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BEREICH DER
TECHNIK
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Züchten von nützlichen Pflanzen unter Verwendung
eines pflanzlichen Genpromotors. Genauer betrifft die vorliegende
Erfindung das Züchten
von nützlichen
Pflanzen unter Verwendung eines Promotorgens des 3β Hydroxylase
2-Gens (hier nachstehend als OsGA3ox2 bezeichnet) von Reis.
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STAND DER
TECHNIK
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Zwergwuchs,
welcher durch künstliche
Modifizierung der Pflanzengestalt verursacht wird (insbesondere
durch Unterdrückung
des Längenwachstums),
ist ein ziemlich wichtiges Ziel beim Züchten von Feldfrüchten. Zwergwuchs
ist eine Wachstumsabnormität,
welche als ein Ergebnis einer Mutation in einem Gen, das in die
Regulation des normalen Längenwachstums
einbezogen ist, verursacht wird. Das Längenwachstum von Pflanzen wird
durch Wiederholung von Zellteilung und Zellverlängerung erreicht, welche durch
komplexe Einflüsse
aufgrund von verschiedenen Faktoren, wie externe Umweltfaktoren
(z.B. Temperatur, Licht und dergleichen) und interne Umweltfaktoren
(z.B. Pflanzenhormone und dergleichen), reguliert werden. Deshalb
wird gefolgert, dass eine Vielzahl von Genen bei Zwergwuchs einbezogen
ist, wie Gene, welche direkt in die Synthese oder Rezeption von
Pflanzenhormonen einbezogen sind, Gene, welche in die Expressionsregulation
davon einbezogen sind, und dergleichen. Unter Anderem ist eine Abnormität im Biosyntheseweg
von Gibberellin als eine Ursache von Zwergwuchs bekannt. Die Gibberellinbiosynthese
in höheren
Pflanzen schließt
drei Stufen ein, welche durch Enzyme katalysiert werden, die in
Plastiden, Membranen des endoplasmatischen Retikulums beziehungsweise
im Zytoplasma vorliegen. In der dritten Stufe, in welcher GA12 Aldehyd
und darauffolgende Substanzen verarbeitet werden, gibt es zwei Wege
einer Früh-13
Hydroxylierungshydroxylase und einer Nicht-Hydroxylase. In beiden
Wegen wird Gibberellin physiologisch durch seinen Kohlenstoff an
der Position 3, der durch 3β Hydroxylase
hydroxyliert wird, aktiviert und wird darauffolgend durch seinen
Kohlenstoff an der Position 2, der durch 2β Hydroxylase hydroxyliert wird,
inaktiviert.
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Bei
Reis ist bekannt, dass mindestens zwei 3β Hydroxylasegene in Reis vorliegen
(OsGA3ox1 und OsGA3ox2). Es wurde gezeigt, dass eines von ihnen,
OsGA3ox2, dem D18 (dy)-Genlocus entspricht, welcher lange als ein
Reiszwergwuchsgen bekannt ist. Ein 2β Hydroxylasegen von Reis, OsGA2ox1,
wurde als ein neues Gen isoliert, welches zu einer Gruppe von 2-Oxoglutarsäure-abhängigen Enzymgenen
gehört.
Versuche wurden unternommen, das Längenwachstum von Pflanzen durch
Regulierung dieser Enzyme, welche direkt in die Umwandlung von aktiven
und inaktiven Gibberellinen einbezogen sind, zu unterdrücken (Kagaku-to-Seibutsu
[Chemistry and Biology], Bd. 38, 2000, S. 131-139). Unter diesen
wurde ein Versuch durchgeführt,
bei welchem durch Regulieren des Expressionslevels eines
2β Hydroxylasegens
in tranformierten Pflanzen der Gehalt an aktivem endogenem Gibberellin
verändert
wurde, um so Pflanzen mit einer gewünschten Höhe zu erhalten. Wenn jedoch
OsGA2ox1 gezwungenermaßen überall in
einer ganzen Pflanze unter Verwendung eines Aktinpromotors, welcher
ein herkömmlicher
konstitutiver Promotor ist, exprimiert wird, wird Gibberellin unvermeidbar
in Reproduktionsorganen sowie Stämmen und
Blättern
metabolisiert. Als ein Ergebnis wird der Gehalt an endogenem Gibberellin
sehr stark auf ein Ausmaß verringert,
welches Superzwergwuchs zeigt. In einer solchen Transformante wird
auch das normale Wachstum von Reproduktionsorganen, welche eine
große
Menge an Gibberellin benötigen,
verhindert. Deshalb ist es notwendig, wenn sich eine transformierte
Pflanze mit Zwergwuchs durch Überexpression
des 2β Hydroxylasegens
entwickelt, den Einfluss auf Reproduktionsorgane durch Verwenden
eines Promotors, welcher spezifisch in vegetativem Wachstumsgewebe
arbeitet, zu unterdrücken.
