KR100874847B1 - 지질-폴리머-접합체 - Google Patents
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Abstract
폴리-[N-(2-히드록시에틸)-글루타민](PHEG)와 같은, 폴리-(아미노산), 폴리-(아미노산 유도체) 또는 폴리-(아미노산 유사체)의 지질 접합체가 제공된다.
지질-폴리머 접합체, 폴리-(아미노산), 폴리-(아미노산 유도체), 폴리(아미노산 유사체)
Description
본 발명은 지질-폴리머-접합체, 그들의 제조 및 그들의 사용에 관한 것이다.
지질-폴리머-접합체는 잘 알려져 있으며, 다양한 여러 적용들에 사용된다. 그들중 하나가 리포솜, 니오좀 및 역 소포와 같은 소포성 이중층 계, 미셀계, 나노캡슐, 나노스피어 등과 같은, 콜로이드상 담체 조성물로의 포함물이다. 이 같은 콜로이드상 담체 조성물중 잘 알려진 대표물은 리포솜에 의해 형성된다. 이후 특별히 리포솜이 언급되지만, 논의, 개시 및 교시는 다른 콜로이드상 담체 조성물에도 관한 것임을 독자는 명심해야 한다.
콜로이드상 담체 입자 군에 속하는 리포솜은, 수성 공간을 둘러싸는 하나이상의 동심성 지질 이중층으로 구성되는 작은 소포이다. 크기, 표면 전하, 지질 조성물, 이중층 유동성에 의한 그들의 구조적 가변성 및, 거의 모든 약물을 캡슐화하는 그들의 능력으로 인해, 약물 전달계로서의 그들의 중요성은 쉽게 인정되었다. 그러나, 그들은 리포솜의 정맥내 주사중에, 단핵성 식세포계(MPS)에 의해 이물입자로서 인식되어, 순환에서 간, 비장 및 골수와 같이, 포식세포가 풍부한 기관으로 빠르게 제거된다. 리포솜의 입자 크기를 감소시키는 것 및 리포솜의 표면 전하를 변화시키는 것과 같은, 이 효과를 감소시키기 위한 몇개의 가능성이 확인되었다. 또 다른 개발은 리포솜 표면위에 특이적 친수성 중합 성분을 도입하는 것에 의한 리포솜의 표면 변형에 관한 것으로, 그들 기는 입자 표면위에서의 단백질 흡수를 감소시킨다. 따라서, 그같은 리포솜은 MPS의 세포에 의한 인식에 대해 보호되며, 일반적인 순환에서 길어진 체류 시간을 갖는다. 리포솜 표면의 변형에 대한 잘 알려진 예는, 리포솜 조성물의 제조동안 친수성 폴리머 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 대한 지질 유도체의 병합이다. 통상적으로 이 폴리머는 포스파티딜에탄올아민 유도체 또는 긴-사슬 지방산의 잔기인 소수성 부분으로 종결-변형된다. 폴리에틸렌 글리콜 그 자체는 다소 안정한 폴리머로, 단백질 부착에 대한 기피제이며, 생리적 조건하에서 효소 또는 가수 분해되지 않는다. 다양한 동물종 및 인간에게 또한, PEG-그래프팅된 표면을 갖는 리포솜의 정맥내 투여 후 혈장 반감기의 연장 및, 포식세포가 풍부한 기관내로의 축적 감소에 대한 좋은 결과를 얻었다(Storm G., Belliot S. O., Daemen T. and Lasic D. D.: Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system in Adv. Drug Delivery Rev. 17, 31-48, (1995); Moghimi S. M., Hunter A. C. and Murray J. C.: Long-circulating and target-specific nanoparticles; theory to practice in Pharmacol. Rev. 53, 283-318, (2001); Boerman O. C., Dams E. T., Oyen W. J. G., Corstens F. H. M. and Storm G.: Radiopharmaceuticals for scintigraphic imaging of infection and inflammation in Inflamm. Res. 50, 55-64, (2001)). 독소루비신을 함유하는 그같은 리포솜 제제에 대해 시판 승인을 얻었다.
반면, 장시간-순환하는 리포솜중의 폴리머 폴리에틸렌 글리콜의 사용에 대해 몇개의 단점에 직면하였다. 대식세포 및 피부중 PEG-그래프팅된 리포솜의 축적은 비-생분해성에 일부 관련이 있다. 두번째의 PEG-리포솜의 주사중에 장기-순환 특성(빠른 제거율)의 손실이 관찰되었다(Dams E. T., Laverman P., Oijen W. J., Storm G., Scherphof G. L., Van der Meer J. W., Corstens F. H. and Boerman O. C.: Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeated injections of sterically stabilized liposomes in J. Pharmacol. Exp. Ther. 292, 1071-1079, (2000)). 환자들에 PEG-리포솜을 사용한 최근 연구들은, PEG-리포솜이 급성 부작용(얼굴 홍조, 흉부의 조임, 숨참, 혈압 변화)을 유발할 수 있으며, 이는 PEG-리포솜 제형의 투여(주입)가 종결될 때 즉각적으로 해결됨을 보였다. 최근 데이터는 부작용 유발에서 보체 활성의 역활을 지적한다(Szebeni J., Baranyi L., Savay S., Lutz H., Jelezarova E., Bunger R. and Alving C. R.: The role of complement activation in hypersensitivity to Pegylated liposome doxorubicin (Doxil) in J. Liposome Res. 10, 467-481, (2000)). 지금까지 상업적으로 이용가능한 PEG-리포솜 기재 제제는 수성 현탁액 제제이다. 일반적으로 리포솜 수성 현탁액 제제의 저장 수명 및 PEG 리포솜의 저장수명 또한 다소 제한된다는 것이 잘 알려져 있다. 분무-건조, 투석여과, 회전 증발 등과 같은, 그같은 제제에 대한 운반체 또는 연속 상의 제거 방법의 몇몇 기술들이 알려져 있으며, 바람직하게는 동결건조이다. 최근, 테크네튬-킬레이터 히드라진 니코틴 아미드를 함유하는 PEG-리포솜의 장기간의 저장 수명을 개선시키는 동결건조 방법이 제안되었으나(Laverman P., van Bloois L., Boerman O. C., Oyen W. J. G., Corstens F. H. M. and Storm G.: Lyophilisation of Tc-99m-HYNIC labelled PEG liposomes in J. Liposome Res. 10 (2 & 3), page 117-129 (2000)), 결과 및 이 기술을 리포솜 제제에의 적용에는 더 많은 연구가 요구된다.
폴리에틸렌 글리콜의 사용에 대한 고유의 단점은 대안적인 폴리머를 찾도록 연구를 촉구하였다. 많은 폴리머가, 리포솜내로의 병합을 위해 (소포-형성)지질과 함께 그들을 유도하는데 적합한 후보물질로서 제안되었다(예를 들어, EP-0688207를 보라). 친수성 수용성 폴리머 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(아크릴로일몰포린), 폴리(2-(m)에틸-2-옥사졸린, 폴리아크릴아미드 및 폴리글리세롤이 정맥내 투여 후 어느 정도로까지 리포솜의 순환 시간을 길게한다는 것을 보였다. 그러나 지금까지 그같은 지질-폴리머 접합체는, 주로 그들이 알려진 지질-PEG-접합체에 대해 어떠한 장점도 보이지 않는다는 이유로, 상업적으로 이용가능한 약물 제제에 적용되지 않았다. 결과, 리포솜과 같은 콜로이드상 담체 조성물내로 병합할 수 있도록 지질과 함께 유도될 수 있며, 장기-순환 특성을 가지며, 이것에 덧붙여 생분해가능성과 같은 PEG에 대해 장점을 갖는 폴리머를 찾으려는 요구가 여전히 존재한다.
발명의 개요
적어도 하나의 소수성 무극성 부분 및 하나의 친수성 극성 머리기로 구성되는 양쪽 친화성의 지질, 그리고 N- 및 C-종결 말단기를 갖는 폴리머 또는 그들에 대한 모노머 선구물질로부터 얻을 수 있는 지질-폴리머 접합체를 제공하며, 여기에서 폴리머는 폴리-(아미노산), 폴리-(아미노산 유도체) 또는 폴리-(아미노산 유사체)이며, 지질은 폴리머의 N 또는 C 종결 말단기에 공유적으로 부착되며, 폴리머는 다음 식을 갖는다:
적어도 하나의 소수성 무극성 부분 및 하나의 친수성 극성 머리기로 구성되는 양쪽 친화성의 지질, 그리고 N- 및 C-종결 말단기를 갖는 폴리머 또는 그들에 대한 모노머 선구물질로부터 얻을 수 있는 지질-폴리머 접합체를 제공하며, 여기에서 폴리머는 폴리-(아미노산), 폴리-(아미노산 유도체) 또는 폴리-(아미노산 유사체)이며, 지질은 폴리머의 N 또는 C 종결 말단기에 공유적으로 부착되며, 폴리머는 다음 식을 갖는다:
-[NHCHR(CH2)mCO]n-,
여기서 -R은 -H,-CH3,-CHCH30R1,-(CH2)xOR1
,-(CH2)x-CO-NHR1, -(CH2)x-NH-CO-R1
, -(CH2)x-SOyCH3, 또는 -(CH2)xCOOH로 정의되고; -R1은 H 또는 하나이상의 히드록시기 또는 하나의 디(C1-C4)알킬아민기로 치환된 (C1-C4)알킬이고; x는 0-4이고; m = 1 또는 0이고, y = 1 또는 2이다. 또한 그같은 접합체를 제조하기 위한 방법 및 접합체의 사용이 제공된다.
도 1은 다른 지질 총 량을 갖는 PEG-DSPE-함유 리포솜 제제에 대해, 시간대 혈액 샘플중에 주사된 투여량에 대한 계산된 백분율의 평균 값을 그래프로 표현한 것이다(실시예 22).
도 2는 다른 지질 총 량을 갖는 PHEA-DODASuc-함유 리포솜 제제에 대해, 시간대 혈액 샘플중에 주사된 투여량에 대한 계산된 백분율의 평균 값을 그래프로 표현한 것이다(실시예 22).
도 3은 시간대 PEG-DSPE 및 PHEA-DODASuc 각각을 함유하는 리포솜 제제중의 캡슐화된 프레드니솔론 포스페이트의 백분율을 그래프로 표현한 것이다(실시예 23).
도 4는 시간대 혈액중 PEG-DSPE 및 PHEA-DODASuc 함유 리포솜중의 캡슐화된 프레드니솔론 포스페이트의 농도를 그래프로 표현한 것이다(실시예 24).
도 5는 식염수 및 프레드니솔론 포스페이트-함유 리포솜(각각 PEG-DSPE 및 PHEA-DODASuc로 코팅됨)의 단일 정맥내 주사 전과 후, 시간대 발 염증 점수를 그래프로 표현한 것이다(실시예 24).
도 6은 지질-폴리머-접합체로서, PEG-DSPE, PHEG-디아미노부탄 DODASuc, PHPG 디아미노부탄 DODASuc, PHBG 디아미노부탄 DODASuc 및 PHEA-DODASuc 각각을 함유하는 리포솜, 및 종래의 리포솜(BARE)의 정맥내 투여후, 간, 비장 및 간+비장에서 발견된 리포솜에 대한 주사된 투여량의 백분율을 그래프로 표현한 것이다(실시예 21).
