DE60200886T2

DE60200886T2 - Polymere

Info

Publication number: DE60200886T2
Application number: DE60200886T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth A. Tennis Court Road HALL; Kawulia T. Tennis Court Road OKOLO
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2002-01-30
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2022-01-31
Also published as: US7022808B2; ZA200305833B; ATE272663T1; EP1368403B1; US20060122289A1; GB0102388D0; DK1368403T3; US20040091896A1; ES2223036T3; CA2454215A1; WO2002060974A1; DE60200886D1; EP1368403A1; JP2004531589A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Polymere, insbesondere Polymere, die als Nucleinsäure-Mimetika oder zur Verwendung bei der Festphasensynthese von Oligomeren nützlich sind.
DNA, wie sie in der Natur gefunden wird, wird häufig als Werkzeug oder Sonde beim Nachweis von Analyten wie biologischen Substanzen verwendet, insbesondere bei der Diagnose und beim Nachweis von mikrobiologischen Organismen, wie beispielsweise pathogenen Bakterien.
In jüngerer Zeit wurde ein Nucleinsäure-Mimetikum entwickelt, das bekannt ist, mit DNA zu wechselwirken und als Peptidnucleinsäure (PNA) bekannt ist. Es ist bekannt, daß Peptidnucleinsäuren unter Bildung von Triplexstrukturen an purinreichen Stellen in DNA-Stränge eindringen (P. E. Nielson et al., Science, 1991, 254, Seite 1497 bis 1506; Turney D. Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 1667 bis 1670).
PNA hat ein Polymer- oder Pseudopeptid-Rückgrat, das synthetisiert wurde, um mit seiner Konfiguration einen DNA-Strang vorzutäuschen, indem es sechs Bindungen zwischen Nucleotideinheiten und drei Bindungen zwischen dem Rückgrat und jeder Nucleotidbase aufweist. Die Vorteile einer Verwendung von DNA-Mimetika in Nachweismethoden sind im Allgemeinen diejenigen, daß sie erhöhte Detektionsgrenzen in Hinblick auf natürlich vorkommende DNA aufweisen. Die Hybridisierungskinetiken können schneller sein, und die Strukturen können robuster oder stabiler als DNA sein.
Es gibt zahlreiche Anwendungen für Nucleinsäure-Mimetika in der biotechnologischen Forschung und in therapeutischen Anwendungen, von denen einige beispielsweise in EP-A-0839830 zusammengefaßt werden, zusammen mit einer acyclischen Nu cleotid-Mimetikumsstruktur. Ferner sind Polymere, die für die Festphasensynthese von Oligomeren nützlich sind in WO92/07882 beschrieben.
Die Anmelder haben gefunden, daß 5–6-gliedrige ungesättigte Ringe gute Rückgratelemente für Nucleinsäure-Mimetika und andere Polymere darstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt bereit ein Polymer, das eine Vielzahl von 5–6-gliedrigen ungesättigten Ringen aufweist, die gleich sein oder sich voneinander unterscheiden können, die mittels Verknüpfergruppen, die ein Rückgrat bilden, miteinander verknüpft sind, wobei wenigstens einige der 5–6-gliedrigen ungesättigten Ringe einen Liganden tragen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung bereit eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
worin n eine ganze Zahl ist, die größer als 1 ist, jedes A gleich oder verschieden ist und ein 5- oder 6-gliedriger ungesättigter Ring ist, jedes R¹ jeder anderen derartigen Gruppe gleich ist oder davon verschieden ist und ausgewählt ist aus Wasserstoff oder einer Ligandengruppe, jedes R² gleich oder verschieden ist und eine ggf. substituierte Verknüpfergruppe ist, R³ Wasserstoff oder eine Blockiergruppe ist, R⁴ wenigstens ein Teil einer Verknüpfergruppe ist, p 0 oder 1 ist, und R⁵ eine austretende Gruppe oder ein blockiertes Derivat davon ist.
Geeignete 5–6-gliedrige ungesättigte Ringe A sind C_5-6-Cycloalkenyl, C_5-6-Cycloalkinyl, Phenyl oder ungesättigte heterocyclische Ringe. Heterocyclische Ringe können eines oder mehrere Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome sind Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel. Somit schließen Beispiele für geeignete heterocyclische Ringe Triazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Imidazol, Imidazolin, Pyrazol, Pyrrol, Furan, Thiazin und Thiophen ein.
Vorzugsweise sind die 5–6-gliedrigen ungesättigten Ringe im Allgemeinen unter normalen Bedingungen planar, und bevorzugte Ringe sind somit aromatische Ringe wie Phenyl oder heteroaromatische Ringe wie Triazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Imidazol, Pyrazol, Pyrrol, Furan, Thiazin und Thiophen.
Am stärksten bevorzugt ist der ungesättigte Ring A eine 6-gliedrige aromatische Gruppe der Unterformel (i)
wobei X₁, X₂ und X₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus C oder N.
Insbesondere sind Gruppen der Unterformel (i) stickstoffhaltige Ringe wie Triazin, Pyridin und Pyrimidin, und von diesen ist Triazin eine besonders bevorzugte Gruppe.
Geeignete Verknüpfergruppen R² variieren in Abhängigkeit von der genauen Natur des benötigten Polymers und dem Zweck, dem es zugeführt werden soll. Im Allgemeinen umfaßt R² jedoch eine ggf. substituierte Kette von 2–8 Atomen oder einen ggf. substituierten Ring aus 3–8 Atomen, wobei die Atome ausgewählt sind aus Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen wie Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel.
