PT1359924E

PT1359924E - Ligação a endotoxina por bactérias de ácido láctico e bifidobactérias

Info

Publication number: PT1359924E
Application number: PT02719762T
Authority: PT
Inventors: Eduardo Schiffrin; Guillermo Kociubinski
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 2001-02-06
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2007-12-07
Also published as: JP5973701B2; NO20033372L; BR0207019A; DE60222856T2; US20100136662A1; CN1501805A; EP1359924A1; US20040115178A1; CN1250232C; JP2004531477A; NZ527493A; NO20033372D0; HK1066174A1; KR20030076652A; JP2014062104A; WO2002062360A1; EP1359924B1; DE60222856D1; ATE375164T1; JP2011246483A

Description

DESCRIÇÃO "LIGAÇÃO A ENDOTOXINA POR BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁCTICO E BIFIDOBACTÉRIAS" A presente invenção refere-se à utilização de bactérias do ácido láctico e/ou bifidobactérias que são hidrofóbicas para a preparação de uma composição alimentar destinada à prevenção ou ao tratamento de distúrbios mediados e/ou associados a endotoxina. A invenção refere-se também a uma composição preparada com as mesmas.

Antecedentes da invenção

As toxinas que induzem sepcia têm sido encontradas associadas a bactérias patogénicas, virus, plantas e veneno. Entre as toxinas bacterianas bem descritas estão as endotoxinas ou lipopolissacáridos (LPS) das bactérias gram-negativas. Estas moléculas são glicolipidos que são ubíquos na membrana externa de todas as bactérias gram-negativas, que se crê serem responsáveis por sepcia de gram-negativas. Este tipo de sepcia é um estado extremamente comum e é frequentemente fatal.

Foram tentadas várias abordagens para tratar a sepcia. Estas incluem a utilização de anticorpos contra LPS, utilização de anticorpos contra o factor de necrose tumoral, utilização de um receptor de TNF solúvel, utilização de um receptor de interleucina-1(IL-1) solúvel, para designar alguns. Embora cada abordagem possua alguma eficácia, os resultados globais têm sido decepcionantes. 1

Outros tentaram conceber e estudar proteínas que se ligam a LPS/endotoxina, e relatos ilustrativos destas tentativas aparecem em Rustici, A. et al. Science (1993) 259:361-364; Matsuzaki, K. et al. Biochemistry (1993) 32:11704-11710; Hoess, A. et al. EMBO J (1993) 12:3351-3356; e Elsbach, P. et al. Current Opinion in Immunology (1993) 5:103-107. De facto, após a introdução de LPS no sangue, esta pode ligar-se a uma proteína denominada proteína de ligação a lipopolissacárido (LBP) . A inibição de LBP, e. g., com um anticorpo anti-LBP, foi sugerida como terapeuticamente útil para o tratamento de sepcia mediada por endotoxina (Pedido Internacional de Patente N.° PCT/US90/04250, de 30 de Julho, 1990). Também, trabalhos de vários laboratórios mostraram que as lipoproteínas do plasma, particularmente as lipoproteínas de elevada densidade (HDL), ligam-se e neutralizam LPS (Skarnes et al., 1968, J. Bacteriology 95:2031; Flegel et al., 1993, Infect. Immunol. 61(12):5140) e que estas partículas podem constituir a actividade neutralizante de LPS no plasma.

Os tratamentos anteriores para as doenças mediadas e/ou associadas a endotoxina têm sido retrospectivos (í. e., após desenvolvimento de doença clínica) e têm-se limitado a intervenção quimioterapêutica. As medidas de prevenção não foram atingidas com tais tratamentos.

Deste modo, existe a necessidade na técnica de um agente eficaz para neutralizar a endotoxina gram-negativa (í. e., LPS), de modo a evitar ou aliviar os sintomas de sepcia e choque séptico. 2

As bactérias hidrofóbicas do ácido láctico e bifidobactérias da presente invenção proporcionam compostos adicionais que são capazes de se ligar a endotoxina e melhorar/prevenir os seus efeitos.

Sumário da Invenção

Deste modo, a presente invenção refere-se à utilização de, pelo menos, uma estirpe de bactérias do ácido láctico e/ou bifidobactérias que possui propriedades de superfície hidrofóbicas, para a preparação de uma composição destinada à prevenção ou tratamento de distúrbios mediados e/ou associados a endotoxina.

De facto, verificou-se, surpreendentemente, que algumas bactérias do ácido láctico e bifidobactérias, particularmente as que possuem superfície hidrofóbica, possuem a capacidade de ligar endotoxinas. Assim, permitindo a sua utilização como agentes eficientes para a prevenção de choque endotóxico e sepcia de origem gastrointestinal, translocação bacteriana, enterocolite necrosante, doença inflamatória do intestino, infecções intestinais, endotoxemia crónica associada ou promotora de inflamação catabólica e sistémica.

As bactérias hidrofóbicas do ácido láctico ou bifidobactérias possuem uma percentagem de hidrofobicidade (%H) de, pelo menos, 80, e de modo mais preferido de 85 a 100 % H.

Numa forma de realização preferida, a estirpe é seleccionada do grupo consistindo em Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalis, 3

Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rahmnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactís, Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma estirpe isolada de bactérias do ácido láctico ou bifidobactérias possuindo propriedades de superfície hidrofóbicas, que foi seleccionada pela sua capacidade para ligar endotoxina ou co-agregar com bactérias gram-negativas.

Num outro aspecto, a invenção proporciona uma composição alimentar para humanos ou animais de companhia para evitar ou tratar distúrbios mediados e/ou associados a endotoxina, que contêm, pelo menos, uma estirpe de bactérias do ácido láctico e/ou bifidobactérias possuindo as características acima, associada com um suporte ingerível ou uma matriz farmacêutica.

