DE60222856T2

DE60222856T2 - Endotoxin-bindung durch milchsäurebakterien und bifidobacteria

Info

Publication number: DE60222856T2
Application number: DE60222856T
Authority: DE
Inventors: Eduardo Schiffrin; Guillermo West Hartford KOCIUBINSKI
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2022-02-02
Also published as: IL157071A0; MXPA03007024A; EA200300862A1; AU2002250886B2; US20040115178A1; NO20033372L; EP1359924B1; WO2002062360A1; EP1359924A1; HK1066174A1; US7550285B2; JP2014062104A; BR0207019A; KR100845456B1; KR20030076652A; ZA200306935B; PT1359924E; US7964384B2; DE60222856D1; NZ527493A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien, die hydrophob sind, zur Herstellung einer Lebensmittelzusammensetzung, die für die Prävention oder die Behandlung von Endotoxin-vermittelten und/oder -assoziierten Gesundheitsstörungen gedacht ist. Die Erfindung betrifft auch eine daraus hergestellte Zusammensetzung.
Hintergrund der Erfindung
Sepsis auslösende Toxine wurden mit pathogenen Bakterien, Viren, Pflanzen und tierischem Gift assoziiert gefunden. Unter den gut beschriebenen bakteriellen Toxinen befinden sich die Endotoxine oder Lipopolysaccharide (LPS) der gramnegativen Bakterien. Diese Moleküle sind Glykolipide, die überall in der äußeren Membran aller gramnegativen Bakterien vorkommen, und es wird angenommen, dass sie für die gramnegative Sepsis verantwortlich sind. Dieser Typ von Sepsis ist ein extrem verbreiteter Krankheitszustand und häufig tödlich.
Es wurde eine Anzahl von Ansätzen zur Behandlung von Sepsis untersucht. Diese beinhalten die Verwendung von Antikörpern gegen LPS, von Antikörpern gegen Tumornekrosefaktor, die Verwendung eines löslichen TNF-Rezeptors, die Verwendung eines löslichen Interleukin-1 (IL-1)-Rezeptors, um nur einige zu nennen. Auch wenn jeder Ansatz eine gewisse Wirksamkeit aufweist, waren die Gesamtergebnisse enttäuschend.
Andere haben versucht, Proteine zu konstruieren und zu untersuchen, die LPS/Endotoxin binden, und illustrative Reports dieser Versuche finden sich in Rustici, A. et al. Science (1993) 259: 361–364; Matsuzaki, K. et al. Biochemistry (1993) 32: 11704–11710; Hoess, A. et al. EMBO J (1993) 12: 3351–3356; und Elsbach, P. et al. Current Opinion in Immunology (1993) 5: 103–107. Tatsächlich kann LPS bei seiner Einführung in das Blut an ein Protein binden, das als Lipopolysaccharid-bindendes Protein (LBP) bezeichnet wird. Die Inhibierung von LBP, z. B. mit einem anti-LBP-Antikörper, wurde vorgeschlagen als therapeutisch nützlich zur Behandlung einer Endotoxin-vermittelten Sepsis ( Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US 90/04250 , eingereicht am 30. Juli 1990). Ferner haben Arbeiten aus verschiedenen Laboratorien gezeigt, dass Plasma-Lipoproteine, insbesondere Lipoproteine hoher Dichte (HDL), LPS binden und neutralisieren (Skarnes et al., 1968, J. Bacteriology 95: 2031; Flegel et al., 1993, Infect. Immunol. 61(12): 5140), und dass diese Partikel die LPS-neutralisierende Aktivität im Plasma darstellen können.
Frühere Behandlungen von Endotoxin-vermittelten und/oder -assoziierten Erkrankungen erfolgten retrospektiv (d. h. nach der Entwicklung der klinischen Krankheit) und beschränkten sich auf eine chemotherapeutische Intervention. Präventionsmaßnahmen wurden mit derartigen Behandlungen nicht erreicht.
Es besteht daher auf dem Fachgebiet ein Bedarf nach einem wirksamen Mittel zur Neutralisierung von gramnegativem Endotoxin (d. h. LPS), um die Symptome von Sepsis und septischem Schock zu verhindern oder abzumildern.
Die hydrophoben Milchsäurebakterien und Bifidobakterien der vorliegenden Erfindung stellen zusätzliche Verbindungen dar, die in der Lage sind, Endotoxine zu binden und ihre Wirkungen zum besseren zu verändern/zu verhindern.
Kurzdarstellung der Erfindung
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von wenigstens einem Stamm von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien, der hydrophobe Oberflächeneigenschaften aufweist, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Prävention oder die Behandlung von Endotoxin-vermittelten und/oder -assoziierten Gesundheitsstörungen bestimmt ist.
Tatsächlich wurde überraschenderweise gefunden, dass gewisse Milchsäurebakterien und Bifidobakterien, insbesonde re diejenigen mit einer hydrophoben Oberfläche die Fähigkeit aufweisen, Endotoxine zu binden. Das erlaubt somit ihre Verwendung als wirksame Mittel zur Prävention von endotoxischem Schock und Sepsis mit einem Ursprung im Darm, in bakteriellen Translokationen, einer nekrotisierenden Enterokolitis, einer entzündlichen Darmerkrankung, bei Dünndarminfektionen, einer chronischen Endotoxämie, die mit einer katabolischen und systemischen Inflammation assoziiert ist oder diese begünstigt.
Die hydrophoben Milchsäurebakterien oder Bifidobakterien weisen eine prozentuale Hydrophobizität (%H) von wenigstens 80, stärker bevorzugt von 85 bis 100% H, auf.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Stamm ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactis, Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen isolierten Stamm von Milchsäurebakterien oder Bifidobakterien mit hydrophoben Oberflächeneigenschaften, der aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt wurde, Endotoxine zu binden oder mit gramnegativen Bakterien zu koaggregieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Humanlebensmittel- oder Haustiernahrungs-Zusammensetzung zur Prävention oder Behandlung von Endotoxin-vermittelten und/oder -assoziierten Gesundheitsstörungen bereit, die wenigstens einen Stamm von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien mit den obigen kennzeichnenden Merkmalen enthält, der mit einem verzehrbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert ist.