발명의 상세한 설명
본 발명의 조성물중의 양쪽 친화성의 지질-폴리머-접합체는 양쪽 친화성의 지질, 및 폴리머 또는 그들의 모노머 선구 물질로부터 얻을 수 있다.
발명에 따른 지질-폴리머 접합체에 사용되는 양쪽 친화성의 지질은, 소포형성 지질 및 막 지질과 같은, 적어도 하나의 소수성 무극성 꼬리 및 친수성 극성 머리 기로 구성되는, 다양한 합성의 또는 자연적으로 발생하는 지질로부터 선택될 수 있다.
지질-폴리머 접합체에 사용되는 양쪽 친화성의 지질의 중요한 특징은, 지질이 폴리머 사슬에 공유 부착하기에 적합한 극성 머리기에서 작용기를 함유한다는 것이다. 극성 머리기는, 예를 들어 1차 또는 2차 아민기, 히드록시기, 알데히드기, 할라이드 또는 카르복실기이다. 지질의 소수성 부분은 리포솜과 같은 이중층 구조 내로 지질-폴리머 접합체를 병합할 수 있으며, 닻으로서의 역활을 한다.
양쪽 친화성의 지질에 대한 예는 인지질, 당지질, 세라마이드, 콜레스테롤 및 유도체, 포화 또는 부분적으로 불포화되며, 분지쇄 또는 직쇄의 C8-C50 모노 또는 디알킬아민, 아릴알킬아민, 시클로알킬아민, 알카놀, 알데히드, 카르보할라이드 또는 알카노산 및 그들의 무수물이며, 여기에서 C-원자의 총 수는 바람직하게는 25이상이다.
보다 구체적으로는, 적절한 양쪽 친화성의 지질에 대한 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 스핀고미엘린, 스테아릴아민, 미리스틸알콜, 콜레스테롤 및 팔미트산이다.
지질-폴리머-접합체중의 바람직한 양쪽 친화성의 지질은 상기에서 설명된 바와 같이, 두개의 소수성 사슬, 전형적으로 알킬 사슬, 및 작용기를 함유하는 극성 머리기를 갖는 지질이다. 포스파티딜 에탄올아민 유도체 및, 특히 디스테아릴 포스파티딜에탄올아민이 반응성 아미노기를 함유하기 때문에 그같은 바람직한 인지질이다.
보다 바람직한 양쪽 친화성의 지질은 친수성 극성 머리기로서 1차 또는 2차 아민, 및 2개의 포화 또는 불포화된 C8-C50 분지쇄 또는 직쇄의 소수성 무극성 부분을 갖는다. 그들의 예는 디스테아릴아민 및 N-숙시닐디옥타데실아민 (DODASuc)과 같은, 1-헵타데실옥타데실아민 및 디스테아릴아민-함유 화합물이다.
본 발명의 지질-폴리머-접합체의 폴리머 부분은 폴리-(아미노산), 폴리- (아 미노산 유도체) 또는 폴리-(아미노산 유사체)에 의해 형성된다. 폴리-(아미노산 유도체)는 하나이상의 치환체가 부착된 아미노산 모노머로 구성되는 폴리머이다. 그들의 예는 폴리(2-히드록시에틸)-L-글루타민이다. 여기에서 개시된 폴리-(아미노산 유사체)는 폴리머로, 여기에서 아미노산 모노머의 탄소원자 사슬 길이는 감소되거나 또는 연장된다. 그들의 예는 폴리(-호모세린) 및 폴리(펜타호모세린)이다.
폴리머는 폴리머 사슬 전체에서 동일한 모노머로 구성되는, 호모-폴리머이다. 폴리머 부분이 폴리-(아미노산), 폴리-(아미노산 유도체) 및 폴리-(아미노산 유사체)로 구성되는 군으로부터 선택된 블록 공중합체로 구성되거나, 또는 폴리머 부분이 일련의 교대 모노머 또는 조절된 순서의 모노머에 의해 또는 하나이상의 아미노산, 아미노산 유도체 및 아미노산 유사체로 구성되는 군으로부터 선택된 적절한 모노머의 무작위 중합에 의해 형성되는 것 또한 가능하다. 폴리머는 선형 또는 분지형이며, 그래프트 폴리머를 포함할 수도 있으나, 바람직하게는 선형이다.
유용한 아미노산은 천연적으로 발생하는 α-아미노산이다. 그러나, 비-단백질 또는 비-천연적으로 발생하는 아미노산 뿐만 아니라 β-아미노산 역시 중요한 듯 보였다. 아미노산 및 그 유도체의 L- 및 D-입체배치 둘 모두가 사용될 수 있다. 지질-폴리머-접합체중의 폴리머의 아미노산 서열이 L-아미노산의 잔기에 의해 형성될 때, 결과로 얻어지는 폴리머는 효소 분해될 것이다. 이에 반해, 본 발명의 지질-폴리머-접합체중의 폴리머의 아미노산 서열이 D-아미노산에 의해 형성될 때, 결과로 얻어지는 폴리머는 펩티드-분해 효소에 대해 안정할 것이다. 또한 L- 및 D-아미노산의 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리머들의 다른 특성들을 고려하여, 본 발 명의 지질-폴리머-접합체가 병합되는 콜로이드상 담체 입자의 표면 변형은 접합체의 제조를 위한 L-및/또는 D-형의 출발 재료의 선택적 사용에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 지질 폴리머-접합체내로의 병합에 적절한 폴리-(아미노산), 폴리-(아미노산 유도체) 및 폴리(아미노산 유사체) 화합물의 중요한 특성은, 그들이 물에 용해가능하다는 것이다(물 100부중 적어도 1부, 바람직하게는 물 30부중 1부, 가장 바람직하게는 물 10부 또는 그 미만중 1부). 폴리머는 또한, 물중에서의 그들의 χ-파라미터에 의해 특징지어질 수도 있다. 이 폴리머-용매 상호작용 파라미터는, 예를 들면 막 삼투압 측정에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 지질-폴리머 접합체에 유리하게 사용될 수 있는 폴리머는, 물중에서 χ-파라미터 ≤ 0. 65, 바람직하게는 ≤ 0.5를 갖는다.
폴리머의 보다 중요한 특징은, 그들이 4-8의 (생리적)pH 범위내에서 실질적인 양의 하전된 기를 함유하지 않는다는 것이다. 바람직하게는, 중성 아미노산 모노머 또는 아미노산 유사체 모노머가 중성이거나 또는 중성화된 폴리머 또는 아미노산 유도체 모노머의 제조에 사용된다. 나타난 바와 같이, 하전된 기는 본 발명에 따른 콜로이드상 담체 조성물의 장기의 순환 특성을 손상하지 않고 낮은 백분율로 존재하도록 할 수 있다. 2-히드록시에틸-L-글루타민과 하전된 모노머의 공중합체에 대해 설명된 바와 같이, 양으로 하전된 기는 음으로 하전된 기보다 더 큰 백분율로 존재하도록 할 수 있다.
폴리머의 제조에 적절한 모노머는 다른 알라닌, 트레오닌, 발린, 사르코신, α-아미노아디프산, α,γ-디아미노부티르산 유도체, 오르니틴, 글루타민산을 포함하는 글루타민 및 유도체, 아스파라트산을 포함하는 아스파라긴 및 유도체, 리신 유도체, 메티오닌 및 유도체, 호모세린 및 펜타호모세린과 같은 추가의 CH2기를 갖는 세린, 그 유도체 및 유사체 중 하나이다. 적절한 측면기는 폴리머가 수용성인 것을 조건으로 하여, (C1-C4)-알킬, 히드록시알킬, 디히드록시알킬, 산 아미드 및 아릴기 또는 그들의 조합물을 포함한다. 그들 기에 대한 예는 2-히드록시에틸, 3-히드록시프로필, 4-히드록시부틸 및 2,3-디히드록시프로필이다. 사용될 수 있는 폴리머는 예를 들어 폴리(D,L-세린)(PDLS), 폴리(2-히드록시에틸)-D,L-글루타민(PDLHEG), 폴리(2-히드록시부틸)-L-글루타민(PHBG) 및 공중합체 폴리(HEG-코-글루타민산) 1% 글루타민산(PHEG 1%GA)이다. 바람직한 폴리머는 폴리(D,L-글루타민)(PDLG), 폴리(D,L-아스파라긴)(PDLA), 폴리(히드록시프로필)-L-글루타민(PHPG), 폴리(2-히드록시프로필)-L-글루타민(P2HPG) 및 베타-알라닌과 2-히드록시에틸-L-글루타민(PbAHEG)의 공중합체, 5% 및 1% 디메틸아미노에틸 측면기를 함유하는 폴리(HEG-코-디메틸아미노에틸-글루타민)(PHEG 5%DG 및 PHEG 1%DG)이다. 보다 바람직한 폴리머는 호모폴리머 폴리-[N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민](PHEG), 폴리(2-히드록시에틸)-L-아스파라긴 (PHEA) 및 폴리(D,L-메티오닌술폭시드) (PDLMS)이다.
폴리머 사슬은 5 내지 500사이, 바람직하게는 20 내지 100사이의 모노머 소 단위를 함유한다. 폴리머의 평균 분자량은 500 내지 75,000, 바람직하게는 2,000 내지 15,000으로 다양하다. 평균 분자량은 기술분야에서 알려진 여러 방법들로 평가될 수 있다. 본 출원의 실시예에서, 분자량의 추정은 NMR-데이터를 토대로 이루어졌다.
본 발명의 조성물내에 병합되는 지질-폴리머-접합체의 제조를 위해, 아미노산 모노머의 측쇄중의 반응기가 지질의 중합 및 짝지음에 앞서 보호되는 제조방법이 바람직하게 사용된다.
지질-폴리머-접합체는 기술분야에서 알려진 방법에 따라서 제조될 수 있다. 아미노산의 폴리머를 제조하기 위한 잘-알려진 방법은, 선택적으로 하나이상의 보호기를 제공하고, (C1-C4) 알킬 1차 아민과 같은 친핵체에 의해 개시되는, 해당하는 아미노산 N-카르복시-무수물(NCA)의 개환 중합을 포함한다. 지질-폴리머-접합체를 얻기위한 또 다른 방법은 개환 NCA 중합에서 개시체로서, 보호된 작용기를 갖는 아민, 예를 들어 N-Boc-1,4-디아미노부탄의 사용을 포함한다. 두개의 여분의 단계, 일명 작용기의 탈보호 및 그 후의 지질과 반응기와의 짝지음이 이 공정에서 필요로 되지만, 이 방법에 의해 제조된 지질-폴리머-접합체는 또한 본 발명의 콜로이드상 담체 조성물내로의 병합에 적절하다.
양쪽 친화성의 지질이 C8-C50 분지쇄 또는 직쇄의- 모노- 또는 디-알킬,-히드록시알킬 또는 -알킬렌 아민, 알카놀 또는 세라마이드일 경우, 이것은 개환 중합 공정에서 개시체로서 유리하게 사용될 수 있다. 이것은 중합동안, 1단계로 양쪽 친 화성 지질이 폴리머에 짝지음되는 것을 의미한다. 폴리-아미노산의 분자량은 용매 또는 용매들의 조합물, 사용된 화합물의 순도 및 모노머/중합 개시체의 비율에 강력하게 좌우된다. 일반적으로 말해, 모노머/중합 개시체의 비율이 커질수록, 폴리머의 분자량이 커지게 될 것이다.