Esta composição apresenta a vantagem de diminuir o sobrecrescimento de bactérias no intestino delgado e diminuir a fuga de endotoxina do tracto gastrointestinal para o meio interno, um distúrbio frequente encontrado em animais de companhia que pode causar episódios de diarreia, malnutrição e inflamação intestinal e sistémica, por exemplo.

Descrição detalhada da invenção

Na descrição que se segue, "NCC" designa Nestlé Culture Collection (Nestlé Research Centre, Vers-chez-les-Blanc, Lausanne, Suíça). 4

Em relação ao primeiro objectivo da presente invenção, este refere-se à utilização de, pelo menos, uma estirpe de bactérias do ácido láctico e/ou bifidobactérias que possuem propriedades de superfície hidrofóbicas, para a preparação de uma composição destinada à prevenção ou ao tratamento de distúrbios mediados e/ou associados a endotoxina.

De facto, foi surpreendentemente verificado que alqumas bactérias do ácido láctico e bifidobactérias, particularmente as que possuem superfície hidrofóbica, possuem a capacidade de ligar endotoxina.

De facto, a estirpe bacteriana, de acordo com a invenção, possui a capacidade para ligar endotoxina na parede celular hidrofóbica e, deste modo, eliminar este produto pró-inflamatório das bactérias gram-negativas que, de outra forma, podem translocar-se do lúmen do tracto gastrointestinal para o sangue e, deste modo, desencadear reacções inflamatórias e, em casos muito graves, choque endotóxico.

As bactérias do ácido láctico ou bifidobactérias, de acordo com a invenção, foram seleccionadas entre estirpes adequadas para o consumo animal, em relação à sua percentagem de hidrofobicidade (%H), como descrito em A.G. Zavaglia et al., Journal of Food Protection, Vol. 61, N.° 7, 1998, p.865-873. A estirpe bacteriana, de acordo com a invenção, possui uma %H de, pelo menos, 80, e de modo mais preferido, de 85 a 100 %H. 5 A determinação da hidrofobicidade da superfície foi efectuada utilizando o método MATH como previamente descrito (Pérez. P.F. et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64:21-26). Resumidamente, 2 mL de suspensão bacteriana (cerca de 108 CFU/mL, PBS) foram extraídos com 0,4 mL de xileno, por agitação em vórtice durante 120 s. As fases foram deixadas separar por decantação e foi medida a A60o da fase aquosa. A hidrofobicidade da superfície celular (%H) foi calculada com a fórmula H%= [ (A0-A) /A0] xlOO em que A0 e A são absorvências antes e depois da extracção com xileno, respectivamente.

Numa forma de realização preferida, a estirpe bacteriana pode ser seleccionada do grupo consistindo em Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalis, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rahmnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactis Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis.

Numa forma de realização muito preferida, a estirpe pode ser Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I 2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (previamente CIDCA 536, CNCM-I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (previamente CIDCA 533, CNCM-I-2335), Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM 1-2168), Bifidobacterium lactis (ATCC27536), por exemplo.

Entre as várias estirpes seleccionadas, de acordo com a presente invenção, as estirpes seguintes foram depositadas, a título de exemplo, sob o Tratado de Budapeste na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut 6

Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França, Lactobacillus acidophilus NCC 2463 em 2-02-2001 sob a referência CNCM 1-2623, e Bifidobacterium bifidum NCC 189 e NCC 235 em 12-10-99 sob as referências CNCM-I-2333 e CNCM 1-2335, respectivamente. A Bidifobacterium adolescentis NCC 251 foi depositada em 15-03-99 sob a referência CNCM 1-2168. A estirpe de Bifidobacterium lactis (Bbl2)(ATCC27536) é proporcionada por Hansen (Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Alie, P.O. Box 407, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca). Possui uma hidrofobicidade de 89 % H. A estirpe bacteriana, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizada para a preparação de composições destinadas ao melhoramento da saúde humana ou animal, particularmente para a prevenção ou tratamento de distúrbios relacionados com endotoxina em humanos e animais de companhia. A estirpe bacteriana pode ser utilizada como agente eficiente para prevenção de choque endotóxico e sepcia de origem gastrointestinal, translocação bacteriana, enterocolite necrotizante, doença inflamatória do intestino, infecções intestinais, e endotoxemia crónica associada ou promotora de inflamação catabólica e sistémica, por exemplo. A estirpe bacteriana, de acordo com a invenção, pode ser utilizada na sua forma viável ou inactivada.

Numa forma de realização preferida, a estirpe de bactérias do ácido láctico é utilizada na presença do seu meio de crescimento fermentado. O referido meio pode ser esterilizado isoladamente ou com um alimento, extrudado ou seco por dispersão, arrefecido ou estabilizado, por exemplo. 7 A estirpe bacteriana pode ser utilizada de modo a que a quantidade disponível para o indivíduo possa corresponder a cerca de 103-1014 cfu por dia. Esta quantidade depende do peso do indivíduo e é, de modo preferido, cerca de 109-1012 cfu/dia para humanos e 107-1010 cfu/dia para animais de companhia.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estirpe isolada de bactérias do ácido láctico ou bifidobactérias possuindo propriedades de superfície hidrofóbicas e possuindo a capacidade para ligar endotoxina ou co-agregar com bactérias gram-negativas. A capacidade de uma estirpe bacteriana, de acordo com a presente invenção, ligar endotoxina, pode ser facilmente medida utilizando endotoxina marcada com FITC, medindo a associação de endotoxina marcada radioactivamente a células bacterianas, neste caso, a estrutura molecular da endotoxina não é alterada, conforme comparado com as modificações possíveis que a molécula pode sofrer após conjugação com o FITC (ver exemplos).