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Für Tabak
wurde der Ort des pflanzlichen Expressionsgewebes eines Gens, welches
3β Hydroxylase codiert,
(Nty-Gen) untersucht (siehe Plant Journal (1999) 20(1), 15–24). Bei
dieser Forschung wurde die Promotorregion des Nty-Gens an das GUS-Gen
gebunden und es wurde beobachtet, wie das Gen in verschiedenen Geweben
in Pflanzen exprimiert wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass
die Expression des GUS-Gens, gebunden an die Promotorregion des
Nty-Gens, auf die Stelle der Wirkung von Gibberellin eingeschränkt war,
einschließlich
dem vegetativen Wachstumsgewebe. Diese Forschung fand nur eine Beziehung zwischen
der Expression des Gens, welches 3β Hydroxylase codiert, und der
Wirkung von Gibberellin. Deshalb wurde kein spezifischer vegetativer
Gewebepromotor entdeckt, welcher praktisch verwendet werden kann.
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Deshalb,
wenn ein Promotor für
Expression in vegetativem Wachstumsgewebe, dessen Aktivität hoch ist
und welcher praktisch verwendet werden kann, aus Reisgenen erhalten
wird, kann dies viel zum Züchten von
nützlichen
Pflanzen, einschließlich
Reis und dergleichen, beitragen.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Züchten von Pflanzen unter Verwendung
von gentechnischen Verfahren. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist die Bereitstellung eines Pflanzengenpromotors mit einem hohen
Aktivitätslevel
in vegetativem Wachstumsgewebe (insbesondere Stämmen und/oder Blättern),
eines Expressionsvektors, der das Gen enthält, und ein Verfahren unter
Verwendung des Gens.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden, dass das Reis-3β Hydroxylase
2 (OsGA3ox2)-Gen einen hohen Promotoraktivitätslevel in vegetativem Wachstumsgewebe
(insbesondere Stämmen
und/oder Blättern)
aufweist, und vollendeten die vorliegende Erfindung basierend auf
diesen Befunden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt DNA bereit, die eine Promotoraktivität zum Exprimieren
eines exogenen Gens, insbesondere in pflanzlichem vegetativem Wachstumsgewebe,
aufweist. Diese DNA weist eine Sequenz von Nukleinsäuren 381
bis 2406, angezeigt durch SEQ ID Nr. 1 (2A bis 2C),
auf, deren Promotoraktivität äquivalent
ist zu der Sequenz, welche durch SEQ ID Nr. 1 angezeigt wird. Die
Sequenz, angezeigt durch SEQ ID Nr. 1, enthält eine 5'-Strangaufwärtregion des Reis-OsGA3ox2-Strukturgens
von Reis, ein erstes Exon, ein erstes Intron und einen Teil eines
zweiten Exons. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist diese DNA mit der Sequenz, welche
durch SEQ ID Nr. 1 angezeigt wird, oder einer Sequenz, welche einen
Teil der Sequenz aufweist, unter stringenten Bedingungen hybridisierbar.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch einen Expressionsvektor zum Exprimieren
eines exogenen Gens, insbesondere in vegetativem Wachstumsgewebe
(insbesondere Stämmen
und/oder Blättern),
bereit. Dieser Expressionsvektor enthält einen Reis-OsGA3ox2-Genpromotor, welcher
die Sequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 angezeigt wird, oder einen Teil
der Sequenz, deren Promotoraktivität äquivalent ist zu der Sequenz, welche
durch SEQ ID Nr. 1 angezeigt wird, aufweist, und ferner ein exogenes
Gen, welches exprimierbar an diesen Promotor gebunden ist. In einer
Ausführungsform
kann das exogene Gen eine Funktion zur Unterdrückung einer Verlängerung
von Stämmen
und/oder Blättern
aufweisen. In einer anderen Ausführungsform
ist das exogene Gen ein Gen, welches 2β Hydroxylase codiert. Die vorliegende
Erfindung stellt auch eine Pflanzenzelle (welche eine monokotyle
Pflanzenzelle oder dikotyle Pflanzenzelle sein kann), welche mit
dem Expressionsvektor transformiert wurde, eine Pflanze, welche
aus dieser Pflanzenzelle regeneriert wurde, einen Nachkommen und
einen Verbreiter dieser Pflanze und einen Samen, welcher von einem
Nachkommen dieser Pflanze erhalten wurde, bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Einführen eines
exogenen Gens, welches spezifisch zur Expression in pflanzlichem
vegetativem Wachstumsgewebe beabsichtigt ist, in Pflanzen bereit. Dieses
Verfahren umfasst die folgenden Schritte: Transformieren einer Pflanzenzelle
mit dem vorstehend beschriebenen Expressionsvektor; und Erhalten
einer Pflanze durch Redifferenzierung dieser transformierten Pflanzenzelle.