미리 정의한 조성물에 대한 폴리머가 제조될 때, 고체상 펩티드 합성 방법이 바람직하게 사용된다.
폴리머의 반복 단위중에 존재하는 보호기는, 2-아미노에탄올, 3-아미노프로판올 또는 2,3-디히드록시프로필아민과 같은 아미노-알콜을 사용한 가아민 분해에 의해 제거될 수 있다.
본 발명의 지질-폴리머-접합체는, 니오좀 및 역 소포과 같은 소포성 이중층 계, 미셀계, 나노캡슐, 나노스피어 등과 같은 발명의 콜로이드상 담체 조성물내로 유리하게 병합될 수 있다. 바람직한 콜로이드상 담체 계는 소포성 이중층 계이다.
리포솜의 제조중에서, 발명에 따른 지질-폴리머-접합체는, 소포-형성 지질, 안정제 등과 같은, 리포솜의 제조에 통상적으로 사용되는 성분들과 혼합된다. 접합체는 폴리머-지질 접합체가 없는 해당 리포솜의 것에 대해 수배로 리포솜의 혈액 순환 시간을 연장하는데 충분한 몰 농도로 포함된다. 폴리머 접합체는 전형적으로 1-15 몰 퍼센트, 바람직하게는 3-10 몰 퍼세트, 가장 바람직하게는 5-7.5 몰 퍼센트로 포함된다.
역동적 광 산란(Dynamic Light Scattering) (DLS) 기술에 의해 결정된, 리포솜의 평균 크기는 200nm이하, 바람직하게는 150nm이하, 가장 바람직하게는 100nm 이하이다. 그같은 타입의 콜로이드상 담체 입자에 대한 하한은 20nm이다.
하전된 리포솜내에 병합될 때, 폴리머-지질-접합체는 제타전위를 감소시키는 능력을 나타내어, 결과 폴리머 그래프팅이 표면 전하를 차폐함을 설명하였다.
조성물은 여러 방법으로 투여될 수 있으나, 비경구 투여가 바람직하다, 활성 성분 및 치료될 의학적 적응증 또는 질병에 따라, 투여가 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 관절내 등의 주사에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 리포솜 제제의 랫트에의 정맥내 투여후, 리포솜의 혈액 순환 시간이 원하는 목적에 따라서 다양화될 수 있음을 보였다. 혈액 순환 시간은 사용된 지질-폴리머-접합체, 상세하게는, 지질/폴리머 조합물의 선택, 폴리머의 분자량 및 그래프팅 밀도에 좌우된다. 해당하는 PEG-그래프팅된 리포솜으로 얻어진 것들에 유사한 결과들이, 예를 들어 지질-PHEG-접합체, 지질-PHEA-접합체 및 지질-PDLMS-접합체에 대해 관찰되며, 여기에서 양쪽 친화성의 지질은 이중의 소수성 꼬리 (PHEG-디아미노부탄 DODASuc, PHEA-DODASuc 및 PDLMS-DODASuc)를 함유한다.
본 발명에 따라서 지질-폴리머 접합체로 제조된 리포솜의 제제의 안정성은 종래의 리포솜 제제의 것과 비교하여 일반적으로 개선된다. 이것에 덧붙여, 리포솜 제제의 안정성은 지질-폴리머-접합체의 적절한 선택에 의해 더욱 개선될 수 있다. 이 선택은 또한 활성 약물의 선택에 좌우됨이 명백할 것이다. 예를 들어, 코르티코스테로이드 그 자체 대신에 코르티코스테로이드의 수용성 유도체의 리포솜 제제내로의 캡슐화는 리포솜 제제의 안정성의 증가를 초래할 것이다. 프레드니솔론 포스페이트의 폴리히드록시에틸아스파라긴-DODASuc-접합체-함유 리포솜내로의 캡슐화는 폴리 (2-히드록시에틸)-L-글루타민-디아미노부탄 DODASuc-접합체-함유 리포솜내로의 병합보다 약간 더 나은 결과를 제공하였다. 안정성에 대한 보다 나은 개선은 분무-건조, 동결-건조, 회전 증발 등과 같은, 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 리포솜 조성물로부터 수성 운반체를 제거함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 콜로이드상 담체 조성물내로 병합된 지질-폴리머 접합체는, 그들 조성물에 장기-순환 특성을 제공한다. 장기-순환 특성하에서,지질-폴리머-접합체를 함유하지 않는 조성물과 비교하여, 콜로이드상 담체 조성물의 혈액 순환 시간의 증가가 이해될 것이다. 장기-순환 특성은 기술분야에서 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다(Torchilin VP, Shtilman MI, Trubetskoy VS, Whiteman K, Milstein AM.: Amphiphilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo. Biochimica et Biophysica Acta (1994) 1195: 181-184; Torchilin VP, Trubetskoy VS, Whiteman KR, Caliceti P, Ferruti P, Verones FM.: New synthetic amphiphilic polymers for steric protection of liposomes in vivo. Journal of pharmaceutical sciences (1995) 84 (9): 1049-1053). 리포솜에 대한 방법이 실시예로 제공되었다. 결과 그같은 조성물 및 특히 소포성의 것들이, 다양한 적용들에 사용될 수 있다.
순환 약물 저장소로서를 제외하고는, 그들은 예를 들어 단클론 항체와 같은 귀착 장치에 짝지음함으로써 내피에(예를 들어, 혈관생성-관련 수용체에), 병리 부위(종양, 감염, 염증)를 수동적으로 타케팅하는데 및 혈류중 세포를 능동적으로 타케팅하는데 사용될 수 있다. 추가의 적용들이 인공 산소 송달계, 혈액-저류 영상화 및, 카테터 및 혈관 삽입물과 같은 생체재료에 대한 항-폴딩(foulding) 코팅될 수도 있다.
이것에 덧붙여, 지질-폴리머 접합체는 생분해성으로, 특히 인간 또는 동물 신체의 세포중에 축적될 위험이 없다는 사실로 인해, 결과 많은 잇점을 제공한다.
더욱이, 지질-폴리머-접합체는 PEG-리포솜과 비교하여, 감소된 지질-투여량 의존성을 나타내었다.
또 다른 추가로, 본 발명에 따른 조성물의 제 2 주사후 증가된 제거율이 항상 관찰되지 않는다는 것과 혈액 순환 시간에서의 감소가 중등도이라는 것은 매우 중요한 잇점이 될 수도 있다. 이것은 PEG로 코팅된, 콜로이드상 담체 조성물과 비교하여 중요한 장점임을 의미한다.
본 발명에 따른 콜로이드상 담체 조성물은, 요법, 진단, 예방 등에서의 사용을 위한 다양한 가능성을 제공한다. 지질-폴리머-접합체의 가변성으로 인해, 목적에 따라 선택될 수 있으며, 또한 다양한 콜로이드상 담체 계 중에서 하나 선택될 수 있는 성분은 일반적으로 모든 활성 약물에 대해 적절한 콜로이드상 담체 조성물을 디자인하는 것이 가능할 것이다는 것은 명백할 것이다. 발명에 따른 조성물의 정맥내 투여 후 제 1 예에서, 혈액 순환 시간에 대한 효과가 없거나 단지 약간의 효과만이 관찰될 경우, 당업자는 표준 설정에 따라 순환 시간을 증가시키도록 지질-폴리머-접합체중에서 및 콜로이드상 담체의 조성물중에서 많은 다른 파라미터(예를 들면, 분자량, 드래프팅 밀도, 폴리머, 지질 등)들을 다양화할 수 있다. 발명에 따른 조성물이 활성 약물로서 수용성 코르티코스테로이드를 함유할 때, 매우 흥미있는 효과가 보여진다. 생체내에서의 실험용 관절염 모델에서, 그같은 조성물의 1 단일 정맥내 주사는 비-캡슐화된 코르티코스테로이드 화합물의 반복 주사와 같이, 또는 종래의 리포솜에서의 캡슐화될 때와 같이 효과적인 듯 보였다. 관심있는 수용성 코르티코스테로이드는 부데소니드 포스페이트 및, 플루니솔리드 및 플루티카손 프로피오네이트의 수용성 유도체이다. 유리한 효과는 관절염-연관된 증상의 완전하고 또한 장기간에 걸친 완화가 될 수도 있지만, 한편 투여되는 코르티코스테로이드의 양에서의 감소로 인해, 및 정상적으로 혈액으로부터의 빠른 제거율을 나타나는 코르티코스테로이드가 현재 사용될 수 있기 때문에, 코르티코스테로이드-기재 요법과 관련된 부작용들은 감소될 것이다. 또한 코르티코스테로이드가 선택 약물이거나 또는 공동-요법으로서 사용되는 다른 질병들에서, 본 발명에 따른 조성물의 유익한 효과는 쉽게 인정될 것이다. 그러나, 다른 활성 약물 역시 본 발명의 조성물에서 관심있는 효과를 보인다.
앞서 발명이 명쾌함과 이해를 목적으로 예시 및 실시예의 방법으로 일부 상세하게 설명되었지만, 덧붙인 청구의 범위를 벗어남 없이 이것에 어떤 변경 및 변형이 이루어질 수도 있다는 것은 본 발명의 기술면에서 당업자에게 명백할 것이다.
다음의 실시예들은 발명을 더욱 예시한다.
실시예
실시예 1
헵타데실옥타데실아민 말단기를 갖는 폴리(γ-벤질-L-글루타메이트) (PBLG-헵타데실옥타데실아민)
0.94 g(3.6 mmol) γ-벤질-L-글루타메이트 N-카르복실산 무수물(NCA)을 질소분위기하에서 5 ml 건조 DMF에 용해시켰다. 1 ml 건조 클로로포름중의 25 mg (0.05 mmol) 1-헵타데실옥타데실아민(Sigma Aldrich)의 용액을 한번에 첨가하였다. 거의 즉각적으로 기체 거품(CO2)이 형성되었다. 용액을 실온에서 하루동안 교반하고 나서 10-20배의 과량의 물에 침전시켰다. 백색 침전물을 수집하고 진공하에서 건조하였다. 수득량: 0.75 g.
특성 규명:
CDCl3 에서의 1H-NMR(용매 피크에 상대적인 ppm δ):
벤질글루타메이트: 7.2 (C6H5), 5.0 (벤질자리 CH2), 3.9 (α-CH), 2.8 & 2.2 (β & γ CH2),
알킬 사슬: 1.2 (CH2 알킬 사슬), 0.85 (CH3)
실시예 2
헵타데실옥타데실아민 말단기를 갖는 폴리(N- (2-히드록시에틸)-L-글루타민) (PHEG-헵타데실옥타데실아민)
5 ml 건조 DMF중의 0.60 g PBLG-헵타데실옥타데실아민(상기를 보라)의 용액에 0.15 g 2-히드록시피리딘 및 0.8 ml 에탄올 아민을 첨가하였다. 이 용액을 질소 분위기하 실온에서 3일동안 교반하였다. 용액을 10-20 배의 과량의 디에틸에테르에 침전시켰다. 생성물을 수집하고 진공하에서 건조하였다. 수용성의 중합 생성물을 2 일동안 셀룰로스 에스테르 투석 튜브 (MWCO 500)에서 물에 대해 투석하였다. 동결건조후 헵타데실옥타데실 말단기를 갖는 정제된 PHEG를 얻었다. 수득량: 0.30g.