De modo preferido, é medida a capacidade da estirpe bacteriana remover endotoxina de uma solução que corresponde à quantidade de endotoxina encontrada no intestino humano. Por exemplo, os níveis de endotoxina foram examinados com o microensaio para a detecção do grupo 2-ceto-3-desoxioctonato no lipopolissacárido de bactérias gram-negativas (Karkhanis Y D, et al., Analytical Chemistry (1978) 85:595-601). De um modo preferido, foram seleccionadas as bactérias que removem mais de 30% do conteúdo em endotoxina destas soluções. As bactérias não-hidrofóbicas testadas neste ensaio foram incapazes de modificar o conteúdo inicial de endotoxina (ver exemplos).

Tal estirpe bacteriana pode ser utilizada como descrito acima, e particularmente como agente eficiente para prevenção de choque endotóxico e sepcia de origem gastrointestinal, translocação bacteriana, enterocolite necrosante, doença inflamatória do intestino, infecções intestinais, endotoxemia crónica associada ou promotora de inflamação catabólica e sistémica, por exemplo.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição alimentar para humanos ou para animais de companhia, contendo, pelo menos, uma estirpe isolada de bactérias do ácido láctico e/ou bifidobactérias, possuindo a referida estirpe as caracteristicas acima associada com um suporte ingerível ou uma matriz farmacêutica. A estirpe pode ser seleccionada como descrito acima.

De modo preferido, as bactérias do ácido láctico ou bifidobactérias podem ser administradas como um suplemento da dieta normal ou como um componente de um alimento humano ou de animais de companhia nutricionalmente completo. A composição alimentar para humanos ou animais de companhia pode compreender, pelo menos, a estirpe de bactérias do ácido láctico e/ou bifidobactérias, como descrito acima, de modo a que a quantidade disponível para o indivíduo possa corresponder a cerca de 103-1014 cfu por dia. Esta quantidade depende do peso do indivíduo, e é, de modo preferido, de cerca de 109-1012 cfu/dia para humanos e 107-1010 cfu/dia para animais de companhia. 9 0 alimento para humanos pode estar na forma de uma fórmula nutricional, uma fórmula infantil, produtos à base de leite, produtos lacticínios, produtos à base de cereais, por exemplo. Para preparar este produto ou composição alimentar, a estirpe bacteriana, como descrito acima, pode ser incorporada num alimento, tal como cereais em pó, leite em pó, um iogurte, durante a sua preparação, por exemplo.

Numa forma de realização, pode ser preparada uma fórmula nutricional compreendendo uma fonte de proteina e, pelo menos, uma estirpe bacteriana de acordo com a invenção. As proteínas dietéticas são, de modo preferido, utilizadas como uma fonte de proteina. As proteínas dietéticas podem ser qualquer proteína dietética adequada; por exemplo, proteínas animais (tais como proteínas do leite, proteínas da carne e proteínas do ovo), proteínas vegetais (tais como proteínas de soja, trigo, arroz ou ervilha), misturas de aminoácidos livres, ou combinação destes. As proteínas do leite, tais como caseína, proteínas do soro de leite e proteínas da soja são particularmente preferidas. A composição também pode conter uma fonte de hidratos de carbono e uma fonte de gordura.

Se a fórmula nutricional incluir uma fonte de gordura, a fonte de gordura proporciona, de modo preferido, cerca de 5% a cerca de 55% da energia da fórmula nutricional; por exemplo, cerca de 20% a cerca de 50% da energia. Os lípidos que constituem a fonte de gordura podem ser quaisquer gorduras ou misturas de gorduras adequadas. As gorduras vegetais são particularmente adequadas; por exemplo, óleo de soja, óleo de palma, óleo de coco, óleo de açafroa, óleo de girassol, óleo de milho, óleo de canola, lecitina, e semelhantes. As gorduras animais, tais como gorduras do leite, podem ser também adicionadas, se desejado. 10

Se a fórmula nutricional incluir uma fonte de hidratos de carbono, a fonte de hidratos de carbono proporciona, de modo preferido, cerca de 40% a cerca de 80% da energia da fórmula nutricional. Podem ser utilizados quaisquer hidratos de carbono, por exemplo, sacarose, lactose, glucose, frutose, sólidos de xarope de milho e maltodextrinas, e misturas destes.

Também pode ser adicionada fibra dietética, se desejado. Estão disponíveis vários tipos de fibra dietética. As fontes de fibra dietética adequadas, entre outras, podem incluir soja, ervilha, aveia, pectina, goma de guar, e goma arábica. Se utilizada, a fibra dietética compreende, de modo preferido, até cerca de 5% da energia da fórmula nutricional. As vitaminas e minerais adequados podem ser incluídos na fórmula nutricional da forma convencional a fim de cumprir as linhas de orientação apropriadas. Podem ser incorporados um ou mais emulsificantes de grau alimentar na fórmula nutricional, se desejado; por exemplo, ésteres de ácido tartárico e diacetilo de monodiglicéridos, lecitina e mono e diglicéridos. De modo semelhante, podem ser incluídos sais e estabilizadores adequados. A fórmula nutricional é, de modo preferido, administrável por via entérica; por exemplo, na forma de um pó, um concentrado líquido ou uma bebida pronta a beber. A fórmula nutricional pode ser preparada de qualquer forma adequada. Por exemplo, a fórmula nutricional pode ser preparada por mistura, da fonte de proteína dietética, da fonte de hidratos de carbono, e da fonte de gordura, em conjunto, em proporções apropriadas. Se utilizados, os emulsificantes podem ser incluídos na mistura. As vitaminas e minerais podem ser adicionados neste ponto mas são normalmente adicionados mais tarde para evitar 11