Wenn R² ein Ring ist, kann dieser aromatisch oder nicht-aromatisch sein. Ein spezielles Beispiel für einen Verknüpfer in Form eines aromatischen Rings ist Benzyl, und ein spezielles Beispiel für einen Verknüpfer in Form eines nicht-aromatischen Rings R² ist Cyclohexyl.
Insbesondere umfaßt der Verknüpfer R² eine ggf. substituierte Kette von 2–8 Atomen und vorzugsweise 3–8 Atomen.
Wenn die Verknüpfergruppen R² Kohlenstoff- oder Stickstoffatome enthalten, sind diese mit weiteren Gruppen substituiert, um die Valenzbedingungen zu erfüllen, und diese Gruppen können Wasserstoff sein, können alternativ jedoch auch ein fakultativer Substituent sein.
Geeignete fakultative Substituenten für Verknüpfergruppen R² schließen ein Alkyl (wie beispielsweise C_1-4-Alkyl), Hydroxy, Hydroxyalkyl (wie beispielsweise Hydroxy-C_1-4-alkyl und insbesondere Hydroxymethyl), Alkoxy (wie C_1-4-Alkoxy), Alkanoyl (wie beispielsweise C_1-4-Alkanoyl), Carboxy oder Salze oder Ester davon (wie beispielsweise Alkylester), Carboxyalkyl (wie beispielsweise Carboxy-C_1-4-alkyl) und insbesondere CH₂COOH) oder Salze oder Ester davon (wie beispielsweise Alkylester), Nitro, Nitroalkyl (wie beispielsweise C_1-4-Nitroalkyl, insbesondere -CH₂NO₂), Cyano, Cyanoalkyl (wie beispielsweise C_1-4-Cyanoalkyl, insbesondere -CH₂CN), Amino, Mono- oder Di-alkylamino, Aminoalkyl (wie beispielsweise Amino-C_1-4-alkyl und insbesondere CH₂NH₂)-Phosphat, Alkylphosphat (wie beispielsweise C_1-4-Alkylphosphat und insbesondere CH₂PO₃), Sulfat, Alkylsulfat (wie beispielsweise C_1-4-Alkylsulfat und insbesondere CH₂SO₃), Mercapto, Alkylthio (wie beispielsweise C_1-4-Alkylthio), Alkylsulfonyl oder ein Reportermolekül oder ein Label.
Die Substituenten an den Verknüpfergruppen können die Lipophilie oder Hydrophilie des gewünschten Polymers beeinträchtigen. Wenn beispielsweise liphophile Polymere benötigt werden, können Substituenten weggelassen werden oder können ausgewählt werden aus Alkylgruppen, wie beispielsweise C_1-4-Alkyl und insbesondere Methyl. Wenn hydrophile Polymere benötigt werden, können geeigneterweise geladene oder elektronenreiche Substituenten wie beispielsweise Hydroxy, Hydroxyalkyl, Carboxy oder Salze oder Ester davon (wie beispielsweise Alkylester), Carboxyalkyl, Nitro, Cyano, Phosphat, Alkylphosphat, Sulfat oder Alkylsulfat verwendet werden.
Wenn die fakultativen Substituenten für die Verknüpfergruppen R² Reportermoleküle oder Label einschließen, können diese fluoreszierende Label umfassen. Typische Nucleinsäurelabel schließen ein Fluoresceinderivate (wie beispielsweise 5-Carboxyfluorescein, Fluoresceinisothiocyanate (FITCs), Fluoresceindichlortriazine (DTAIs)), Rhodaminderivate (wie beispielsweise 5-Carboxytetramethylrhodamin, Rhodamin 6G, Rhodamine Green^TM, Rhodamine Red^TM, Lissamine^TM, Rhodamin B), Texas-Red^TM, BODIPY^TM und Cascade Blue^TM. Andere Anfärbmittel, die zum Nachweis von Nucleinsäuren verwendet werden können, schließen ein Ethidiumbromid, Acridinhomodimer, Acridinorange, Ethidium-Acridin-Heterodimer, SYBR^TM Green, SYBR^TM Gold und PicoGreen^TM.
Geeigneterweise enthalten die Verknüpfergruppen R² sowohl Kohlenstoff- als auch Heteroatome, insbesondere Sauerstoff- oder Stickstoffatome.
Besonders bevorzugte Verknüpfergruppen R² sind Gruppen der Unterformeln (ii) oder (iii) -Y¹-(CR⁶R⁷)m-Y²- (ii) -(CR⁸R⁹)_s-Y³-(CR¹⁰R¹¹)_t- (iii)worin m, s und t unabhängig voneinander aus ganzen Zahlen von 1–6, und vorzugsweise 2–4, ausgewählt sind, und Y¹ und Y² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Bindung, O, S, NR¹², -C(O)O-, -OC(O)-, -NR¹²C(O)-, -C(O)NR¹²-, oder -NR¹²C(O)NR¹³, wobei R¹² und R¹³ unabhängig voneinander aus Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl, wie beispielsweise Methyl, ausgewählt sind und Y³ eine Gruppe ist, die durch Verknüpfung von zwei Einheiten gebildet wird, wie beispielsweise Ester und Amide der Formeln -C(O)O-, -OC(O)-, -NR¹²C(O)-, -C(O)NR¹²-, oder -NR¹²C(O)NR¹³, wobei R¹² und R¹³ wie oben definiert sind; und wobei jedes R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl (wie beispielsweise C_1-4-Alkyl), Hydroxy, Hydroxyalkyl (wie beispielsweise Hydroxy-C_1-4-Alkyl und insbesondere Hydroxymethyl), Alkoxy (wie beispielsweise C_1-4-Alkoxy), Alkanoyl (wie beispielsweise C_1-4-Alkanoyl), Carboxy oder Salzen oder Estern davon (wie beispielsweise Alkylestern), Carboxyalkyl (wie beispielsweise Carboxy-C_1-4-alkyl und insbesondere CH₂COOH) oder Salzen oder Estern davon (wie beispielsweise Alkylestern), Nitro, Nitroalkyl (wie beispielsweise C_1-14-Nitroalkyl und insbesondere -CH₂NO₂), Cyano, Cyanoalkyl (wie beispielsweise C_1-4-Cyanoalkyl und insbesondere -CH₂CN), Amino, Mono- oder Di-alkylamino, Aminoalkyl- (wie beispielsweise Amino-_1-4-alkyl- und insbesondere -CH₂NH₂)-phosphat, Alkylphosphat (wie beispielsweise C_1-4-Alkylphosphat und insbesondere CH₂OPO₃), Sulfat, Alkylsulfat (wie beispielsweise C_1-4-Alkylsulfat und insbesondere CH₂SO₃), Mercapto, Alkylthio (wie beispielsweise C_1-4-Alkylthio), Alkylsulfonyl oder einem Reportermolekül oder einem Label, wie oben beschrieben.