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Das
vorstehend beschriebene exogene Gen kann ein Gen sein, welches eine
Funktion zur Unterdrückung
einer Verlängerung
von Stämmen
und/oder Blättern
aufweist. Durch Verwenden eines solchen Gens in dem vorstehend beschriebenen
Verfahren können
Zwergpflanzen hergestellt werden. In dem vorstehend beschriebenen
Verfahren kann die Pflanzenzelle entweder eine monokotyle Pflanzenzelle
oder eine dikotyle Pflanzenzelle sein.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein schematisches Diagramm, welches die Herstellung eines Expressionsvektors pBI101-Hm3
zeigt, der in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung verwendet
wird.
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Die 2A bis 2C sind
Diagramme, welche die Sequenz einer Region zeigen, welche die 5'-Nichttranslationssequenz
von OsGA3ox2, ein erstes Exon, ein erstes Intron und einen Teil
eines zweiten Exons enthält.
In den 2A bis 2C zeigen
Basen, welche durch Großbuchstaben
gezeigt sind, Exonstellen (Position 1567 bis 2039 und 2151 bis 2406)
und eine codierte Aminosäuresequenz
ist unter der Basensequenz gezeigt. In den 2A bis 2C sind
auch Restriktionsenzymerkennungsstellen gezeigt.
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3 ist
eine Fotografie, welche ein Ergebnis einer histologischen GUS-Färbung von
Stämmen
zeigt.
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4 ist
eine Fotografie, welche eine Zwergpflanze zeigt, die mit einem OsGA2ox1-Gen
transformiert wurde, welches mit einem Promotor der vorliegenden
Erfindung gebunden war.
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BESTE WEISE
ZUR DURCHFÜHRUNG
DER ERFINDUNG
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Hier
nachstehend wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.
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(Isolierung eines Reis-OsGA3ox2-Genpromotors)
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Ein
Reis-OsGA3ox2-Genpromotor kann durch Durchmustern (engl. screening)
einer Reisgenombibliothek erhalten werden. Eine Reisgenom-DNA-Bibliothek
(Rice Genomic Library), welche kommerziell von CLONTECH Laboratories
Inc., Palo Alto, CA erhältlich
ist, kann verwendet werden.
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Als
eine Probe zum Durchmustern kann Reis-OsGA3ox2-cDNA, welche durch
die Erfinder der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, verwendet
werden.
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Zu
Beginn wird E. coli mit einer Reisgenomgenbibliothek infiziert,
welche unter Verwendung von Phage λ hergestellt wird, gefolgt von
der Bildung von Plaque. Diese Plaque werden auf eine Membran, wie
Nitrocellulose oder dergleichen, unter Verwendung eines allgemein
verwendeten Verfahrens übertragen,
gefolgt von Hybridisieren mit markierten Durchmusterungsproben.
Nach dem Hybridisieren wird die Membran gewaschen, gefolgt von Autoradiographie.
DNA wird aus einem Phagen, für
welchen eine Hybridisierung bestätigt ist,
hergestellt.
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Die
hergestellte Phagen-DNA wird mit einer Kombination von geeigneten
Restriktionsenzymen verdaut und die resultierenden Fragmente werden
durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die aufgetrennten DNA-Fragmente
werden auf eine Nylonmembran übertragen,
gefolgt von Hybridisieren mit der vorstehend beschriebenen Durchmusterungsprobe.