Diese Zusammensetzung bietet den Vorteil, eine bakterielle Fehlbesiedlung des Dünndarms zu vermindern und eine Endotoxin-Leckage aus dem Darm in das interne Milieu zu ver mindern, eine häufige Gesundheitsstörung, die bei Haustieren gefunden wird, die Episoden von Diarrhöe, Mangelernährung und beispielsweise Darmentzündung und systemische Entzündung bewirken kann.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In der folgenden Beschreibung bezeichnet "NCC" die Nestlé Culture Collection (Nestlé Research Centre, Verschez-les-Blanc, Lausanne, Schweiz).
Im Hinblick auf die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von wenigstens einem Stamm von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien, der hydrophobe Oberflächeneigenschaften aufweist, zur Herstellung einer Zusammensetzung betroffen, die für die Prävention oder die Behandlung von Endotoxin-vermittelten und/oder -assoziierten Gesundheitsstörungen gedacht ist.
Tatsächlich wurde überraschenderweise gefunden, dass gewisse Milchsäurebakterien und Bifidobakterien, insbesondere diejenigen mit hydrophober Oberfläche, die Fähigkeit aufweisen, Endotoxine zu binden.
Tatsächlich hat der Bakterienstamm gemäß der Erfindung die Fähigkeit, Endotoxine an der hydrophoben Zellwand zu binden und auf diese Weise dieses proinflammatorische Produkt von gramnegativen Bakterien abzufangen, das sich anderweitig aus dem Lumen des Darms in das Blut verlagern kann und auf diese Weise inflammatorische Reaktionen und, in sehr ernsten Fällen, einen Endotoxinschock auslösen kann.
Die Milchsäurebakterien oder Bifidobakterien gemäß der Erfindung wurden unter Stämmen ausgewählt, die für einen Verzehr durch Tiere geeignet sind, und zwar im Hinblick auf ihre prozentuale Hydrophobizität (%H), wie beschrieben wird in A.G. Zavaglia et al., Journal of Food protection, Vol. 61, No. 7, 1998, Seiten 865–873.
Der bakterielle Stamm gemäß der Erfindung weist ein %H von wenigstens 80, und stärker bevorzugt von 85 bis 100 %H auf.
Die Bestimmung der Oberflächenhydrophobizität erfolgte unter Verwendung des MATH-Verfahrens, wie es früher bereits beschrieben wurde (Pérez, P.F. et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 21–26). Kurz gesagt wurden 2 ml Bakteriensuspension (etwa 10⁸ KBE/ml, PBS) mit 0,4 ml Xylol durch deren Verwirbeln für 120 s extrahiert. Man ließ die Phasen durch Dekantieren trennen und es wurde A₆₀₀ der wässrigen Phase gemessen. Die Zelloberflächen-Hydrophobizität (%H) wurde errechnet mit der Formel H% = [(A₀ – A)/A₀] × 100, wobei A₀ und A die Absorptionsgrade vor und nach einer Extraktion mit Xylol darstellen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der bakterielle Stamm ausgewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactis, Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis.
Gemäß einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform kann der Stamm zum Beispiel sein Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM I-2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (früher CIDCA 536, CNCM I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (früher CIDCA 533, CNCM I-2335), Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM I-2168), Bifidobacterium lactis (ATCC2 7536).
Unter den verschiedenen Stämmen, die gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurden, wurden die folgenden Stämme als Beispiele unter dem Budapester Vertrag hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Frankreich, und zwar Lactobacillus acidophilus NCC 2463 am 2.02.2001 unter der Referenz-Nummer CNCM I-2623, und Bifidobacterium bifidum NCC 189 und NCC 235 am 12.10.99 unter den Referenz-Nummern CNCM I-2333 bzw. CNCM I-2335. Bifidobacterium adolescentis NCC 251 wurde hinterlegt am 15.03.99 unter der Referenz-Nummer CNCM I-2168.
Der Stamm von Bifidobacterium lactis (Bb12) (ATCC27536) wird geliefert von Hansen (Chr. Hansen A/S, 10–12 Boege Alle, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Dänemark). Er weist eine Hydrophobizität von 89% H auf.
Der Bakterienstamm gemäß der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden für die Herstellung von Zusammensetzungen, um die menschliche oder tierische Gesundheit zu verbessern, insbesondere für die Prävention oder Behandlung von Gesundheitsstörungen, die mit Endotoxinen bei Menschen und Haustieren zu tun haben. Der Bakterienstamm kann verwendet werden als wirksames Mittel zur Prävention von endotoxischem Schock und Sepsis mit einem Ursprung im Darm, zum Beispiel einer bakteriellen Translokation, einer nekrosierenden Enterokolitis, einer entzündlichen Darmerkrankung, von Dünndarminfektionen und von chronischer Endotoxämie, die mit einer katabolischen und systemischen Inflammation assoziiert ist oder diese begünstigt.
Der Bakterienstamm gemäß der Erfindung kann in seiner lebenden oder in inaktivierter Form verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Milchsäurebakterienstamm in Gegenwart seines fermentierten Wachstumsmediums verwendet. Das genannte Medium kann entweder allein sterilisiert sein oder mit einem Lebensmittel, beispielsweise extrudiert oder sprühgetrocknet, gekühlt oder bei Raumtemperatur lagerfähig.
Der Bakterienstamm kann so verwendet werden, dass die Menge, die für die Person verfügbar ist, etwa 10³–10¹⁴ KBE/Tag entspricht. Diese Menge hängt vom Gewicht der Person ab und beträgt vorzugsweise 10⁹–10¹² KBE/Tag für Menschen und 10⁷–10¹⁰ KBE/Tag für Haustiere.
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung einen isolierten Stamm von Milchsäurebakterien und Bifidobakterien mit hydrophoben Oberflächeneigenschaften und mit der Fähigkeit, Endotoxine zu binden oder mit gramnegativen Bakterien zu koaggregieren.