Geeigneterweise sind wenigstens einige Gruppen R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ und R¹¹ Wasserstoff. Besonders bevorzugt ist maximal eine Gruppe R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ und R¹¹ eine andere Gruppe als Wasserstoff.
Vorzugsweise sind R¹² und R¹3 Wasserstoff.
Bei der Verwendung hierin beinhaltet der Begriff "Alkyl" sowohl gerad- als auch verzweigtkettige Gruppen, die, wenn nichts anderes gesagt ist, beispielsweise von 1–10 und geeigneterweise von 1–6 Kohlenstoffatome enthalten können. Andere Begriffe, wie beispielsweise Alkoxy und Alkanoyl, wie sie hierin verwendet werden, schließen Alkylgruppen ein, wie sie hier diskutiert wurden, in Kombination mit der herkömmlichen Funktionalität.
Besondere Beispiele für Verknüpfergruppen der Unterformel (ii) sind Gruppen -NHCH₂CH₂NH-, -OCH₂CH₂O-, -NHC(O)CH₂O-, -NHC(O)NHCH₂-, -NHC(OH)CH₂NH-, -NHCH(CH₂COOH)CH₂NH-, -NHCH(CH₂OH)CH₂NH₂-, -OCH(CH₂OH)CH₂O-, -NHCH(CH₂OPO₃ ^2–)CH₂NH₂- oder -NHCH(CH₂NH₂)CH₂NH-. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für eine Verknüpfergruppe R² ist eine Gruppe -NHCH₂CH₂NH-. Derartige Verknüpfergruppen sind insbesondere dann nützlich, wenn lipophile Polymere benötigt werden.
Beispiele für geeignete Liganden für R¹ hängen von der Natur des Polymers ab und dem Zweck, dem es zugeführt werden soll. Die Liganden R¹ können beispielsweise ausgewählt sein aus Nucleobasen, und insbesondere natürlich vorkommenden Nucleobasen, Nucleobasen-bindenden Gruppen oder DNA-Intercalatoren. Diese können direkt an den Ring A gebunden sein, oder es kann eine Abstandsgruppe, wie beispielsweise eine C_1-4 und vorzugsweise eine C_1-2 Alkylenkette zwischen den Nucleobasen, der Nucleobasen-bindenden Gruppe oder dem DNA-Intercalator und dem Ring A eingeschoben sein.
Derartige Liganden ermöglichen es der Verbindung der Formel (I), Wechselwirkungen auszubilden, wie beispielsweise Hybridisierungswechselwirkungen, mit DNA- oder RNA-Molekülen.
Für eine Verwendung als DNA-Mimetika weisen die Liganden R¹ jedoch im Allgemeinen natürlich vorkommende Nucleobasen auf. In einigen Fällen, wenn eine zusätzliche Beabstandung zwischen Liganden benötigt wird, können jedoch wenigstens einige der Gruppen R¹ Wasserstoff sein. Vorzugsweise sind jedoch die meisten, wenn nicht alle Gruppen R¹ andere als Wasserstoff.
Allgemein gesprochen, hängt die Natur von R³, R⁴, so vorhanden, und R⁵ von dem für die Herstellung des Polymers angewandten Herstellungsverfahren ab, wie weiter unten ausgeführt wird, sowie von der Natur der Verknüpfergruppe R². Geeignete blockierende Gruppen R³ sind diejenigen, die dazu verwendet werden, Gruppen Y² in der Unterformel (ii) während der Polymerherstellungsreaktion zu schützen. So kann beispielsweise auch R³ eine Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonyl- wie beispielsweise eine Benzylcarbonyl-Gruppe sein, wenn Y² Sauerstoff ist, oder ein Alkoxycarbonylester wie beispielsweise t-Butoxycarbonylester, wenn Y² NH- ist. Üblicherweise ist R³ jedoch Wasserstoff.
In ähnlicher Weise kann R⁵ eine austretende Gruppe wie beispielsweise Halogen, wie beispielsweise Fluor, Chlor, Brom oder Iod, sein, sowie auch Mesylat oder Tosylat, insbesondere Chlor. Derartige austretende Gruppen können bei dem Herstellungsverfahren benötigt werden, um es der Polymerkette zu ermöglichen, in diese Richtung zu wachsen, wenn das benötigt wird. Die terminalen austretenden Gruppen können jedoch blockiert sein, wenn das gewünscht wird oder erforderlich ist, um ein Kettenwachstum in dieser Richtung zu verhindern, wobei herkömmliche Chemie, wie sie nachfolgend beschrieben wird, zum Einsatz kommt.