Quaisquer vitaminas degradação térmica. Quaisquer vitaminas lipofilicas, emulsificantes e semelhantes podem ser dissolvidos na fonte de gordura antes da mistura. Água, de modo preferido água que foi submetida a osmose reversa, pode, depois, ser misturada para formar uma mistura liquida. A temperatura da água é convenientemente cerca de 50 °C a cerca de 80 °C para auxiliar na dispersão dos ingredientes. Podem ser utilizados agentes de liquefacção comercialmente disponíveis para formar a mistura líquida. A mistura líquida é, então, homogeneizada; por exemplo, em duas fases. A mistura líquida pode, então, ser termicamente tratada para reduzir as cargas bacterianas. Por exemplo, a mistura líquida pode ser rapidamente aquecida até uma temperatura no intervalo de cerca de 80 °C a cerca de 150 °C durante cerca de 5 segundos a cerca de 5 minutos. Isto pode ser efectuado por injecção de vapor, autoclave ou por permutador de calor; por exemplo uma placa permutadora de calor. A mistura líquida pode, então, ser arrefecida para cerca de 60 °C a cerca de 85 °C; por exemplo, por arrefecimento "flash". A mistura líquida pode, então, ser novamente homogeneizada; por exemplo, em duas fases de cerca de 7 MPa a cerca de 40 MPa na primeira fase e de cerca de 2 MPa a cerca de 14 MPa na segunda fase. A mistura homogeneizada pode, então, ser adicionalmente arrefecida para adicionar quaisquer componentes sensíveis ao calor; tais como vitaminas e minerais. O pH e conteúdo em sólidos da mistura homogeneizada são convenientemente normalizados neste ponto.

Se se deseja produzir uma fórmula nutricional em pó, a mistura homogeneizada é transferida para um dispositivo de secagem adequado, tais como um secador por dispersão ou 12 liofilizador e convertida num pó. 0 pó deve ter um conteúdo em humidade inferior a cerca de 5% em peso.

Se se deseja produzir uma fórmula liquida, a mistura homogeneizada é, de modo preferido, assepticamente introduzida em recipientes adequados. 0 enchimento asséptico dos recipientes pode ser efectuado por pré-aquecimento da mistura homogeneizada (por exemplo, até cerca de 75 a 85 °C) e injectando depois vapor na mistura homogeneizada para aumentar a temperatura até cerca de 140 a 160 °C; por exemplo a cerca de 150 °C. A mistura homogeneizada pode, então, ser arrefecida, por exemplo, por arrefecimento "flash", até uma temperatura de cerca de 75 a 85 °C. A mistura homogeneizada pode, então, ser homogeneizada, adicionalmente arrefecida até cerca da temperatura ambiente e introduzida em recipientes. Os dispositivos adequados para efectuar o enchimento asséptico desta natureza estão disponíveis comercialmente. A fórmula líquida pode estar na forma de uma fórmula pronta a comer possuindo um conteúdo em sólidos de cerca de 10 a cerca de 14% em peso ou pode estar na forma de um concentrado; normalmente com um conteúdo em sólidos de cerca de 20 a cerca de 26% em peso. Podem ser adicionados aromatizantes às fórmulas líquidas de modo a que as fórmulas sejam proporcionadas na forma conveniente de bebidas prontas a beber, com sabores.

Numa outra forma de realização, um produto alimentar normal pode ser enriquecido com a estirpe bacteriana de acordo com a presente invenção. Por exemplo, leite fermentado, iogurte, um queijo fresco, um leite coalhado, uma barra confeccionada, flocos ou barras de cereais de pequeno-almoço, bebidas, leites em pó, produtos à base de soja, produtos fermentados não lacticínios ou suplementos nutricionais para nutrição clínica. 13

Numa outra forma de realização, pode ser preparada uma composição alimentar nutricionalmente completa para animais de companhia. Pode ser um produto alimentar para animais de companhia em pó, na forma seca, semi-húmida ou molhada, arrefecida ou estável à temperatura ambiente. Podem ser também suplementos dietéticos para animais de companhia ou composições farmacêuticas. Estes alimentos para animais de companhia podem ser produzidos da forma convencional. Para além da estirpe de bactéria, estes alimentos para animais de companhia podem incluir qualquer uma ou mais de uma fonte de amido, uma fonte de proteína e uma fonte de lípido.

Fontes de amido adequadas são, por exemplo, grãos e legumes, tais como milho, arroz, trigo, cevada, aveia, soja, e misturas destes. Fontes de proteína adequadas podem ser seleccionadas de qualquer fonte de proteína animal ou vegetal adequada; por exemplo, carne e farinha para animais, carne de aves, farinha de peixe, concentrados de proteína de soja, proteínas de leite, glúten, e semelhantes. Para animais mais velhos, é preferido que a fonte de proteína contenha uma proteína de elevada quantidade. Fontes de lípidos adequadas incluem carnes, gorduras animais e gorduras vegetais. Além disso, também podem ser incorporados vários outros ingredientes, por exemplo, açúcar, sal, especiarias, temperos, vitaminas, minerais, agentes aromatizantes, gorduras e semelhantes, na comida para animais de companhia como desejado.

Para alimentos secos para animais de companhia, um processo adequado é a cozedura por extrusão, embora possa ser utilizada cozedura e outros processos adequados. Quando cozinhada por extrusão, a comida seca para animais de companhia é normalmente proporcionada sob a forma de uma moagem. Se for utilizado um 14 pré-biótico, o pré-biótico pode ser misturado com os outros ingredientes da comida seca para animais de companhia antes do processamento. É descrito um processo adequado no Pedido de Patente Europeia N.° 0850569; cuja divulgação é incorporada por referência. Se for utilizado um microrganismo pró-biótico, o organismo é, de um modo preferido, revestido sobre ou introduzido dentro da comida seca para animais de companhia. Um processo adequado é descrito no Pedido de Patente Europeia N.° 0862863; cuja divulgação é incorporada por referência.