특성 규명:
DMSO-d6에서의 1H-NMR(용매 피크에 상대적인 ppm δ):
히드록시에틸글루타민: 4.1 (α-CH), 2.2 & 1.8-1.9 (β & γ CH2), 3.4 (CH2-OH), 3.1 (CH2-NH2),
알킬 사슬: 1.2 (CH2 알킬 사슬), 0.8 (CH3).
스테아릴 시그널과 α-CH 시그널의 정수비로부터, PHEG 분자량을 추정한 결과 12,000이었다.
실시예 3
개시체로서 N-Boc-1,4-디아미노부탄를 통해 도입된 디스테아릴아민 말단기를 갖는 폴리-[N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민] (PHEG-디아미노부탄-DODASuc)
2.5 g (9.5 mmol) γ-벤질-L-글루타메이트 N-카르복실산 무수물을 2.5 ml 건조 에틸아세테이트와 12.5 ml 건조 디클로로메탄의 혼합물에 용해시키고, 개시체로서, 디클로로메탄중의 N-Boc-1,4-디아미노부탄 1몰 용액 0.95 ml (0.95 mmol)의 을 첨가하였다. 혼합물을 질소하 실온에서 3일동안 교반하고 나서 메탄올에 침전시켰다. 수득량: 1.48 g PBLG-N-Boc-디아미노부탄.
1H-NMR (CDCl3) 스펙트럼은 δ 1.4-1.3에서 N-Boc-1,4-디아미노부탄 시그널 을 나타내었다.
Maldi TOF ms:
반복하는 벤질글루타민산 단위의 질량: n x 219.
m/z 1417 (n=5), 1636 (n=6), 1855 (n=7), 2074 (n=8)로, N-Boc-1,4-디아미노부탄 (187 Da)기 및 고리모양 펩티드 말단기 (112 Da)를 갖는 나트륨 첨가 생성물의 질량에 해당한다.
m/z 1433 (n=5), 1652 (n=6), 1872 (n=7)로, N-Boc-1,4-디아미노부탄 (187 Da)기 및 고리모양 펩티드 말단기(112 Da)를 갖는 칼륨 첨가 생성물의 질량에 해당한다 .
PBLG-N-Boc-디아미노부탄의 탈보호화.
738 mg PBLG-N-Boc-디아미노부탄을 디옥산 중의 4N HCl 용액 5 ml중에서 3.5시간동안 교반하였다. 그 후에 반응 혼합물을 로타베이퍼에서 증발시켰다. 잔여물을 5 ml 테트라히드로푸란중에 용해시키고, 80 ml NaHC03 용액 (물중 6.5 g)에 적하하여 첨가하였다. 생성물을 여과하고, 물로 세척하고 진공 건조하였다. 수득량: 677 mg PBLG-디아미노부탄.
1H-NMR (CDCl3)는 보호기가 성공적으로 제거되었음을 나타내었다.
Maldi TOF 질량분석은 원하는 몰질량을 나타내었다.
반복하는 벤질글루타민산 단위에 대한 질량: n x 219.
m/z 1318 (n=5), 1537 (n=6), 1756 (n=7), 1976 (n=8)로, 1,4-디아미노부탄 (87 Da)기 및 고리모양 펩티드 말단기 (112 Da)를 갖는 나트륨 첨가 생성물의 질량에 해당한다.
DODASuc에의 짝지음:
62 mg (0.1 mmol) N-숙시닐-디옥타데실아민 (DODASuc, Schmitt et al, J. Am. Chem. Soc. 1994,116,19,8485-8491), 13.7 mg (0.12 mmol) N-히드록시숙신이미드 및 0.66 mg 디메틸아미노피리딘 (DMAP)을 2 ml 디클로로메탄에 용해시켰다. 0℃로 냉각한 후, 24.6 mg (0.12 mmol) N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)를 첨가하였다. 용액을 0℃에서 1시간, 실온에서 밤새 교반하였다. 다음으로, 불용성 디시클로헥실우레아를 여과하여 제거하고, 여과액을 3 ml 디클로로메탄과 14 μl 트리에틸아민중의 200 mg PBLG-디아미노부탄의 용액에 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 용액을 메탄올에 적하하여 첨가하고, 여과하고 건조하였다. 수득량: 135 mg. 1H-NMR (CDCl3) 스펙트럼은 디스테아릴의 존재와, δ 1.4-1.2에서의 CH2
시그널 및 δ 0.9-0.8에서의 CH3 시그널을 나타내었다.
Maldi TOF 질량분석은 DODASuc가 PBLG-디아미노부탄에 짝지음되었음을 지시하는 원하는 몰 질량을 나타내었다.
m/z 1922 (n=5), 2141 (n=6), 2360 (n=7), 2580 (n=8), 2799 (n=9), 3018 (n=10)로, 고리모양 펩티드 말단기(112 Da)를 갖는, PBLG-디아미노부탄-DODASuc의 나트륨 생성 첨가물의 질량에 해당한다.
구조:
가아민 분해.
120 mg PBLG-디아미노부탄 DODASuc과 10.8 mg 2-HP를 1.3 ml 디메틸포름아미드에 용해시키고, 0.68 ml 2-아미노에탄올을 첨가하였다. 질소하 40℃에서 24시간동안 교반한 후, 클로로포름에 용액을 적하하여 첨가하였다. 생성물을 여과하여 제거하고 진공건조하였다. 수득량: 83 mg PHEG-디아미노부탄-DODASuc.
1H-NMR (DMSO)는 δ 1.2-1.4 (CH2) 및 δ 0.8-0.9 (CH3)에서 디스테아릴 시그널을 나타내었다.
스테아릴 시그널과 α-CH 시그널의 정수비로부터 PHEG 분자량을 추정한 결과 4,000이었다.
구조:
실시예 4
개시체로서 디스테아릴아민에 의해 도입된 아민 말단기를 갖는 폴리-[N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민] (PHEG-디스테아릴아민)
1.0 g(3.8 mmol) γ-벤질-L-글루타메이트 N-카르복실산 무수물을 1 ml 건조 에틸아세테이트와 5 ml 건조 클로로포름의 혼합물에 용해시켰다. 그 후에, 3.26 ml 클로로포름중의 163 mg 디스테아릴아민 용액 2 ml (0.19 mmol)을 첨가하였다. 플라스크에 CaCl2 튜브를 장착하고, 혼합물을 질소하 실온에서 4일동안 교반하였다. 혼합물을 메탄올에 적하하여 첨가하고, 폴리머를 여과에 의해 단리하고, 진공 건조하였다. 수득량: 757 mg PBLG-디스테아릴아민.
반응:
1H-NMR (CDCl3) 분석은 생성물중의 디스테아릴 시그널: δ 0.9 (t)에서 CH3 및 δ 1.3-1.2에서 CH2 시그널을 나타내었다.
Maldi TOF ms:
반복하는 벤질글루타민산 단위의 질량: n x 219.
m/z 1971 (n=6), 2190 (n=7), 2410 (n=8), 2629 (n=9), 2848 (n=10)로, 디스테아릴아민기(521 Da) 및 고리모양 펩티드 말단기 (112 Da)를 갖는 나트륨 첨가 생 성물의 질량에 해당한다.
m/z 2206 (n=7), 2427 (n=8)로, 디스테아릴아민기 (521 Da) 및 고리모양 펩티드 말단기(112 Da)를 갖는 칼륨 첨가 생성물의 질량에 해당한다.
가아민 분해
디메틸포름아미드중에서 아미노에탄올과 촉매로써 2-히드록시피리딘으로 상기에서 제조된 PBLG-디스테아릴아민 (600 mg)을 가아민 분해하여 430 mg PHEG-디스테아릴아민을 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6)는 디스테아릴아민 시그널을 나타내었다.
구조 :
실시예 5
디아미노부탄 DODASuc 말단기를 갖는 폴리-[N-(히드록시알킬)-L-글루타민]
PBLG-디아미노부탄BOC:
8 ml 건조 DMF중의 3 g 벤질-L-γ-글루타메이트 N-카르복실산 무수물 (NCA)의 용액에 1 ml 클로로포름중의 0.1 g N-BOC-1,4-디아미노부탄의 용액을 첨가하였다. 처음 1시간 동안 기체 (이산화탄소)의 형성이 관찰되었다. 이 용액을 질소 분위기하 실온에서 1일 동안 교반하였다. 약 100 ml 메탄올에 침전시킨 후, 폴리머를 여과하여 제거하고 건조하여, BOC-보호된 아미노기를 함유하는 2 g PBLG를 수득하였다.
1H-NMR (CDCl3) (용매 피크에 상대적인 δ):
BOC: 1.4 (CH3)
PBLG: 2.2 & 2.6 (β, γ-CH2), 4.0 (α-CH), 5.0 (벤질 CH2), 7.3 (페닐)
PBLG-디아미노부탄 (제거 보호 BOC 기):
5 ml 4N HCl/디옥산중의 1.1 g PBLG-디아미노부탄BOC의 용액을 3-4시간동안 교반하고 나서, 약 80 ml NaHC03 용액 (물중 6.5 g)에 적하하여 첨가하였다. 생성물을 여과하여 제거하고, 물로 세척하여, 진공 건조하였다. 수득량: 1 g PBLG 디아미노부탄.
1H-NMR (CDCl3) (용매 피크에 상대적인 δ):
PBLG: 2.2 & 2.6 (β, γ-CH2), 4.0 (α-CH), 5.0 (벤질 CH2), 7.3 (페닐)
BOC 시그널 부재
PBLG-디아미노부탄 DODASuc (DCC 짝지음):
170 mg N-숙시닐-디옥타데실아민 (DODASuc), 90 mg DCC 및 10 mg 4-(디메틸아미노)피리디늄 4-톨루엔 술포네이트(DPTS)를 4 ml 디클로로메탄중에 용해시켰다. 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 3 ml 클로로포름중의 0.73 g PBLG-디아미 노부탄 및 40 μl 트리에틸아민의 용액을 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 용액(디시클로헥실우레아 침전물 함유)을 과량의 메탄올 (약 100 ml)에 적하하여 첨가하였다. 중합 생성물을 여과하여 제거하고 건조하였다. 수득량: 0.5 g.