Die Fähigkeit des Bakterienstammes gemäß der vorliegenden Erfindung, Endotoxine zu binden, kann leicht gemessen werden unter Verwendung von FITC-markierten Endotoxinen, durch Messung der Assoziation von radioaktiv markiertem Endotoxin mit bakteriellen Zellen, wobei in diesem Falle die molekulare Struktur des Endotoxins unverändert geblieben ist, verglichen mit den möglichen Modifikationen, denen das Molekül nach einer Konjugation mit dem FITC (vergleiche Beispiele) unterliegen kann.
Vorzugsweise wird die Fähigkeit des bakteriellen Stamms, Endotoxin aus einer Lösung zu entfernen, die die Menge an Endotoxinen simuliert, die im menschlichen Darm gefunden wird, gemessen. Beispielsweise wurden Mengen an Endotoxinen mit dem Mikroassay zum Nachweis von 2-Keto-3-desoxyoctonat-Gruppen im Lipopolysaccharid von gramnegativen Bakterien untersucht (Karkhanis Y D, et al., Analytical Chemistry (1978)85: 595–601). Vorzugsweise wurden Bakterien ausgewählt, die mehr als 30% des Endotoxingehalts aus diesen Lösungen entfernten. Die in diesem Assay getesteten nicht-hydrophoben Bakterien waren nicht in der Lage, den Ausgangsgehalt an Endotoxin zu modifizieren (vergleiche Beispiele).
Ein derartiger Bakterienstamm kann, wie oben beschrieben, verwendet werden, und insbesondere als wirksames Mittel zur Prävention von endotoxischem Schock und Sepsis mit einem Ursprung im Darm, zum Beispiel einer bakteriellen Translokation, einer nekrotisierenden Enterokolitis, einer entzündlichen Darmerkrankung, Dünndarminfektionen, einer chronischen Endotoxämie, die mit einer katabolischen und systemischen Inflammation assoziiert ist oder diese begünstigt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Menschen-Lebensmittel- oder Haustiernahrungs-Zusammensetzung, die wenigstens einen isolierten Stamm von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien enthält, wobei der genannte Stamm die beiden obigen kennzeichnenden Merkmale aufweist, assoziiert mit einem verzehrbaren Träger oder eine pharmazeutischen Matrix.
Der Stamm kann wie oben beschrieben ausgewählt werden. Vorzugsweise können die Milchsäurebakterien oder Bifidobakterien als Ergänzung einer normalen Diät verabreicht werden oder als ein Bestandteil einer ernährungsmäßig vollständigen Menschen- oder Haustiernahrung.
Die Menschen- oder Haustier-Lebensmittelzusammensetzung kann wenigstens den Milchsäurebakterien- und/oder Bifidobakterien-Stamm umfassen, wie er oben beschrieben wurde, so dass die einer Person zur Verfügung stehende Menge etwa 10³–10¹⁴ KBE/Tag entsprechen kann. Diese Menge hängt vom Gewicht des Individuums ab und beträgt bei Menschen vorzugsweise von etwa 10⁹–10¹² KBE/Tag und für Haustiere 10⁷–10¹⁰ KBE/Tag.
Das Humanlebensmittel kann in Form beispielsweise einer Formulanahrung, einer Kleinkinder-Formulanahrung, von Produkten auf Milchbasis, von Molkereiprodukten, von Produkten auf Getreidebasis vorliegen. Um ein derartiges Lebensmittelprodukt oder eine derartige Lebensmittelzusammensetzung herzustellen, kann der wie oben beschriebene Bakterienstamm in ein Lebensmittel inkorporiert werden, wie beispielsweise in ein Getreidepulver, ein Milchpulver, einen Joghurt, und zwar beispielsweise während deren Herstellung.
Gemäß einer Ausführungsform kann eine Formulanahrung hergestellt werden, die eine Proteinquelle und wenigstens einen Bakterienstamm gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Diätetische Proteine werden vorzugsweise als Proteinquelle verwendet. Die diätetischen Proteine können irgendwelche geeigneten diätetischen Proteine sein; beispielsweise tierische Proteine (wie beispielsweise Milchproteine, Fleischproteine und Eiproteine), pflanzliche Proteine (wie beispielsweise Soja-, Weizen-, Reis- oder Erbsenproteine), Mischungen von freien Aminosäuren oder Kombinationen davon. Milchproteine wie beispielsweise Casein, Molkenproteine sowie Sojaproteine sind besonders bevorzugt. Die Zusammensetzung kann auch eine Quelle für Kohlenhydrate und eine Quelle für Fett enthalten.
Wenn die Formulanahrung eine Fettquelle beinhaltet, liefert die Fettquelle vorzugsweise etwa 5% bis etwa 55% der Energie der Formulanahrung; beispielsweise etwa 20% bis etwa 50% der Energie. Die Lipide, die die Fettquelle bilden, können irgendein geeignetes Fett oder irgendeine geeignete Fettmischung sein. Pflanzenfette sind besonders geeignet, beispielsweise Sojaöl, Palmöl, Kokosnussöl, Safloröl, Sonnenblumenöl, Maisöl, Canolaöl, Lecithin und dergleichen. Gewünschtenfalls können auch tierische Fette wie Milchfett zugegeben werden.
Wenn die Formulanahrung eine Kohlenhydratquelle beinhaltet, liefert die Kohlenhydratquelle vorzugsweise etwa 40% bis etwa 80% der Energie der Formulanahrung. Es können irgendwelche geeignete Kohlenhydrate verwendet werden, beispielsweise Saccharose, Lactose, Glukose, Fructose, Glukosesirup-Feststoffe und Maltodextrine und Mischungen davon.
Gewünschtenfalls können auch diätetische Ballaststoffe zugesetzt werden. Es stehen zahlreiche Typen von diätetischen Ballaststoffen zur Verfügung. Einige Quellen für diätetische Ballaststoffe können u. a. einschließen Soja, Erbse, Hafer, Pektin, Guargummi und Gummi arabicum. Wenn sie verwendet werden, bilden die diätetischen Ballaststoffe vorzugsweise bis zu etwa 5% der Energie der Formulanahrung. Der Formulanahrung können auf übliche Weise geeignete Vitamine und Mineralstoffe zugegeben werden, um die einschlägigen Richtlinien zu erfüllen. Gewünschtenfalls können ein oder mehrere Emulgator(en) von Lebensmittelqualität in die Formulanahrung inkorporiert werden; beispielsweise Di-Acetylweinsäureester von Mono-Diglyceriden, Lecithin und Mono- und Di-Glyceride. Auf ähnliche Weise können geeignete Salze und Stabilisatoren zugegeben werden.
Die Formulanahrung ist vorzugsweise enteral verabreichbar; beispielsweise in Form eines Pulvers, eines flüssigen Konzentrats oder eines trinkfertigen Getränks.