Para alimentos húmidos, os processos descritos nas Patentes US 4781939 e 5132137 podem ser utilizados para produzir produtos de carne simulada. As divulgações destas patentes são incorporadas por referência. Também podem ser utilizados outros processos para produzir produtos do tipo nacos; por exemplo cozinhar num forno de vapor. Alternativamente, podem ser produzidos produtos do tipo rolo por emulsificação de um material de carne adequado para produzir uma emulsão de carne, adicionando um agente gelificante adequado, e aquecendo a emulsificação de carne antes do enchimento em latas ou outros recipientes. A quantidade de pré-biótico na comida para animais de companhia é, de um modo preferido, de cerca de 20% em peso; especialmente cerca de 10% em peso. Por exemplo, o pré-biótico pode compreender cerca de 0,1% até cerca de 5% em peso da comida para animais de companhia. Para alimentos de animais de companhia que utilizam chicória como pré-biótico, a chicória pode ser incluída para compreender cerca de 0,5% até cerca de 10% em peso da mistura de ração; de modo mais preferido cerca de 1% até cerca de 5% em peso. 15

Se for utilizado um microrganismo pró-biótico, a comida para animais de companhia contém, de um modo preferido, cerca de 104 até cerca de IO10 células do microrganismo pró-biótico por grama da comida para animais de companhia; de um modo mais preferido cerca de 106 até cerca de 108 células do microrganismo pró-biótico por grama. A comida para animais de companhia pode conter cerca de 0,5% até cerca de 20% em peso da mistura do microrganismo pró-biótico; de um modo preferido cerca de 1% até cerca de 6% em peso; por exemplo cerca de 3% até cerca de 6% em peso. A comida para animais de companhia pode conter outros agentes activos, tais como ácidos gordos de cadeia longa. Ácidos gordos de cadeia longa adequados incluem ácido linoleico alfa, ácido linoleico gama, ácido linoleico, ácido eicosapentanóico, e ácido docosa-hexanóico. Óleos de peixe são uma fonte adequada de ácidos eicosapentanóicos e ácido docosa-hexanóico. Óleo de borragem, óleo de semente de groselha e óleo de primavera-nocturna são fontes adequadas de ácido linoleico gama. Óleos de açafroa, óleos de girassol, óleos de milho e óleos de soja são fontes adequadas de ácido linoleico. Se necessário, os alimentos para animais de companhia são suplementados com minerais e vitaminas de modo a serem nutricionalmente completos.

Além disso, se desejado, a estirpe bacteriana pode ser encapsulada; por exemplo numa matriz de açúcar, matriz de gordura ou matriz de polissacárido. A quantidade de comida para animais de companhia a ser consumida pelos animais de companhia para obter um efeito benéfico irá depender do tamanho dos animais de companhia, do tipo de animais de companhia, e idade dos animais de companhia. Todavia uma quantidade da comida para animais de companhia para 16 proporcionar uma quantidade diária de cerca de 103-1014 cfu de, pelo menos, uma estirpe da bactéria de ácido láctico ou bifidobactéria seria normalmente adequada. De um modo preferido, são administrados cerca de 109-1010 cfu/dia para cães ou 107-1010 cfu/dia para gatos, por exemplo. A composição, de acordo com a invenção, é particularmente destinada à utilização na profilaxia ou tratamento de infecções relacionadas com bactérias gram-negativas, bactérias produtoras de endotoxina, tais como Helicobacter spp, Salmonella spp, e também com o sobrecrescimento de bactérias intestinais pequenas (SIBO) podendo todas elas manifestar-se clinicamente com diarreia, estados inflamatórios intestinais ou sistémicos, ou catabolismo e malnutrição.

Esta utilização pode ser particularmente destinada à profilaxia ou tratamento de infecções relacionadas com bactérias gram-negativas, bactérias produtoras de endotoxina, tais como Helicobacter spp, Samonella spp, e também com sobrecrescimento de bactérias intestinais pequenas (SIBO) podendo todas elas manifestar-se clinicamente com diarreia, estados inflamatórios intestinais ou sistémicos, ou catabolismo e malnutrição.

Os exemplos seguintes são fornecidos apenas a titulo ilustrativo. Todas as percentagens são fornecidas em peso, salvo indicação em contrário. Os exemplos são precedidos por uma breve descrição das figuras. 17

Figuras

Figura 1: Representações gráficas de histograma para a estirpe de Bifidobacteríum bifidum NCC 189 (previamente CIDCA 536, CNCM 1-2333) apresentando ligação de FITC-LPS. A: controlo sem FITC-LPS. B: incubação com 50 pL/rnL de FITC-LPS. Foram analisados, pelo menos, 16000 eventos.

Figura 2: Efeito da albumina na ligação de FITC-LPS por bactérias do ácido láctico e bifidobactérias. A: estirpe de Bifidobacteríum bifidum NCC 200 (previamente CIDCA 538, CNCM 1-2334). B: estirpe de Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM 1-2623). C: estirpe de Bifidobacteríum bifidum NCC 189 (previamente CIDCA 536, CNCM 1-2333).

Figura 3: Cinética do crescimento e ligação de FITC-LPS para estirpe de Bifidobacteríum bifidum NCC 189 (previamente CIDCA 536, CNCM 1-2333) . Os valores são médias de duas experiências independentes.

Figura 4: Ligação de LPS pela estirpe de Bifidobacteríum, detectada pelo microensaio para determinar 2-ceto-3-desoxioctonato (KDO) em lipopolissacárido. A concentração inicial da solução foi 100 pg/mL. As barras apresentam a concentração final após incubação da solução com as estirpes hidrofóbicas de bif idobactérias NCC 189 e NCC 251 (CNCM 1-2168) em comparação com uma estirpe não hidrofóbica de bifidobactéria (NCC 200 (CNCM 1-2334)).