1H-NMR (CDCl3) (용매 피크에 상대적인 δ):
0.8-0.9 (CH3) 및 1.2-1.4 (메틸렌 양성자)에서 디스테아릴 시그널
PBLG: 2.2 & 2.6 (β,γ-CH2), 4.0 (α-CH), 5.0 (벤질 CH2), 7.3 (페닐)
5.1 PHEG-디아미노부탄 DODASuc
다음과 같이 에탄올아민으로 PBLG-디아미노부탄 DODASuc를 가아민 분해하여 PHEG-디아미노부탄 DODASuc를 얻었다:
0.5 g PBLG-디아미노부탄 DODASuc과 15 mg 2-히드록시피리딘을 4 ml DMF에 용해시켰다. 다음으로 2 ml 에탄올아민을 첨가하였다. 질소 분위기하 40℃에서 24시간동안 교반한 후, 용액을 약 100 ml 디에틸에테르에 침전시켰다. PHEG-디아미노부탄 DODASuc를 물에 용해시키고, 투석하고(MWCO 500) 이후에 동결 건조하여 0.35 g 정제된 PHEG 디아미노부탄 DODASuc 접합체를 수득하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
0.8-0.85 (CH3) 및 1.2-1.5 (메틸렌 양성자)에서 디스테아릴 시그널
PHEG: 1.7-2.2 (β, γ-CH2), 3.1 & 3.3 (히드록시에틸), 4.2 (α-CH), 4.7 (OH), 7.8 & 8.2 (NH)
디스테아릴 시그널과 α-CH 시그널의 정수비로부터, PHEG 분자량을 추정한 결과 약 4000이었다.
Maldi-TOF로 PHEG 디아미노부탄 DODASuc 접합체의 분자구조를 확인하였다.
Na+-첨가 생성물: m/z 3064.5 (n=13), 3236.1 (n=14), 3408.7 (n=15), 3580.6 (n=16), 3752.9 (n=17), 3924.7 (n=18), 4096.7 (n=19), 4268.4 (n=20), 4441.1 (n=21), 4613.3 (n=22), 4785.1 (n=23), 등.
5.2 폴리-[(2-히드록시프로필)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc
다음과 같이 2-프로판올아민(이소프로판올아민)으로 PBLG-디아미노부탄 DODASuc를 가아민 분해하여 폴리-[(2-히드록시프로필)-L-글루타민]디아미노부탄 DODASuc을 얻었다:
0.15 g PBLG-디아미노부탄 DODASuc 및 0.05 g 2-히드록시피리딘을 4 ml DMF중에 용해시켰다. 다음으로 1 ml 2-프로판올아민을 첨가하였다. 질소분위기하 40℃에서 24시간동안 교반한 후, 용액을 약 100 ml 디에틸에테르에 침전시켰다. 건조 후, 0.1 g PH이소PG-디아미노부탄 DODASuc를 얻었다. 폴리머를 물에 용해시키고, 투석하고 (MWCO 500), 그 후에 동결-건조하여 정제된 폴리-[(2-히드록시프로필)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc를 수득하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
0.8-0.85 (CH3) 및 1.2-1.5 (메틸렌 양성자)에서 디스테아릴 시그널
PHPG : 1.7-2.2 (β,γ-CH2), 1.0 (CH3) & 3.0 & 3.3 & 3.7 (히드록시프로필), 4.2 (α-CH), 4.7 (OH), 7.8 & 8.2 (NH)
계산된 분자량: 약 4000.
5.3 폴리-[(3-히드록시프로필)-L-글루타민]디아미노부탄 DODASuc
3-프로판올아민으로 PBLG-디아미노부탄 DODASuc를 가아민 분해하여 폴리-[(3-히드록시프로필)-L-글루타민]디아미노부탄 DODASuc을 얻었다:
0.3 g PBLG-디아미노부탄 DODASuc 및 0.1 g 2-히드록시피리딘을 4 ml DMF중에 용해시켰다. 다음으로 2 ml 3-프로판올아민을 첨가하였다. 질소분위기하 40℃에서 24시간동안 교반한 후, 용액을 약 100 ml 디에틸에테르에 침전시켰다. 건조 후 0.25 g PHPG5000-디아미노부탄 DODASuc을 얻었다. 폴리머를 물에 용해시키고, 투석하고(MWCO 500), 그 후에 동결-건조하여 정제된 폴리-[(3-히드록시프로필)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc를 수득하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
0.8-0.85 (CH3) 및 1.2-1.5 (메틸렌 양성자)에서 디스테아릴 시그널
PHPG: 1.7-2.2 (β,γ-CH2), 1.5 & 3.1 & 3.3 (히드록시프로필), 4.2 (α-CH), 4.6 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).
분자량: 약 5000.
Maldi-TOF:
Na+-첨가 생성물 : m/z 3623 (n=15), 3810 (n=16), 3996 (n=17), 4182 (n=18), 4368 (n=19), 4555 (n=20), 등.
5.4 폴리-[(4-히드록시부틸)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc
4-부탄올아민으로 PBLG-디아미노부탄 DODASuc를 가아민 분해하여 폴리-[(4-히드록시부틸)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc을 얻었다:
0.3 g PBLG-디아미노부탄 DODASuc 및 0.1 g 2-히드록시피리딘을 4 ml DMF중에 용해시켰다. 다음으로 2 ml 4-부탄올아민을 첨가하였다. 질소분위기하 40℃에서 48시간동안 교반한 후, 용액을 약 100 ml 디에틸에테르에 침전시켰다. 폴리머를 물에 용해시키고, 투석하고(MWCO 500), 그 후에 동결-건조하여 0.2g 정제된 폴리-[ (4-히드록시부틸)-L-글루타민]디아미노부탄 DODASuc를 수득하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
0.8-0.85 (CH3) 및 1.2-1.5 (메틸렌 양성자)에서 디스테아릴 시그널
PHBG: 1.7-2.2 (β,γ-CH2), 1.4 & 3.1 & 3.3 (히드록시부틸), 4.2 (α-CH), 4.5 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).
분자량: 약 4000.
5.5 폴리-[(2,3-디히드록시프로필)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc
2,3-디히드록시프로필아민으로 PBLG-디아미노부탄 DODASuc를 가아민 분해하여 폴리-[(2,3-디히드록시프로필)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc을 얻었다:
0.15 g PBLG-디아미노부탄 DODASuc 및 0.06 g 2-히드록시피리딘을 3 ml DMF중에 용해시켰다. 다음으로 1 ml 2,3-디히드록시프로필아민을 첨가하였다. 질소분위기하 40℃에서 하루동안 교반한 후, 용액을 약 100 ml 디에틸에테르에 침전시켰다. 폴리머를 물에 용해시키고, 투석하고(MWCO 500), 그 후에 동결-건조하여 0.1g 정제된 폴리-[(2,3-디히드록시프로필)-L-글루타민] 디아미노부탄 DODASuc를 수득하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
0.8-0.85 (CH3) 및 1.2-1.5 (메틸렌 양성자)에서 디스테아릴 시그널
폴리(디히드록시프로필)G: 1.7-2.2 (β,γ-CH2), 3.1 & 3.3-3.6 (디히드록시프로필), 4.2 (α-CH), 4.6 & 4.8 (OH), 7.8 & 8.2 (NH).
분자량: 약 4000.
실시예 6
콜레스테릴-PHEG
2 ml 클로로포름중의 0.2 g PBLG-NH2 및 20 μl 트리에틸아민의 용액에 1 ml 클로로포름중의 0.07 g 콜레스테릴 클로로포르메이트의 용액을 첨가하였다. 용액을 실온에서 약 1시간동안 교반하고나서 디에틸에테르에서 침전시켰다. 수집 및 건조후, 0.13 g 중합 생성물을 얻었다.
40℃에서 하루동안 에탄올아민 (촉매로서 2-히드록시피리딘)으로 가아민 분해하여 콜레스테릴-PHEG를 수득하였다. 투석(MWCO 500)에 의해 중합생성물을 정제 하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
PHEG: 1.7-2.2 (β,γ-CH2), 3.1 & 3.3 (히드록시에틸), 4.2 (α-CH), 4.7 (OH), 7.8 & 8.2 (NH)
콜레스테릴: 0.6-1.6.
분자량: 약 4000.
Maldi TOF로 콜레스테릴-PHEG 접합체의 분자구조를 확인하였다.
Na+-첨가 생성물 : m/z 3046 (n=14), 3218 (n=15), 3390 (n=16), 3562 (n=17), 3735 (n=18), 3907 (n=19), 4080 (n=20), 등.
실시예 7
폴리(2-히드록시에틸)-DL-글루타민 디아미노부탄 DODASuc
합성은 폴리(2-히드록시에틸)-L-글루타민 디아미노부탄 DODASuc (실시예 8)의 합성과 유사하지만, 몇개의 상세들에서 다르다:
γ-벤질-L- 및 γ-벤질-D-글루타메이트의 1:1 혼합물로 부터 γ-벤질-DL-글루타민 NCA를 합성하고, 에틸아세테이트/헥산(약 1: 5)로 결정화하였다(실시예 1을 보라).
폴리(벤질-DL-글루타민) 디아미노부탄 BOC를 메탄올대신에 물에 침전시켰다.
폴리(벤질-DL-글루타민) 디아미노부탄 DODASuc를 메탄올에 침전시켰다.
NMR 스펙트럼은 폴리(2-히드록시에틸)-L-글루타민 디아미노부탄 DODASuc (실 시예 8.1)의 것과 실질적으로 동일하다.
분자량: 약 3000.
실시예 8
PHEG 공중합체 : 폴리(HEG-코-글루타민산) 디아미노부탄 DODASuc; 5% 글루타민산
1.5 ml DMF중의 0.14 g PBLG 디아미노부탄 DODASuc, 0.05 g 2-히드록시피리딘, 약 1 ml 에탄올아민의 용액을 질소분위기하 실온에서 하루동안 교반하였다. 다음으로 용액을 디에틸에테르에 침전시켰다. 생성물, 부분적으로 에탄올아민-아미노 분해된 PBLG 디아미노부탄 DODASuc (5% 벤질 에스테르 측면기를 갖는 PHEG)를 수집하고 건조하였다. DMSO에서 기록된 NMR은 5% 미반응된 벤질기의 존재를 나타내었다.
상기 폴리머를 1 M NaOH 8.5 ml에 용해시키고, 4시간동안 교반하였다. 용액을 1 N HCl로 중화하고나서, 수일동안 투석하였다(MWCO 500). 투석된 용액을 동결-건조한 후 음으로 하전된 (생리적 pH에서) 공중합체-지질-접합체(0.1 g)를 얻었다.
DMSO중의 NMR은 벤질기의 완전한 전환을 나타내었다.
Maldi TOF는 글루타민산 및 히드록시에틸글루타민 반복 단위 둘 모두의 존재를 확인하는데 사용되었다.
분자량: 약 3500.
실시예 9
PHEG 공중합체 : 폴리 (HEG-코-디메틸아미노에틸글루타민) 디아미노부탄 DODASuc ; 5 % 디메틸아미노에틸 측면기
2.5 ml DMF중의 0.25 g PBLG 디아미노부탄 DODASuc, 0.08 g 2-히드록시피리딘, 및 1 ml 에탄올아민의 용액을 질소분위기하 실온에서 2일동안 교반하였다. 결과로 얻어진 용액을 디에틸에테르에 침전시켰다. 부분적으로 에탄올아민-아미노 분해된 PBLG 디아미노부탄 DODASuc (5% 벤질 에스테르 측면기를 갖는 PHEG)를 수집하고 건조하였다. CDCl3에서 기록된 NMR은 5% 미반응된 벤질기의 존재를 나타내었다.