Das Durchmustern wird bezogen auf die Signalintensität und einen Bandenmusterunterschied
durchgeführt.
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Man
nimmt an, dass ein Klon mit dem intensivsten Signal das OsGA3ox2-Gen
enthält,
wogegen Klone mit schwächeren
Signalen ein Gen enthalten, welches ähnlich zu, aber nicht gleich
OsGA3ox2 ist. Weiter ist es durch Vergleichen von Bandenmustern
möglich,
einen Klon, bei welchem ein Teil des Gens fehlt, zu identifizieren.
Darüber
hinaus ist es durch Erstellen einer physikalischen Karte von jedem
Klon, bezogen auf ein Bandenmuster davon, möglich, einen Klon mit einer
5'-Region von ungefähr 1,6 Kbp
in der Länge,
strangaufwärts
von einem Strukturgen, von welchem man annimmt, dass es einen Promotor
einschließt,
zu spezifizieren.
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In
der vorstehend beschriebenen Weise kann das gesamte OsGA3ox2-Genomgen
isoliert werden.
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Durch
Vergleichen der Basensequenz des OsGA3ox2-Genomgens mit der Basensequenz
der OsGA3ox2-cDNA kann eine Promotorregion spezifiziert werden.
Wenn das Genomgen ein Intron aufweist, kann die Promotorsequenz
nicht nur die 5'-Region,
strangaufwärts
von dem Strukturgen, enthalten, sondern auch eine Region, wie ein
erstes Intron oder dergleichen. Diese Promotorsequenz ist bevorzugt
eine Sequenz, welche durch SEQ ID Nr. 1 (siehe 2A bis 2C)
angezeigt wird. Die Sequenz, welche durch SEQ ID Nr. 1 angezeigt
wird, enthält
eine 5'-Region,
strangaufwärts
von dem Reis-OsGA3ox2-Strukturgen, ein erstes Exon, ein erstes Intron
und einen Teil eines zweiten Exons.
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(Spezifierung eines aktiven
Teils eines Promotors durch Messen der GUS-Aktivität)
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Wenn
die Promotorregion des OsGA3ox2-Gens spezifiziert ist, kann die
Sequenz davon herausgeschnitten und in einen pflanzlichen Expressionsvektor
eingebracht werden. Um die Aktivität des eingebrachten Promotors
zu bewerten, kann ein Plasmid hergestellt werden, in welchem ein
Reportergen, wie ein Gen, welches ein geeignetes Enzym codiert,
strangabwärts
von dem Promotor gebunden ist. Dieses Plasmid wird in Pflanzenzellen
eingeführt
und die Expression des Gens wird durch zum Beispiel Messen der Enzymaktivität beobachtet.
Wenn Pflanzen als Wirte verwendet werden, ist es zum Beispiel normal,
ein Plasmid, wie pBI221 oder dergleichen, zu verwenden, um eine
Messung mit Expression von β-Glucuronidase
(GUS) oder dergleichen als ein Indikator durchzuführen. Dieses
Messverfahren unter Verwendung von GUS-Expression kann hier verwendet
werden.
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Die
GUS-Aktivität
kann gemäß einem
Verfahren gemessen werden, welches in zum Beispiel Syokubutsu-saibo-kogaku
[Plant Cell Engineering], Bd. 4, Nr. 4, S. 281–286 (1992); Syokubutsu-saibo-kogaku
[Plant Cell Engineering], Bd. 5, Nr. 5, S. 407–413 (1992); und Plant Mole.
Biol. Reporter 5(4) 387–405
(1987) beschrieben wird. Das Messverfahren ist so nicht eingeschränkt. Kurz,
Gewebe oder ein Abschnitt einer Pflanze werden in eine histochemische
Substratlösung,
welche 1 mM 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc), 7% (v/v) Methanol
und 50 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 7,0) enthält, bei
einer Temperatur und einer Zeit, welche für das Fortschreiten einer Umsetzung
geeignet sind (z.B. 37°C
und 30 Minuten bis 4 Stunden, wenn ein Fusionsgen von GUS und ein
CaMV-Promotor oder dergleichen eingeführt werden), getaucht und inkubiert.
