DE60218154T2

DE60218154T2 - Lipid-polymer konjugaten

Info

Publication number: DE60218154T2
Application number: DE60218154T
Authority: DE
Inventors: J. M. Metselaar; W. E. Hennink; Tom De Vringer; L. W. T. De Boer; C. Oussoren; G. Storm; P. Bruin
Original assignee: Astellas Pharma Europe BV
Current assignee: Astellas Pharma Europe BV
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-06-03
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2022-06-04
Also published as: EE200300596A; US20100145018A1; US20040254352A1; PL367479A1; ATE353927T1; DE60230137D1; HUP0400171A2; WO2002098952A1; EP1392756A2; JP2004527586A; KR20040027513A; CZ20033480A3; HRP20030976A2; PL369455A1; CN1271116C; EP1392755A1; ZA200308938B; WO2002098951A2; CA2448856A1; NO20035264D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Lipid-Polymer-Konjugate, deren Herstellung und deren Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Lipid-Polymer-Konjugate sind wohlbekannt und werden für eine Vielzahl verschiedener Anwendungen verwendet. Eine davon ist der Einschluss in kolloidale Trägerzusammensetzungen, wie z.B. vesikulären Doppelschicht-Systemen, wie z.B. Liposomen, Niosomen und inversen Vesikeln, micellaren Systemen, Nanokapseln, Nanokügelchen, usw. Ein bekannter Vertreter solcher kolloidaler Trägerzusammensetzungen wird von Liposomen gebildet. Obwohl nachfolgend insbesondere Liposome erwähnt werden, sollte der Leser berücksichtigen, dass die Ausführungen, Offenbarungen und Lehren auch andere kolloidale Trägerzusammensetzungen betreffen.
Liposome, die zur Gruppe der kolloidalen Trägerteilchen gehören, sind kleine Vesikeln, die aus einer oder mehreren konzentrischen Lipid-Doppelschichten bestehen, die einen wässrigen Raum umschließen. Aufgrund ihrer strukturellen Vielseitigkeit bezüglich der Größe, Oberflächenladung, Lipidzusammensetzung, Doppelschichtfluidität und aufgrund ihrer Fähigkeit, nahezu jeden Wirkstoff einzukapseln, wurde ihre Bedeutung als Wirkstoffverabreichungssysteme schnell erkannt. Bei der intravenösen Verabreichung von Liposomen werden diese jedoch von dem mononuklearen Phagozyten-System (MPS) als körperfremdes Teilchen erkannt und schnell aus dem Kreislauf zu Organen, die reich an Phagozytenzellen sind, wie der Leber, der Milz und dem Knochenmark, entfernt. Es sind verschiedene Möglichkeiten identifiziert worden, um diesen Effekt zu verringern, wie z.B. die Verringerung der Teilchengröße der Liposome und die Veränderung der Oberflächenladung der Liposome. Eine andere Entwicklung bezieht sich auf die Oberflächenmodifikation der Liposome durch die Einbringung spezifischer hydrophiler polymerer Komponenten an der Liposomenoberfläche, die die Proteinadsorption an der Teilchenoberfläche reduzieren. Solche Liposome sind demzufolge gegenüber einer Erkennung durch Zellen des MPS geschützt und besitzen eine verlängerte Verweilzeit im allgemeinen Blutkreislauf. Ein wohlbekanntes Beispiel für die Modifikation der liposomalen Oberfläche ist die Einbringung eines Lipid-Derivats des hydrophilen polymeren Polyethylenglykol (PEG) während der Herstellung der liposomalen Zusammensetzungen. Dieses Polymer ist üblicherweise terminal modifiziert mit einer hydrophoben Gruppe, die der Rest eines Phosphatidyl-Ethanolamin-Derivats oder eine langkettige Fettsäure ist. Polyethylenglykol als solches ist ein vergleichsweise stabiles Polymer, das der Proteinadhäsion entgegenwirkt und das unter physiologischen Bedingungen nicht enzymatisch oder hydrolytisch abgebaut wird. Bei intravenöser Verabreichung von Liposomen, die eine PEG-gepfropfte Oberfläche aufweisen, an verschiedene Tierarten sowie an Menschen, sind gute Ergebnisse hinsichtlich der Verlängerung der Plasma Halbwertszeit und der Verringerung der Ansammlung in Organen, die reich an phagozyti schen Zellen sind, erhalten worden (Storm G., Belliot S.O., Daemen T. und Lasic D.D.: Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system in Adv. Drug Delivery Rev. 17, 31–48, (1995); Moghimi S.M., Hunter A.C. und Murray J.C.: Longcirculating and target-specific nanoparticles; theory to practice in Pharmacol. Rev. 53, 283–318, (2001); Boerman O.C., Dams E.T., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M. und Storm G.: Radiopharmaceuticals for scintigraphic imaging of infection and inflammation in Inflamm. Res. 50, 55–64, (2001)). Zulassungen zum Inverkehrbringen solcher liposomaler Zubereitungen, die Doxorubicin enthalten, sind bereits erteilt worden.
Inzwischen sind jedoch verschiedene Nachteile der Verwendung des Polymers Polyethylenglykol bei lang zirkulierenden Liposomen festgestellt worden. Die Akkumulation von PEG-gepfropften Liposomen in Makrophagen und der Haut gibt Anlass zu Bedenken wegen fehlender Bioabbaubarkeit. Der Verlust der lang zirkulierenden Eigenschaft (schnelle Clearance), wenn PEG-Liposome ein zweites Mal injiziert werden, ist beobachtet worden (Dams E.T., Laverman P., Oijen W.J., Storm G., Scherphof G.L., Van der Meer J.W., Corstens F.H. und Boerman O.C.: Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeated injections of sterically stabilized liposomes in J. Pharmacol. Exp. Ther. 292, 1071–1079, (2000)). Neuere Untersuchungen mit PEG-Liposomen bei Patienten haben gezeigt, dass PEG-Liposome akute Nebenwirkungen hervorrufen können (Gesichtsröte, Engegefühl in der Brust, Atemnot, Veränderungen des Blutdrucks), die sofort verschwinden, wenn die Verabreichung (Infusion) der PEG-Liposom-Zubereitung beendet wird. Neuere Daten deuten auf eine Rolle der Komplementaktivierung bei der Hervorrufung von Nebenwirkungen hin (Szebeni J., Baranyi L., Savay S., Lutz H., Jelezarova E., Bunger R. und Alving C.R.: The role of complement activation in hypersensitivity to Pegylated liposomal doxorubicin (Doxil) in J. Liposome Res. 10, 467–481, (2000)). Bis jetzt sind die kommerziell verfügbaren Zubereitungen, die auf PEG-Liposomen basieren, wässrige Suspensionszubereitungen. Es ist wohlbekannt, dass die Haltbarkeit von liposomalen wässrigen Suspensionszubereitungen im Allgemeinen und auch von PEG-Liposomen eher begrenzt ist. Es sind verschiedene Techniken bekannt, um den Träger oder die kontinuierliche Phase solcher Zubereitungen zu entfernen, wie z.B. das Sprühtrocknen, die Diafiltration, die Rotationsverdampfung, usw., und, bevorzugt, das Gefriertrocknen. Kürzlich wurde ein Gefriertrocknungsverfahren vorgeschlagen, dass die Langzeithaltbarkeit von PEG-Liposomen, die den Technetium-Chelator Hydrazinonikotinamid enthalten, vorgeschlagen (Laverman P., van Bloois L., Boerman O.C., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M. und Storm G.: Lyophilisation of Tc-99m-HYNIC labelled PEG-liposomes in J. Liposome Res. 10(2&3), Seite 117–129 (2000)), diese Ergebnisse und die Anwendbarkeit dieser Technik auf liposomale Zubereitungen bedürfen jedoch weiterer Untersuchungen.
Die mit der Verwendung von Polyethylenglykol inhärent verbundenen Nachteile haben Forscher dazu veranlasst, nach alternativen Polymeren zu suchen. Zahlreiche Polymere sind als geeignete Kandidaten zur Derivatisierung mit (Vesikel-bildenden) Lipiden für die Einarbeitung in Liposome vorgeschlagen worden (siehe z.B. EP-0688207). Es wurde gezeigt, dass die hydrophilen wasserlöslichen Polymere Poly(vinylpyrrolidon), Poly(acryloylmorpholin), Poly(2-(m)ethyl-2-oxazolin, Polyacrylamid und Polyglycerin die Zirkulationszeit von Liposomen nach der intravenösen Verabreichung bis zu einem gewissen Grad verlängern. Bis jetzt sind solche Lipid-Polymer-Konjugate jedoch nicht in kommerziell verfügbaren Wirkstoffzubereitungen eingesetzt worden, hauptsächlich da sie keine Vorteile gegenüber den bekannten Lipid-PEG-Konjugaten gezeigt haben. Deshalb besteht nach wie vor ein Bedürfnis, ein Polymer zu finden, das mit einem Lipid derivatisiert werden kann, um die Einbringung in kolloidale Trägerzusammensetzungen, wie z.B. Liposome, zu ermöglichen, wobei das Polymer lang zirkulierende Eigenschaften besitzt und zusätzlich dazu Vorteile gegenüber PEG, wie z.B. Bioabbaubarkeit, aufweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Lipid-Polymer-Konjugate bereitgestellt, die erhältlich sind aus einem amphiphilen Lipid, bestehend aus mindestens einer hydrophoben apolaren Gruppierung und einer hydrophilen polaren Kopfgruppe, und einem Polymer oder einem monomeren Vorläufer dafür mit einer N- und einer C-terminalen Endgruppe, wobei das Polymer eine Polyaminosäure, ein Polyaminosäure-Derivat oder ein Polyaminosäure-Analoges ist, und wobei das Lipid kovalent an die N- oder C-terminale Endgruppe des Polymers gebunden ist, wobei das Polymer die folgende Formel aufweist: -[NHCHR(CH₂)_mCO]_n-, worin -R definiert ist als: -H, -CH₃, -CHCH₃OR₁, -(CH₂)_xOR₁, -(CH₂)_x-CO-NHR₁, -(CH₂)_x-NH-CO-R₁, -(CH₂)_x-SO_yCH₃ oder -(CH₂)_xCOOH; -R₁ H oder (C₁-C₄)-Alkyl, substituiert mit einer oder mehreren Hydroxylgruppen oder einer Di-(C₁-C₄)-alkylaminogruppe, ist; x 0–4 ist; m = 1 oder 0 und y = 1 oder 2. Außerdem werden Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate und Verwendungen solcher Konjugate bereitgestellt.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
1 ist eine graphische Darstellung des Mittelwerts der berechneten prozentualen injizierten Dosis in Blutproben, aufgetragen gegen die Zeit für PEG-DSPE-enthaltende liposomale Zubereitungen mit verschiedenen Mengen an Gesamt-Lipid (Beispiel 22).
2 ist eine graphische Darstellung des Mittelwerts der berechneten prozentualen injizierten Dosis in Blutproben, aufgetragen gegen die Zeit für PHEA-DODASuc-enthaltende liposomale Zubereitungen mit verschiedenen Mengen an Gesamt-Lipid (Beispiel 22).
3 ist eine graphische Darstellung des Prozentanteils an verkapseltem Prednisolonphosphat in PEG-DSPE- bzw. PHEA-DODASuc-enthaltenden liposomalen Zubereitungen, aufgetragen gegen die Zeit (Beispiel 23).
4 ist eine graphische Darstellung der Konzentration von Prednisolonphosphat, das in PEG-DSPE- und PHEA-DODASuc-enthaltenden Liposomen verkapselt ist im Blut, aufgetragen gegen die Zeit (Beispiel 24).
5 ist eine graphische Darstellung des Pfotenentzündungswerts ("paw inflammation score"), aufgetragen gegen die Zeit vor und nach einer einzelnen intravenösen Injektion von Kochsalzlösung- und Prednisolonphosphat-enthaltenden Liposomen (beschichtet mit PEG-DSPE bzw. PHEA-DODASuc) (Beispiel 24).