Die Formulanahrung kann auf irgendeine geeignete Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann die Formulanahrung dadurch hergestellt werden, dass man die Quelle für diätetisches Protein, die Kohlenhydratquelle und die Fettquelle in geeigneten Proportionen vermischt. Wenn sie verwendet werden, können die Emulgatoren in die Mischung gegeben werden. Die Vitamine und Mineralstoffe können zu diesem Zeitpunkt zugesetzt werden, werden jedoch üblicherweise später zugesetzt, um einen thermischen Abbau zu vermeiden. Irgendwelche lipophilen Vitamine, Emulgatoren und dergleichen können vor dem Vermischen in dem Fett aufgelöst werden. Es kann dann Wasser, vorzugsweise Wasser, das einer Umkehrosmose unterzogen wurde, zugemischt werden, um eine flüssige Mischung zu bilden. Die Temperatur des Wassers liegt üblicherweise bei etwa 50°C bis etwa 80°C, um die Dispergierung der Bestandteile zu unterstützen. Kommerziell erhältliche Verflüssiger können verwendet werden, um die flüssige Mischung zu bilden. Die flüssige Mischung wird dann homogenisiert; beispielsweise in zwei Stufen.
Die flüssige Mischung kann dann thermisch behandelt werden, um die Bakterienbelastungen zu vermindern. Beispielsweise kann die flüssige Mischung rasch auf eine Temperatur im Bereich von etwa 80°C bis 150°C für etwa 5 Sekunden bis etwa 5 Minuten erhitzt werden. Das kann durchgeführt werden durch Dampfinjektion, durch Autoklaven oder durch Wärmetauscher; beispielsweise einen Plattenwärmetauscher. Die flüssige Mischung kann dann auf etwa 60°C bis etwa 85°C abgekühlt werden, beispielsweise durch Entspannungskühlung. Die flüssige Mischung kann dann wiederum homogenisiert werden; beispielsweise in zwei Stufen von etwa 7 MPa bis etwa 40 MPa in der ersten Stufe und etwa 2 MPa bis etwa 14 MPa in der zweiten Stufe. Die homogenisierte Mischung kann dann weiter abgekühlt werden, um irgendwelche wärmeempfindlichen Bestandteile zuzusetzen, wie beispielsweise Vitamine und Mineralstoffe. Der pH und der Feststoffgehalt der homogenisierten Mischung wird üblicherweise zu diesem Zeitpunkt standardisiert.
Wenn es gewünscht wird, eine pulverförmige Formulanahrung herzustellen, wird die homogenisierte Mischung in eine geeignete Trockenvorrichtung überführt, wie beispielsweise einen Sprühtrockner oder Gefriertrockner, und in ein Pulver überführt. Das Pulver sollte einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als etwa 5 Gew.-% aufweisen.
Wenn gewünscht wird, eine flüssige Formulanahrung herzustellen, wird die homogenisierte Mischung vorzugsweise aseptisch in geeignete Behälter abgefüllt. Das aseptische Befüllen der Behälter kann durchgeführt werden durch Vorerhitzen der homogenisierten Mischung (beispielsweise auf etwa 75 bis 85°C) und anschließende Dampfinjektion in die homogenisierte Mischung, um die Temperatur auf etwa 140 bis 160°C zu erhöhen, beispielsweise auf etwa 150°C. Die homogenisierte Mischung kann dann abgekühlt werden, beispielsweise durch Entspannungskühlung, auf eine Temperatur von etwa 75 bis 85°C. Die homogenisierte Mischung kann dann homogenisiert werden, weiter auf etwa Raumtemperatur abgekühlt werden und in Behälter gefüllt werden. Eine geeignete Apparatur zur Durchführung einer aseptischen Abfüllung dieser Art ist kommerziell erhältlich. Die flüssige Formulanahrung kann in Form einer zum Verfüttern fertigen Formulanahrung mit einem Feststoffgehalt von etwa 10 bis etwa 14 Gew.-% vorliegen, oder sie kann in Form eines Konzentrats vorliegen; üblicherweise mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 bis etwa 26 Gew.-% Den flüssigen Formulanahrungen können Aromen zugesetzt werden, so dass die Formulanahrungen in Form von bequemen, aromahaltigen, trinkfertigen Getränken bereitgestellt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann ein übliches Lebensmittelprodukt mit dem Bakterienstamm gemäß der vorliegenden Erfindung angereichert werden. Beispielsweise eine fermentierte Milch, ein Joghurt, ein Frischkäse, eine eingelabte Milch, ein Süßigkeitenriegel, Frühstückscerealien-Flocken oder -Riegel, Drinks, Milchpulver, Produkte auf Sojabasis, fermentierte Produkte auf Nicht-Milchbasis oder Nahrungsergänzungen für die klinische Ernährung.
In einer weiteren Ausführungsform kann eine ernährungsmäßig vollständige Haustierfutterzusammensetzung hergestellt werden. Sie kann vorliegen in pulverisierter, getrockneter Form, als halbfeuchtes oder nasses, gekühltes oder bei Raum temperatur lagerstabiles Haustiernahrungsprodukt. Es kann sich auch um diätetische Ergänzungen für Haustiere oder um pharmazeutische Zusammensetzungen handeln. Diese Haustiernahrungen können hergestellt werden, wie üblich ist. Abgesehen von dem Bakterienstamm können diese Haustiernahrungen irgendeines oder mehrere von einer Stärkequelle, einer Proteinquelle und einer Lipidquelle beinhalten.
Geeignete Stärkequellen sind beispielsweise Körner und Hülsenfrüchte wie Mais, Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Soja und Mischungen davon. Geeignete Proteinquellen können ausgewählt werden aus irgendeiner geeigneten tierischen oder pflanzlichen Proteinquelle; beispielsweise Fleisch und Mehl, Geflügelmehl, Fischmehl, Sojaproteinkonzentraten, Milchproteinen, Gluten und dergleichen. Für ältere Tiere ist es bevorzugt, dass die Proteinquelle ein Protein hoher Qualität enthält. Geeignete Lipidquellen schließen ein Fleischprodukte, tierische Fette und pflanzliche Fette. Ferner können verschiedene andere Bestandteile, beispielsweise Zucker, Salz, Gewürze, Würzmittel, Vitamine, Mineralstoffe, Aromatisierungsmittel und dergleichen nach Wunsch in die Haustiernahrung inkorporiert werden.