Figura 5: Actividade pró-inflamatória (IL-8 (ng/mL)) de solução de LPS pré-incubada com bactérias hidrofóbicas em células epiteliais humanas HT-29. 18

As amostras de controlo de DMEM, leite humano (HM) a 2%, LPS (2,5 pg/mL) isoladamente, estirpe de Bifidobacterium bifidum NCC 189 (l,5e8 cfu/mL) isoladamente, foram testadas quanto à actividade estimuladora de fundo. As soluções de teste de LPS + leite humano (fonte de SCD14) foram comparadas com uma solução contendo LPS 2,5 pg/mL + hm a 2% pré-incubado com estirpe de Bifidobacterium bifidum estirpe NCC 189 (l,5e8 cfu/mL).

Exemplos

Exemplo 1: Selecção da estirpe de bactérias de ácido láctico hidrofóbicas de acordo com a invenção: A selecção de bactérias hidrofóbicas foi inicialmente baseada na % de partição de células bacterianas entre uma fase orgânica (hidrofóbica) e uma fase aquosa. A determinação da hidrofobicidade de superfície foi realizada utilizando o método de MATH, como previamente descrito (Pérez, P.F. et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64: 21-26). Resumidamente, 2 mL de suspensão bacteriana (cerca de 108 CFU/mL, PBS) foram extraídos com 0,4 mL de xileno por agitação em vórtice durante 120 s. As fases foram deixadas separar por decantação e foi medida a A6oo da fase aquosa. A hidrofobicidade da superfície celular (%H) foi calculada com a fórmula H%= [ (A0-A) /A0] xlOO em que A0 e A são as absorvências antes e após a extracção com xileno, respectivamente.

Subsequentemente, as bactérias de ácido láctico ou bifidobactérias foram seleccionadas pela sua capacidade para remover endotoxinas de uma solução que corresponde à quantidade de endotoxina encontrada no intestino humano. Os níveis de 19 endotoxina foram examinados com o microensaio para a detecção do grupo 2-ceto-3-desoxioctonato no lipopolissacárido de bactérias gram negativas (Karkhanis Y D, et ai., Analytical Chemistry (1978) 85:595-601).

Foram seleccionadas bactérias que removem mais do que 30% do teor em endotoxina destas soluções. As bactérias não hidrofóbicas testadas neste ensaio foram incapazes de modificar o teor inicial de endotoxina.

Exemplo 2: Efeito in vitro de bactérias de ácido láctico como eliminador de endotoxina A interacção entre LPS de Escherichia coli e bactérias de ácido láctico contendo diferentes propriedades de superfície foi estudada tendo sido seleccionadas bactérias com mais de 80% H e alguns controlos não hidrofóbicos "negativos", a interacção com endotoxina marcada com fluorescência foi realizada com citometria de fluxo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Estirpes Bacterianas e condições de crescimento A estirpe de Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM 1-2623) era da colecção Nestec (Lausanne, Suíça). As estirpes Bifidobacterium bifidum NCC 189 (previamente CIDCA 536, 1-2333) e Bifidobacterium bifidum NCC 200 (previamente CIDCA 538, (CNCM 1-2334)) eram da colecção do Centro de Investigacion y Desarrollo en Criotecnologia de Alimentos (La plata, Argentina). Suspensões 20 congeladas (-80 °C) conservadas com 10% (vol./vol.) de glicerol foram reactivadas uma vez em caldo de MRS antes das experiências. Todas as culturas foram realizadas a 37 °C em condições anaeróbicas (BBL GasPak Plus).

Ligação de FITC-LPS

Lipopolissacárido e lipopolissacárido marcado com FITC eram do serotipo de Escherichia coli 0111:B4 (Skelly, R.R et al., 1979, Infect. Immun. 23: 287-293) e foram adquiridos da Sigma. As soluções stock contendo 1000 pL/mL foram preparadas em água destilada e apropriadamente diluídas.

As culturas bacterianas foram lavadas três vezes com PBS e as suspensões foram padronizadas com 107 CFU/mL. Foram misturados 400 pL com diferentes quantidades de FITC-LPS ou LPS, para obter concentrações variando desde 0 até 50 pg/mL na mistura de reacção. As incubações foram realizadas a 4 °C ou 37 °C durante 30 minutos e, depois, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com paraformaldeido a 1% (vol./vol.) durante 30 minutos a 4 °C. A análise por citometria de fluxo foi realizada utilizando uma luz de excitação azul-verde (FACScan™).

Hidrofobicidade de Superfície A determinação da hidrofobicidade de superfície foi realizada utilizando o método MATH, como previamente descrito (Pérez, P.F. et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64:21-26). Resumidamente, foram extraídos 2 mL de suspensão bacteriana (cerca de 108 CFU/mL, em PBS) com 0,4 mL de xileno por agitação 21 em vórtice durante 120 s. As fases foram deixadas separar por decantação e foi medida a A60o da fase aquosa. A hidrofobicidade da superfície celular (%H) foi calculada com a fórmula H%=[(A0-A)/A0]xlOO em que A0 e A são as absorvências antes e após a extracção com xileno, respectivamente.

RESULTADOS

As hidrofobicidades de superfície das estirpes em estudo são apresentadas na Tabela 1. Os valores foram 93 e 96% para as estirpes de Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM 1-2623) e Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM 1-2333), respectivamente enquanto a estirpe de Bifidobacterium infantis NCC 200 (CNCM 1-2334) não era hidrofóbica e apresentou valores de cerca de 3%.

Tabela 1: Hidrofobicidades das estirpes em estudo.