6 ist eine graphische Darstellung der prozentualen injizierten Dosis von Liposomen, die in der Leber, der Milz und der Leber+Milz festgestellt werden nach der intravenösen Verabreichung von Liposomen, die als Lipid-Polymer-Konjugate PEG-DSPE, PHEG-Diaminobutan DODASuc, PHPB Diaminobutan DODASuc, PHBG Diaminobutan DODASuc bzw. PHEA-DODASuc enthalten, und herkömmlichen Liposomen (BARE) (Beispiel 21).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen amphiphilen Lipid-Polymer-Konjugate sind erhältlich aus einem amphiphilen Lipid und einem Polymer oder einem monomeren Vorläufer dafür.
Die in den erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugaten zu verwendenden amphiphilen Lipide können ausgewählt werden aus einer Vielzahl von synthetischen und natürlich vorkommenden Lipiden, bestehend aus mindestens einem hydrophoben apolaren Schwanz und einer hydrophilen polaren Kopfgruppe, wie z.B. Vesikel-bildenden Lipiden und Membranlipiden.
Ein wichtiges Merkmal des in dem Lipid-Polymer-Konjugat zu verwendenden amphiphilen Lipids ist, dass das Lipid eine funktionelle Gruppe an seiner polaren Kopfgruppe enthält, die zur kovalenten Anbindung an eine Polymerkette geeignet ist. Die polare Kopfgruppe ist z.B. eine primäre oder sekundäre Amingruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Aldehydgruppe, ein Halogenid oder eine Carbonsäuregruppe. Die hydrophobe Gruppierung des Lipids ermöglicht die Einbindung des Lipid-Polymer-Konjugats in Doppelschichtstrukturen, wie z.B. Liposome, und fungiert als Anker.
Beispiele für amphiphile Lipide sind Phospholipide, Glycolipide, Ceramide, Cholesterin und Derivate, gesättigte oder teilweise ungesättigte, verzweigte oder geradkettige C₈-C₅₀ Mono- oder Dialkylamine, Arylalkylamine, Cycloalkylalkylamine, Alkanole, Aldehyde, Carbohalogenide oder Alkansäuren und die Anhydride davon, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome bevorzugt 25 oder höher ist.
Beispiele für geeignete amphiphile Lipide sind Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinositol, Sphingomyelin, Stearylamin, Myristylalkohol, Cholesterin und Palmitinsäure.
Ein bevorzugtes amphiphiles Lipid in dem Lipid-Polymer-Konjugat ist ein Lipid mit zwei hydrophoben Ketten, typischerweise Alkylketten, und einer polaren Kopfgruppe, enthaltend eine funktionelle Gruppe, wie oben beschrieben. Phosphatdidylethanolamin-Derivate und, insbesondere, Distearylphosphatidylethanolamin, sind solche bevorzugten Phospholipide, da sie eine reaktive Aminogruppe enthalten.
Weitere bevorzugte amphiphile Lipide besitzen als hydrophile Kopfgruppe ein primäres oder sekundäres Amin und zwei gesättigte oder ungesättigte C₈-C₅₀, verzweigte oder geradkettige hydrophobe apolare Gruppierungen. Beispiele dafür sind 1-Heptadecyloctadecylamin- und Distearylamin-enthaltende Verbindungen, wie z.B. Distearylamin- und N-Succinyldioctadecylamin (DODASuc).
Der Polymer-Teil der erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugate wird von einer Poly(aminosäure), einem Poly(aminosäure-Derivat) oder einem Poly(aminosäure-Analogen) gebildet. Ein Poly(aminosäure-Derivat) ist ein Polymer, das aus Aminosäuremonomeren besteht, an die ein oder mehrere Substituenten gebunden sind. Ein Beispiel dafür ist Poly-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin. Ein Poly(aminosäure-Analoges) ist hier ein Polymer, bei dem die Kohlenstoffatom-Kettenlänge des Aminosäuremonomers verringert oder verlängert ist. Beispiele hierfür sind Poly(homoserin) und Poly(pentahomoserin).
Das Polymer ist ein Homopolymer, bestehend aus Monomeren, die über die gesamte Polymerkette gleich sind. Es ist auch möglich, dass der Polymer-Teil aus Blockcopolymeren besteht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Poly(aminosäure), Poly(aminosäure-Derivat) und Poly(aminosäure-Analoges), oder dass der Polymer-Teil gebildet wird von einer Reihe abwechselnder Monomere oder einer kontrollierten Abfolge von Monomeren oder durch Zufallspolymerisation geeigneter Monomere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer oder mehreren Aminosäuren, Aminosäure-Derivaten und Aminosäure-Analogen. Die Polymere können linear oder verzweigt sein und umfassen Pfropfpolymere, bevorzugt sind sie jedoch linear.
Geeignete Aminosäuren sind die natürlich vorkommenden α-Aminosäuren. β-Aminosäuren sowie Nicht-Protein- oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren scheinen jedoch auch von Interesse zu sein. Sowohl die L- als auch die D-Konfiguration der Aminosäuren kann verwendet werden. Wenn die Aminosäuresequenz des Polymers in dem Lipid-Polymer-Konjugat von Resten der L-Aminosäure gebildet wird, unterliegt das resultierende Polymer dem enzymatischen Abbau. Wenn die Aminosäuresequenz des Polymers in dem erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugat andererseits von der D-Aminosäure gebildet wird, dürfte das resultierende Polymer gegenüber Peptid-spaltenden Enzymen stabil sein. Es können auch Gemische aus den L- und D-Aminosäuren verwendet werden. Unter Berücksichtigung der verschiedenen Eigenschaften der Polymere kann die Oberflächenmodifikation von kolloidalen Trägerteilchen, in die die erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugate eingebracht werden, angepasst werden durch selektive Verwendung der L- und/oder D-Form der Ausgangsstoffe zur Herstellung der Konjugate.
Eine wichtige Eigenschaft der Poly(aminosäure)-, Poly(aminosäurederivats)- und Poly(aminosäure-Analoge)-Verbindungen, die zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugate geeignet sind, ist, dass sie in Wasser löslich sind (mindestens ein Teil in 100 Teilen Wasser, bevorzugt 1 Teil in 30 Teilen Wasser, und am meisten bevorzugt 1 Teil in 10 Teilen Wasser oder weniger). Die Polymere können auch charakterisiert werden durch ihren χ-Parameter in Wasser. Dieser Polymer-Lösungsmittel-Wechselwirkungsparameter kann bestimmt werden z.B. durch Membran-Osmometrie. Die Polymere, die vorteilhafterweise in den erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugaten verwendet werden können, besitzen χ-Parameter von ≤ 0,65, bevorzugt ≤ 0,5, in Wasser.
Ein weiteres wichtiges Merkmal der Polymere ist, dass sie im (physiologischen) pH-Bereich von 4–8 keine wesentliche Menge geladener Gruppen aufweisen. Bevorzugt werden zur Herstellung der Polymere neutrale Aminosäuremonomere oder Aminosäure-Analoge-Monomere verwendet, oder es werden Aminosäure-abgeleitete Monomere verwendet, die neutral sind oder neutralisiert worden sind. Es scheint, dass geladene Gruppen im geringen Prozentanteil zugelassen werden können, ohne die lang zirkulierenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen kolloidalen Trägerzusammensetzungen zu stören. Wie für Copolymere aus 2-Hydroxyethyl-L-glutamin und geladenen Monomeren gezeigt worden ist, können positiv geladene Gruppen in größerem Prozentanteil zugelassen werden als negativ geladene Gruppen.
Geeignete Monomere zur Herstellung der Polymere sind unter anderen Alanin, Threonin, Valin, Sarcosin, α-Aminoadipinsäure, α,γ-Diaminobuttersäure-Derivate, Ornithin, Glutamin und Derivate, einschließlich Glutaminsäure, Asparagin und Derivate, einschließlich Asparaginsäure, Lysin-Derivate, Methionin und Derivate, Serin, dessen Derivate und Analoga mit zusätzlichen CH₂-Gruppen, wie z.B. Homoserin und Pentahomoserin. Geeignete Seitengruppen umfassen die (C₁-C₄)-Alkyl-, Hydroxyalkyl-, Dihydroxyalkyl-, Carbamoyl- und Arylgruppen oder Kombinationen davon, vorausgesetzt, dass das Polymer wasserlöslich bleibt. Beispiele für diese Gruppen sind 2-Hydroxyethyl, 3-Hydroxypropyl, 4-Hydroxyeutyl und 2,3-Dihydroxypropyl. Polymere, die verwendet werden können, sind z.B. Poly(DL-Serin) (PDLS), Poly(2-hydroxyethyl)-DL-glutamin (PDLHEG), Poly(2-hydroxbutyl)-L-glutamin (PHBG) und das Copolymer Poly(HEG-co-glutaminsäure) 1% Glutaminsäure (PHEG1%GA). Bevorzugte Polymere sind Poly(D,L-glutamin) (PDLG), Poly(D,L-asparagin) (PDLA), Poly(hydroxypropyl)-L-glutamin (PHPG), Poly(2-hydroxypropyl)-L-glutamin (P2HPG) und das Copolymer aus beta-Alanin und 2-Hydroxyethyl-L-glutamin (PbAHEG), Poly(HEG-co-dimethylaminoethylglutamin), enthaltend 5 und 1% Dimethylaminoethyl-Seitengruppen (PHEG5%DG und PHEG1%DG). Mehr bevorzugte Polymere sind die Homopolymere Poly-[N-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin] (PHEG), Poly(2-hydroxyethyl)-L-asparagin (PHEA) und Poly(D,L-methioninsulfoxid) (PDLMS).
Die Polymerkette enthält zwischen 5 und 500 Monomer-Untereinheiten, bevorzugt zwischen 20 und 100. Das mittlere Molekulargewicht des Polymers variiert im Bereich von 500 bis 75.000, bevorzugt 2.000 bis 15.000. Das mittlere Molekulargewicht kann auf verschiedene Arten und Weisen, die im Stand der Technik bekannt sind, beurteilt werden. Bei den Beispielen der vorliegenden Anmeldung wurde eine Schätzung des Molekulargewichts auf der Grundlage von NMR-Daten vorgenommen.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugate sind bevorzugt Herstellungsverfahren verwendet worden, bei denen reaktive Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuremonomere vor der Polymerisation und dem Kuppeln des Lipids geschützt wurden.
Die Lipid-Polymer-Konjugate können nach Verfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Ein wohlbekanntes Verfahren zur Herstellung von Polymeren aus Aminosäuren umfasst die Ring-öffnende Polymerisation der entsprechenden Aminosäure-N-carboxyanhydride (NCA), die optional mit einer oder mehreren Schutzgruppen versehen sind, initiiert durch Nucleophile, wie z.B. primäre (C₁-C₄)-Alkylamine. Ein weiteres Verfahren zur Herstellung der Lipid-Polymer-Konjugate umfasst die Verwendung eines Amins mit einer geschützten funktionellen Gruppe, z.B. N-Boc-1,4-diaminobutan, als Initiator bei der Ring-öffnenden NCA-Polymerisation. Obwohl bei diesem Verfahren zwei zusätzliche Stufen, nämlich die Entschützung der funktionellen Gruppen und die anschließende Kupplungsreaktion an ein Lipid mit einer reaktiven Gruppe, erforderlich sind, sind die nach diesen Verfahren hergestellten Lipid-Polymer-Konjugate zur Einarbeitung in die erfindungsgemäßen kolloidalen Trägerzusammensetzungen geeignet.
