt sind. Die Kontaktflächen liegen jedenfalls unterhalb von 1% der Gesamtoberfläche der Fiberelemente.
Ein Fiberelementebündel weist in der Regel zueinander coplanare Stirnflächen der gebündelten Fiberelemente auf. Es ist aber auch möglich, innerhalb eines Fiberelementebündels Gruppen von Fiberelementen mit jeweils coplanaren Strinflächen auszubilden, wobei die Strinflächen von Fiberelementen unterschiedlicher Gruppen zueinander nicht coplanar sind.
Optische Fiberelemente sind optisch transparent für elektromagnetische Strahlung zumindest in einem Teilbereich der Bereiche IR, sichtbares Licht und/oder UV. Optisch transparent meint, daß die Dämpfung der elektromagnetischen Strahlung ausreichend gering ist, um eine Detektion an einem Ende eines Fiberelements erzeugter elektromagnetischen Strahlung an dem gegenüberliegenden Ende des Fiberelementes mittels üblicher Detektionstechnologien zu erlauben.
Der Begriff der optischen Kontaktierbarkeit bezeichnet eine Aufbereitung einer Teilfläche eines Fiberelementes, welche die Emission von elektromagnetischer Strahlung aus dem Fiberelement heraus durch die
Teilfläche erlaubt. Eine starke Streuung ist möglichst zu vermeiden. Ggf. können die Teilflächen auf geeignete Weise bearbeitet, beispielsweise geglättet oder poliert werden. .
Ein nicht-poröser Werkstoff weist einen Porositätsgrad (offene Porosität) , meßbar mittels der Xylol-Methode, von weniger als 1%, vorzugsweise weniger als 0,1%, noch besser weniger als 0,01%, auf (Porenvolumen/Ge- samtvolumen Werkstück) .
Detergenzien sind Grenzflächenspannungen herabsetzende Substanzen, insbesondere Tenside, ionisch, nichtionisch oder ampholytisch.
Eine die Benetzung einer Oberfläche fördernde Lösung enthält typischerweise ein oder mehrere Detergenzien. Ob eine Lösung das Kriterium der Förderung der Bentzung erfüllt läßt sich feststellen, indem zwei definierte Kapillaren aus dem Polymerwerkstoff hergestellt werden, wobei ein der Kapillaren mit der Lösung behandelt wird und die zweite dagegen nicht. Dann wird für beide Kapillaren die Kapillaraszension mit beispielsweise einer Hybridisierungslösung unter gleichen Bedingungen bestimmt. Wenn die Kapillaraszen- sion in der behandelten Kapillaren größer ist als in der unbehandelten, so ist die eingesetzte Lösung die Benetzung fördernd.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht limitierenden Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Immobilisierung einer Nukleinsäure
Es wurde eine wäßrige Lösung hergestellt enthaltend ein Oligonukleotid mit der Sequenz (T)20-ATT CTA GCT AGT TCA ACT TC (10 nM) , MgCl2 (0,2 M) , NaCl (1,0 M) und Tris (0,1 M) , wobei ein pH von 8 eingestellt war. 1 μl dieser Lösung wurde auf ein Polycarbonat Plättchen aufgebracht und das Polycarbonat Plättchen mit der 'aufgebrachten Lösung für 1 min. mit UV-Licht der Wellenlänge 254 nm bestrahlt. Das Plättchen wurde anschließend mit einer Detergens-haltigen Lösung gespült.
Beispiel 2: Immobilisierung einer Nukleinsäure
(Vergleichsbeispiel)
Es wurde wie in Beispiel 1 vorgegangen mit dem Unterschied, daß eine Bestrahlung mit UV-Licht nicht durch- geführt wurde. Beispiel 3: Hybridisierung der Immobilisate aus den. Beispielen 1 und 2.
Die Plättchen wurden jeweils in eine Hybridisierungs- lösung enthaltend ein mit Biotin markiertes Oligonukleotid mit der Sequenz GCT GAA ATG" GCA ATG GAA GTT GAA CTA GCT eingebracht und es wurde eine Inkubation über 10 min. bei 20 °C durchgeführt. Dannach wurde mit einer lösung gemäß der Hybridisierungslösung, jedoch ohne das Oligonukleotid nachgespült. Sodann erfolgte eine Untersuchung auf Hybridisierung mittels eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats und einem col- orimetrischen Substrat. Das Plättchen aus Beispiel 1 zeigt eine Verfärbung, was die Koppelung des Oligonuk- leotids im Rahmen der Maßnahmen des Beispiels 1 belegt. Das Plättchen aus Beispiel 2 zeigte dagegen keine Verfärbung; eine Bindung des Oligonukleotids an der Oberfläche hatte also ohne Bestrahlung nicht stattgefunden .
Beispiel 4: Untersuchung der Bindungsfestigkeit des Oligonukleotids bei dem Plättchen aus Beispiel 1.