2.5 ml DMF중의 0.16 g의 이 부분적으로 에탄올아민-아미노 분해된 PBLG 디아미노부탄 DODASuc, 0.06 g 2-히드록시피리딘, 1 ml N, N-디메틸에틸렌디아민의 용액을 질소분위기하 40℃에서 하루동안 교반하였다. 디에틸에테르에 침전시키고, 이를 수집하고 진공 건조하여 분말을 얻었다. DMSO에서의 NMR은 남아있는 벤질기의 완전한 전환을 나타내었다. 생성물을 물에 용해시키고 수일동안 투석하고(MWCO 500), 그 후에 동결-건조하였다. 수득량: 0.1 g의 양으로 하전된 PHEG 공중합체-지질-접합체.
분자량: 약 4000.
실시예 10
스테아릴아민 및 헵타데실옥타데실아민 말단기를 각각 갖는 폴리(2-히드록시에틸)-L-아스파라긴 (PHEA)
β-벤질 L-아스파라긴산염 N-카르복실산 무수물(NCA):
톨루엔 중 약 16 ml의 20 % 포스겐 용액을 함유하는 50 ml 증류된 THF중의 5 g β-벤질 L-아스파라긴산염의 현탁액을 60-65℃에서 가열하였다(용액에 대해 질소 기체의 흐름). 약 10분 후, 맑은 용액을 얻었다. 약 1.5 시간 후 용액을 약 140 ml n-헥산에 천천히 부었다. 거의 즉각적으로 결정이 형성되었다. -20℃에서 하루밤동안 더욱 결정화한후, NCA 결정성 생성물을 단리하였다. THF/헥산 및 뜨거운 클로로포름으로부터의 추가의 결정화로 4.3 g 미세한 침상 결정체를 수득하였다(Biopolymers 1976, 15 (9) 1869-71).
1H-NMR (CDCl3) (용매 피크에 상대적인 δ):
벤질기: 7.3 (페닐), 5.1 (CH2)
아스파라긴산염 NCA: 2.8 & 3.0 (β-CH2), 4.5 (α-CH), 6.4 (NH)
스테아릴-PBLA :
2 ml DMF중의 0.95 g β-벤질 L-아스파라긴산염 NCA의 용액에 0.5 ml 클로로포름중의 0.04 g 스테아릴아민의 용액을 첨가하였다. 60℃에서 수시간동안 교반한 후, 흐린 용액을 메탄올에 침전시켰다. 건조후, 0.56 g 폴리(벤질 L-아스파라긴산염) 스테아릴아민을 얻었다.
헵타데실 옥타데실-PBLA:
2 ml DMF중의 0.5 g β-벤질 L-아스파라긴산염 NCA의 용액에 약 1 ml 클로로포름중의 0.1 g 1-헵타데실 옥타데실아민을 첨가하였다. 실온에서 3시간동안 교반한 후, 흐린 용액을 메탄올에 침전시켰다. 수득량: 0.2 g 중합 생성물 PBLA-헵타데실 옥타데실 아민.
스테아릴-/헵타데실 옥타데실-PHEA:
촉매로서 에탄올아민 및 2-히드록시피리딘을 사용하여 40℃에서 1일동안 상기 PBLA-접합체를 가아민 분해한 후, 이어서 디에틸 에테르에 침전시켜 스테아릴 또는 헵타데실 옥타데실 꼬리 각각을 함유하는, 수용성의 폴리(히드록시에틸) L-아스파라긴 (PHEA)를 수득하였다. 투석(MWCO 500)에 의해 지질-폴리머-접합체를 정제하였다.
스테아릴-PHEA :
Maldi TOF: Na+ 첨가 생성물 m/z 2823 (n=16), 2981 (n=17), 3139 (n=18), 3297 (n=19), 3455 (n=20), 3613 (n=21), 등.
Maldi TOF로부터 각각의 PHEA 사슬이 유리 아미노 말단기를 함유한다고 결론을 내렸다.
헵타데실 옥타데실-PHEA:
NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
헵타데실 옥타데실 : 0.8 & 1.2
PHEA: 2.2-2.6 (β-CH2), 3.1 & 3.4 (히드록시에틸), 4.5 (OH + α-CH), 7.8 & 8.3 (NH)
분자량: 약 6000.
실시예 11
폴리(2-히드록시에틸)-L-아스파라긴 DODASuc
PBLA DODASuc:
5 ml DMF중의 1.7 g β-벤질 L-아스파라긴산염 N-카르복실산 무수물 (NCA)의 용액에 THF중의 메틸아민 2 M 용액 0.2ml을 첨가하였다. 맑은 용액을 하루동안 교반하고나서, 메탄올 (약 100 ml)과 물 (250 ml)의 혼합물에 침전시켰다. 수득량: 1.3 g 메틸 아미드 및 아미노 말단기를 함유하는 PBLA.
5 ml DMSO와 1 ml 클로로포름중의 0.4 g PBLA, 30 mg DCC, 10 mg DPTS 및 100 mg N-숙시닐-디스테아릴아민의 용액을 하루동안 교반하고나서 물에 침전시켰다. 중합 생성물을 교반하고/디에틸 에테르로 세척하고, 건조하였다.
PHEA DODASuc
DMF 용액중에서 에탄올아민 (촉매로서 2-히드록시피리딘을 사용)으로 40℃에서 하루동안 PBLA DODASuc를 가아민 분해하여 PHEA DODASuc (투석 및 동결-건조후 0.2 g)를 수득하였다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.4 (CH2-N)
PHEA: 2.4-2.8 (β-CH2), 3.2 & 3.4 (히드록시에틸), 4.6 (α-CH + OH), 7.8-8.5 (NH)
계산된 분자량: 약 3000.
Maldi TOF는 PHEA DODASuc 접합체의 분자구조를 확인한다:
Na+-첨가 생성물 : m/z 2084 (n=9), 2243 (n=10), 2401 (n=11), 2559 (n=12), 2718 (n=13), 2876 (n=14), 등.
실시예 12
폴리(2-히드록시에틸)-L-아스파라긴 DSPESuc 접합체
벤질-L-아스파라긴산염 NCA의 메틸아민-개시 중합으로 얻어진, PBLA (폴리벤질-L-아스파라긴산염)의 가아민 분해로 아미노-종결된 PHEA를 얻었다. 숙신화된 DSPE (synthesis analogous to the one described for DPPE in JACS, 116,8485 (1994))를 먼저 DCC (디시클로헥실카르보디이미드)를 사용하여 인 시츄에서 그것의 NHS 에스테르로 전환하였다:
2 ml 디클로로메탄중의 70 mg 숙신화된 DSPE, 20 mg NHS (N-히드록시숙신이미드), 5 mg DMAP 및 30 mg DCC (디시클로헥실카르보디이미드)의 용액을 약 3-4시간동안 교반하였다. 이 혼합물에 2 ml DMSO중의 0.13 g 아미노-종결된 PHEA (분자량 약 4000)의 용액을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 에테르에 침전시켰다. 침전물을 수집하고, 물에 용해시키고, 수일간 투석하였다(MWCO 500). 동결-건조 후, 약 80 mg PHEA-DSPE를 얻었다.
1H-NMR (DMSO-d6) (용매 피크에 상대적인 δ):
DSPE: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.4 (CH2-N)
PHEA : 2.4-2.8 (β-CH2), 3.2 & 3.4 (히드록시에틸), 4.6 (α-CH + OH), 7.8-8.4 (NH)
계산된 분자량: 약 4000
실시예 13
폴리 (DL-세린) DODASuc
O-벤질-DL-세린 N-카르복실산 무수물 (NCA):
톨루엔 중에 약 10 ml의 20 % 포스겐 용액을 함유하는 30 ml 증류된 (건조) THF중의 2.5 g O-벤질-DL-세린의 현탁액을 60-65℃에서 가열하였다(용액에 대해 질소 기체의 흐름). 약 5분 후, 맑은 용액을 얻었다. 약 1.5 시간 후, 용액을 약 100 ml n-헥산에 천천히 부었다. 생성물을 오일로서 분리하였다. 용매를 기울여 따르고, 오일을 약 25 ml 에틸아세테이트에 용해시키고 여기에 100 ml 헥산을 천천히 첨가하였다. 플라스크를 격렬하게 흔들고 -20℃에서 냉장한 후, O-벤질-DL-세린 NCA가 결정화하기 시작했다. 에틸아세테이트/헥산 및/또는 클로로포름/헥산으로부터의 유사한 재결정화로 2 g 결정성 재료를 수득하였다.(Biopolymers 1976,15 (9) 1869-71)
1H-NMR (CDCl3) (용매 피크에 상대적인 δ):
벤질기: 4.5 (CH2), 7.2 (페닐)
세린 NCA: 3.7 (β-CH2), 4.4 (α-CH), 5.8 (NH)
폴리(O-벤질-DL-세린):
2.5 ml DMF중의 0.9 g O-벤질-DL-세린 NCA의 용액에 THF중의 2 M 메틸아민의 용액 0.08 ml을 첨가하였다. 실온에서 수시간동안 교반한 후, 용액은 흐리고 점성이 있게 되었다. 하루 뒤, 점성의, "결정화된" 용액을 메탄올/물과 혼합하여 중합 생성물을 완전히 침전시켰다. 수득량: 0.6 g 중합 생성물 폴리(O-벤질-DL-세린).
DMSO-d6에서의 1H-NMR(용매 피크에 상대적인 δ):
벤질기: 4.4 (CH2), 7.2 (페닐)
폴리세린: 3.5 (β-CH2), 4.7 (α-CH), 8.2 (NH)
폴리(O-벤질-DL-세린) DODASuc:
150 mg N-숙시닐-디옥타데실아민 (DODASuc), 80 mg DCC 및 5 mg DPTS를 4 ml 클로로포름에 용해시켰다. 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 약 5 ml 클로로포름중의 0.6 g 폴리 (O-벤질-DL-세린) 및 약 50 μl 트리에틸아민의 용액을 첨가하였다. 밤새 실온에서 교반한 후, 용액(디시클로헥실우레아 침전물 함유)을 과량의 메탄올(약 100 ml)에 적하하여 첨가하였다. 중합 생성물을 여과하여 제거하고 건조하였다. 수득량: 0.4 g.
DMSO-d6에서의 1H-NMR(용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.6 (CH2-N)
벤질기: 4.4 (CH2), 7.2 (페닐)
폴리세린: 3.5 (β-CH2), 4.7 (α-CH), 8.2 (NH)
폴리 (DL-세린) DODASuc:
0.1 g 폴리 (O-벤질-DL-세린) DODASuc을 약 4 ml 33% HBr/AcOH 용액에 용해시키고, 1시간동안 교반하였다. 다음으로 용액을 물에 침전시켰다, 중합 침전물을 여과하여 제거하고, 물로 세척하고, 수집하고, 그 후에 1M NaOH 4 ml중에 용해시켰다(1-2 시간). 결과로 얻어진 용액을 1 N HCl 용액으로 중화하고나서, 수일동안 투석하였다(MWCO 500). 투석된 용액을 동결건조하였다. 수득량: 20 mg 폴리(DL-세린) DODASuc.
DMSO-d6에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.6 (CH2-N)
폴리세린: 3.6 (β-CH2), 4.3 (OH), 5.0 (α-CH), 8.0 (NH)
디스테아릴 시그널과 α-CH 시그널의 정수비로 부터, 폴리세린 분자량을 추정한 결과 약 1500이었다.