Wenn das amphiphile Lipid ein C₈-C₅₀-verzweigtes oder geradkettiges Mono- oder Dialkyl-, -hydroxyalkyl- oder -alkylenamin, ein Alkanol oder ein Ceramid ist, kann dieses vorteilhafterweise als der Initiator bei dem Ring-öffnenden Polymerisationsverfahren verwendet werden. Dies bedeutet, dass das amphiphile Lipid während der Polymerisation in einem Schritt an das Polymer gebunden wird. Das Molekulargewicht der Polyaminosäuren ist stark abhängig von dem Lösungsmittel oder der Kombination von Lösungsmitteln, der Reinheit der verwendeten Stoffe und dem Verhältnis von Monomer zu Polymerisationsinitiator. Im Allgemeinen ist das Molekulargewicht des Polymers umso höher, je höher das Verhältnis von Monomer zu Polymerisationsinitiator ist.
Wenn ein Polymer von im Vorhinein definierter Zusammensetzung hergestellt werden soll, wird bevorzugt das Festphasen-Peptid-Syntheseverfahren verwendet.
Schutzgruppen, die in den Monomer-Einheiten des Polymers vorhanden sind, können durch Aminolyse unter Verwendung eines Aminoalkohols, wie z.B. 2-Aminoethanol, 3-Aminopropanol oder 2,3-Dihydroxypropylamin, entfernt werden.
Die erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugate können vorteilhafterweise in erfindungsgemäße kolloidale Trägerzusammensetzungen eingearbeitet werden, wie z.B. vesikuläre Doppelschichtsysteme, wie z.B. Liposome, Niosome, inverse Vesikeln, micellare Systeme, Nanokapseln, Nanokügelchen, usw. Bevorzugte kolloidale Trägersysteme sind die vesikulären Doppelschichtsysteme.
Bei der Herstellung von Liposomen wird das erfindungsgemäße Lipid-Polymer-Konjugat mit Komponenten vermischt, die normalerweise zur Herstellung von Liposomen verwendet werden, wie z.B. Vesikel-bildende Lipide, Stabilisatoren, usw. Das Konjugat wird in einer molaren Konzentration eingesetzt, die ausreichend ist, um die Zirkulationsdauer der Lipo somen im Blut auf ein Mehrfaches derjenigen von entsprechenden Liposomen, die das Lipid-Polymer-Konjugat nicht aufweisen, auszudehnen. Das Polymer-Konjugat ist typischerweise in einer Menge von 1–15 Mol-%, bevorzugt 3–10 Mol-%, und am meisten bevorzugt 5–7,5 Mol-%, enthalten.
Die durchschnittliche Größe der Liposomen, die durch die dynamische Lichtstreuungstechniken ("Dynamic Light Scattering (DLS) techniques") zu bestimmen ist, liegt unterhalb von 200 nm, bevorzugt unterhalb von 150 nm, und am meisten bevorzugt unterhalb von 100 nm. Die Untergrenze für kolloidale Trägerteilchen dieser Art beträgt 20 nm. Die Lipid-Polymer-Konjugate zeigten bei Einbringung in geladene Liposome die Fähigkeit, das Zeta-Potential zu verringern, was zeigt, dass das Polymerpfropfen die Oberflächenladung abschirmte.
Die Zusammensetzungen können auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, die parenterale Verabreichung ist jedoch bevorzugt. In Abhängigkeit von dem Wirkstoff und der medizinischen Indikation oder der zu behandelnden Krankheit kann die Verabreichung durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intraartikuläre, usw., Injektion erfolgen.
Nach intravenöser Verabreichung der erfindungsgemäßen liposomalen Zubereitungen an Ratten wurde gezeigt, dass die Blutzirkulationszeit der Liposomen je nach dem gewünschten Zweck variiert werden kann. Die Blutzirkulationszeit hängt ab von dem verwendeten Lipid-Polymer-Konjugat, insbesondere von der Wahl der Lipid/Polymer-Kombination, dem Molekulargewicht des Polymers und der Pfropfdichte. Ähnliche Ergebnisse wie die mit den entsprechenden PEG-gepfropften Liposomen wurden z.B. beobachtet für Lipid-PHEG-Konjugate, Lipid-PHEA-Konjugate und Lipid-PDLMS-Konjugate, wobei das amphiphile Lipid einen doppelten hydrophoben Schwanz (PHEG-Diaminobutan DODASuc, PHEA-DODASuc und PDLMS-DODASuc) enthält.
Die Stabilität der mit den erfindungsgemäßen Lipid-Polymer-Konjugaten hergestellten liposomalen Zubereitungen ist gegenüber der von herkömmlichen liposomalen Zubereitungen im Allgemeinen verbessert. Darüber hinaus kann die Stabilität der liposomalen Zubereitungen weiter verbessert werden durch die geeignete Auswahl des Lipid-Polymer-Konjugats. Es versteht sich, dass diese Auswahl auch abhängig ist von der Auswahl des Wirkstoffs. So wird z.B. die Verkapselung eines wasserlöslichen Derivats eines Corticosteroids anstelle des Corticosteroids als solchem in einer liposomalen Zubereitung zu einer erhöhten Stabilität der liposomalen Zubereitung führen. Die Verkapselung von Prednisolonphosphat in einem Polyhydroxyethylasparagin-DODASuc-Konjugat enthaltenden Liposom ergab geringfügig bessere Ergebnisse als die Einarbeitung in ein Poly(2-hydroxyethyl)-L-glutamindiaminobutan-DODASuc-Konjugat-enthaltendes Liposom. Eine weitere Verbesserung der Stabilität kann erreicht werden durch Entfernen des wässrigen Trägers aus der liposomalen Zusammensetzung durch Verfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, wie z.B. das Sprühtrocknen, Gefriertrocknen, die Rotationsverdampfung, usw.
Die in die erfindungsgemäßen kolloidalen Trägerzusammensetzungen eingearbeiteten Lipid-Polymer-Konjugate verleihen diesen Zusammensetzungen lang zirkulierende Eigenschaften. Unter lang zirkulierenden Eigenschaften ist eine Erhöhung der Blutzirkulationszeit der kolloidalen Trägerzusammensetzung zu verstehen, und zwar im Vergleich mit einer solchen Zusammensetzung, die das Lipid-Polymer-Konjugat nicht enthält. Die lang zirkulierenden Eigenschaften können nach Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind (Torchilin VP, Shtilman MI, Trubetskoy VS, Whiteman K., Milstein AM.: Amphiphilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo. Biochimica et Biophysica Acta (1994) 1195: 181–184; Torchilin VP, Trubetskoy VS, Whiteman KR, Caliceti P, Ferruti P, Veronese FM.: New synthetic amphiphilic polymers for steric protection of liposomes in vivo. Journal of pharmaceutical sciences (1995) 84 (9): 1049–1053). Für Liposome wird in den Beispielen ein Verfahren angegeben. Deshalb können solche Zusammensetzungen, und insbesondere die vesikulären Zusammensetzungen, für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Außer als zirkulierendes Wirkstoffreservoir können sie verwendet werden für das passive "Targeting" von Erkrankungsorten (Tumore, Infektionen, Entzündungen) und für das aktive "Targeting" von Zellen im Blutkreislauf des Endotheliums (z.B. von Angiogenese-Rezeptoren), z.B. durch Kopplung an zielsuchende Strukturen ("homing devices"), wie z.B. monoklonale Antikörper. Weitere Anwendungen können künstliche Sauerstofftransportsysteme, die Darstellung eines Blut-Pools und eine Anti-Fouling-Beschichtung für Biomaterialien, wie z.B. Katheter und Blutgefäßprothesen, sein.
Darüber hinaus sind die Lipid-Polymer-Konjugate bioabbaubar und bieten deshalb zahlreiche Vorteile, insbesondere aufgrund der Tatsache, dass kein Risiko der Ansammlung von Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers besteht.
Darüber hinaus haben die Lipid-Polymer-Konjugate gezeigt, dass eine verminderte Lipid-Dosis-Abhängigkeit im Vergleich zu PEG-Liposomen besteht.
Ein weiterer zusätzlicher, jedoch sehr wichtiger Vorteil kann darin bestehen, dass nach einer zweiten Injektion der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine beschleunigte Clearance nicht immer beobachtet wird und dass die Verringerung der Blutzirkulationszeit schwach ist. Dies würde einen signifikanten Vorteil gegenüber mit PEG beschichteten kolloidalen Trägerzusammensetzungen bedeuten.
Die erfindungsgemäßen kolloidalen Trägerzusammensetzungen eröffnen eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten im Bereich der Therapie, Diagnose, Prophylaxe, usw. Aufgrund der Vielseitigkeit der Lipid-Polymer-Konjugate, deren Komponenten entsprechend dem Zweck ausgewählt werden können, und der Verschiedenheit kolloidaler Trägersysteme, aus der ausgewählt werden kann, ergibt sich ohne weiteres, dass es im Allgemeinen möglich erscheinen dürfte, für jeden Wirkstoff eine geeignete kolloidale Trägerzusammensetzung zu entwickeln. Wenn nach der intravenösen Verabreichung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zunächst kein oder nur ein geringer Effekt auf die Blutzirkulationszeit beobachtet wird, kann der Fachmann zahlreiche verschiedene Parameter des Lipid-Polymer-Konjugats (z.B. Molekulargewicht, Pfropfdichte, Polymer, Lipid, usw.) und der Zusammensetzung des kolloidalen Trägers variieren, um die Zirkulationszeit entsprechend den vorgegebenen Anforderungen zu erhöhen. Ein sehr interessanter Effekt wird beobachtet, wenn erfindungsgemäße Zusammensetzungen ein wasserlösliches Corticosteroid als Wirkstoff enthalten. In einem experimentellen in vivo-Arthritis-Modell erschien eine einzige intravenöse Injektion einer solchen Zusammensetzung ebenso wirksam zu sein wie wiederholte Injektionen der nicht-verkapselten Corticosteroid-Verbindung oder wenn diese in herkömmlichen Liposomen eingekapselt ist. Interessierende wasserlösliche Corticosteroide sind Budesonidphosphat und wasserlösliche Derivate von Flunisolid und Fluticasonpropionat. Die vorteilhaften Wirkungen können ein vollständiger und langanhaltender Rückgang Arthritis-bedingter Symptome sein, während Nebenwirkungen aufgrund der Corticosteroid-basierten Therapie vermindert werden durch die Verringerung der zu verabreichenden Menge der Corticosteroide und da nun Corticosteroide verwendet werden können, die normalerweise eine schnelle Clearance aus dem Blut zeigen. Auch bei anderen Erkrankungen, bei denen Corticosteroide die Wirkstoffe der Wahl sind oder als Co-Therapie verwendet werden, werden die günstigen Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erkennbar. Andere Wirkstoffe zeigen jedoch ebenfalls interessante Effekte in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
BEISPIELE
Beispiel 1
Poly(γ-benzyl-L-glutamat) mit einer Heptadecyloctadecylamin-Endgruppe (PBLG-Heptadecyloctadecylamin)
0,94 g (3,6 mmol) γ-Benzyl-L-glutamat-N-carboxyanhydrid (NCA) wurde in 5 ml trockenem DMF unter Stickstoffatmosphäre aufgelöst. Eine Lösung von 25 mg (0,05 mmol) 1-Heptadecyloctadecylamin (Sigma Aldrich) in 1 ml trockenem Chloroform wurde auf einmal zugegeben. Fast sofort bildeten sich Gasblasen (CO₂). Die Lösung wurde 1 Tag bei Raumtemperatur gerührt und dann in einem 10–20fachen Überschuss Wasser gefällt. Der weiße Niederschlag wurde gesammelt und in vacuo getrocknet. Ausbeute: 0,75 g.
Charakterisierung:

¹H-NMR in CDCl₃ (δ in ppm, relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Benzylglutamat: 7,2 (C₆H₅), 5,0 (benzylisches CH₂), 3,9 (α-CH), 2,8 & 2,2 (β & γ CH₂),
Alkylkette: 1,2 (CH₂-Alkylkette), 0,85 (CH₃)

Beispiel 2
Poly(N-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin) mit einer Heptadecyloctadecylamin-Endgruppe (PHEGHeptadecyloctadecylamin)
Zu einer Lösung von 0,60 g PBLG-Heptadecyloctadecylamin (siehe oben) in 5 ml trockenem DMF wurden 0,15 g 2-Hydroxypyridin und 0,8 ml Ethanolamin zugegeben. Diese Lö sung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Die Lösung wurde in einem 10-20fachen Überschuss Diethylether gefällt. Das Produkt wurde gesammelt und in vacuo getrocknet. Das wasserlösliche polymere Produkt wurde 2 Tage lang gegen Wasser in Celluloseester-Dialyseschläuchen (MWCO 500) dialysiert. Gereinigtes PHEG mit den Heptadecyloctadecyl-Endgruppen wurde nach Gefriertrocknen erhalten. Ausbeute: 0,30 g.
Charakterisierung:

¹H-NMR in DMSO-d6 (δ in ppm, relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Hydroxyethylglutamin: 4,1 (α-CH), 2,2 & 1,8-1,9 (β & γ CH₂), 3,4 (CH₂-OH), 3,1 (CH₂-NH₂),
Alkylkette: 1,2 (CH₂-Alkylkette), 0,8 (CH₃).

Anhand des Verhältnisses der Integrale der Stearyl-Signale und des α-CH-Signals wurde das PHEG-Molekulargewicht auf 12.000 geschätzt.
Beispiel 3
Poly[N-(2-hydroxyethyl)-L-glutaminl mit einer Distearylamin-Endgruppe, eingeführt über N-Boc-1,4-diaminobutan als Initiator (PHEG-Diaminobutan-DODASuc)
2,5 g (9,5 mmol) γ-Benzyl-L-glutamat-N-carboxyanhydrid wurden in einem Gemisch aus 2,5 ml trockenem Ethylacetat und 12,5 ml trockenem Dichlormethan aufgelöst, und es wurden 0,95 ml (0,95 mmol) einer 1-molaren Lösung von N-Boc-1,4-diaminobutan in Dichlormethan als Initiator zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Tage unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und anschließend in Methanol gefällt. Ausbeute: 1,48 g PBLG-N-Boc-diaminobutan.
Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃) zeigte N-Boc-1,4-diaminobutan-Signale bei δ 1,4-1,3.
Maldi-TOF-MS:

Masse der Benzylglutaminsäure-Monomer-Einheit: n × 219.
m/z 1417 (n=5), 1636 (n=6), 1855 (n=7), 2074 (n=8), entsprechend den Massen des Natrium-Addukts mit einer N-Boc-1,4-diaminobutangruppe (187 Da) und einer cyclischen Peptid-Endgruppe (112 Da).
m/z 1433 (n=5), 1652 (n=6), 1872 (n=7), entsprechend den Massen des Kalium-Addukts mit einer N-Boc-1,4-diaminobutangruppe (187 Da) und einer cyclischen Peptid-Endgruppe (112 Da).

Entschützung von PBLG-N-Boc-diaminobutan
738 mg PBLG-N-Boc-diaminobutan wurden über 3,5 Stunden in 5 ml einer Lösung aus 4N HCl in Dioxan gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch an einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wurde in 5 ml Tetrahydrofuran aufgelöst und tropfenweise zu 80 ml einer NaHCO₃-Lösung (6,5 g in Wasser) gegeben. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 677 mg PBLG-Diaminobutan.
¹H-NMR (CDCl₃) zeigte, dass die Schutzgruppe erfolgreich entfernt wurde.
Die Maldi-TOF-Massenanalyse zeigte die gewünschte Molmasse.
Masse der Benzylglutaminsäure-Monomer-Einheit: n × 219.
m/z 1318 (n=5), 1537 (n=6), 1756 (n=7), 1976 (n=8), entsprechend den Massen des Natrium-Addukts mit einer 1,4-Diaminobutangruppe (87 Da) und einer cyclischen Peptid-Endgruppe (112 Da).
Kupplung an DODASuc:
62 mg (0,1 mmol) N-Succinyl-Dioctadecylamin (DODASuc, Schmitt et al., J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 19, 8485–8491), 13,7 mg (0,12 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 0,66 mg Dimethylaminopyridin (DMAP) wurden in 2 ml Dichlormethan aufgelöst. Nach Abkühlen auf 0°C wurden 24,6 mg (0,12 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 0°C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der unlösliche Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, und das Filtrat wurde zu einer Lösung von 200 mg PBLG-Diaminobutan in 3 ml Dichlormethan und 14 μl Triethylamin gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Lösung tropfenweise zu Methanol gegeben, filtriert und getrocknet. Ausbeute: 135 mg. Das ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃) zeigte, dass Distearyl vorhanden war, CH₂-Signale bei δ 1,4-1,2 und CH₃-Signale bei δ 0,9-0,8.
Die Maldi-TOF-Massenanalyse zeigte die gewünschte Molmasse, d.h., dass DODASuc an PBLG-Diaminobutan gekoppelt wurde.
m/z 1922 (n=5), 2141 (n=6), 2360 (n=7), 2580 (n=8), 2799 (n=9), 3018 (n=10), entsprechend den Massen des Natrium-Addukts von PBLG-Diaminobutan-DODASuc, mit einer cyclischen Peptid-Endgruppe (112 Da).
Struktur:
Aminolyse.
120 mg PBLG-Diaminobutan-DODASuc und 10,8 mg 2-HP wurden in 1,3 ml Dimethylformamid aufgelöst, und 0,68 ml 2-Aminoethanol wurden zugegeben. Nach 24-stündigem Rühren bei 40°C unter Stickstoff wurde die Lösung tropfenweise zu Chloroform gegeben. Das Produkt wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 83 mg PHEG-Diaminobutan-DODASuc.
¹H-NMR (DMSO) zeigte Distearyl-Signale bei δ 1,2-1,4 (CH₂) und δ 0,8-0,9 (CH₃).
Anhand des Verhältnisses der Integrale der Stearyl-Signale und des α-CH-Signals wurde das PHEG-Molekulargewicht auf 4.000 geschätzt.
Struktur:
Beispiel 4
Poly[N-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin] mit einer Amin-Endgruppe, eingeführt durch Disterarylamin als Initiator (PHEG-Distearylamin)
1,0 g (3,8 mmol) γ-Benzyl-L-glutamat-N-carboxyanhydrid wurde in einem Gemisch aus 1 ml trockenem Ethylacetat und 5 ml trockenem Chloroform aufgelöst. Anschließend wurden 2 ml (0,19 mmol) einer Lösung von 163 mg Distearylamin in 3,26 ml Chloroform zugegeben. Der Kolben wurde mit einem CaCl₂-Rohr versehen, und das Gemisch wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Das Gemisch wurde tropfenweise zu Methanol zugegeben, das Polymer wurde durch Filtration isoliert und in vacuo getrocknet. Ausbeute 757 mg PBLG-Distearylamin.
Reaktion:
Die ¹H-NMR-Analyse (CDCl₃) zeigte die Distearyl-Signale in dem Produkt: CH₃-Signal bei δ 0,9 (t) und CH₂-Signal bei δ 1,3-1,2.
Maldi-TOF-MS:

Masse der Benzylglutaminsäure-Monomer-Einheit: n × 219.
m/z 1971 (n=6), 2190 (n=7), 2410 (n=8), 2629 (n=9), 2848 (n=10), entsprechend den Massen des Natrium-Addukts mit einer Distearylamingruppe (521 Da) und einer cyclischen Peptid-Endgruppe (112 Da).
m/z 2206 (n=7), 2427 (n=8), entsprechend den Massen des Kalium-Addukts mit einer Distearylamingruppe (521 Da) und einer cyclischen Peptid-Endgruppe (112 Da).