Bei den Verbindungen der Formel (I) kann die ganze Zahl n irgendetwas sein, und zwar in Abhängigkeit von der Natur des Produkts, das hergestellt wird. Im Allgemeinen wird n jedoch im Bereich von 2–200 liegen und vorzugsweise von etwa 6–100, stärker bevorzugt von 10–60.
Bei einer besonderen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Verbindungen der Formel II
worin R², R³, R⁵ und n wie im Hinblick auf Formel (I) definiert sind, jedes R¹ gleich ist oder unterschiedlich ist und wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist, und X₁, X₂ und X₃ wie im Hinblick auf Unterformel (ii) definiert sind.
Besonders geeignete Verbindungen der Formel (II) können teilweise dargestellt werden wie folgt:
worin B₁, B₂ und B₃ Nucleobasen darstellen
a, b und c unabhängig voneinander ausgewählt sind aus 0 oder einer ganzen Zahl von 1–6, mit der Maßgabe, daß a + b + c m äquivalent ist, wie dieses im Hinblick auf die Unterformel (iii) definiert ist;
jedes R²⁰ ein fakultativer Substituent für eine Verknüpfergruppe, wie er oben definiert wurde, ist;
R⁵ wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist,
Y₁ und Y₂ definiert sind wie im Hinblick auf Unterformel (iii), und wobei sich das Polymer in ähnlicher Weise in Richtung der punktierten Linie weiter erstreckt.
Vorzugsweise ist in der obigen Formel b 0, 1 oder 2 und vorzugsweise 0 oder 1.
Geeigneterweise werden a und c unabhängig voneinander ausgewählt aus 0, 1 oder 2.
Vorzugsweise ist dann, wenn b 1 ist, eines von a oder c 0 und das andere 1.
Wenn R⁵ eine austretende Gruppe ist, wird ein weiteres Kettenwachstum an diesem Ende des Polymers erleichtert.
Polymere Verbindungen der Formel (I) werden geeigneterweise hergestellt nach Verfahren, die in der Literatur konventionell sind. Insbesondere können sie hergestellt werden durch schrittweise Anfügung von geeignet substituierten Monomeren an eine Kette. Somit werden Verbindungen der Formel (I) in geeigneter Weise hergestellt durch ein reiteratives Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Umsetzen einer Verbindung der Formel (III)
in der A, R⁴, R⁵ und p wie im Hinblick auf Formel (I) definiert sind, R^1' eine Gruppe R¹, wie sie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist, oder ein geschütztes Derivat davon ist; R^2' eine Gruppe R² ist, wie sie in Hinblick auf Formel I definiert ist, oder eine geschützte Form davon ist, wobei p 0 ist; oder R^2' eine Vorläufergruppe ist, so daß R² oder eine geschützte Form davon gebildet wird durch -R^2'-R⁴-, wobei p 1 ist, und R¹⁴ eine Schutzgruppe ist, mit einer Verbindung der Formel (IV)
wobei A, R², R⁴ und p wie im Hinblick auf Anspruch 1 definiert sind, q 0 oder 1 ist, R^1' und R^2' wie oben im Hinblick auf Formel (III) definiert sind, und alle davon entsprechenden Einheiten in der Verbindung der Formel (III) gleich sind oder sich davon unterscheiden, wobei R¹⁵ eine Schutzgruppe ist und q 0 oder 1 ist, danach
(b) Entfernen der Schutzgruppe R¹⁴ und Umsetzen des Produkts mit einer weiteren Verbindung der Formel (III); oder
(c) wenn q gleich 1 ist, Entfernen der Schutzgruppe R¹⁵ und Umsetzen des Produkts mit einer weiteren Verbindung der Formel (III); und
(d) Wiederholen von Schritt (b) und/oder (c), bis das gewünschte Polymer erhalten wurde;
(e) Entfernen aller Schutzgruppen an R^1' und/oder R^2'; sowie danach gewünschtenfalls oder erforderlichenfalls Entfernen aller restlichen Schutzgruppen R¹⁴ oder R¹⁵ und/oder Einführen einer blockierenden Gruppe R³.

Bei diesem Verfahren ergibt die Gesamtzahl von Stufen in den Schritten (a), (b) und/oder (c) insgesamt n – 1, wobei n in Bezug auf Formel (I) definiert ist.
In jeder Stufe kann die verwendete Verbindung der Formel (III) gleich sein oder verschieden. Wenn diese verschieden sind, kann die genaue Struktur des Zielpolymers der Formel (I) ausgewählt werden.
Indem man beispielsweise die Natur der Verknüpfergruppen variiert, die in den Polymerketten enthalten sind, können Punkte einer besonderen Schwäche vorgesehen werden, die einer nachfolgenden Spaltung unterzogen werden können, wenn das nötig ist.
Die Kupplungsreaktionen des obigen Verfahrens werden üblicherweise unter herkömmlichen Bedingungen durchgeführt. Beispielsweise wird die Kupplung in geeigneter Weise in einem Lösemittel durchgeführt, und insbesondere in einem organischen Lösemittel wie Tetrahydrofuran (THF) bei moderaten Temperaturen, die im Bereich von 0 bis 80°C liegen können, vorzugsweise von 30 bis 50°C. Die Reaktion kann in Anwesenheit einer Base durchgeführt werden, die geeigneterweise eine schwache Base wie beispielsweise Triethylamin ist.