실시예 14
폴리-L-트레오닌 DODASuc
이 합성은, 0-벤질-L-트레오닌·HCl 및 포스겐으로부터 출발하여, O-벤질-L-트레오닌 N-카르복실산 무수물 (NCA)을 통한 폴리 (D, L-세린) DODASuc 의 합성과 유사하다.
폴리-L-트레오닌 DODASuc (M = 약 2000):
DMSO-d6에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.6 (CH2-N)
폴리트레오닌: 1.0 (CH3), 4.0 (β-CH), 4.3 (α-CH), 5.0 (OH), 7.8 (NH)
실시예 15
폴리(D,L-메티오닌 술폭시드) DODASuc
DL-메티오닌 N-카르복실산 무수물 (NCA):
톨루엔중에 20 % 포스겐 용액 약 15 ml을 함유하는 40 ml 증류 (건조) THF중에서의 2.5 g DL-메티오닌의 현탁액을 60-65℃에서 가열하였다(용액에 대한 질소 기체의 흐름). 거의 동시에 맑은 용액이 형성되었다. 약 1시간 후, 용액을 천천히 약 140 ml n-헥산에 부었다. DL-메티오닌 NCA를 약 -20℃에서 결정화하였다(몇일 걸림). 에틸아세테이트/헥산으로부터의 재 결정화로 약 0.7 g 결정성 재료를 수득하였다.(Biopolymers 1976, 15 (9) 1869-71)
1H-NMR (CDCl3) (용매 피크에 상대적인 δ):
메티오닌 NCA: 2.0-2.4 (β-CH2 + CH3), 4.5 (α-CH), 6.8 (NH)
폴리(DL-메티오닌):
2.5 ml DMF중의 0.7 g DL-메티오닌 NCA의 용액에 THF중의 2 M 메틸아민의 용액 0.1 ml를 첨가하였다. 하루뒤, 흐린용액을 약 100 ml 메탄올에 침전시키고, 그 후에 건조하였다. 수득량: 0.33 g 중합 생성물 폴리 (DL-메티오닌).
CDCl3/TF-d에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
폴리메티오닌 : 2.0-2.3 (CH2 & CH3), 2.6 (CH2), 4.7 (α-CH).
폴리 (DL-메티오닌) DODASuc:
80 mg N-숙시닐-디옥타데실아민 (DODASuc), 45 mg DCC 및 5 mg DPTS를 2 ml 클로로포름에 용해시켰다. 용액을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 약 2.5 ml DMSO중의 0.33 g 폴리 (DL-메티오닌)과 약 20 μl 트리에틸아민의 용액을 첨가하였다, 실온에서 밤새 교반한 후, 용액(디시클로헥실우레아 침전물을 함유)을 과량의 메탄올(약 100 ml)에 적하하여 첨가하였다. 중합 생성물을 여과하여 제거하고 건조하였다. 수득량: 0.22g.
DMSO-d6에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.4 (CH2-N)
폴리메티오닌: 1.8 (β-CH2), 2.0 (CH3), 2.4 (γ-CH2), 4.4 (α-CH), 8.1 (NH)
폴리 (DL-메티오닌 술폭시드) DODASuc :
폴리 (DL-메티오닌) DODASuc의 단-산화:
2 ml 물중의 0.3 g 과요오드산 나트륨의 용액을 약 6 ml 아세트산중의 0.22 g 폴리 (DL-메티오닌) 디아미노부탄 DODASuc의 현탁액에 천천히 첨가하였다. 결과로 얻어진 주황색/적색 용액(몇 시간후에 형성된다)을 하룻밤동안 교반하였다. 다음으로 약 15 ml 물을 첨가하고, 결과로 얻어진 주황색/적색 용액을 수일동안 투석하였다(MWCO 500). 동결-건조후, 0.25 g 생성물을 얻었다.
D20에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.7 (CH3), 1.2 (CH2) (폭넓은 피크)
폴리메티오닌 술폭시드 : 2.0 (β-CH2), 2.5 (CH3), 2.8 (γ-CH2), 4.3 (α-CH), 8.5 (NH)
계산된 분자량: 약 4000.
실시예 16
폴리(DL-글루타민) DODASuc
고체상 펩티드 합성방법 (약 50 mg 척도)을 사용하여, Ansynth Service B. V.에 의해 폴리(DL-글루타민) DODASuc 접합체를 합성하였다. 수지에 묶인 폴리(DL-글루타민) (n=20)을 Fmoc-보호된 아미노산을 사용하여 단계적으로 증강하였다. N-말단에 N-숙시닐-디스테아릴아민를 짝지움시켰다. C-말단을 아미드로 전환하였다. 1H-NMR 스펙트럼으로 구조를 확인하였다.
DMSO-d6에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.4 (CH2-N)
폴리글루타민 : 1.7-2.2 (β,γ-CH2), 4.2 (CH), 6.8 & 7.3 (NH2), 8.2 (NH)
실시예 17
폴리(DL-아스파라긴) DODASuc
Fmoc-보호된 아미노산 (약 50 mg 척도)로부터 출발하여 고체상 펩티드 합성방법를 사용하여 Ansynth Service B. V.에 의해 폴리 (DL-아스파라긴) DODASuc 접합체를 합성하였다. 수지에 묶인 폴리(DL-아스파라긴) (n=20)을 단계적으로 증강하였다. N-말단에 N-숙시닐-디스테아릴아민을 짝지움시켰다. C-말단을 아미드로 전환 하였다. DMSO에서 기록된 1H-NMR 스펙트럼으로 구조를 확인하였다
DMSO-d6에서의 1H-NMR (용매 피크에 상대적인 δ):
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.4 (CH2-N)
폴리아스파라긴: 2.5 (CH2), 4.5 (CH), 7.0 & 7.4 (NH2), 8. 1 (NH)
실시예 18
폴리-(D,L-알라닌) DODASuc
95 mg 폴리-DL-알라닌 (Sigma; MW: 약 2000)을 4 ml DMSO에 용해시켰다. 40 μl 트리에틸아민을 이 용액에 첨가하였다. 그 후에, 이 용액을 2 ml 클로로포름중의 0.1 g DODASuc, 70 mg DCC 및 5 mg DPTS의 용액에 첨가하고, 1시간동안 교반하였다. 하루동안 교반한 후, 혼합물을 메탄올/디에틸에테르 혼합물에 침전시켰다. 침전물을 여과하여 제거하고 건조하였다.
DMSO에서 기록된 1H-NMR:
디스테아릴: 0.8 (CH3), 1.2 (CH2), 1.4 (CH2N)
폴리알라닌: 1.2 (CH3), 4.2 (CH), 8.0 (NH).
실시예 19
β-알라닌 및 히드록시에틸 L-글루타민의 코폴리펩티드
DODAsuc-(β-Ala)3-Glu(OBzl)-(β-Ala)4-Glu(OBzl)-(β-Ala)3-Glu(OBzl)-(β-Ala)2-NH2:
Fmoc-보호된 모노머로부터 출발하여 Ansynth Service B. V.에 의해 고체상 방법을 통해 β-알라닌 및 벤질 L-글루타메이트의 코폴리펩티드를 합성하였다.
C-말단: 아미드; N-말단 : DODASuc.
DODASuc-(β-Ala)3-HEG-(β-Ala)4-HEG-(β-Ala)3-HEG-(β-Ala)2-NH
2
이후 DMF에서 수행된 가아민 분해(에탄올아민) 반응에 의해 벤질 글루타메이트 단위를 히드록시에틸 글루타민 (HEG) 단위로 전환하였다.
DMSO에서 기록된 1H-NMR는 벤질기의 부재/전환을 보였다.
실시예 20
PHEG-스테아릴아민-함유 리포솜의 제조
33.8 mg의 에그 포스파티딜콜린 (EPC) (Lipoid Ludwigshafen), 9.67 mg의 콜레스테롤 (Sigma Aldrich) 및 30.0 mg의 폴리-[N-(2-히드록시에틸)-L-글루타민]스테아릴아민(PHEG-스테아릴아민)(합성됨)를 칭량하여 50 ml 둥근바닥 플라스크에 옮겼다. 500 kBq의 트리튬-표지된 콜레스테릴로올레일에테르를 지질 마커로서 첨가하였다. 지질 및 표지물을 약 10 ml 에탄올에 용해시켰다. 이후 로타베이퍼에서 40℃ 진공하 1시간동안 증발시켜 건조하고, 이어서 1시간동안 질소 기체로 흐름을 일으 켰다.
PBS를 건조 지질 필름에 첨가하고, 지질 필름을 완전히 수화할 수 있도록, 유리 구슬의 존재에서 한 시간동안 흔들었다.
리포솜 현탁액을 압출기 (Avestin, 최대 부피 15 ml)로 옮기고, 질소기체를 사용하여, 하나가 다른 것위에 놓여지며, 각각 200 nm 및 100 nm의 구멍크기를 갖는 2개의 폴리카르보네이트 필터를 통해 6회, 각각 100 nm 및 50 nm의 구멍크기를 갖는 필터를 통해 18회 가압하에서 압출하였다. 그 후에, 리포솜 현탁액을 1리터의 살균 PBS에 대해 투석 구획(Slide-A-Lyzer, 10,000 MWCO)에서 24시간동안 2회 투석하였다.
리포솜의 평균 입자 크기를 광 산란(Malvem Zeta-sizer)에 의해 결정한 결과, 93.6± 0.9 nm이며, 다분산 지수는 0.099± 0.02임을 알게되었다. 리포솜의 제조동안 지질 손실은 25%이었으며, 제제의 최종 방사능과 압출과정전 활성을 비교하여 결정되었다. 리포솜의 현탁액을 질소 분위기하 4℃에서 저장하였다.
실시예 21
추가의 지질-폴리머-접합체-함유 리포솜의 제조
상기 실시예 20에서 설명된 바와 같이 필름 방법을 사용하여 리포솜을 제조하였다. 에그 포스파티딜콜린대신에 디팔미토일 포스파티딜콜린을 사용하였다. 5 mM HEPES 완충액을 건조 지질 필름에 첨가하고 지질 필름이 완전한 수화할 수 있도록 유리구슬의 존재하에서 5분동안 흔들었다. 리포솜을 100 및 200 nm의 구멍크기를 갖는 2 적층된 PC 막을 통해 12회 압출하여 크기에 따라 분류하였다. 결과로 얻 어진 리포솜 분산을 투석하고(MWCO 10,000), 동적 광 산란 기술을 사용하여 평균 입자 크기를 결정하였다. 리포솜 제제의 특성에 대해 표 1을 보라.
실시예 22
랫트에의 단일 정맥내 주사 후 리포솜내로 병합된
3
H-표지된 폴리머-지질-접합체의 비교 동력학
웅성 랫트 (Wistar, Crl : (WI) BR (outbred, SPF-Quality) (Charles River, Sulzfeld, Germany))를 표준 펠렛화된 실험동물 음식물(Altromin, code VRF 1, Lage, Germany)과 수도물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다. 각각이 40-50 kBq의 방사능, (50μmol 지질당 조성을 표 1에 나타내었다)을 갖는 3H-표지된 콜레스테릴로올레일에테르(Amersham)를 함유하는, 리포솜 제제의 단일-투여량 정맥내 주사를 꼬리정맥(tail vein)내에 주었다. 지시된 경우를 제외하고는, 투여된 총 지질은 5μmol이었다.