Aminolyse.
Die Aminolyse des voranstehend hergestellten PBLG-Distearylamins (600 mg) mit Aminoethanol und 2-Hydroxypyridin als Katalysator in Dimethylformamid ergab 430 mg PHEG-Distearylamin.
¹H-NMR (DMSO-d6) zeigte die Distearylamin-Signale.
Beispiel 5
Poly[N-(hydroxyalkyl)-L-glutamin] mit einer Diaminobutan-DODASuc-Endgruppe
PBLG-DiaminobutanBOC:
Zu einer Lösung von 3 g Benzyl-L-γ-glutamat-N-carboxyanhydrid (NCA) in 8 ml trockenem DMF wurde eine Lösung von 0,1 g N-BOC-1,4-Diaminobutan in 1 ml Chloroform gegeben. Die Bildung eines Gases (Kohlendioxid) wurde während der ersten Stunden beobachtet. Diese Lösung wurde 1 Tag unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Nach Fällung in ca. 100 ml Methanol wurde das Polymer abfiltriert und getrocknet, was 2 g PBLG, enthaltend eine BOC-geschützte Aminogruppe, ergab.
¹H-NMR (CDCl₃) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
BOC: 1,4 (CH₃)
PBLG: 2,2 & 2,6 (β,γ-CH₂), 4,0 (α-CH), 5,0 (benzylisches CH₂), 7,3 (Phenyl)
PBLG-Diaminobutan (Entfernung der BOC-Schutzgruppe):
Eine Lösung von 1,1 g PBLG-DiaminobutanBOC in 5 ml 4N HCl/Dioxan wurde 3–4 Stunden gerührt und anschließend tropfenweise zu ca. 80 ml NaHCO₃-Lösung (6,5 g in Wasser) gegeben. Das Produkt wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in vacuo getrocknet. Ausbeute: 1 g PBLG-Diaminobutan.
¹H-NMR (CDCl₃) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
PBLG: 2,2 & 2,6 (β,γ-CH₂), 4,0 (α-CH), 5,0 (benzylisches CH₂), 7,3 (Phenyl)
Keine BOC-Signale
PBLG-Diaminobutan-DODASuc (DCC-Kupplung):
170 mg N-Succinyl-Dioctadecylamin (DODASuc), 90 mg DCC und 10 mg 4-(Dimethylamino)pyridinium-4-toluolsulfonat (DPTS) wurden in 4 ml Dichlormethan aufgelöst. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von 0,73 g PBLG-Diaminobutan und 40 μl Triethylamin in 3 ml Chloroform wurde zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Lösung (die einen Niederschlag von Dicyclohexylharnstoff enthielt) tropfenweise zu einem Überschuss Methanol (ca. 100 ml) gegeben. Das polymere Produkt wurde abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 0,5 g.
¹H-NMR (CDCl₃) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl-Signale bei 0,8-0,9 (CH₃) und 1,2-1,4 (Methylenprotonen)
PBLG: 2,2 & 2,6 (β,γ-CH₂), 4,0 (α-CH), 5,0 (benzylisches CH₂), 7,3 (Phenyl)
5.1 PHEG-Diaminobutan-DODASuc
PHEG-Diaminobutan-DODASuc wurde durch Aminolyse von PBLG-Diaminobutan-DODASuc mit Ethanolamin wie folgt erhalten:
0,5 g PBLG-Diaminobutan-DODASuc und 15 mg 2-Hydroxypyridin wurden in 4 ml DMF aufgelöst. Anschließend wurden 2 ml Ethanolamin zugegeben. Nach 24-stündigem Rühren bei 40°C unter einer Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung in ca. 100 ml Diethylether gefällt. PHEG-Diaminobutan-DODASuc wurde in Wasser aufgelöst, dialysiert (MWCO 500) und anschließend gefriergetrocknet, was 0,35 g gereinigtes PHEG-Diaminobutan-DODASuc-Konjugat ergab.
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl-Signale bei 0,8-0,85 (CH₃) und 1,2-1,5 (Methylenprotonen)
PHEG: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 3,1 & 3,3 (Hydroxyethyl), 4,2 (α-CH), 4,7 (OH), 7,8 & 8,2 (NH)
Anhand des Verhältnisses der Integrale der Distearyl-Signale und des α-CH-Signals wurde das PHEG-Molekulargewicht zu etwa 4.000 berechnet.
Maldi-TOF bestätigt die Molekularstruktur des PHEG-Diaminobutan-DODASuc-Konjugats.
Na⁺-Addukt: m/z 3064,5 (n=13), 3236,1 (n=14), 3408,7 (n=15), 3580,6 (n=16), 3752,9 (n=17), 3924,7 (n=18), 4096,7 (n=19), 4268,4 (n=20), 4441,1 (n=21), 4613,3 (n=22), 4785,1 (n=23), etc.
5.2 Poly-[(2-hydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc
Poly-[(2-hydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc wurde durch Aminolyse von PBLG-Diaminobutan-DODASuc mit 2-Propanolamin (Isopropanolamin) wie folgt erhalten:
0,15 g PBLG-Diaminobutan-DODASuc und 0,05 g 2-Hydroxypyridin wurden in 4 ml DMF aufgelöst. Anschließend wurde 1 ml 2-Propanolamin zugegeben. Nach 24-stündigem Rühren bei 40°C unter Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung in etwa 100 ml Diethylether gefällt. 0,1 g PHisoPG-Diaminobutan-DODASuc wurden nach dem Trocknen erhalten. Das Polymer wurde in Wasser aufgelöst, dialysiert (MWCO 500) und anschließend gefriergetrocknet, was gereinigtes Poly-[(2-hydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc ergab.
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl-Signale bei 0,8-0,85 (CH₃) und 1,2-1,5 (Methylenprotonen)
PHPG: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 1,0 (CH₃) & 3,0 & 3,3 & 3,7 (Hydroxypropyl), 4,2 (α-CH), 4,7 (OH), 7,8 & 8,2 (NH).
Berechnetes Molekulargewicht: ca. 4000.
5.3 Poly-[(3-hydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc
Poly-[(3-hydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc wurde durch Aminolyse von PBLG-Diaminobutan-DODASuc mit 3-Propanolamin erhalten:
0,3 g PBLG-Diaminobutan-DODASuc und 0,1 g 2-Hydroxypyridin wurden in 4 ml DMF aufgelöst. Anschließend wurden 2 ml 3-Propanolamin zugegeben. Nach 24-stündigem Rühren bei 40°C unter Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung in etwa 100 ml Diethylether gefällt. 0,25 g PHPG5000-Diaminobutan-DODASuc wurden nach dem Trocknen erhalten. Das Polymer wurde in Wasser aufgelöst, dialysiert (MWCO 500) und anschließend gefriergetrocknet, was gereinigtes Polγ-[(3-hydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc ergab.
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl-Signale bei 0,8-0,85 (CH₃) und 1,2-1,5 (Methylenprotonen)
PHPG: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 1,5 & 3,1 & 3,3 (Hydroxypropyl), 4,2 (α-CH), 4,6 (OH), 7,8 & 8,2 (NH).
Molekulargewicht: ca. 5000.
Maldi-TOF:

Na⁺-Addukt: m/z 3623 (n=15), 3810 (n=16), 3996 (n=17), 4182 (n=18), 4368 (n=19), 4555 (n=20), etc.

5.4 Poly-[(4-hydroxybutyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc
Poly-[(4-hydroxybutyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc wurde durch Aminolyse von PBLG-Diaminobutan-DODASuc mit 4-Butanolamin erhalten:
0,3 g PBLG-Diaminobutan-DODASuc und 0,1 g 2-Hydroxypyridin wurden in 4 ml DMF aufgelöst. Anschließend wurden 2 ml 4-Butanolamin zugegeben. Nach 48-stündigem Rühren bei 40°C unter Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung in etwa 100 ml Diethylether gefällt. Das Polymer wurde in Wasser aufgelöst, dialysiert (MWCO 500) und anschließend gefriergetrocknet, was 0,2 g gereinigtes Poly-[(4-hydroxybutyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc ergab.
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl-Signale bei 0,8-0,85 (CH₃) und 1,2-1,5 (Methylenprotonen)
PHBG: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 1,4 & 3,1 & 3,3 (Hydroxybutyl), 4,2 (α-CH), 4,5 (OH), 7,8 & 8,2 (NH).
Molekulargewicht: ca. 4000.
5.5 Poly-[(2,3-dihydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc
Poly-[(2,3-dihydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc wurde durch Aminolyse von PBLG-Diaminobutan-DODASuc mit 2,3-Dihydroxypropylamin erhalten:
0,15 g PBLG-Diaminobutan-DODASuc und 0,06 g 2-Hydroxypyridin wurden in 3 ml DMF aufgelöst. Anschließend wurde 1 ml 2,3-Dihydroxypropylamin zugegeben. Nach 1-tägigem Rühren bei 40°C unter Stickstoffatmosphäre wurde die Lösung in etwa 100 ml Diethylether gefällt. Das Polymer wurde in Wasser aufgelöst, dialysiert (MWCO 500) und anschließend gefriergetrocknet, was 0,1 g gereinigtes Poly-[(2,3-dihydroxypropyl)-L-glutamin]diaminobutan-DODASuc ergab.
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl-Signale bei 0,8-0,85 (CH₃) und 1,2-1,5 (Methylenprotonen)
Poly(dihydroxypropyl)G: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 3,1 & 3,3-3,6 (Dihydroxypropyl), 4,2 (α-CH), 4,6 & 4,8 (OH), 7,8 & 8,2 (NH).
Molekulargewicht: ca. 4000.
Beispiel 6
Cholesteryl-PHEG
Zu einer Lösung von 0,2 g PBLG-NH₂ und 20 μl Triethylamin in 2 ml Chloroform wurde eine Lösung von 0,07 g Cholesterylchlorformiat in 1 ml Chloroform gegeben. Die Lösung wurde etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend in Diethylether gefällt. Nach Isolierung und Trocknung wurden 0,13 g polymeres Produkt erhalten.
Die Aminolyse mit Ethanolamin (2-Hydroxypyridin als Katalysator) über einen Zeitraum von 1 Tag bei 40°C ergab Cholesteryl-PHEG. Das polymere Produkt wurde gereinigt durch Dialyse (MWCO 500).
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
PHEG: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 3,1 & 3,3 (Hydroxyethyl), 4,2 (α-CH), 4,7 (OH), 7,8 & 8,2 (NH).
Cholesteryl: 0,6-1,6.
Molekulargewicht: ca. 4000.
Maldi-TOF bestätigt die Molekularstruktur des Cholesteryl-PHEG-Konjugats.
Na⁺-Addukt: m/z 3046 (n=14), 3218 (n=15), 3390 (n=16), 3562 (n=17), 3735 (n=18), 3907 (n=19), 4080 (n=20), etc.
Beispiel 7
Poly(2-hydroxyethyl)-DL-glutamindiaminobutan-DODASuc
Die Herstellung erfolgt analog zu der von Poly(2-hydroxyethyl)-L-glutamindiaminobutan-DODASuc (Beispiel 5), jedoch mit Abweichungen in einigen Einzelheiten:
γ-Benzyl-DL-glutamin-NCA wurde hergestellt aus einem 1:1-Gemisch aus γ-Benzyl-L- und γ-Benzyl-D-glutamat und aus Ethylacetathexan (ca. 1:5) kristallisiert. Poly(benzyl-DL-glutamin)diaminobutan-BOC wurde in Wasser anstelle von Methanol gefällt.
Poly(Benzyl-DL-glutamin)diaminobutan-DODASuc wurde in Methanol gefällt.
Das NMR-Spektrum ist praktisch identisch mit dem von Poly(2-hydroxyethyl)-L-glutamindiaminobutan-DODASuc (Beispiel 5.1).
Molekulargewicht: ca. 3000.
Beispiel 8
PHEG-Copolymere: Poly(HEG-co-glutaminsäure)diaminobutan-DODASuc; 5% Glutaminsäure
Eine Lösung von 0,14 g PBLG-Diamionbutan-DODASuc, 0,05 g 2-Hydroxpyridin, ca. 1 ml Ethanolamin in 1,5 ml DMF wurde unter Stickstoffatmosphäre einen Tag bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde sodann in Diethylether gefällt. Das Produkt, teilweise Ethanol amin-aminolysiertes PBLG-Diaminobutan-DODASuc (PHEG mit 5% Benzylester-Seitengruppen), wurde isoliert und getrocknet. Das in DMSO aufgenommene NMR-Spektrum zeigte die Gegenwart von 5% nicht-umgesetzten Benzylgruppen.
Das Polymer wurde in 8,5 ml 1 M NaOH aufgelöst und 4 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit 1 N HCl neutralisiert und anschließend einige Tage dialysiert (MWCO 500). Das (bei physiologischem pH-Wert) negativ geladene Copolymer-Lipid-Konjugat (0,1 g) wurde nach Gefriertrocknen der dialysierten Lösung erhalten.
NMR in DMSO zeigte die volle Umwandlung der Benzylgruppen.
Maldi-TOF wurde verwendet, um das Vorhandensein sowohl von Glutaminsäure- als auch von Hydroxyethylglutamin-Monomer-Einheiten zu bestätigen.
Molekulargewicht: ca. 3500.
Beispiel 9
PHEG-Copolymer: Poly(HEG-co-dimethylaminoethylglutamin)diaminobutan-DODASuc; 5% Dimethylaminoethyl-Seitengruppen
Eine Lösung von 0,25 g PBLG-Diaminobutan-DODASuc, 0,08 g 2-Hydroxpyridin und 1 ml Ethanolamin in 2,5 ml DMF wurde unter Stickstoffatmosphäre zwei Tage bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde in Diethylether gefällt. Das teilweise Ethanolamin-aminolysierte PBLG-Diaminobutan-DODASuc (PHEG mit 5% Benzylester-Seitengruppen) wurde isoliert und getrocknet. Das in CDCl₃ aufgenommene NMR-Spektrum zeigte die Gegenwart von 5% nicht-umgesetzten Benzylgruppen.
Eine Lösung von 0,16 g von diesem teilweise Ethanolamin-aminolysierten PBLG-Diaminobutan-DODASuc, 0,06 g 2-Hydroxypyridin, 1 ml N,N-Dimethylethylendiamin in 2,5 ml DMF wurde 1 Tag unter Stickstoffatmosphäre bei 40°C gerührt. Die Fällung in Diethylether ergab ein Pulver, das isoliert und im Vakuum getrocknet wurde. NMR in DMSO zeigte die vollständige Umwandlung der verbleibenden Benzylgruppen. Das Produkt wurde in Wasser aufgelöst und einige Tage dialysiert (MWCO 500) und anschließend gefriergetrocknet. Ausbeute: 0,1 g positiv geladenes PHEG-Copolymer-Lipid-Konjugat.
Molekulargewicht: ca. 4000.
Beispiel 10
Poly(2-hydroxyethyl)-L-asparagin (PHEA) mit einer Stearylamin- bzw. Heptadecyloctadecylamin-Endgruppe
β-Benzyl-L-aspartat-N-carboxyanhydrid (NCA):
Eine Suspension von 5 g β-Benzyl-L-aspartat in 50 ml destilliertem THF, enthaltend ca. 16 ml einer 20%igen Phosgenlösung in Toluol, wurde auf 60–65°C erhitzt (Stickstoffgasstrom über der Lösung). Nach ca. 10 Minuten wurde eine klare Lösung erhalten. Nach ca. 1,5 Stunden wurde die Lösung langsam in etwa 140 ml N-Hexan gegossen. Kristalle bildeten sich fast sofort. Nach weiterer Kristallisierung während einer Nacht bei –20°C wurde das kristalline NCA- Produkt isoliert. Weitere Kristallisierungen aus THF/Hexan und aus heißem Chloroform ergaben 4,3 g feiner Nadeln (Biopolymers 1976, 15(9) 1869–71).
¹H-NMR (CDCl₃) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Benzylgruppe: 7,3 (Phenyl), 5,1 (CH₂)
Aspartat NCA: 2,8 & 3,0 (β-CH₂), 4,5 (α-CH), 6,4 (NH).
Stearyl-PBLA:
Zu einer Lösung von 0,95 g β-Benzyl-L-aspartat-NCA in 2 ml DMF wurde eine Lösung von 0,04 g Stearylamin in 0,5 ml Chloroform gegeben. Nach mehrstündigem Rühren bei 60°C wurde die trübe Lösung in Methanol gefällt. Nach dem Trocknen wurden 0,56 g Poly(benzyl-L-aspartat)stearylamin erhalten.
Heptadecyloctadecyl-PBLA:
Zu einer Lösung von 0,5 g β-Benzyl-L-aspartat-NCA in 2 ml DMF wurden 0,1 g 1-Heptadecyloctadecylamin in ca. 1 ml Chloroform gegeben. Nach 3-tägigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die trübe Lösung in Methanol gefällt. Ausbeute: 0,2 g polymeres Produkt PBLA-Heptadecyloctadecylamin.
Stearyl-/Heptadecyloctadecyl-PHEA:
Die Aminolyse des obigen PBLA-Konjugats unter Verwendung von Ethanolamin und 2-Hydroxypyridin als Katalysator über einen Zeitraum von 1 Tag bei 40°C, gefolgt von der Fällung in Diethylether, ergibt das wasserlösliche Polyhydroxyethyl-L-asparagin (PHEA), enthaltend einen Stearyl- bzw. einen Heptadecyloctadecyl-Schwanz. Die Lipid-Polymer-Konjugate wurden durch Dialyse (MWCO 500) gereinigt.
Stearyl-PHEA:

Maldi-TOF: Na⁺-Addukt m/z 2823 (n=16), 2981 (n=17), 3139 (n=18), 3297 (n=19), 3455 (n=20), 3613 (n=21), etc.

Anhand Maldi-TOF wurde geschlossen, dass jede PHEA-Kette eine freie Amino-Endgruppe enthält.
Heptadecyloctadecyl-PHEA:

NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Heptadecyloctadecyl: 0,8 & 1,2
PHEA: 2,2-2,6 (β-CH₂), 3,1 & 3,4 (Hydroxyethyl), 4,5 (OH + α-CH), 7,8 & 8,3 (NH)
Molekulargewichte: ca. 6000.

Beispiel 11
Poly(2-hydroxyethyl)-L-asparagin-DODASuc
PBLA-DODASuc:
Zu einer Lösung von 1,7 g β-Benzyl-L-aspartat-N-carboxyanhydrid (NCA) in 5 ml DMF wurden 0,2 ml einer 2 M-Lösung von Methylamin in THF gegeben. Die klare Lösung wurde einen Tag gerührt und dann in einem Gemisch aus Methanol (ca. 100 ml) und Wasser (250 ml) gefällt. Ausbeute: 1,3 g PBLA, enthaltend eine Methylamid- und eine Amino-Endgruppe.
Eine Lösung von 0,4 g PBLA, 30 mg DCC, 10 mg DPTS und 100 mg N-Succinyldistearylamin in 5 ml DMSO und 1 ml Chloroform wurde einen Tag gerührt und anschließend in Wasser gefällt. Das polymere Produkt wurde mit Diethylether gerührt/gewaschen und getrocknet.
PHEA-DODASuc
Die Aminolyse von PBLA-DODASuc mit Ethanolamin (unter Verwendung von 2-Hydroxypyridin als Katalysator) in DMF-Lösung über einen Zeitraum von 1 Tag bei 40°C ergab PHEA-DODASuc (0,2 g nach Dialyse und Gefriertrocknung).
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,4 (CH₂-N)
PHEA: 2,4-2,8 (β-CH₂), 3,2 & 3,4 (Hydroxyethyl), 4,6 (α-CH + OH), 7,8-8,5 (NH)
Berechnetes Molekulargewicht: ca. 3000.
Maldi-TOF bestätigt die Molekularstruktur des PHEA-DODASuc-Konjugats:
Na⁺-Addukt: m/z 2084 (n=9), 2243 (n=10), 2401 (n=11), 2559 (n=12), 2718 (n=13), 2876 n=14 etc.
Beispiel 12
Poly(2-hydroxyethyl)-L-asparagin-DSPESuc-Konjugat
Amino-terminiertes PHEA wurde nach Aminolyse von PBLA (Polybenzyl-L-aspartat), erhalten durch die Methylamin-initiierte Polymerisation von Benzyl-L-aspartat-NCA, erhalten. Succinyliertes DSPE (Herstellung analog zu der von DPPE in JACS, 116, 8485 (1994)) beschriebenen Herstellung) wurde zunächst in situ unter Verwendung von DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) in den NHS-Ester umgewandelt:
Eine Lösung von 70 mg succinyliertem DSPE, 20 mg NHS (N-Hydroxysuccinimid), 5 mg DMAP und 30 mg DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) in 2 ml Dichlormethan wurde ca. 3–4 Stunden gerührt. Zu diesem Gemisch wurde eine Lösung von 0,13 g des Amino-terminierten PHEA (Molekulargewicht ca. 4000) in 2 ml DMSO gegeben. Nach Rühren über Nacht wurde das Gemisch in Ether gefällt. Der Niederschlag wurde isoliert, in Wasser aufgelöst und einige Tage dialysiert (MWCO 500). Nach dem Gefriertrocknen wurden ca. 80 mg PHEA-DSPE erhalten.
¹H-NMR (DMSO-d6) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
DSPE: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,4 (CH₂-N)
PHEA: 2,4-2,8 (β-CH₂), 3,2 & 3,4 (Hydroxyethyl), 4,6 (α-CH + OH), 7,8-8,4 (NH)
Berechnetes Molekulargewicht: ca. 4000.
Beispiel 13
Poly(DL-serin)-DODASuc
O-Benzyl-DL-serin-N-carboxyanhydrid (NCA):
Eine Suspension von 2,5 g O-Benzyl-DL-serin in 30 ml destilliertem (trockenem) THF, enthaltend ca. 10 ml einer 20%igen Phosgenlösung in Toluol, wurde auf 60–65°C erhitzt (Stickstoffgasstrom über der Lösung). Nach ca. 5 Minuten wurde eine klare Lösung erhalten. Nach ca. 1,5 Stunden wurde die Lösung langsam in ca. 100 ml N-Hexan gegossen. Das Produkt trennte sich als Öl ab. Das Lösungsmittel wurde abgegossen, und das Öl wurde in ca. 25 ml Ethylacetat aufgelöst, zu dem 100 ml Hexan langsam gegeben wurden. Nach kräftigem Schütteln des Kolbens und Kühlung auf –20°C begann das 0-Benzyl-DL-serin-NCA zu kristallisieren. Ähnliche Kristallisierungen aus Ethylacetat/Hexan und/oder aus Chloroform/Hexan ergaben 2 g kristallines Material (Biopolymers 1976, 15(9) 1869–71).
¹H-NMR (CDCl₃) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Benzylgruppe: 4,5 (CH₂), 7,2 (Phenyl),
Serin-NCA: 3,7 (β-CH₂), 4,4 (α-CH), 5,8 (NH).
Poly(O-Benzyl-DL-serin):
Zu einer Lösung von 0,9 g O-Benzyl-DL-serin-NCA in 2,5 ml DMF wurden 0,08 ml einer Lösung von 2 M Methylamin in THF gegeben. Nach mehrstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung trübe und viskos. Nach einem Tag wurde die viskose ("kristallisierte") Lösung mit Methanol/Wasser gemischt, um das polymere Produkt vollständig auszufällen. Ausbeute: 0,6 g polymeres Produkt Poly(O-Benzyl-DL-serin).
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Benzylgruppen: 4,4 (CH₂), 7,2 (Phenyl)
Polyserin: 3,5 (β-CH₂), 4,7 (α-CH), 8,2 (NH)
Poly(O-Benzyl-DL-serin)-DODASuc:
150 mg N-Succinyl-Dioctadecylamin (DODASuc), 80 mg DCC und 5 mg DPTS wurden in 4 ml Chloroform aufgelöst. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von 0,6 g Poly(O-Benzyl-DL-serin) und ca. 50 μl Triethylamin in ca. 5 ml Chloroform wurde zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Lösung (die einen Niederschlag aus Dicyclohexylharnstoff enthielt) tropfenweise zu einem Überschuss an Methanol (ca. 100 ml) gegeben. Das polymere Produkt wurde abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 0,4 g.
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,6 (CH₂-N)
Benzylgruppen: 4,4 (CH₂), 7,2 (Phenyl)
Polyserin: 3,5 (β-CH₂), 4,7 (α-CH), 8,2 (NH)
Poly(DL-serin)-DODASuc:
0,1 g Poly(O-benzyl-DL-serin)-DODASuc wurden in ca. 4 ml einer 33%igen HBr/AcOH-Lösung aufgelöst und 1 Stunde gerührt. Die Lösung wurde anschließend in Wasser gefällt. Der polymere Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, isoliert und anschließend in 4 ml 1 M NaOH aufgelöst (1–2 Stunden). Die resultierende Lösung wurde mit 1 N HCl-Lösung neutralisiert und anschließend mehrere Tage dialysiert (MWCO 500). Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrocknet. Ausbeute: 20 mg Poly(DL-serin)DODASuc.
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,6 (CH₂-N)
Polyserin: 3,6 (β-CH₂), 4,3 (OH), 5,0 (α-CH), 8,0 (NH)
Anhand des Verhältnisses der Integrale der Disteraryl-Signale und des α-CH-Signals wurde das Polyserin-Molekulargewicht zu ca. 1500 berechnet.
Beispiel 14
Poly-L-threonin-DODASuc
Die Herstellung erfolgt analog zur Herstellung von Poly(D,L-serin)-DODASuc und wurde über O-Benzyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid (NCA), ausgehend von O-Benzyl-L-threonin.HCl und Phosgen, durchgeführt.
Poly-L-threonin-DODASuc (M = ca. 2000):
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,6 (CH₂-N)
Polythreonin: 1,0 (CH₃), 4,0 (β-CH), 4,3 (α-CH), 5,0 (OH), 7,8 (NH)
Beispiel 15
Poly(D,L-methioninsulfoxid)-DODASuc
DL-Methionin-N-carboxyanhydrid (NCA):
Eine Suspension von 2,5 g DL-Methionin in 40 ml destilliertem (trockenem) THF, enthaltend ca. 15 ml einer 20%igen Phosgenlösung in Toluol, wurde auf 60–65°C erhitzt (Stickstoffgasstrom über der Lösung). Eine klare Lösung bildete sich fast sofort. Nach ca. 1 Stunde wurde die Lösung langsam in ca. 140 ml n-Hexan gegossen. DL-Methionin-NCA kristallisierte bei –20°C (dauert einige Tage). Die Umkristallisierung aus Ethylacetat/Hexan ergab ca. 0,7 g kristallines Material (Biopolymers 1976, 15(9) 1869–71)
¹H-NMR (CDCl₃) (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Methionin NCA: 2,0-2,4 (β-CH₂ + CH₃), 4,5 (α-CH), 6,8 (NH)
Poly(DL-methionin):
Zu einer Lösung von 0,7 g DL-Methionin-NCA in 2,5 ml DMF wurden 0,1 ml einer Lösung von 2 M Methylamin in THF gegeben. Nach 1 Tag wurde die trübe Lösung in ca. 100 ml Methanol gefällt und anschließend getrocknet. Ausbeute: 0,33 g polymeres Produkt Poly(DL-methionin).
¹N-NMR in CDCl₃/TF-d (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Polymethionin: 2,0-2,3 (CH₂ + CH₃), 2,6 (CH₂), 4,7 (α-CH).
Poly(DL-methionin)-DODASuc:
80 mg N-Succinyl-Dioctadecylamin (DODASuc), 45 mg DCC und 5 mg DPTS wurden in 2 ml Chloroform aufgelöst. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Eine Lösung von 0,33 g Poly(DL-methionin) und ca. 20 μl Triethylamin in ca. 2,5 ml DMSO wurde zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Lösung (die einen Niederschlag aus Dicyclohexylharnstoff enthielt) tropfenweise zu einem Überschuss an Methanol (ca. 100 ml) gegeben. Das polymere Produkt wurde abfiltriert und getrocknet. Ausbeute: 0,22 g.
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,4 (CH₂-N)
Polymethionin: 1,8 (β-CH₂), 2,0 (CH₃), 2,4 (γ-CH₂), 4,4 (α-CH), 8,1 (NH)
Poly(DL-methioninsulfoxid)-DODASuc:
Mono-Oxidation von Poly(DL-methionin)-DODASuc:
Eine Lösung von 0,3 g Natriumperiodat in 2 ml Wasser wurde langsam zu einer Suspension von 0,2 g Poly(DL-methionin)diaminobutan-DODASuc in ca. 6 ml Essigsäure gegeben. Die resultierende orange/rote Lösung (die nach einigen Stunden gebildet wurde) wurde 1 Nacht lang gerührt. Anschließend wurden ca. 15 ml Wasser zugegeben, und die resultierende oran-gerote Lösung wurde einige Tage dialysiert (MWCO 500). Nach dem Gefriertrocknen wurden 0,25 g Produkt erhalten.
¹H-NMR in D₂O (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,7 (CH₃), 1,2 (CH₂) (breite Peaks)
Polymethioninsulfoxid: 2,0 (β-CH₂), 2,5 (CH₃), 2,8 (γ-CH₂), 4,3 (α-CH), 8,5 (NH)
Berechnetes Molekulargewicht: ca. 4000.
Beispiel 16
Poly(DL-glutamin)-DODASuc
Ein Poly(DL-glutamin)-DODASuc-Konjugat wurde von Ansynth Service B.V. hergestellt unter Verwendung eines Festphasen-Peptid-Syntheseverfahrens (im Maßstab von ca. 50 mg). An ein Harz gebundenes Poly(DL-glutamin) (n=20) wurde unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren schrittweise aufgebaut. An den N-Terminus wurde N-Succinyl-Distearylamin gekoppelt. Der C-Terminus wurde in ein Amid umgewandelt. Das ¹H-NMR-Spektrum bestätigte die Struktur.
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,4 (CH₂-N)
Polyglutamin: 1,7-2,2 (β,γ-CH₂), 4,2 (CH), 6,8 & 7,3 (NH₂), 8,2 (NH)
Beispiel 17
Poly(DL-asparagin)-DODASuc
Ein Poly(DL-asparagin)-DODASuc-Konjugat wurde von Ansynth Service B.V. hergestellt unter Verwendung eines Festphasen-Peptid-Syntheseverfahrens, ausgehend von Fmoc-geschützten Amionsäuren (im Maßstab von ca. 50 mg). An ein Harz gebundenes Poly(DL-asparagin) (n=20) wurde schrittweise aufgebaut. An den N-Terminus wurde N-Succinyl-Distearylamin gekoppelt. Der C-Terminus wurde in ein Amid umgewandelt. Das ¹H-NMR-Spektrum, aufgenommen in DMSO, bestätigte die Struktur.
¹H-NMR in DMSO-d6 (δ relativ zum Lösungsmittel-Peak):
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,4 (CH₂-N)
Polyasparagin: 2,5 (CH₂), 4,5 (CH), 7,0 & 7,4 (NH₂), 8,1 (NH)
Beispiel 18
Poly(D,L-alanin)-DODASuc
95 mg Poly-DL-alanin (Sigma; MG: ca. 2000) wurde in 4 ml DMSO aufgelöst. 40 μl Triethylamin wurden zu dieser Lösung gegeben. Anschließend wurde diese Lösung zu einer Lösung von 0,1 g DODASuc, 70 mg DCC und 5 mg DPTS in 2 ml Chloroform, die 1 Stunde gerührt worden war, gegeben. Nach 1-tägigem Rühren wurde das Gemisch in einem Methanol/Diethylether-Gemisch gefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet.
¹H-NMR, aufgenommen in DMSO:
Distearyl: 0,8 (CH₃), 1,2 (CH₂), 1,4 (CH₂N)
Polyalanin: 1,2 (CH₃), 4,2 (CH), 8,0 (NH)
Beispiel 19
Copolypeptid aus β-Alanin und Hydroxyethyl-L-glutamin
DODASuc-(β-Ala)₃-Glu(OBzI)-(β-Ala)₄-Glu(OBzI)-(β-Ala)₃-Glu(OBzI)-(β-Ala)₂-NH₂:
Das Copolypeptid aus β-Alanin und Benzyl-L-glutamat wurde von Ansynth Service B.V. nach einem Festphasenverfahren, ausgehend von Fmoc-geschützten Monomeren, hergestellt.
C-Terminus: Amid; N-Terminus: DODASuc.
DODASuc-(β-Ala)₃-HEG-(β-Ala)₄-HEG-(β-Ala)₃-HEG-(β-Ala)₂-NH₂:
Anschließend wurden die Benzylglutamat-Einheiten in Hydroxyethylglutamin (HEG)-Einheiten umgewandelt, und zwar durch eine in DMF durchgeführte Aminolysereaktion (Ethanolamin).
Das in DMSO aufgenommene ¹H-NMR-Spektrum zeigte die Abwesenheit/Umwandlung von Benzylgruppen.
Beispiel 20
Herstellung von PHEG-Stearylamin-enthaltenden Liposomen
33,8 mg Ei-Phosphatidylcholin (EPC) (Lipoid Ludwigshafen), 9,67 mg Cholesterin (Sigma Aldrich) und 30,0 mg Poly-[N-(2-hydroxyethyl)-L-glutamin]stearylamin (PHEG-Stearylamin) (synthetisch) wurden abgewogen und in einen 50 ml-Rundkolben überführt. 500 kBq Tritium-markierter Cholesteryloleylether wurden als Lipidmarker zugegeben. Die Lipide und der Marker wurden in etwa 10 ml Ethanol aufgelöst. Anschließend wurde mit einem Rotationsverdampfer über einen Zeitraum von 1 Stunde unter Vakuum bei 40°C zur Trockenheit eingedampft und danach 1 Stunde mit Stickstoffgas gespült.
Zu dem trockenen Lipidfilm wurde PBS gegeben und eine Stunde in Gegenwart von Glaskugeln geschüttelt, um die vollständige Hydratation des Lipidfilms zu ermöglichen.
Die liposomale Suspension wurde in einen Extruder überführt (Avestin, maximales Volumen 15 ml) und unter Druck und Verwendung von Stickstoffgas extrudiert, und zwar 6 Mal durch zwei übereinander angeordnete Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 200 bzw. 100 nm, und 18 Mal durch Filter mit einer Porengröße von 100 nm bzw. 50 nm. Anschließend wurde die liposomale Suspension in einer Dialysekammer (Slide-A-Lyzer, 10.000 MWCO) 2 Mal über 24 Stunden gegen 1 Liter sterilisiertes PBS dialysiert.
Die mittlere Teilchengröße der Liposome wurde mittels Lichtstreuung (Malvern Zetasizer) bestimmt und betrug 93,6 ± 0,9 nm, wobei der Polydispersitäts-Index 0,099 ± 0,02 betrug. Der Lipidverlust während der Herstellung der Liposomen betrug 25%, bestimmt durch Vergleich der letztlich erhaltenen Radioaktivität der Zusammensetzung mit der Aktivität vor dem Extrusionsverfahren. Die Suspension der Liposomen wurde in einer Stickstoffatmosphäre bei 4°C gelagert.
Beispiel 21
Herstellung weiterer Lipid-Polymer-Konjugate-enthaltender Liposome
Liposome wurden unter Verwendung des in Beispiel 20 beschriebenen Filmverfahrens hergestellt. Anstelle von Ei-Phosphatidylcholin wurde Dipalmitoylphosphatidylcholin verwendet. 5 mM HEPES-Puffer wurde zu dem trockenen Lipidfilm gegeben und 5 Minuten in Gegenwart von Glaskugeln geschüttelt, um die vollständige Hydratation des Lipidfilms zu ermöglichen. Die Liposome wurden durch Extrusion klassiert, und zwar 12 Mal durch 2 übereinander angeordnete PC-Membranen mit Porengrößen von 100 und 200 nm. Die resultierenden Liposomdispersionen wurden dialysiert (MWCO 10.000), und die durchschnittlichen Teilchengrößen wurden unter Verwendung der dynamischen Lichtstreuungstechnik bestimmt. Bezüglich der Eigenschaften der liposomalen Zubereitungen siehe Tabelle 1.
Beispiel 22
Vergleichende Kinetik von ³H-markierten Lipid-Polymer-Konjugaten in Liposomen nach einer einzigen intravenösen Injektion bei Ratten
Männliche Ratten (Wistar, Crl: (WI) BR (outbred, SPF-Qualität) (Charles River, Sulzfeld, Deutschland)) hatten freien Zugang zu standardisierter pelletisierter Versuchstiernahrung (Altromin, Code VRF 1, Lage, Deutschland) und Leitungswasser. Intravenöse Einzeldosis-Injektionen von liposomalen Zubereitungen, die jeweils ³H-markierten Cholesteryloleylether (Amersham) mit 40–50 kBq Radioaktivität enthielten (die Zusammensetzungen pro 50 μmol Lipid sind in Tabelle 1 gezeigt), wurden über die Schwanzvene verabreicht. Die verabreichte Gesamt-Lipidmenge betrug 5 μmol, außer in den angegebenen Fällen.
Zu folgenden Zeitpunkten nach der Verabreichung wurden Blutproben über die Schwanzvene jeder Ratte genommen: 5 Minuten und 4, 24 und 48 Stunden. Das Probenvolumen betrug jeweils etwa 300 μl.
Das entnommene Blut wurde in heparinisierte Röhrchen überführt und bei –20°C gelagert.
Ein einzelnes Teilvolumen von 100 μl wurde nach folgendem Verfahren solubilisiert:

• 100 μl wurden in ein Szintillationsgefäß (20 ml) überführt.
• 100 μl Solvable wurden zugegeben. Dieses Gemisch wurde etwa 1 Stunde lang inkubiert.
• 100 μl 1 mM EDTA und 200 μl H₂O₂ 30% würden zugegeben. Dieses Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend über Nacht bei 50°C inkubiert.
• Als Szintillationsflüssigkeit wurde Ultima Gold (10 ml) zugegeben.
• Die Radioaktivität wurde durch LSC gemessen.