Os valores são médias de, pelo menos, 3 determinações

Estirpe % de Hidrofobicidade NCC 2463 (CNCM 1-2623) 93 + 3 NCC 189 (CNCM 1-2333) 96 ± 3 NCC 200 (CNCM 1-2334) 3 + 2 A incubação da estirpe NCC 189 com 50 pg/mL de LPS marcado com FITC desvia claramente a população bacteriana para uma zona fluorescente. Os eventos situados no lado direito do gráfico (marcador Ml) representam 90% da população controlada (Figura 1B). Para suspensões incubadas sem FITC-LPS, apenas 2% dos eventos estão situados em diferente capacidade de ligação. 22 A Tabela 2 (abaixo) demonstra que a ligação de FITC-LPS é dependente da dose. Foram encontrados 5 e 15% de células FITC (+) para as estirpes NCC 200. Por outro lado, a estirpe NCC 189 apresenta cerca de 95% de células FITC ( + ) . A saturação ocorre próximo de 10 pg/mL de FITC-LPS. A adição de albumina, um ligante de lipido, reduz claramente a proporção de FITC ( + ) em todas as estirpes em estudo (figura 2). Todavia, a estirpe CIDCA 536 apresenta cerca de 30% de células FITC (+) na presença de albumina a 0,4% e 50 pg/mL de FITC-LPS (Figura 2C) . Para além disso, para esta estirpe, 10% das células FITC (+) foram encontradas com concentrações de albumina tão elevadas quanto 3%. Os catiões divalentes (Ca2+ 0,9 mM e Mg2+ 0,5 mM) não modificaram a ligação (resultados não apresentados).

Tabela 2: Percentagem de bactérias FITC (+) a diferentes concentrações de FITC-LPS. Foram analisados, pelo menos, 30000 eventos. FITC-LPS Estirpe (pg/mL) NCC 189 NCC 200 0 0,1 0,2 1 88,1 0,7 10 92,1 5,2 20 92, 8 5,9 30 93, 9 3,7 40 94, 7 4,6 50 94, 8 4,6 23 A ligação de FITC-LPS para a estirpe de Bifidobacterium bifidum NCC 189 (previamente CIDCA 536, CNCM 1-2333) era fortemente dependente da fase de crescimento (figura 3) . As bactérias recolhidas na fase estacionária apresentam uma taxa elevada de células FITC (+). Estes valores caem dramaticamente durante a fase de retardamento e foram progressivamente restaurados durante o crescimento. Não foram encontradas diferenças entre a ligação a 4 °C e 37 °C.

Em resumo, as estirpes altamente hidrofóbicas apresentam células FITC (+) que atingem cerca de 95% para a estirpe NCC 189. A estirpe não hidrofóbica NCC 200 nunca atinge valores superiores a 5%. Estes resultados demonstram que a ligação de LPS está correlacionada com a hidrofobicidade de superfície.

Estes resultados indicam claramente que as bactérias hidrofóbicas se ligam a endotoxina marcada com FITC e desse modo tornam-se fluorescentes. A uma concentração de 10 pg/mL de endotoxina, mais de 90% das culturas de células hidrofóbicas tornam-se fluorescentes como detectado com citometria de fluxo; em contraste, menos de 10% das células bacterianas não hidrofóbicas tornam-se positivas em concentrações de endotoxina semelhantes.

Quando as culturas hidrofóbicas foram introduzidas em meios contendo endotoxina a uma concentração que varia entre 30 e 90 pg/mL, as culturas bacterianas a uma concentração de 107 até 108 bactérias por mL removeram, pelo menos, 20% da presente endotoxina. Este resultado foi confirmado utilizando endotoxina marcada radioactivamente. 24

Exemplo 3: Experiências em células imunocompetentes humanas

Foi estudada a abolição da reacção pró-inflamatória em células imunocompetentes humanas induzida pela endotoxina na presença do sistema de cultura de estirpes hidrofóbicas em comparação com bactérias não hidrofóbicas.

Bifidobacterium bifidum hidrofóbico NCC 189(CNCM 1-2333) e Bifidobacterium infantis não hidrofóbico NCC 200 (CNCM 1-2334) foram incubados numa solução contendo uma quantidade definida de endotoxina, como determinado pelo método KDO (ver exemplo 1) (figura 4) . A presença de endotoxina após incubação com suspensão de bactérias foi claramente diminuída pela estirpe hidrofóbica, enquanto que não se observaram alterações para a estirpe não hidrofóbica.

Exemplo 4: Estudos funcionais para bactérias hidrofóbicas

MATERIAIS E MÉTODOS

As bactérias lavadas foram ressuspensas em DMEM com glucose elevada (AMIMED) e foram pré-incubadas com LPS de Escherichia coli 0111: B4 (Sigma) a uma concentração final de 2,5 pg/mL. Após centrifugação, foram utilizados 200 pL de sobrenadante ou sedimento bacteriano ressuspenso para estimular células epiteliais HT-29. 25

Após cultura de 20 h a 37 °C o sobrenadante da cultura de células HT-29 foi examinado quanto à presença de IL-8 utilizando uma técnica de ELISA.

RESULTADOS

Os resultados são apresentados na Figura 5. A actividade pró-inflamatória de LPS é significativamente reduzida quando uma solução de LPS é pré-incubada com bactérias hidrofóbicas. Após centrifugação, o sobrenadante adicionado a uma cultura de células epiteliais humanas (na presença de leite humano uma vez que a estimulação com LPS está dependente da presença de sCDl4) é significativamente reduzido em relação ao sobrenadante que não tinha sido pré-incubado com a bactéria hidrofóbica.