Versuche zur Ablösung des Oligonukleotids von der Oberfläche des Plättchens mit Lösungen enthaltend SDS, IM NaOH und/oder chaotropen Reagenzien bei 100 °C und über 2 h in wäßriger Lösung zeigten, daß das Oligonuk- leotid fest gebunden bleibt. Solche Bedingungen wären geeignet nicht-covalente Wechselwirkungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Plättchen aufzuheben. Beispiel 5: Versuche mit anderen Polymerwerkstoffen.
Die Versuche aus den .Beispielen 1 bis 4 wurden wieder- holt mit dem Unterschied, daß das Plättchen anstatt aus Polycarbonat aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid bestand. Diese beiden Polymere enthalten ebenfalls keine primären oder sekundären Amingruppen. In allen Versuchen wurde Ergebnisse entsprechend der Beispiel 1 bis 4 erhalten.
Beispiel 6: Anwendung einer die Selbstbenetzung fördernden Lösung.
Es wurde ein Immobilisat gemäß dem Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, daß der Polymerwerkstoff Polystyrol und zu einer Mikrotestplatte (MTP) geformt war. Die MTP wurde dann mit einer die Selbstbenetzung fördernden Lösung enthaltend NaCl (0,75 M) , Natriumeitrat (0,075 M) , Tween® 20 (0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht Lösung) und optional Natriumazid (0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht Lösung) gespült .
Sodann wurden zur Hybridisierung in einem Kapillarfilm 5 μl einer 10 mM NaOH enthaltend 1 pM eines mit Biotin markierten Oligonukleotids mit der Sequenz GCT GAA ATG GCA ATG GAA GTT GAA CTA GCT in die Vertiefung der MTP eingebracht.
Aufgrund der Kombination oberflächengebundenes Deter- gens und leicht alkalische Hybridisierungslösung erfolgte nicht nur eine Benetzung der gesamten Vertiefung der MTP durch einen Kapillarfilm, sondern gleichzeitig eine Stabilisierung und Hybridisierung des Targe-ts an die immobilisierten Nukleinsäuren. Nach 15 min. Inkubation bei 20 °C konnte eine Hybridisierung mittels eines Streptavidin Peroxidase Konjugats sowie eines colorimetrischen Substrats nachgewiesen werden.
Kontrollvertiefungen, welche mit einem höheren Volumen (10 bis 200 μl) beschickt wurden, zeigten eine abnehmende Signalstärke.
Weitere Versuche zeigten, daß die Bindung von Deter- genzien an die Oberfläche wichtig ist, einerseits zur Erzeugung eines Kapillarfilmes und andererseits um eine Stabilisierung/Hybridisierung vorher denaturierter Nukleinsäuren direkt an der Oberfläche zu bewirken. Eine Nukleinsäure, welche in einer neutralen oder alkalischen Lösung (entsprechend 1 bis 200 mM NaOH) denaturiert vorliegt, wird somit ausschließlich bei Kontakt mit der Oberfläche hybridisierungsfähig gemacht .
Beispiel 7: Immobilisierung mit verschiedenen Salzen bei verschiedenen Konzentrationen.
Bindung wurde festgestellt für jeweils die folgenden Salze bei verschiedenen pH Werten: MgCl,, CaCl2, NaCl, KCl, LiCl, NH4HC03, NaHC03, Na2C03, NH4C1, NaHP04, NaPi, NH4Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base, KHS04, K2S205, Tetraethylammoniumchlorid, MOPS, HEPES, Bernsteinsäure, Diethanolamin, Ethanolamin, NaHC03/NaCl/ EDTA, PBS, TAE, Bisulfit und NaBorat . Dabei war eine Konzentration von 100 mM eingestellt. - Einige dieser Salze wurden auf konzentrationsabhäng.ig- keit untersucht. NaCl, NH4C1 und NaPi bewirkten bis hinunter zu 10 mM 100% Bindung, bei 5 mM 80% Bindung und bei 1 M und weniger 0% Bindung. NaHC03 verhielt sich gleich nur mit lediglich 60% Bindung bei 5 mM. MgCl2 zeigte bis 10 mM 100% Bindung, gefolgt von 80% Bindung bis hinunter zu 0,1 mM. KHS04 zeigte 100% Bindung bis hinunter zu 5 mM, 80% Bindung bei 1 mM und 0,5 mM sowie 60% Bindung bei 0,1 mM. NH4Ac zeigte bis 10 mM 100% Bindung, bis 1 mM 80% Bindung und bis 0,1 mM 40% Bindung. Es ist davon auszugehen, daß auch die weiteren Salze jedenfalls bis hinunter zu 5 mM zumindest 80% Bindung zeigen, jedenfalls bei 10 mM 100% Bindung.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren mit weniger als 300 Basenpaaren an einer Oberfläche eines organischen Polymerwerkstoffs, welcher keine primären und/oder sekundären Amingruppen trägt, mit den folgenden Verfahrensstufen:
a) es wird eine wäßrige Lösung enthaltend eine Nukleinsäure sowie ein gelöstes Salz hergestellt,
b) die Lösung aus Stufe a) wird mit der Oberfläche des Polymerwerkstoffs kontaktiert,
c) es wird die Oberfläche des Polymerwerkstoffs, welche in Kontakt mit der Lösung steht, mit UV-Licht bestrahlt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei nach der Verfahrenstufe c) eine Waschverfahrensstufe durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei nach der Verfahrenstufe c) oder nach der Waschverfahrenstufe eine Spülverfahrenstufe mit einer wäßrigen Lösung enthaltend ein Detergens durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Polymerwerkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "Polyethylen (PE) , Polycarbonat (PC) , Polyvinylchlorid (PVC) , Polystyrol (PS), Polythere- phthalat (PETP) , Polyethersulfon (PES) , Polyethere- therketon (PEEK) , Polyphenylenoxid (PPO) , Polyphenylensulfid (PPS) , Polybuthylenterephthalat (PBT), Polyoxymethylen (POM), Polysulfon (PSU), Polyetherimid (PEI) , Polyamid (PA) und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere", insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Polycarbonat (PC), Polyvinylchlorid (PVC), Polystyrol und Mischungen sowie Copolymere der Monomere solcher Polymere". .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration der Nukleinsäure in der Lösung im Bereich von 0,0001 bis 1000 nM, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 nM, liegt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Gesamtkonzentration des gelösten Salzes in der Lösung im Bereich von 0,1 mM bis 6 M, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 3 M, insbesondere 0,1 bis 0,2 M, liegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus "MgCl2/ CaCl2, NaCl, KCl, LiCl, NH4HCO,, NaHC03, Na2C03, NH4C1, NaHP04, NaPi, NH4Ac, NaAc, KAc, TrisHCl, HC1, Tris Base,- KHS04, K,S,05, Tetraethy- lammoniumchlorid, MOPS, HEPES, Bernsteinsäure, Di- ethanola in, Ethanola in, NaHC03/NaCl/EDTA, PBS, TAE, Bisulfit, NaBorat, und Mischungen dieser Stoffe".
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das UV-Licht eine Wellenlänge im Bereich 1 nm bis 480 nm, insbesondere 100 nm bis 300 nm, aufweist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei das Detergenz ausgewählt ist aus der Gruppe beste- hend aus "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarko- sysl, und Mischungen solcher Substanzen".
10. Immobilisat mit einem Polymerwerkstoff und einer an eine Oberfläche' des Polymerwerkstoffes gebundenen Nukleinsäure, erhältlich mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Oberfläche planar oder die Mantelfläche einer Polymerfaser ist.
11. Verwendung eines Immobilisats nach Anspruch 10 in einem Verfahren zur Hybridisierung von Nukleinsäuren, wobei die an der Oberfläche des Po- lymerwerkstoffes immobilisierte Nukleinsäure eine Hybridisierungsregion aufweist, mit den folgenden Verfahrensstufen: a) die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats wird mit einer die Benetzung der Oberfläche fördernden Lösung behandelt,
b) ein Teil der die Nukleinsäure tragenden Oberfläche des Immobilisats wird dann mit einer Hybridisierungslösung kontaktiert, wobei die Hybridisierungslösung die die Nukleinsäure tragende Oberfläche des Immobilisats selbsttätig vollständig benetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die die
Benetzung fördernde Lösung ein Detergenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus "Tween 20, Triton X100, Brij-35, Sarkosysl, und Mischungen solcher Substanzen" enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Hybridisierungslösung einen pH von 6,5 bis 11, vorzugsweise 7 bis 9, aufweist.
PCT/DE2001/000812 2000-02-28 2001-02-27 Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren WO2001062963A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01929225A EP1305444A2 (de) 2000-02-28 2001-02-27 Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren
AU2001256106A AU2001256106A1 (en) 2000-02-28 2001-02-27 Method for immobilizing nucleic acids
US10/220,331 US20040023226A1 (en) 2000-02-28 2001-02-27 Method for immobilizing nucleic acids