Wenn p gleich 1 ist, führt die Kupplung zu der Bildung der Verknüpfergruppe R². Beispielsweise kann es besonders geeignet sein, eine Bindung wie eine Amidbindung in der Mitte des Verknüpfers R² auszubilden, der daher von der Unterformel (iii), wie oben definiert, sein kann.
In diesem Falle würde somit eine besonders geeignete Gruppe R^2' in Formel (IV) eine Gruppe der Unterformel (iv) umfassend -(CR⁸R⁹)_s-NH- (iv)worin R⁸, R⁹ und s wie im Hinblick auf die Unterformel (iii) definiert sind, und in der Verbindung der Formel (III) ist R⁵ Hydroxy, und R⁴ ist eine Gruppe der Unterformel (v) -C(O)-(CR¹⁰R¹¹)_t- (v)worin R¹⁰, R¹¹ und t wie im Hinblick auf Unterformel (iii) definiert sind.
Die genaue Natur der Schutzgruppen R¹⁴ und R¹⁵ variiert in Abhängigkeit von der Einheit, an die sie angefügt sind, (d. h. R^2' oder beziehungsweise R²), und geeignete Beispiele sind für einen erfahrenen Chemiker offensichtlich. Vorzugsweise unterscheidet sich R¹⁴ von R¹⁵, um die Entfernung einer dieser Gruppen zu einem Zeitpunkt zu erleichtern. Geeignete Schutzgruppen R¹⁴ und R¹⁵ (wenn beispielsweise R^2' und/oder R² Aminogruppen enthalten) schließen ein Benzyl, Alkoxycarbonylester wie beispielsweise t-Butoxycarbonylester (Boc), 9-Fluorenylmethoxycarbonylester (FMOC) oder Amide wie beispielsweise N-Formyl, oder Amide wie beispielsweise Phthalimid. Wenn R^2' und R² Sauerstoffatome enthalten wie beispielsweise Ether, sind R¹⁴ und/oder R¹⁵ geeigneterweise Ester wie beispielsweise Acetate, insbesondere OC(O)CH₃ oder Trifluoracetat, Carbamate wie beispielsweise Alkylcarbamate, insbesondere -OC(O)OCH₃, oder Ether, wie beispielsweise Tertiärbutylether, Benzylether oder Trimethysilylether.
Ähnliche Überlegungen gelten im Hinblick auf die Anwesenheit oder das Fehlen von Schutzgruppen an den Gruppen R^1' und/oder R^2'. Wenn beispielsweise R¹ eine natürlich vorkommende Nucleobase ist, kann es vorzuziehen sein, eine oder mehrere der Aminogruppen oder Ring-Stickstoffatome zu schützen, um zu gewährleisten, daß es während seiner Bildung zu keiner zufälligen "Vernetzung" des Polymers kommen kann. Geeignete Schutzgruppen schließen ein Alkanoyl- oder Aroyl-Gruppen wie beispielsweise Benzoyl. Diese werden in geeigneter Weise in eine Base in einem vorausgehenden Schritt eingeführt, unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, beispielsweise wie sie nachfolgend illustriert werden.
Wenn R^2' reaktive Substituenten wie Hydroxy-, Amino- oder Carboxy-Gruppen enthält, können diese während der Herstellung geschützt werden, und zwar unter Verwendung von Verfahren, die denen ähnlich sind, die im Hinblick auf R¹⁴ und R¹⁵ erläutert wurden.
Die Entfernung von Schutzgruppen R¹⁴ und R¹⁵ sowie aller Schutzgruppen, die an R^1' oder R^2' vorhanden sind, kann unter herkömmlichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie auch in den nachfolgenden Beispielen illustriert werden.
Verbindungen der Formel (III) und (IV) werden geeigneterweise dadurch hergestellt, daß man die geeigneten Substituenten, in irgendeiner Reihenfolge, an eine Verbindung der Formel (V) einführt (V)
worin A im Hinblick auf Formel (I) definiert ist und R¹⁷, R¹⁸ und R¹⁹ gleich oder verschieden sind und jeweils austretende Gruppen sind. Beispiele für geeignete Verfahren werden nachfolgend angegeben. Die Reihenfolge, in der die Substituenten in die Verbindung der Formel (V) eingeführt werden, variiert in Abhängigkeit von der Natur der speziellen involvierten Substituenten. Vorzugsweise sind R¹⁷, R¹⁸ und R¹⁹ voneinander verschieden, da das eine präzise gezielte Anordnung von Substituenten um den Ring ermöglicht. Die Anmelder haben jedoch gefunden, daß zwei oder mehr von R¹⁷, R¹⁸ und R¹⁹ gleich sein können, und daß eine sorgfältige Kontrolle der Reaktionsbedingungen gute Ausbeuten an dem gewünschten substituierten Produkt gewährleistet.
Geeignete austretende Gruppen R¹⁷, R¹⁸ und R¹⁹ schließen ein austretende Gruppen, wie sie oben im Hinblick auf R⁵ aufgelistet wurden, und insbesondere sind sie Halogengruppen wie beispielsweise Chlor.
Beispielsweise werden Verbindungen der Formel (III), wobei p 0 ist und R⁵ die gleiche austretende Gruppe ist wie R¹⁹, in geeigneter Weise hergestellt dadurch, daß man eine Verbindung der Formel (VI)
worin R² wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist, R¹⁴, wie im Hinblick auf Formel (III) definiert ist und R¹⁷ und R¹⁹ wie im Hinblick auf Formel (V) definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (VII) umsetzt, HR^1' (VII) worin R¹ wie im Hinblick auf Formel (III) definiert ist. Die Reaktion wird geeigneterweise in einem Lösemittel wie beispielsweise einem Aceton/Wasser-Lösemittel durchgeführt, in Gegenwart einer Base wie beispielsweise Natriumcarbonat. Es werden moderate Temperaturen, beispielsweise von 0° bis 50°C und bequemerweise etwa Raumtemperatur angewandt, um eine Überproduktion eines unerwünschten trisubstituierten Produkts zu vermeiden, was ein besonderes Risiko darstellen kann, wenn R¹⁷ und R¹⁹ die gleichen austretenden Gruppen sind.