Um Braunfärben
und GUS-Inaktivierung zu verhindern, kann ein Reduktionsmittel,
wie Dithiothreitol (DTT) oder dergleichen, zugegeben werden. Zum
Beispiel werden 2 mM DTT sofort nach dem Schneiden (wenn Abschnitte
hergestellt werden) in der Stufe des Einbettens des Abschnitts in
Agar; in der Stufe des Aufschneidens des Abschnitts; oder beim Entfernen
von Luft von dem Abschnitt unter verringertem Druck zugegeben. 5
mM DTT können
auch zu einer GUS-Umsetzung bei 37°C gegeben werden. Danach wird die
Umsetzung durch Zugeben von Ethanol abgebrochen, gefolgt von Entfärben. Das
resultierende Gewebe oder Abschnitt werden unter einem Mikroskop
oder einem Stereomikroskop beobachtet.
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Verschiedene
Deletionsmutanten in der Promotorregion des OsGA3ox2-Gens (z.B.
die Promotorregion des OsGA3ox2-Gens mit teilweisen Deletionen in
verschiedenen Längen
von der 5'-Seite
strangaufwärts) werden
mit dem GUS-Gen in einem Plasmid verschmolzen. Dieses Plasmid wird
zum Messen der Promotoraktivität
verwendet. Als ein Ergebnis kann ein Teil oder dergleichen, welcher
für die
Promotoraktivität
wesentlich ist, spezifiziert werden. Ein Verfahren zum Spezifizieren
eines solchen aktiven Teils ist dem Fachmann bekannt. Deshalb liegt
zum Beispiel eine Sequenz, die durch Entfernen einer Sequenz erhalten
wird, welche für die
Promotorregion des OsGA3ox2-Gens nicht notwendig ist und die gleiche
Aktivität
wie die des Promotors des OsGA3ox2-Gens aufweist, innerhalb des
Umfangs der vorliegenden Erfindung.
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Nachdem
die Promotorregion des OsGA3ox2-Gens und der aktive Teil davon spezifiziert
sind, kann die Sequenz davon modifiziert werden, um die Promotoraktivität zu verbessern
und die Spezifität
für Gewebe, in
welchem eine Expression durchgeführt
wird, zu verändern.
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Zum
Beispiel liegt eine Sequenz, welche durch teilweise Modifizierung
der Promotorregion des OsGA3ox2-Gens oder eines aktiven Teils davon
erhalten wird und eine Aktivität
aufweist, die äquivalent
zu der von vor der Modifizierung ist, innerhalb des Umfangs der
vorliegenden Erfindung.
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Die
Promotorregion mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 (2A bis 2C)
zeigt Aktivität
spezifisch in vegetativem Wachstumsgewebe. Deshalb zeigt der Ausdruck „äquivalent" bei der Promotoraktivität, dass die
Intensität
der Aktivität
im Wesentlichen gleich ist wie die Intensität der Aktivität von mindestens
einer Promotorregion als eine Referenz, und unterdessen, dass die
Spezifität
der Aktivität
im Wesentlichen gleich ist wie die Spezifität der Aktivität der Promotorregion
als eine Referenz. Es sollte angemerkt werden, dass nicht beabsichtigt
ist, mit dem Ausdruck „äquvialent" den Fall auszuschließen, wo
die Intensität
und Spezifität
der Aktivität
klar höher
sind als jene einer Promotorregion als eine Referenz. „Aufweisen
einer Promotoraktivität, welche äquivalent
zu der der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 ist" zeigt, dass zum Beispiel, wenn das
GUS-Gen in Protoplasten unter Bedingungen, welche nachstehend beschrieben
werden, exprimiert wird, die GUS-Aktivität mindestens ungefähr 50%,
bevorzugt mindestens ungefähr
70% und stärker
bevorzugt mindestens ungefähr 90%
der GUS-Aktivität
der Sequenz SEQ ID Nr. 1 beträgt
und spezifisch in vegetativem Wachstumsgewebe exprimiert wird.