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10010376.6 2000-02-28
DE10010376 2000-02-28
DE10053393.0 2000-10-20
DE10053393A DE10053393A1 (de) 2000-02-28 2000-10-20 Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2001062963A2 true WO2001062963A2 (de) 2001-08-30
WO2001062963A3 WO2001062963A3 (de) 2002-04-25

Family

ID=26004661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2001/000812 WO2001062963A2 (de) 2000-02-28 2001-02-27 Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20040023226A1 (de)
EP (1) EP1305444A2 (de)
AU (1) AU2001256106A1 (de)
WO (1) WO2001062963A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1471355A1 (de) * 2002-02-01 2004-10-27 Nisshinbo Industries, Inc. Verfahren zum anheften eines biomoleküls an einen träger

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1130121A3 (de) * 2000-01-26 2003-04-16 Nisshinbo Industries Inc. Immobilisierte Nukleinsäuren und Methoden zum Nchhweis von Nukleinsäuren
EP2940136A1 (de) * 2014-04-30 2015-11-04 QIAGEN GmbH Verfahren zur Isolierung von Poly(A)-Nukleinsäuren

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2197720A (en) * 1986-11-20 1988-05-25 Nat Res Dev Immobilisation of polynucleotides
WO1989011548A1 (en) * 1988-05-20 1989-11-30 Cetus Corporation Immobilized sequence-specific probes
US5610287A (en) * 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
US5663318A (en) * 1991-03-01 1997-09-02 Pegg; Randall Kevin Assay preparation containing capture and detection polynucleotides covalently bound to substrates with a heterobifunctional crosslinking agent
US5741638A (en) * 1990-06-28 1998-04-21 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Microtiter well for detecting nucleic acid
US5858653A (en) * 1997-09-30 1999-01-12 Surmodics, Inc. Reagent and method for attaching target molecules to a surface