Alle Radioaktivitätsmessungen wurden unter Verwendung eines Packard Szintillationszählers (1900TR) durchgeführt. Die Messzeit wurde bis zu einer statistischen Präzision von ±0,2% ausgedehnt, betrug jedoch höchstens 5 Minuten. Das Gerät Packard 1900TR wurde so programmiert, dass der Hintergrund automatisch subtrahiert wurde und "counts" pro Minute (CPM) in Zerfälle ("disintegrations") pro Minute (DPM) umgewandelt wurden.
Bei einigen der erwähnten Zubereitungen wurden die Leber und die Milz der Ratten 48 Stunden nach der Injektion entnommen, und die Lokalisation der Liposomen wurde nach folgendem Verfahren beurteilt:
Die Organe wurden homogenisiert und die Homogenisate auf 25 ml (Leber) oder 5 ml (Milz) verdünnt. 1 ml der verdünnten Homogenisate wurde in Szintillationsgefäße überführt, zu denen anschließend zugegeben wurden:

• 200 ml Solvable (vermischt und Probe über Nacht bei 50°C inkubiert)
• 200 ml 0,5 M EDTA-Lösung
• 250 ml H₂O₂ (30%)-Lösung (über Nacht bei 50°C inkubiert)
• 10 ml Ultima Gold Szintillationsflüssigkeit (verwirbelt und Probe 24 Stunden lang inkubiert).

Anschließend wurden die Proben in einem β-Szintillationszähler 10 Minuten lang gezählt. Die Ergebnisse für einige liposomale Zubereitungen sind in 6 gezeigt.
Die Zusammensetzungen der liposomalen Zubereitungen, die nach Beispiel 21 hergestellt worden sind, und die Ergebnisse, die in den in vivo-Tests dieses Beispiels erhalten wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Zunahme der Blutzirkulationszeit wurde beurteilt, wobei:

• gut eine Wirkung auf die Zirkulationszeit bedeutet, die vergleichbar ist mit der von PEG-DSPE-enthaltenden Liposomen gezeigten Wirkung.
• Moderat eine Wirkung auf die Zirkulationszeit bedeutet, die zwischen denen von PEG-DSPE-enthaltenden Liposomen und denen von "nackten" Liposomen ohne Polymerbeschichtung liegt.
• Geringfügig eine Wirkung auf die Zirkulationszeit unter den vorliegenden Bedingungen bedeutet, die ähnlich zu der von "nackten" Liposomen gezeigten Wirkung ist.

Tabelle 1 Zusammensetzung von Liposomen pro 50 μmol Lipid und Eigenschaften

*: Verabreichtes Gesamt-Lipid 0,5 μmol (siehe 1 und 2)
**: Verabreichtes Gesamt-Lipid 0,05 μmol(siehe 1 und 2)
***: Verabreichtes Gesamt-Lipid 0,005 μmol(siehe 1 und 2)
§: Wenn nach einer Woche eine zweite Injektion (GL 1 μmol) verabreicht wurde, wurde eine Verringerung der Zirkulationszeit für Liposome, enthaltend das Lipid-Polymer-Konjugat von Beispiel 5.1, beobachtet. Die Liposome, enthaltend das Konjugat von Beispiel 11, zeigten ebenfalls eine solche Verringerung, bei zwei Tieren war der beobachtete Effekt jedoch moderat.

Beispiel 23
Herstellung von Liposomen, enthaltend ein Lipid-Polymer-Konjugat, und Prednisolonphosphat
750 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) (Lipoid Ludwigshafen), 220,0 mg Cholesterin (Sigma Aldrich) und 270,0 mg des Lipid-Polymer-Konjugats aus Beispiel 11 bzw. 750 mg Dipalmitoylphopsphatidylcholin, 250,8 mg Cholesterin, 267,6 mg PEG-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) (Avanti Polar Lipids) wurden abgewogen und in einem 100 ml-Rundkolben gemischt. Die Lipide wurden in etwa 30 ml eines 1:1-Gemisches aus Methanol und Chloroform (Lipid-Polymer-Konjugat aus Beispiel 14) oder Ethanol (PEG-DSPE) aufgelöst. Anschließend wurde über einen Zeitraum von 1 Stunde unter Vakuum bei 40°C mit einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und danach 1 Stunde mit Stickstoffgas gespült.
1200 mg Prednisolondinatriumphosphat (PLP) (OPG Nieuwegein) wurden abgewogen und in 12 ml sterilisiertem PBS aufgelöst. Die Lösung wurde zu den getrockneten Lipidfilmen gegeben und 1 Stunde in Gegenwart von Glaskugeln geschüttelt, um die vollständige Hydratation des Lipidfilms zu ermöglichen.
Die liposomalen Suspensionen wurden in einen Extruder überführt (Avestin, maximales Volumen 15 ml) und unter Druck und Verwendung von Stickstoffgas extrudiert, und zwar 6 Mal durch zwei übereinander angeordnete Porenfilter mit einer Porengröße von 200 bzw. 100 nm, 100 nm bzw. 50 nm und 50 bzw. 50 nm. Anschließend wurden die liposomalen Suspensio nen in einer Dialysekammer (Slide-A-Lyzer, 10.000 MWCO) 2 Mal über 24 Stunden gegen 1 Liter sterilisiertes PBS dialysiert.
Die mittlere Teilchengröße der Liposome wurde durch Lichtstreuung (Malvern Zetasizer) bestimmt und betrug etwa 85 bzw. 90 nm, wobei der Polydispersitäts-Index < 0,1 war. Die Verkapselungseffizienz des Prednisolonphosphats wurde nach einem HPLC-Verfahren bestimmt und betrug 2,6%. Die Suspension der Liposome wurde in einer Stickstoffatmosphäre bei 4°C gelagert und erwies sich über einen Zeitraum von mindestens 5 Wochen als stabil, wobei die liposomalen Zubereitungen, die das Lipid-Polymer-Konjugat aus Beispiel 14 enthielten, etwas bessere Ergebnisse zeigten als die liposomalen Zubereitungen, die das Vergleichs-Lipid-Polymer-Konjugat PEG-DSPE enthielten (siehe 3).
Beispiel 24
Beurteilung der Zirkulationszeit und der therapeutischen Wirksamkeit von Prednisolonphosphat-enthaltenden liposomalen Formulierungen im Rattenmodell für Hilfsstoff-induzierte Arthritis
Lewis-Ratten wurden an der Schwanzwurzel subcutan immunisiert mit Hitze-deaktiviertem Mycobacterium tuberculosis in unvollständigem Freund'schem Hilfsstoff. Die Entzündung der Pfoten begann zwischen 9 und 12 Tage nach der Immunisierung, erreichte nach etwa 20 Tagen eine maximale Stärke und klang dann allmählich ab.
Die Beurteilung der Erkrankung wurde durch visuelle Bewertung der Pfotenentzündungsstärke von Tag 10 bis Tag 35 nach der Immunisierung durchgeführt. Als die Entzündungsbewertungen kurz davor waren, Werte in halber Höhe der maximalen Bewertungen zu erreichen (Tag 14–15), wurden alle Ratten in 5er Gruppen mit gleichen durchschnittlichen Bewertungen eingeteilt und behandelt mit einer einzelnen intravenösen Injektion von:

1. 10 mg/kg PLP in PHEA-DODASuc-Liposomen, die nach Beispiel 23 hergestellt wurden, oder
2. 10 mg/kg PLP in PEG-DSPE-Liposomen, die nach Beispiel 23 hergestellt wurden (Vergleichsversuch), oder
3. PBS (Kontrollversuch).

Bei t = 0, 24 und 48 Stunden wurden Blutproben genommen und bezüglich der Plasmakonzentration von liposomalem PLP untersucht.
Das Zirkulationsverhalten, sowohl von PHEA- als auch PEG-Liposomen im Blut ist durch die Plasma-Konzentrationsprofile von PLP gezeigt, die in 4 dargestellt sind. Beide Liposom-Typen zeigten bezüglich der Zirkulations-Halbwertszeit gleich gute Ergebnisse.
5 zeigt die therapeutische Aktivität bei Ratten-Hilfsstoff-Arthritis von 10 mg/kg PLP-PHEA- und 10 mg/kg PLP-PEG-Liposomen im Vergleich zu Kochsalzlösung-behandelten Ratten als Kontrollversuch.

Claims

Lipid-Polymer-Konjugat, erhältlich aus einem amphiphilen Lipid, bestehend aus mindestens einer hydrophoben apolaren Gruppierung und einer hydrophilen polaren Kopfgruppe, und einem Polymer oder einem monomeren Vorläufer dafür mit einer N- und einer C-terminalen Endgruppe, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer eine Poly(aminosäure), ein Poly(aminosäurederivat) oder ein Poly(aminosäureanaloges) ist und dass das Lipid an die N- oder C-terminale Endgruppe des Polymers gebunden ist, wobei das Polymer die folgende Formel aufweist: –[NHCHR(CH₂)_mCO]_n worin: -R definiert ist als: -H, -CH₃, -CHCH₃OR₁, -(CH₂)_xOR₁, -(CH₂)_x-CO-NHR₁, -(CH₂)_x-NH-COR₁, -(CH₂)_x-SO_yCH₃, oder -(CH₂)_xCOOH; -R₁ H oder (C₁-C₄)alkyl, substituiert mit einer oder mehreren Hydroxygruppen oder einer Di(C₁-C₄)alkylaminogruppe, ist; x 0–4 ist; m = 1 oder 0 und y = 1 oder 2.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Lipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phospholipiden, Glycolipiden, Ceramiden, Cholesterin und Derivaten, gesättigt oder ungesättigt, verzweigtkettigen oder geradkettigen C₈-C₅₀-Mono- oder Dialkylaminen, Arylalkylaminen, Cycloalkylalkylaminen, Alkanolen, Aldehyden, Carbohalogeniden oder Alkansäuren und den Anhydriden davon und dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtzahl an C-Atomen 25 oder höher ist.
Konjugat nach Anspruch 2, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Lipid mindestens zwei hydrophobe apolare Gruppierungen enthält.
Konjugat nach Anspruch 3, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Lipid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 1-Heptadecyloctadecylamin, N-Succinyldiocta-decylamin und Distearylphosphatidylethanolamin.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer einen x-Parameter von ≤ 0,65, vorzugsweise von ≤ 0,5 in Wasser aufweist.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer aus α-Aminosäuren und Derivaten oder Analogen davon besteht.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer keine wesentliche Menge an geladenen Gruppen innerhalb eines physiologischen pH-Werts von 4–8 enthält.
Konjugat nach Anspruch 7, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer aus Aminosäuremonomeren, Monomeren von Aminosäureanalogen oder Monomeren von Aminosäurederivaten besteht, die neutral sind oder auf einen physiologischen pH von 4–8 neutralisiert worden sind.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Molekulargewicht zwischen 500 und 75.000, vorzugsweise zwischen 2.000 und 15.000 aufweist.
Konjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer bioabbaubar ist.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer Poly[N-(2-hydroxyethyl)]-L-glutamin ist.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer Poly(2-hydroxyethyl)-L-asparagin ist.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer Poly(D,L-methioninsulfoxid) ist.