Für getrocknete Haustiernahrung ist ein geeignetes Verfahren die Kochextrusion, obwohl auch ein Backen oder irgendwelche andere geeignete Verfahren zur Anwendung kommen können. Wenn die getrocknete Haustiernahrung kochextrudiert ist, wird es üblicherweise in Form eines Happens bereitgestellt. Wenn ein Präbiotikum verwendet wird, kann das Präbiotikum vor der Verarbeitung mit den anderen Bestandteilen der getrockneten Haustiernahrung vermischt werden. Ein geeignetes Verfahren wird beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 850 569 , deren Inhalt durch Bezugnahme hierin inkorporiert wird. Wenn ein probiotischer Mikroorganismus verwendet wird, wird der Organismus am besten auf die getrocknete Haustiernahrung aufgebracht oder in diese eingeführt. Ein geeignetes Verfahren wird beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 862 863 , deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin inkorporiert wird.
Für nasse Lebensmittel können die Verfahren, die in den US-Patenten 4 781 939 und 5 132 137 beschrieben werden, dazu verwendet werden, simulierte Fleischprodukte herzustellen. Die Offenbarungen dieser Patente werden durch Bezugnahme inkorporiert. Andere Arbeitsweisen zur Herstellung von Produkten vom Brockentyp können ebenfalls verwendet werden; beispielsweise das Kochen in einem Dampfofen. Alternativ können Produkte vom Laibtyp dadurch hergestellt werden, dass man ein geeignetes Fleischmaterial unter Erzeugung einer Fleischemulsion emulgiert, geeignete Geliermittel zugibt und die Fleischemulsion vor dem Abfüllen in Dosen oder andere Behälter erhitzt.
Die Menge an Präbiotikum in dem Lebensmittelprodukt beträgt vorzugsweise etwa 20 Gew.-%, insbesondere etwa 10 Gew.-%. Beispielsweise kann das Präbiotikum etwa 0,1% bis etwa 5 Gew.-% des Haustiernahrungsmittels bilden. Bei Haustiernahrungen, die Chicorée als Präbiotikum verwenden, könnte Chicorée so eingearbeitet werden, dass er etwa 0,5% bis etwa 10 Gew.-% der zugeführten Mischung ausmacht; stärker bevorzugt etwa 1% bis etwa 5 Gew.-%. Wenn ein probiotischer Mikroorganismus verwendet wird, enthält die Haustiernahrung etwa 10⁴ bis etwa 10¹⁰ Zellen des probiotischen Mikroorganismus pro Gramm der Haustiernahrung; stärker bevorzugt etwa 10⁶ bis etwa 10⁸ Zellen des probiotischen Mikroorganismus pro Gramm. Die Haustiernahrung kann etwa 0,5% bis etwa 20 Gew.-% der Mischung des probiotischen Mikroorganismus enthalten, vorzugsweise etwa 1% bis etwa 6 Gew.-%; beispielsweise etwa 3% bis etwa 6 Gew.-%.
Die Haustiernahrungen können andere aktive Mittel enthalten, wie beispielsweise langkettige Fettsäuren. Geeignete langkettige Fettsäuren schließen ein alpha-Linolsäure, gamma-Linolsäure, Linolsäure, Eicosapentansäure, und Docosahexansäure. Fischöle sind geeignete Quellen für Eicosapentansäure und Docosahexansäure. Borretschöl, Öl aus schwarzen Johannisbeersamen und Nachtkerzenöl sind geeignete Quellen für gamma-Linolsäure. Safloröle, Sonnenblumenöle, Maisöle und Sojaöle sind geeignete Quellen für Linolsäure. Wenn nötig, werden die Haustiernahrungen mit Mineralstoffen und Vitaminen ergänzt, so dass sie ernährungsmäßig vollständig sind.
Gewünschtenfalls kann der Bakterienstamm außerdem verkapselt sein, beispielsweise in einer Zuckermatrix, einer Fettmatrix oder Polysaccharidmatrix.
Die Menge an Haustiernahrung, die durch das Haustier verzehrt werden muss, um eine vorteilhafte Wirkung zu erhalten, hängt ab von der Größe des Haustiers, vom Typ des Haustiers und vom Alter des Haustiers. Eine Menge der Haustiernahrung für die Zufuhr einer täglichen Menge von etwa 10³–10¹⁴ KBE von wenigstens einem Milchsäurebakterien- oder Bifidobakterien-Stamm sollte jedoch üblicherweise geeignet sein. Vorzugsweise werden beispielsweise etwa 10⁹–10¹⁰ KBE/Tag bei Hunden oder 10⁷–10¹⁰ KBE/Tag bei Katzen verabreicht.
Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist insbesondere gedacht für die Verwendung bei der Prophylaxe und Behandlung von Infektionen, die sich auf gramnegative Bakterien beziehen, Endotoxin-produzierende Bakterien wie Helicobacter spp, Samonella spp sowie auch eine bakterielle Fehlbesiedlung des Dünndarms (small intestinal bacterial overgrowth, SIBO), die sich klinisch alle Diarrhöe, intestinale oder systemische entzündliche Erkrankungen oder als Katabolismus und Mangelernährung äußern können.
Diese Verwendung kann insbesondere gedacht sein für die Prophylaxe oder die Behandlung von Infektionen, die sich auf gramnegative Bakterien beziehen, auf Endotoxin-erzeugende Bakterien, wie beispielsweise Helicobacter spp, Samonella spp und auch auf eine bakterielle Fehlbesiedlung des Dünndarms (SIBO), die sich alle als Diarrhöe, intestinale oder systemische entzündliche Erkrankungen oder als Katabolismus und Mangelernährung äußern können.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Illustration angeführt. Alle Prozentangaben erfolgen in Gewicht, es sei denn, es wird etwas anderes angegeben. Den Beispielen geht eine kurze Beschreibung der Figuren voraus.
Figuren
1: Histogramm-Kurven für Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 189 (früher CIDCA 536, CNCM I-2333), die das Binden von FITC-LPS zeigen. A: Kontrolle ohne FITC-LPS. B: Inkubation mit 50 μl/ml FITC-LPS. Es wurden wenigstens 16000 Ereignisse analysiert.
2: Wirkung von Albumin auf die FITC-LPS-Bindung durch Milchsäurebakterien und Bifidobakterien. A: Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 200 (früher CIDCA 538, CNCM I-2334). B: Lactobacillus acidophilus-Stamm NCC 2463 (CNCM I-2623). C: Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 189 (früher CIDCA 536, CNCM I-2333).
3: Die Kinetik des Wachstums und der FITC-LPS-Bindung für den Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 189 (früher CIDCA 536, CNCM-I-2333). Die Werte sind Mittelwerte aus zwei unabhängigen Versuchen.