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2197720A (en) * 1986-11-20 1988-05-25 Nat Res Dev Immobilisation of polynucleotides
WO1989011548A1 (en) * 1988-05-20 1989-11-30 Cetus Corporation Immobilized sequence-specific probes
US5741638A (en) * 1990-06-28 1998-04-21 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Microtiter well for detecting nucleic acid
US5663318A (en) * 1991-03-01 1997-09-02 Pegg; Randall Kevin Assay preparation containing capture and detection polynucleotides covalently bound to substrates with a heterobifunctional crosslinking agent
US5610287A (en) * 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
US5858653A (en) * 1997-09-30 1999-01-12 Surmodics, Inc. Reagent and method for attaching target molecules to a surface

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRAYAMA H ET AL: "Improved immobilization of DNA to microwell plates for DNA-DNA hybridization" NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 24, Nr. 20, 1996, Seiten 4098-99, XP002189260 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1471355A1 (de) * 2002-02-01 2004-10-27 Nisshinbo Industries, Inc. Verfahren zum anheften eines biomoleküls an einen träger
EP1471355A4 (de) * 2002-02-01 2005-08-17 Nisshin Spinning Verfahren zum anheften eines biomoleküls an einen träger

Also Published As

Publication number Publication date
US20040023226A1 (en) 2004-02-05
EP1305444A2 (de) 2003-05-02
WO2001062963A3 (de) 2002-04-25
AU2001256106A1 (en) 2001-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60123480T2 (de) Behandlung von hydrophoben oder hydrophilen oberflächen mit polymeren
DE69828083T2 (de) Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Durchführung eines Tests, Verwendung einer Membran zur Herstellung dieser Vorrichtung, Kit mit dieser Vorrichtung und Analyseverfahren unter Verwendung dieses Gerätes
DE19740263C2 (de) Kachelungsverfahren zum Bauen eines chemischen Arrays
DE60125312T2 (de) Mikroarray
EP1379545A2 (de) Verfahren zur herstellung stabiler, regenerierbarer antikörper-arrays
DE68927403T2 (de) Derivatisierte glasträger zur sequenzierung von peptiden und proteinen
DE19943374A1 (de) Verfahren zum Anbinden von Nukleinsäuren an eine Festphase
DE68922501T2 (de) Enzymelektrode.
WO2006048164A1 (de) Aptamerbasiertes testsystem
EP2252410B1 (de) Oberflächenmodifikation
DE10149786A1 (de) Oberfläche für Untersuchungen aus Populationen von Einzelmolekülen
DE102004025695A1 (de) Verfahren und Oberfläche zur parallelen Sequenzierung von Nukleinsäureketten
DE102004025745A1 (de) Oberfläche für die Analysen an einzelnen Molekülen
DE102005017522A1 (de) Immobilisierungs- und Reaktionsmatrix für Biosensoren
WO2001062963A2 (de) Verfahren zur immobilisierung von nukleinsäuren
DE10053393A1 (de) Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren
DE10110511C1 (de) Verfahren zur Herstellung eines Arrays zur Detektion von Komponenten aus einer biologischen Probe
DE3614432A1 (de) Verfahren zum antigennachweis
EP1660886B1 (de) Vorrichtungen zum nachweis biochemischer aktivität enthaltend gap junctions
EP1278834B1 (de) Verfahren für die komplexe nukleinsäureanalytik
DE19832598C2 (de) Oberflächenmodifizierung von Mikrotiterplatten mit pH- und/oder redoxsensitiven und/oder molekular geprägten Polymeren sowie die Verwendung solcher modifizierter Mikrotiterplatten in Assays bzw. Test- und Screeningssystemen
DE2938737A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur gleichzeitigen analytischen bestimmung von mehreren komponenten in einer probe mittels enzymatischer analyse
DE10053472B4 (de) Vorrichtung und Verfahren zur kombinatorischen Immobilisierung von Probenmolekülen auf Fiberelementen
EP1234056B1 (de) Dynamische bestimmung von analyten durch arrays auf inneren oberflächen
WO2006027088A1 (de) Verfahren zur erweiterung des dynamischen erfassungsbereichs bei mikroarrays

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DK DM EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001929225

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10220331

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001929225

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001929225

Country of ref document: EP