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Der
Umfang der vorliegenden Erfindung kann eine Sequenz umfassen, welche
mit der Promotorregion des OsGA3ox2-Gens oder dem aktiven Teil davon
unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist. Wie hier verwendet,
betreffen „stringente
Hybridisierungsbedingungen" oder „Stringentheit" Bedingungen in einem
Bereich von ungefähr
5°C bis
ungefähr
20°C oder
25°C unter
der Schmelztemperatur (Tm) der Zielsequenz
und einer Probe mit exakten oder nahezu exakten Komplementäreigenschaften
zum Ziel. Wie hier verwendet, ist die Schmelztemperatur die Temperatur,
bei welcher eine Population von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen zu Einzelsträngen halb-dissoziiert
wird. Verfahren zum Berechnen der Tm von
Nukleinsäuren
sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Berger und Kimmel, 1987,
Methods In Enzymology, Bd. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques,
San Diego: Academic Press, Incl, und Sambrook et al., (1989) Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory,
hier nachstehend als „Sambrook" bezeichnet, wobei
beide hier durch Bezugnahme aufgenommen werden). Wie von Standarddruckschriften
angegeben wird, kann eine einfache Abschätzung des Tm-Wertes
durch die folgende Gleichung berechnet werden: Tm =
81,5 + 0,41 (% G + C), wenn eine Nukleinsäure in wässriger Lösung bei 1 M NaCl vorliegt (siehe
z.B. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization in NUCLEIC
ACID HYBRIDIZATION (1985)). Andere Druckschriften schließen ausgefeiltere
Berechnungen, welche Struktur- sowie Sequenzcharakteristika für die Berechnung
von Tm berücksichtigen, ein. Die Schmelztemperatur
eines Hybrids (und folglich die Bedingungen für eine stringente Hybridisierung)
wird durch unterschiedliche Faktoren, wie die Länge und die Natur (DNA, RNA,
Basenzusammensetzung) der Probe und die Natur des Ziels (DNA, RNA,
Basenzusammensetzung, vorliegend in Lösung oder immobilisiert, und
dergleichen), und die Konzentration von Salzen und anderen Komponenten
(z.B. die Anwesenheit oder Abwesenheit von Formamid, Dextransulfat,
Polyethylenglycol) beeinflusst. Die Wirkungen dieser Faktoren sind
bekannt und werden in Standarddruckschriften auf dem Fachgebiet
erörtert,
siehe z.B. Sambrook, vorstehend, und Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology, Greene Publishing and Whiley-Interscience,
New York (1997). Typischerweise sind stringente Hybridisierungsbedingungen
Salzkonzentrationen von weniger als ungefähr 1,0 M Natriumion, typischerweise
ungefähr
0,01 M bis 1,0 M Natriumion bei pH-Wert 7,0 bis 8,3, und Temperaturen
von mindestens ungefähr
30°C für kurze Proben
(z.B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens ungefähr 60°C für lange Proben (z.B. mehr als
50 Nukleotide). Wie angemerkt, können
stringente Bedingungen auch mit der Zugabe von destabilisierenden
Mitteln wie Formamid erreicht werden, wobei in diesem Fall niedrigere
Temperaturen verwendet werden können. Wenn
zum Beispiel zwei Polynukleotide spezifisch miteinander unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen hybridisiert werden, werden sie als mit
wesentlicher Sequenzidentität
identifiziert. Wie hier verwendet, betreffen die Ausdrücke „wesentliche
Identität", „wesentliche
Sequenzidentität" oder „wesentliche Ähnlichkeit" das Ausmaß der Sequenzähnlichkeit
zwischen zwei Polynukleotiden im Nukleinsäurekontext. Alternativ wird
wesentliche Sequenzidentität
als prozentuale Identität
zwischen zwei Nukleotid- (oder Polypeptid-)sequenzen beschrieben.
Wenn zwei Sequenzen mindestens ungefähr 60%, bevorzugt mindestens
ungefähr
70% Identität, mindestens
ungefähr
80% Identität
oder mindestens ungefähr
90% Identität,
mindestens ungefähr
95% oder 98% bis 100% Identität
aufweisen, werden sie als im Wesentlichen identisch zueinander angesehen.
Ein anderes Ausmaß von
Sequenzidentität
(z.B. „im
Wesentlichen" weniger
als) kann durch Hybridisierung unter unterschiedlichen Stringentheitbedingungen
charakterisiert werden. Die prozentuale Identität von Sequenzen (Nukleotiden
oder Aminosäuren)
wird typischerweise durch Bestimmen der optimalen Orientierung von
zwei Sequenzen und dann Vergleichen der zwei Sequenzen berechnet.