4: Bindung von LPS durch einen Bifidobacterium-Stamm, nachgewiesen durch Mikroassay zur Bestimmung von 2-Keto-3-desoxyoctonat (KDO) in Lipopolysacchariden. Die Anfangskonzentration der Lösung betrug 100 μg/ml. Die Balken zeigen die Endkonzentration nach der Inkubation der Lösung mit hydrophoben Bifidobakterien-Stämmen NCC 189 und NCC 251 (CNCM I-2168) im Vergleich mit einem nicht-hydrophoben Stamm von Bifidobakterien (NCC 200 (CNCM I-2334)).
5: Entzündungsfördernde Wirkung (IL-8 (ng/ml)) einer LPS-Lösung, die mit hydrophoben Bakterien vorinkubiert wurde, auf HAT-29 Humanepithelzellen.
Kontrollproben von DMEM, Humanmilch (HM) 2%, LPS (2,5 μg/ml) allein, Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 189 (1,5 × 10⁸ KBE/ml) allein wurden im Hinblick auf die stimulatorische Wirkung des Hintergrunds getestet. Testlösungen von LPS + Humanmilch (Quelle für sCDl4) wurden verglichen mit einer Lösung, die enthielt LPS 2,5 μg/ml + HM 2%, vorinkubiert mit Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 189 (1,5 × 10⁸ KBE/ml).
Beispiele
Beispiel 1: Auswahl eines hydrophoben Milchsäurebakteriumstamms gemäß der Erfindung:
Die Auswahl von hydrophoben Bakterien basierte ursprünglich auf der prozentualen Verteilung von Bakterienzellen zwischen einer organischen (hydrophoben) und einer wässrigen Phase. Die Bestimmung der Oberflächen-Hydrophobizität erfolgte unter Verwendung des MATH-Verfahrens, wie es früher schon beschrieben wurde (Pérez, P.F. et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 21–26). Kurz gesagt wurden 2 ml Bakteriensuspension (etwa 10⁸ KBE/ml, PBS) dadurch mit 0,4 ml Xylol extrahiert, dass man sie für 120 s verwirbelte. Man ließ die Phasen durch Dekantieren trennen und es wurde A₆₀₀ der wässrigen Phase gemessen. Die Zelloberflächen Hydrophobizität (%H) wurde errechnet mit der Formel H% = [(A₀ – A)/A₀] × 100, worin A₀ und A die Absorptionsgrade vor und nach der Extraktion mit Xylol sind.
Anschließend wurden Milchsäurebakterien und Bifidobakterien aufgrund ihrer Fähigkeit selektiert, Endotoxin aus einer Lösung zu entfernen, die die Menge an Endotoxin vortäuscht, die im humanen Darm gefunden wird. Die Endotoxin-Mengen wurden mit dem Mikroassay zum Nachweis der 2-Keto-3-desoxyoctonat-Gruppe im Lipopolysaccharid von gramnegativen Bakterien untersucht (Karkhanis Y D, et al., Analytical Chemistry (1978) 85: 595–601).
Bakterien, die mehr als 30% des Endotoxin-Gehalts aus diesen Lösungen entfernten, wurden selektiert. Die in diesem Assay getesteten nicht-hydrophoben Bakterien waren nicht in der Lage, den Ausgangsgehalt an Endotoxin zu modifizieren.
Beispiel 2: In vitro-Wirkung von Milchsäurebakterien als Endotoxin-Fänger
Die Wechselwirkung zwischen LPS aus Escherichia coli und Milchsäurebakterien, die unterschiedliche Oberflächeneigenschaften aufwiesen, wurde untersucht, wobei man ausgewählte Bakterien mit mehr als 80% H sowie einige nicht-hydrophobe "negative" Kontrollen verwendete, wobei die Wechselwirkung mit fluoreszenzmarkiertem Endotoxin mittels Durchflusszytometrie durchgeführt wurde.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen
Der Stamm Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM I-2623) stammte aus der Nestec Sammlung (Lausanne, Schweiz). Die Stämme Bifidobacterium bifidum NCC 189 (früher CIDCA 536, I-2333) und Bifidobacterium bifidum NCC 200 (früher CIDCA 538, (CNCM I-2334) stammten aus der Sammlung des Centro de Investigacion y Desarrollo en Criotecnologia de Alimentos (La Plata, Argentinien). Gefrorene Suspensionen (–80°C), konserviert mit 10% (Vol/Vol) Glycerin, wurden vor den Versuchen reaktiviert, wenn sie sich in MRS-Brühe befanden. Alle Kulturen wurden bei 37°C unter anaeroben Bedingungen (BBL GasPak Plus) gehalten.
FITC-LPS-Bindung
Das Lipolysaccharid und das FITC-markierte Lipopolysaccharid waren vom Escherichia coli Serotyp 0111:B4 (Skelly, R.R. et al., 1979, Infect. Immun. 23: 287–293), und wurden von Sigma erworben. Vorratslösungen, die 1000 μl/ml enthielten, wurden in destilliertem Wasser hergestellt und auf geeignete Weise verdünnt.
Bakterienkulturen wurden dreimal mit PBS gewaschen, und die Suspensionen wurden auf 10⁷ KBE/m1 standardisiert. 400 μl wurden mit unterschiedlichen Mengen FITC-LPS oder LPS vermischt, um Konzentrationen zu erhalten, die von 0 bis 50 μg/ml in der Reaktionsmischung reichten. Die Inkubationen wurden durchgeführt bei 4°C oder 37°C für 30 Minuten, und dann wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit Paraformaldehyd 1% (Vol/Vol) fixiert, und zwar innerhalb von 30 Minuten bei 4°C. Die durchflusszytometrische Analyse erfolgt unter Verwendung eines blau-grünen Anregungslichts (FACSan^TM)
Oberflächen-Hydrophobizität
Die Bestimmung der Oberflächen-Hydrophobizität erfolgte unter Verwendung des MATH-Verfahrens, wie es früher beschrieben wurde (Pérez, P.F. et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 21–26). Kurz gesagt wurden 2 ml einer Bakteriensuspension (etwa 10⁸ KBE/ml, PBS) mit 0,4 ml Xylol dadurch extrahiert, dass man sie für 120 s verwirbelte. Man ließ die Phasen durch Dekantieren trennen, und es wurde A₆₀₀ der wässrigen Phase gemessen. Die Zelloberflächen-Hydrophobizität (%H) wurde errechnet mit der Formel H% = [(A₀ –A)/A₀] × 100, worin A₀ und A die Absorptionsgrade vor und nach der Extraktion mit Xylol sind.
ERGEBNISSE
Die Oberflächenhydrophobizitäten von untersuchten Stämmen sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Werte betrugen 93 und 96% für die Stämme Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM I-2623) bzw. für Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM I-2333), während der Stamm Bifidobacterium infantis NCC 200 (CNCM I-2334) nicht hydrophob war und Werte um etwa 3% zeigte.