Verbindungen der Formel (VI) können dadurch hergestellt werden, daß man eine Verbindung der Formel (V), wie sie oben definiert wurde, mit einer Verbindung der Formel (VIII) H-R²-R¹⁴ (VIII)umsetzt, worin R² wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist und R¹⁴ wie im Hinblick auf Formel (III) definiert ist. Die Reaktion wird geeigneterweise in einem organischen Lösemittel wie beispielsweise einem Aceton/Wasser-Lösemittel bewirkt, in Gegenwart einer Base wie beispielsweise Natriumhydrogencarbonat. In diesem Fall werden niedrige Temperaturen, beispielsweise von –20 bis 10°C und üblicherweise etwa 0°C angewandt, um eine Überproduktion von unerwünschten di- oder tri-substituierten Produkten zu vermeiden.
Bei einer speziellen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (X) bereit
wobei R² wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist, und R¹⁴ wie im Hinblick auf Formel (III) definiert ist, durch Umsetzen eines Cyanurchlorids mit einer Verbindung der Formel (XI) H-R²-R¹⁴ (XI)wobei R² und R¹⁴ wie oben definiert sind, bei einer Temperatur unterhalb von 10°C und vorzugsweise bei etwa 0°C.
Verbindungen der Formel (III) können in Verbindungen der Formel (IV) umgewandelt werden, und zwar durch Reaktion mit einer Verbindung der Formel (IX) R¹⁵[ -R²] -_qH (IX)worin R² wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist, und R¹⁵ und q wie im Hinblick auf Formel (IV) definiert sind. Die Reaktion wird geeigneterweise in einem organischen Lösemittel wie Tetrahydrofuran (THF) bei erhöhten Temperaturen durchgeführt, beispielsweise bei der Rückflußtemperatur des Lösemittels.
Zwischenstufen der Formeln (III), (IV) und (VI) können neue Verbindungen sein und stellen als solche einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Verbindungen der Formeln (V), (VIII) und (IX) sind entweder bekannte Verbindungen oder können nach herkömmlichen Verfahren aus bekannten Verbindungen hergestellt werden.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) können erforderlichenfalls automatisiert werden.
Verbindungen der Formel (I) sind besonders gute DNA-Mimetika trotz der Tatsache, daß sowohl die Ringstruktur A als auch die Verknüpfergruppe sich signifikant von denjenigen unterscheiden, die in DNA gefunden werden, wie unten erläutert wird, worin "TNA" ein bevorzugtes Beispiel für eine Verbindung der Erfindung ist, B für eine Nucleobase steht und Y₁ und Y₂, wie im Hinblick auf die Unterformel (iii) weiter oben definiert sind.
Das bedeutet, daß sie umfangreiche Anwendungen finden, und zwar in der Biotechnologie, einschließlich von Oligomerproduktionstechniken, sowie auch bei therapeutischen Anwendungen.
Die Erfindung wird nunmehr spezieller in Form von Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Stufe 1
Schutz von Ethylendiamin
Ethylendiamin (10,45 g) in Dichlormethan (60 ml) wurde zu einer Lösung von t-Butoxycarbonylester (Boc)-Anhydrid (4,90 g) in Dichlormethan (60 ml) innerhalb eines 2-stündigen Zeitraums zugegeben. Die Reaktion wurde 22 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bevor das Lösemittel verdampft wurde. Zu dem Rückstand wurde Wasser (100 ml) zugesetzt, und das unlösliche Produkt wurde durch Filtration entfernt. Die wäßrige Lösung wurde mit Dichlormethan (3 × 100 ml) extrahiert, und die kombinierten organischen Schichten wurden eingedampft und lieferten das gewünschte einfach geschützte Produkt als farbloses Öl (23,01 g, 83%).
Stufe 2
Anfügung des einfachen Boc-geschützten Ethylendiamins an Cyanurchlorid
Das N-Boc-Ethylendiamin aus Stufe 1 (500 mg) wurde zu einer Aufschlämmung aus Cyanurchlorid (75 mg) in Aceton (12 ml) gegeben, die dann in Eiswasser, das auf 0°C gehalten wurde, unter Rühren eingegossen wurde. Es wurde Natriumbicarbonat (262 mg) zugesetzt, und nach einem Rühren für 2 Stunden bei 0°C wurde ein weißer Feststoff abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Es wurde dafür gesorgt, sicher zu stellen, daß die Temperatur der Reaktion nicht über 0°C anstieg, um die Bildung von unerwünschten di- und tri-substituierten Produkten und die Hydrolyse der Chlorgruppen zu verhindern. Das gewünschte Produkt wurde als weißer Feststoff (763 mg, 93%) erhalten, der aus Pyridin umkristallisiert wurde.
Stufe 3
Einfacher Schutz der Nucleobase (Thymin) als Benzoylaminoderivat
Thymin (2,62 g) wurde in Acetonitril (33 ml) gelöst, und es wurden Pyridin (13,5 ml) und Benzoylchlorid (11,68 g) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Die erhaltene orange Lösung wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand in eine 1 : 1-Dioxan/Wasser-Mischung (62 ml) extrahiert. Es wurde Kaliumcarbonat (4,86 g) zugesetzt, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Zu der Lösung wurde Chlorwasserstoffsäure (1 N) zugesetzt, um den pH auf etwa 3 zu vermindern, wonach der Niederschlag gesammelt und aus Ethanol umkristallisiert wurde. Das gewünschte 3-Benzoylaminderivat wurde in Form fahlgelber Nadeln (2,5 g) erhalten.