각 랫트의 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 투여 후 다음의 시간점에서 수집하였다: 5분, 4시간, 24시간 및 48기간. 수집된 샘플의 양은 샘플화 사건당 대략 300μl이었다.
샘플화된 혈액을 헤파린 처리된 튜브로 옮기고 -20℃에서 저장하였다.
100μl의 단일 분취량을 다음의 방법에 따라서 가용화하였다:
· 100μl를 신틸레이션 바이알(20 ml)에 옮겼다.
· 100μl의 가용해물을 첨가하였다. 이것을 적어도 1시간 인큐베이팅하였 다.
· 100μl 1 mM EDTA 및 200μl H202(30%)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 24시간, 이후 50℃에서 밤새 인큐베이팅하였다.
·울티마 골드(Ultima Gold) (10 ml)를 신틸레이션 유체로서 첨가하였다.
·방사성을 LSC로 측정하였다.
모든 방사성 측정을 팩커드 신틸레이션 카운터(Packard scintillation counter) (1900TR)을 사용하여 행하였다. 카운팅 시간은 어떤 것이 처음이 되든, ±0.2%의 통계적 정밀도 또는 최대 5분을 갖는다. 팩커드 1900TR은 자동적으로 백그라운드를 빼어 분당 계수(CPM)를 분당 붕괴수(DPM)으로 전환하도록 프로그램밍화 하였다.
언급된 일부 제조에 대해, 주사 후 48시간에 랫트의 간과 비장을 절개하고, 리포솜 정위를 다음의 방법에 따라 평가하였다:
기관들을 균일화하고 균질화물을 25ml(간) 또는 5ml(비장)에 희석하였다/ 1ml의 균질화물을 신틸레이션 바이알에 옮기고 그 후에 첨가하였다:
·200 ml 가용해물(혼합되고 50℃에서 밤새 샘플 인큐베이팅된다)
·200 ml 0.5 M EDTA 용액
·250 ml H202 (30%) 용액 (50℃에서 밤새 인큐베이팅된다)
·10 ml 울티마 골드 신틸레이션 액체 (보텍스되고 25시간동안 샘플 인큐베이팅된다)
이후, 샘플을 베타-신틸레이션 카운터에서 10분동안 카운팅하였다. 일부 리포솜 제제에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
리포솜 제제의 조성물을 실시예 21에 따라 제조하고, 이 실시예에 대한 생체내 시험에서 얻어진 결과를 표 1에 나타내었다. 혈액 순환 시간의 증가를 평가하였으며, 여기에서:
·좋음은, PEG-DSPE 함유 리포솜에 의해 나타내어진 것에 필적하는 순환 시간에 대한 효과를 의미한다.
·중등도는 PEG-DSPE 함유 리포솜 및 폴리머 코팅이 없는 노출 리포솜(bare ribosome)에 의해 나타내어진 것들 사이의 순환시간에 대한 효과를 의미한다.
·약간은 노출 리포솜에 의해 나타내어진 것과 거의 유사한, 통상의 조건하에서의 순환 시간에 대한 효과를 의미한다.
* : 0.5μmol 투여된 총 지질 (도 1 및 2를 보라)
** : 0.05μmol 투여된 총 지질 (도 1 및 2를 보라)
*** : 0.005μmol 투여된 총 지질 (도 1 및 2를 보라)
§: 약 1주일뒤 제 2의 주사를 주었을 때, 실시예 5.1의 지질-폴리머-접합체를 함유하는, 리포솜에 대해 순환 시간에서의 감소를 나타내었다. 실시예 11의 접합체를 함유하는 리포솜 역시 그같은 감소를 보였으나, 2마리의 동물에서는 이 효과가 중등도로 관찰되었다.
실시예 23
지질-폴리머-접합체 및 프레드니솔론 포스페이트를 함유하는 리포솜의 제조
750 mg 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC) (Lipoid Ludwigshafen), 220.0 mg 콜레스테롤 (Sigma Aldrich) 및 270.0 mg 실시예 11의 지질-폴리머 접합체 및 750 mg 디팔미토일 포스파티딜콜린, 250.8 mg 콜레스테롤 및 267.6 mg PEG 디스테아로일 포스파티딜에탄올-아민 (PEG-DSPE) (Avanti Polar Lipids) 각각을 칭량하여 100 ml 둥근바닥 플라스크에서 혼합하였다. 지질을 약 30ml의 메탄올과 클로로포름(실시예 14의 지질-폴리머-접합체) 또는 에탄올(PEG-DSPE)의 1:1 혼합물에 용해시켰다. 이후 40℃ 진공하 로터베이퍼에서 1시간 동안 증발시켜 건조하고, 이어서 1시간동안 질소 기체로 흐름을 일으켰다.
1200 mg 프레드니솔론 디소듐 포스페이트(PLP) (OPG Nieuwegein)를 칭량하여 12 ml 살균 PBS에 용해시켰다. 용액을 건조 지질 필름에 첨가하고, 지질 필름을 완전히 수화할 수 있도록 유리구슬의 존재하에서 1시간동안 흔들었다.
리포솜 현탁액을 압출기(Avestin, 최대 부피 15 ml)로 옮기고, 질소기체를 사용하여, 하나가 다른 것 위에 놓여지며, 각각이 200과 100 nm, 각각 100과 50 nm, 및 각각 50과 50 nm의 구멍크기를 갖는 2개의 구멍 필터를 통해 6회, 가압하에서 압출하였다. 그 후에, 리포솜 현탁액을 1리터의 살균 PBS에 대해 투석 구획(Slide-A-Lyzer, 10,000 MWCO)에서 24시간동안 2회 투석하였다.
리포솜의 평균 입자 크기를 광 산란(Malvem Zeta-sizer)에 의하여 결정한 결과, 각각 85 및 90nm이며, 다분산 지수는 <0.1임을 알게 되었다. 프레드니솔론 포스페이트의 캡슐화 효율성을 HPLC 방법에 의해 결정한 결과 2.6%임을 알게 되었다. 리포솜의 현탁액을 4℃에서 질소 분위기중에서 저장하여, 적어도 5주동안 안정하다는 것을 알게되었으며, 여기에서 실시예 14의 지질-폴리머-접합체를 함유하는 리포솜 제제가 참고의 지질-폴리머-접합체 PEG-DSPE를 함유하는 리포솜 제제보다 훨씬 더 양호하게 행해졌다(도 3을 보라).
실시예 24
프레드니솔론 포스페이트-함유 리포솜 제형의 랫트 아주반트 관절염 모델에서의 순환 시간 및 치료 효율성 평가
루이스 랫트를 불완전 프로인트 항원보강제(Freund's adjuvant)중의 열-비활성화된 미토박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로 꼬리 바닥에서 피하로 면역화시켰다. 면역화후 9 내지 12일 사이에 시작된 발 염증이 약 20일 후에 최대 심각성에 도달하였으며, 그리고나서 점차적으로 해결되었다.
질병에 대한 평가를 면역화 후 10일부터 35일까지 발 염증 심각성을 외관상으로 점수화하여 행하였다. 발 염증 점수가 최대 점수(14-15일)의 중간값에 도달하였을 때, 모든 랫트를 동일한 평균 점수를 갖는 군으로 나누고, 단일 정맥내 주사로 처리하였다:
1. 실시예 23에 따라 제조된 PHEA-DODASuc 리포솜중의 10 mg/kg PLP 또는
2. 실시예 23에 따라 제조된 PEG-DSPE 리포솜중의 10 mg/kg PLP(참조군) 또는
3. PBS(대조군).
t=0, 24 및 48시에, 혈액 샘플을 수집하고 리포솜 PLP중의 혈장 농도에 대해 분석하였다.
혈액중 PHEA- 및 PEG- 리포솜 둘 모두의 순환 작용을 PLP에 대한 혈장 농도 프로파일에 의해 나타내었으며, 도 4에서 묘사하였다. 순환 반감기에 관하여 두 리포솜 타입 모두 동일하게 잘 행했다.
도 5는, 대조군으로서 식염수-처리된 랫트대 10 mg/kg PLP-PHEA- 및 10 mg/kg PLP-PEG-리포솜의 랫트 아주반트 관절염에서의 치료 활성도를 나타낸다.
Claims (13)
- 양쪽 친화성 지질, 및 폴리머 또는 그들의 모노머 선구물질로부터 얻을 수 있는 지질-폴리머 접합체에 있어서,상기 양쪽 친화성 지질은 적어도 하나의 소수성 무극성 부분과 하나의 친수성 극성 머리 기로 구성되고, 상기 폴리머 또는 그들의 모노머 선구물질은 N- 및 C-종결 말단기를 가지는 것으로서,상기 폴리머가 폴리-(아미노산) 또는 폴리-(아미노산 유도체)이고, 상기 지질이 상기 폴리머의 N 또는 C 종결 말단기에 부착되고, 상기 폴리머가 다음의 식을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체.-[NHCHR(CH2)mCO]n-여기서:-R은 -H, -CH3, -CHCH30R1, -(CH2)xOR1, -(CH2)x-CO-NHR1, -(CH2)x-NH-CO-R1, -(CH2)x-SOyCH3, 또는 -(CH2)xCOOH로 정의되고;-R1은 H 또는 하나이상의 히드록시기 또는 하나의 디(C1-C4)알킬아민기로 치환된 (C1-C4)알킬이고;x는 0-4이고;m = 1 또는 0이고;y = 1 또는 2이다.
- 제 1 항에 있어서, 양쪽 친화성 지질이 인지질, 당지질, 세라마이드, 콜레스테롤 및 유도체, 포화 또는 불포화, 분지쇄 또는 직쇄의 C8-C100 모노- 또는 디- 알킬아민, 아릴알킬아민, 시클로알킬 알킬아민, 알카놀, 알데히드, 카르보할라이드 또는 알카노산 및 그들의 무수물로 구성되는 군으로부터 선택되고, C-원자의 총 수가 25이상인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 2 항에 있어서, 양쪽 친화성 지질이 적어도 두개의 소수성 무극성 부분을 함유하는 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 3 항에 있어서, 양쪽 친화성 지질이 1-헵타데실옥타데실아민, N-숙시닐-디옥타-데실아민 및 디스테아릴포스파티딜에탄올아민으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머가 물 중에서, χ-파라미터 ≤ 0.65 인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머가 α-아미노산 또는 그들의 유도체로 구성되는 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머가 4-8의 생리적 pH내에서 하전된 기를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 7항에 있어서, 폴리머가 중성이거나 4-8의 생리적 pH에서 중성화된 아미노산 모노머 또는 아미노산 유도체 모노머로 구성되는 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머가 500 내지 75,000 사이의 수평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리머가 생분해가능한 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리머가 폴리[N-(2-히드록시에틸)]-L-글루타민인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리머가 폴리(2-히드록시에틸)-L-아스파라긴인 것을 특징으로 하는 접합체.
- 제 1 항에 있어서, 폴리머가 폴리(D,L-메티오닌 술폭시드)인 것을 특징으로 하는 접합체.
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