Stamm Hydrophobizität %

NCC 2463 (CNCM I-2623) 93 ± 3

NCC 189 (CNCM I-2333) 96 ± 3

NCC 200 (CNCM I-2334) 3 ± 2

Tabelle 1: Hydrophobizität von untersuchten Stämmen. Die Werte sind Mittelwerte von wenigstens 3 Bestimmungen.
Die Inkubation von Stamm NCC 189 mit 50 μg/ml von FITC-markiertem LPS verschiebt ganz klar die bakterielle Population in eine fluoreszierende Zone. Ereignisse, die auf der rechten Seite des Graphen liegen (Marker M1) stellen 90% der erfassten Population (1B) dar. Bei Suspensionen, die ohne FITC-LPS inkubiert wurden, lagen nur 2% der Fälle bei einer unterschiedlichen Bindungsfähigkeit.
Tabelle 2 (weiter unten) zeigt, dass die FITC-LPS-Bindung dosisabhängig ist. 5 und 15% FITC(+)Zellen wurden für die Stämme NCC 200 gefunden. Andererseits zeigt der Stamm NCC 189 etwa 95% FITC(+)Zellen. Zur Sättigung kommt es bei etwa 10 μg/ml FITC-LPS. Die Zugabe von Albumin, einem Lipidbinder, führt zu einer klaren Verminderung des FITC(+)-Verhältnisses bei allen untersuchten Stämmen (2). Der Stamm CIDCA 536 zeigt jedoch in Gegenwart von 0,4% Albumin und 50 μg/ml FITC-LPS etwa 30% FITC(+)Zellen (2C). Außerdem wurden für diesen Stamm 10% FITC(+)Zellen mit Albuminkonzentrationen bis hinauf zu 3% gefunden. Divalente Kationen (Ca²⁺, 0,9 mM, und Mg²⁺, 0,5 mM) modifizierten die Bindung nicht (Daten nicht gezeigt).