Stufe 4
Anfügung der Nucleobase an das einfach substituierte Produkt
Das 3-N-Benzoylthymin aus Stufe (3) (0,4 g), Natriumcarbonat (0,2 g) und das einfach substituierte Produkt von Stufe 2 (0,5 g) in Aceton (20 ml) und Wasser (10 ml) wurden miteinander vermischt. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raum temperatur 5 Stunden gerührt. Der Abschluß der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) angezeigt. Der erhaltene gelbe Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet und lieferte das gewünschte Produkt als hellgelben Feststoff (0,41 g).
Stufe 5
Einfacher Schutz von Ethylendiamin als Benzylaminoderivat
Es wurde ein zweites Monomer hergestellt, das einen dritten Substituenten am Triazinmolekül einführte. Ethylendiamin (10 g) in Dichlormethan (60 ml) wurde mit Benzylchlorid (21,01 g) in Dichlormethan vermischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit 1 M Kaliumhydrogensulfat (2 × 100 ml), 5% Natriumhydrogensulfat (100 ml) und Salzlauge (100 ml) gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde bei vermindertem Druck verdampft, und das gewünschte Produkt wurde in Form eines farblosen Öls (22,40 g, 92%) erhalten.
Stufe 6
Drittsubstitution des zweifach substituierten Triazinderivats
Das im obigen Schritt 4 hergestellte disubstituierte Derivat (0,1 g) suspendiert in Tetrahydrofuran (THF) (5 ml) wurde mit der Benzyl-geschützten Ethylendiaminverbindung (0,034 g) aus Stufe 5 behandelt. Die Reaktionsmischung wurde am Rückfluß über Nacht erhitzt, und die Reaktion wurde als abgeschlossen angesehen, wenn mittels TLC kein weiteres Ausgangsmaterial beobachtet wurde. Der schmutzig-weiße Feststoff, der erhalten wurde, wurde abfiltriert und mit mehr THF gewaschen. Nach einer Umkristallisation aus Pyridin wurde das gewünschte Produkt als schmutzig-weißer Feststoff (84 mg, 63%) erhalten.
Schritt 7
Herstellung eines Dimeren
Die beiden in den Stufen 4 bzw. 6 hergestellten Monomeren wurden dann schrittweise in Lösung gekuppelt, wie im nachfolgenden Reaktionsschema gezeigt ist.
Insbesondere wurde das dreifach substituierte Produkt von Stufe 6 (0,50 mg) in Dichlormethan (300 ml) suspendiert und es wurde Trifluoressigsäure (0,5 ml) zugesetzt. Die Mischung wurde 1 Stunde gerührt und dann eingedampft. Der Rückstand wurde in THF (5 ml) mit Triethylamin (24,52 ml) aufgelöst, und das disubstituierte Produkt von Stufe 4 (34 mg) wurde zugesetzt. Die Mischung wurde 2 Stunden bei 40°C gerührt, und es wurde weiteres Triethylamin zugesetzt, bis die Mischung basisch war. Flüchtige Materialien wurden dann bei vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgelöst, mit Kaliumhydrogensulfat (2 × 5 ml), Wasser (5 ml), Natriumbicarbonat (2 × 5 ml) und Salzlauge gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde dann bei vermindertem Druck entfernt, und lieferte das gewünschte Produkt als einen schmutzig-weißen Feststoff (70.91; 93%).
Das Verfahren von Stufe 7 könnte mit den gleichen oder anderen Monomeren wiederholt werden, bis eine optimale Kette erhalten wird.

Claims

Polymer, das eine Vielzahl von 5–6-gliedrigen ungesättigten Ringen aufweist, die gleich sein oder sich voneinander unterscheiden können, die mittels Verknüpfergruppen, die ein Rückgrat bilden, miteinander verknüpft sind, wobei wenigstens einige der 5–6-gliedrigen ungesättigten Ringe einen Liganden tragen.
Polymer nach Anspruch 1, das eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfaßt
worin n eine ganze Zahl ist, die größer als 1 ist, jedes A gleich oder verschieden ist und ein 5- oder 6-gliedriger ungesättigter Ring ist, jedes R¹ jeder anderen derartigen Gruppe gleich ist oder davon verschieden ist und ausgewählt ist aus Wasserstoff oder einer Ligandengruppe, jedes R² eine ggf. substituierte Verknüpfergruppe ist, die jeder anderen derartigen Gruppe gleich ist oder davon verschieden ist, R³ Wasserstoff oder eine Blockiergruppe ist, R⁴ wenigstens ein Teil einer Verknüpfergruppe ist, p 0 oder 1 ist, und R⁵ eine austretende Gruppe oder ein blockiertes Derivat davon ist.
Polymer nach Anspruch 2, wobei die Ringe A aromatische Ringe sind.
Polymer nach Anspruch 2, wobei die Ringe A solche der Unterformel (i) sind
worin X₁, X₂ und X₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus C oder N.
Polymer nach Anspruch 4, wobei wenigstens eine der Gruppen der Unterformel (i) Triazingruppen sind.
Polymer nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Verknüpfergruppen R² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Kette von 2 bis 8 Atomen oder einem Ring aus 3 bis 8 Atomen, die ausgewählt sind aus Kohlenstoffatomen und Heteroatomen, die ggf. substituiert sein können.