Exemplo 5: Fórmula para crianças

Para obter uma fórmula para crianças foi preparada a seguinte mistura contendo por 100 mL de fórmula: 0,5 até 5%, de um modo preferido 2% de péptidos, 0,2 até 10%, de um modo preferido 4% de gordura, 1 até 25%, de um modo preferido 8 % de hidratos de carbono não levano ( [incluindo lactose a 65%, maltodextrina a 20%, amido a 15%) e, pelo menos, 106 cfu/mL das seguintes estirpes: Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM 1-2623), Bifidobacterium bifidum NCC189 (CNCM 1-2333), Bifidobacterium bifidum CNCM 1-2335, Bidifobacterium adolescentis CNCM 1-2168, em combinação com vestígios de vitaminas e oligoelementos para satisfazer as necessidades diárias, e 0,01 até 2%, de um modo preferido 0,3%, de minerais, e 50 até 90%, de um modo preferido 75% de água. 26

Exemplo 6: Utilização de bactérias hidrofóbicas de ácido láctico, de acordo com a invenção, em lacticínios frescos

Pode ser utilizada uma ou mais estirpes de Bifidobacterium bifidum (CNCM 1-2333), Lactobacillus acidophillus NCC 2463 (CNCM 1-2623), Bifidobacterium bifidum NCC235 (CNCM 1-2335) ou

Bifidobacterium adolescentis NCC251 (CNCM 1-2168), de acordo com a presente invenção, para o fabrico de produtos lácteos do tipo iogurte fermentado.

Para realizar isto, é preparado 1L de um produto lácteo contendo 2,8% de gorduras e suplementado com 2% de leite magro em pó e 6% de sacarose, é pasteurizado a 96 °C durante 30 minutos e a sua temperatura é então baixada para 42 °C. São reactivadas pré-culturas de uma estirpe não espessante de Streptococcus thermophilus e de uma estirpe não viscosa de Lactobacillus bulgaricusr num meio de cultura MSK estéril contendo 10% de leite em pó reconstituído e 0,1% de extracto de levedura comercial.

Uma pré-cultura de uma ou mais das estirpes é também reactivada num meio contendo 10% de leite em pó reconstituído e 0,1% de extracto de levedura comercial com 1% de sacarose. O produto lácteo pasteurizado é então inoculado com 1% de cada uma destas pré-culturas reactivadas e este produto lácteo é então deixado a fermentar a 32 °C até que o pH atinja um valor de 4,5. Os produtos de tipo iogurte de leite fermentado são produzidos deste modo e armazenados a 4 °C. 27

Exemplo 7: comida de cão seca

Uma mistura de ração é produzida a partir de cerca de 58% em peso de milho, cerca de 5,5% em peso de glúten de milho, cerca de 22% em peso de farinha de galinha, 2,5% de chicória seca, leite fermentado pelas estirpes de Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I 2623)) de modo a que a quantidade correspondente para o cão seja cerca de 109-1010 cfu/dia, e sais, vitaminas e minerais perfazendo o restante. A mistura de ração é adicionada a um pré-condicionador e humedecida. A ração humedecida é então adicionada a um fogão de extrusão e gelatinizada. A matriz gelatinizada que sai do extrusor é forçada através de um molde e extrudida. 0 extrudado é cortado em pedaços adequados para ração para cães, seco a cerca de 110 °C durante cerca de 20 minutos, e arrefecido para formar bolinhas.

Esta ração seca para cão é capaz de melhorar a saúde dos animais de companhia e, particularmente previne distúrbios relacionados com endotoxina em animais de companhia.

Lisboa, 27 de Novembro de 2007 28

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de, pelo menos, uma estirpe de bactérias de ácido láctico e/ou Bifidobactérias seleccionada do grupo consistindo em Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus animalís, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rahmnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus delbrueckii subs. lactis, Bifidobacterium spp., Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis possuindo propriedades de superfície caracterizadas por uma percentagem de hidrofobicidade (%H) de, pelo menos, 80, para a preparação de uma composição destinada à prevenção ou ao tratamento de distúrbios mediados e/ou associados a endotoxina.
2. Utilização de acordo com reivindicação 1, em gue a bactéria de ácido láctico ou Bifidobactéria possui uma percentagem de hidrofobicidade (%H) de 85 até 100%.
3. Utilização, de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, em que a estirpe é seleccionada do grupo consistindo em Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I 2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM-I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (CNCM-I-2335), Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM-I-2168) e Bifidobacterium lactis (ATCC27536). 1
4. Utilização, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que as bactérias de ácido láctico são utilizadas de modo a que a quantidade disponível para o indivíduo seja de cerca de 103-1014 cfu por dia.
5. Estirpe isolada de bactérias de ácido láctico ou bifidobactérias que é Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I 2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM-I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (CNCM-I-2335), ou Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM-i-2168).
6. Composição alimentar para humanos ou animais de companhia contendo, pelo menos, uma estirpe de bactérias lácticas e/ou Bifidobactérias seleccionada do grupo consistindo em Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus johnsonii, paracasei, ruminis, rahmnosus, reuterii, animalis, acidophilus, fermentum, lactis, bifidum, pseudolongum, adolescentis Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus delbrueckii subs. Bifidobacterium spp., Bifidobacterium Bifidobacterium longum, Bifidobacterium Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium possuindo propriedades de superfície caracterizada por uma percentagem de hidrofobicidade (%H) de, pelo menos, 80, associada com um suporte ingerivel ou uma matriz farmacêutica.
7. Composição, de acordo com reivindicação 7, em que a bactéria do ácido láctico ou Bifidobactéria possui uma percentagem de hidrofobicidade (%H) de 85 até 100%. 2
8. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 6 e 7, em que a estirpe é utilizada na sua forma viável ou inactiva.
9. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 8, em que a estirpe de bactérias do ácido láctico ou Bifidobactérias é seleccionada do grupo consistindo em Lactobacillus acidophilus NCC 2463 (CNCM-I 2623), Bifidobacterium bifidum NCC 189 (CNCM-I-2333), Bifidobacterium bifidum NCC 235 (CNCM-I-2335), Bifidobacterium adolescentis NCC 251 (CNCM-I-2168), Bifidobacterium lactis (ATCC27536).
10. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 9, em que a quantidade de estirpe de bactérias do ácido láctico ou Bifidobactérias disponível para o indivíduo é correspondente a cerca de 10 -10 cfu por dia.
11. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 10, que reduz, previne ou trata distúrbios mediados e/ou associados a endotoxina. Lisboa, 27 de Novembro de 2007 3