FITC-LPS (μg/ml) Stamm

NCC 189 NCC 200

0 0,1 0,2

1 88,1 0,7

10 92,1 5,2

20 92,8 5,9

30 93,9 3,7

40 94,7 4,6

50 94,8 4,6

Tabelle 2: Prozent FITC(+)Bakterien bei unterschiedlichen Konzentrationen von FITC-LPS. Es wurden wenigstens 30.000 Ereignisse analysiert.
Das Binden von FITC-LPS war für den Bifidobacterium bifidum-Stamm NCC 189 (früher CIDCA 536, CNCM I-2333) stark von der Wachstumsphase abhängig (3). Bakterien, die in einer stationären Phase geerntet wurden, zeigten ein hohes Verhältnis an FITC(+)Zellen. Diese Werte sinken während der lag-Phase dramatisch und wurden während des Wachstums zunehmend wieder hergestellt. Es wurden keine Unterschiede zwischen dem Binden bei 4°C und 37°C festgestellt.
In der Summe zeigen hoch hydrophobe Stämme FITC(+)Zellen, die für den Stamm NCC 189 etwa 95% erreichen. Der nicht hydrophobe Stamm NCC 200 erreicht nie Werte von mehr als 5%. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von LPS mit der Oberflächen-Hydrophobizität korreliert.
Diese Ergebnisse zeigen ganz klar, dass hydrophobe Bakterien FITC-markiertes Endotoxin binden und dadurch fluoreszierend werden. Bei einer Konzentration von 10 μg/ml Endotoxin werden mehr als 90% der hydrophoben Zellkulturen fluoreszierend, und zwar gemäß Nachweis mit Durchflußzytometrie; im Gegensatz dazu wurden weniger als 10% der nicht-hydrophoben Bakterienzellen bei ähnlichen Endotoxin-Konzentrationen positiv.
Wenn hydrophobe Kulturen in Medien eingeführt wurden, die Endotoxin in einer Konzentration im Bereich zwischen 30 und 90 μg/ml enthielten, entfernten Bakterienkulturen bei einer Konzentration von 10⁷ bis 10⁸ Bakterien pro ml wenigstens 20% des vorhandenen Endotoxins. Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung von radioaktiv markiertem Endotoxin bestätigt.
Beispiel 3: Experimente mit humanen immunkompetenten Zellen
Die Löschung der pro-inflammatorischen Reaktion in humanen immunkompetenten Zellen, die durch Endotoxin ausgelöst wird, aufgrund der Anwesenheit von hydrophoben Zellen im Kultursystem wurde im Vergleich mit nicht-hydrophoben Bakterien untersucht.
Hydrophobes Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM I-2333) und nicht-hydrophobes Bifidobacterium infantis NCC 200 (CNCM I-2334) wurden in einer Lösung inkubiert, die eine definierte Menge an Endotoxin enthielt, und zwar bestimmt nach dem KDO-Verfahren (vgl. Beispiel 1) (4).
Die Endotoxin-Präsenz war nach der Inkubation mit der Bakteriensuspension im Falle des hydrophoben Stammes deutlich vermindert, während im Falle des nicht-hydrophoben Stammes keine Veränderungen beobachtet wurden.
Beispiel 4: Funktionelle Studien für hydrophobe Bakterien
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Gewaschene Bakterien wurden in DMEM-glukosereich (AMIMED) resuspendiert und mit LPS aus Escherichia coli O111: B4 (Sigma) in einer Endkonzentration von 2,5 μg/ml vorinkubiert. Nach dem Zentrifugieren wurden 200 μl Überstand oder resuspendiertes Bakterienpellet dazu verwendet, HT-29 Epithelzellen zu stimulieren.
Nach einer 20-stündigen Kultur bei 37°C wurde der HT-29-Zellkulturüberstand auf das Vorhandensein von IL-8 untersucht, und zwar unter Anwendung einer ELISA-Technik.
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Die proinflammatorische Aktivität von LPS ist signifikant vermindert, wenn eine LPS-Lösung mit hydrophoben Bakterien vorinkubiert wird. Nach der Zentrifugation ist der Überstand, der zu einer humanen Epithelzellkultur zugegeben wird (in Gegenwart von Humanmilch, da die LPS-Stimulation vom Vorhandensein von sCD14 abhängig ist) signifikant im Vergleich mit dem Überstand vermindert, der nicht mit den hydrophoben Bakterien vorinkubiert wurde.
Beispiel 5: Kleinkinder-Formula-Nahrung
Um eine Kleinkinder-Formula-Nahrung zu erhalten, stellten wir die folgende Mischung her, die auf 100 ml der Formula-Nahrung enthielt: 0,5 bis 5%, vorzugsweise 2% Peptide, 0,2 bis 10%, vorzugsweise 4% Fett, 1 bis 25%, vorzugsweise 8% nicht-blähende Kohlenhydrate (einschließlich Laktose 65%, Maltodextrin 20%, Stärke 15%), sowie wenigstens 10⁶ KBE/ml der folgenden Stämme: Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM I-2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM I-2333), Bifidobacterium bifidum CNCM I-2335, Bifidobacterium adolescentis CNCM I-2168, in Kombination mit Spuren von Vitaminen und Oligo-Elementen, um die täglichen Bedürfnisse zu decken, sowie 0,01 bis 2%, vorzugsweise 0,3%, Mineralstoffe, sowie 50 bis 90%, vorzugsweise 75% Wasser.
Beispiel 6: Verwendung von hydrophoben Milchsäurebakterien gemäß der Erfindung in Molkereiprodukten
Einer oder mehrere Stämme von Bifidobacterium bifidum (CNCM I-2333), Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM I-2623), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (CNCM I-2335) oder Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM I-2168) gemäß der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung von fermentierten Joghurt-artigen Milchprodukten verwendet werden.
Zu diesem Zwecke wird 1 l eines Milchprodukts hergestellt, das 2,8% Fette enthält und ergänzt ist mit 2% Magermilchpulver und 6% Saccharose, wird pasteurisiert bei 96°C für 30 Minuten, und seine Temperatur wird dann auf 42°C abgesenkt. Vorkulturen eines nicht-verdickenden Stamms von Streptococcus thermophilus und eines nicht-viskosen Stammes von Lactobacillus bulgaricus werden in einem sterilen MSK-Kulturmedium reaktiviert, das 10% eines rekonstituierten Milchpulvers und 0,1% eines kommerziellen Hefeextrakts enthielt.
Eine Vorkultur von einem oder mehreren der Stämme wird ebenfalls in einem Medium reaktiviert, das 10% rekonstituiertes Milchpulver und 0,1% eines kommerziellen Hefeextraktes mit 1% Saccharose enthielt. Das pasteurisierte Milchprodukt wird dann mit 1% einer jeden dieser reaktivierten Vorkulturen beimpft, und man lässt das Milchprodukt bei 32°C fermentieren, bis der pH einen Wert von 4,5 erreicht. Es werden auf diese Weise fermentierte Milchjoghurt-artige Produkte hergestellt und bei 4°C gelagert.
Beispiel 7: Trockenes Hundefutter
Eine Futtermischung wird hergestellt aus etwa 58 Gew.-% Mais, etwa 5,5 Gew.-% Maisgluten, etwa 22 Gew.-% Hühnermehl, 2,5% getrocknetem Chicoree, durch Stämme von Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM I-2623) fermentierter Milch, so dass die entsprechende Menge für den Hund etwa 10⁹–10¹⁰ KBE/pro Tag beträgt, sowie Salzen, Vitaminen und Mineralstoffen, die den Rest bilden.
Die Futtermischung wird einem Vorkonditionierer zugeführt und angefeuchtet. Das angefeuchtete Einsatzprodukt wird dann einem Kochextruder zugeführt und verkleistert. Die verkleisterte Matrix, die den Extruder verlässt, wird durch eine Formdüse gedrückt und extrudiert. Das Extrudat wird in Stücke geschnitten, die für die Verfütterung an Hunde geeignet sind, bei etwa 110°C für etwa 20 Minuten getrocknet und unter Bildung von Pellets abgekühlt.
Dieses getrocknete Hundefutter kann die Gesundheit des Haustiers verbessern, und stellt eine Vorsorge gegen Gesundheitsstörungen dar, die bei Haustieren mit Endotoxinen zu tun haben.

Claims

Verwendung von wenigstens einem Stamm von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rahmnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactis, Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis mit Oberflächeneigenschaften, die durch eine prozentuale Hydrophobizität (%H) von wenigstens 80 gekennzeichnet sind, zur Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Prävention oder Behandlung von Endotoxin-vermittelten und/oder -assoziierten gesundheitlichen Störungen bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Milchsäurebakterien oder Bifidobakterien eine prozentuale Hydrophobizität (%H) von 85 bis 100% aufweisen.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, wobei der Stamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I-2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM-I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (CNCM-I-2335), Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM-I-2168) und Bifidobacterium lactis (ATCC27536).
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Milchsäurebakterien so verwendet werden, dass die der Person zur Verfügung stehende Menge pro Tag etwa 10³ bis 10¹⁴ KBE/Tag beträgt.
Isolierter Stamm von Milchsäurebakterilen oder Bifidobakterien, der Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I-2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM-I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (CNCM-I-2335), oder Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM-I-2168) ist.
Humanlebensmittel- oder Haustierfutterzusammensetzung, die wenigstens einen Stamm von Milchsäurebakterien und/oder Bifidobakterien enthält, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rahmnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactis, Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis mit Oberflächeneigenschaften, die durch eine prozentuale Hydrophobizität (%H) von wenigstens 80 gekennzeichnet sind, der mit einem verzehrbaren Träger oder einer pharmazeutischen Matrix assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Milchsäurebakterien oder Bifidobakterien eine prozentuale Hydrophobizität (%H) von 85 bis 100% aufweisen.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 6 und 7, wobei der Stamm in seiner lebensfähigen oder inaktivierten Form verwendet wird.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Milchsäurebakterien- oder Bifidobakterien-Stamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I-2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM-I-2333), Bifido bacterium bifidum NCC 235 (CNCM-I-2335), Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM-I-2168) und Bifidobacterium lactis (ATCC27536).
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die der der Person zur Verfügung gestellte Menge des Milchsäurebakterien- oder Bifidobakterien-Stammes, etwa 10³ bis 10¹⁴ KBE/Tag entspricht.
Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 10, die Endotoxin-vermittelte und/oder -assoziierte Gesundheitsstörungen vermindert, verhindert oder behandelt.