Polymer nach Anspruch 6, wobei wenigstens einige der Verknüpfergruppen R² Gruppen der Unterformel (ii) oder (iii) sind, -Y¹-(CR⁶R⁷)m-Y²- (ii) -(CR⁸R⁹)_sY³-(CR¹⁰R¹¹)_t- (iii) worin m, s und t unabhängig voneinander aus ganzen Zahlen von 1–6 ausgewählt sind, und Y¹ und Y² unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Bindung, O, S, NR¹², -C(O)O-, -OC(O)-, -NR¹²C(O)-, -C(O)NR¹²-, oder -NR¹²C(O)NR¹³, wobei R¹² und R¹³ unabhängig voneinander aus Wasserstoff oder C_1-4Alkyl ausgewählt sind, und Y³ eine Gruppe ist, die durch Verknüpfung von zwei Einheiten gebildet wird, wie beispielsweise Ester und Amide der Formeln -C(O)O-, -OC(O)-, -NR¹²C(O)-, -C(O)NR¹²-, oder -NR¹²C(O)NR¹³, wobei R¹² und R¹³ wie oben definiert sind; und wobei jedes R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ und R¹¹ unabhängig voneinander ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Hydroxy, Hydroxyalkyl, Alkoxy, Alkanoyl, Carboxy oder Salzen oder Estern davon, Carboxyalkyl oder Salzen oder Estern davon, Nitro, Nitroalkyl, Cyano, Cyanoalkyl, Amino, Mono- oder Di-alkylamino, Aminoalkylphosphat, Alkylphosphat, Sulfat, Alkylsulfat, Mercapto, Alkylthio, Alkylsulfonyl oder einem Reportermolekül oder einem Label.
Polymer nach Anspruch 7, wobei wenigstens einige Verknüpfungsgruppen R² Gruppen der Formel -NHCH₂CH₂NH- sind.
Polymer nach irgendeinem der vorausgegangenen Ansprüche, wobei die Gruppen R¹ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Nucleobasen, Nucleobasen-bindenden Gruppen oder DNA-Intercalatoren, wobei die Nucleobasen, die Nucleobasen-bindenden Gruppen oder die DNA-Intercalatoren direkt an den Ring A gebunden sein können oder eine dazwischen eingeschobene C_1-4-Alkylenkette aufweisen können.
Polymer nach Anspruch 9, wobei wenigstens einige Gruppen R¹ natürlich vorkommende Nucleobasen sind.
Polymer nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche der Formel (II)
worin R², R³, R⁵ und n wie in Anspruch 1 definiert sind, jedes R¹ gleich ist oder unterschiedlich ist und wie in Anspruch 1 definiert ist, und X₁, X₂ und X₃ wie in Anspruch 4 definiert sind.
Verfahren zur Herstellung eines Polymers nach irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Verfahren das schrittweise Anfügen von geeignet substituierten Monomeren an eine Kette umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 12, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Umsetzen einer Verbindung der Formel (III)
in der A, R⁴, R⁵ und p wie in Anspruch 2 definiert sind, R^1' eine Gruppe R¹, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, oder ein geschütztes Derivat davon ist; R^2' eine Gruppe R² ist, wie sie in Hinblick auf Anspruch 1 definiert ist, oder eine geschützte Form davon ist, wobei p 0 ist; oder R^2' eine Vorläufergruppe ist, so daß R² oder eine geschützte Form davon gebildet wird durch -R^2'-R⁴-, wobei p 1 ist, und R¹⁴ eine Schutzgruppe ist, mit einer Verbindung der Formel (IV)
wobei A, R², R⁴ und p wie in Anspruch 1 definiert sind, q 0 oder 1 ist, R^1' und R^2' wie oben im Hinblick auf Formel (III) definiert sind, und alle davon entsprechenden Einheiten in der Verbindung der Formel (III) gleich sind oder sich davon unterscheiden, wobei R¹⁵ eine Schutzgruppe ist und q 0 oder 1 ist, danach (b) Entfernen der Schutzgruppe R¹⁴ und Umsetzen des Produkts mit einer weiteren Verbindung der Formel (III); oder (c) wenn q gleich 1 ist, Entfernen der Schutzgruppe R¹⁵ und Umsetzen des Produkts mit einer weiteren Verbindung der Formel (III); und (d) Wiederholen von Schritt (b) und/oder (c), bis das gewünschte Polymer erhalten wurde; (e) Entfernen aller Schutzgruppen an R^1' und/oder R²; sowie danach gewünschtenfalls oder erforderlichenfalls Entfernen aller restlichen Schutzgruppen R¹⁴ oder R¹⁵ und/oder Einführen einer blockierenden Gruppe R³.
Verfahren nach Ansrpuch 12 oder Anspruch 13, das auf eine automatisierte Art und Weise durchgeführt ist.
Verbindung der Formel (III), wie sie in Anspruch 13 definiert ist.
Verbindung der Formel (IV), wie sie in Anspruch 13 definiert ist.
Verbindung der Formel (VI)
worin R² wie in Anspruch 2 definiert ist, R¹⁴, wie in Anspruch 13 definiert ist und R¹⁷ und R¹⁹ austretende Gruppen sind.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (X)
wobei R² wie im Hinblick auf Formel (I) definiert ist, und R¹⁴ wie im Hinblick auf Formel (III) definiert ist, durch Umsetzen eines Cyanurchlorids mit einer Verbindung der Formel (XI) H-R²-R¹⁴ (XI)wobei R² und R¹⁴ wie oben definiert sind, bei einer Temperatur unterhalb von 10°C.