Zum Beispiel kann für
exogene Transkripte, welche bei Proteinexpression verwendet werden,
beschrieben werden, dass sie eine besondere prozentuale Identität oder Ähnlichkeit
aufweisen, wenn mit einer Referenzsequenz (z.B. einer entsprechenden
endogenen Sequenz) verglichen wird. Eine optimale Orientierung von
Sequenzen kann durch den Homologieorientierungsalgorithmus von Needleman
und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durch die Suche nach Ähnlichkeitsverfahren
von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,
durch computerunterstützte Vervollständigungen
dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin
Genetics Softwarepaket, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI), oder durch eine Überprüfung mit
dem Lokalhomologiealgorithmus von Smith und Waterman (1981) Adv.
Appl. Math. 2:482 durchgeführt
werden. Die beste Orientierung (d.h. die höchste prozentuale Identität wird erhalten)
wird von jenen, welche durch unterschiedliche Verfahren erhalten
werden, ausgewählt.
Typischerweise vergleichen diese Algorithmen zwei Sequenzen über ein „Vergleichsfenster" (das normalerweise
mindestens 18 Nukleotide lang ist), um lokale Regionen von Sequenzähnlichkeit
zu identifizieren und zu vergleichen, und ermöglichen deshalb kleine Additionen oder
Deletionen (d.h. Lücken).
Additionen und Deletionen haben typischerweise eine Länge von
20 Prozent oder weniger im Vergleich mit Referenzsequenzen ohne
eine Addition oder eine Deletion. Es ist manchmal bevorzugt, Sequenzidentität zwischen
zwei Sequenzen durch Referenzbezug auf eine besondere Länge oder Region
zu beschreiben (z.B. können
zwei Sequenzen so beschrieben werden, dass sie mindestens 95% Identität über eine
Länge von
mindestens 500 Basenpaaren aufweisen). Normalerweise beträgt die Länge mindestens
ungefähr
50, 100, 200, 300, 400 oder 500 Basenpaare, Aminosäuren oder
andere Reste. Ein Prozentsatz von Sequenzidentität wird durch Vergleichen von
zwei Sequenzen, welche optimal über
eine Vergleichsregion orientiert sind, berechnet, wobei die Anzahl
von Stellen, an welchen die gleichen Nukleinsäurebasen (z.B. A, T, C, G oder
U) in beiden Sequenzen vorkommen, bestimmt wird, um die Anzahl von
passenden Stellen zu erhalten, und diese mit der Gesamtanzahl (oder
-prozentsatz) der Basen einer Referenzsequenz oder einer Vergleichregion
zu vergleichen. Ein anderer Algorithmus, der zur Messung von Sequenzähnlichkeit
geeignet ist, ist ein BLAST-Algorithmus,
welcher in Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410; und Shpaer (1996) Genomics
38:179–191
beschrieben wird. Software zum Durchführen von BLAST-Analysen ist öffentlich
vom National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
verfügbar.
Dieser Algorithmus bezieht zuerst eine Identifizierung von Sequenzpaaren
mit hohen Werten (HSPs) durch Identifizieren von kurzen Wörtern der
Länge W
in der Querysequenz ein, welche entweder passend sind oder dem im
positiven Bereich liegenden Schwellenwert T entsprechen, wenn mit
einem Wort der gleichen Länge
in einer Datenbanksequenz orientiert wird. T wird als der Wortnachbarschaftsschwellenwert
bezeichnet (Altschul et al., vorstehend). Diese anfänglichen
Treffer von Nachbarschaftswörtern
wirken als Keime zum Initiieren von Suchen, um längere HSPs, welche diese enthalten,
zu finden. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang
jeder Sequenz ausgeweitet, solange der kumulative Orientierungswert
erhöht
werden kann. Die Ausweitung der Worttreffer in jede Richtung wird
beendet, wenn: der kumulative Orientierungswert um den nicht bekannten
Umfang X von seinem maximal erreichen Wert abfällt; der kumulative Wert gegen
null oder darunter geht, aufgrund der Akkumulation von einer oder
mehreren Orientierungen von Resten mit einem negativen Wert; oder
die Ausweitung das Ende von einer Sequenz erreicht. Die BLAST-Algorithmusparameter
W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der
Orientierung. Das BLAST-Programm verwendet als Voreinstellungen eine
Wortlänge
(W) von 11, die Orientierungen (B) der BLOSUM62-Wertmatrix (siehe
Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919)
von 50, Erwartungswert (E) von 10, M = 5, N = –4, und einen Vergleich von
beiden Strängen.
Der Ausdruck BLAST betrifft einen BLAST-Algorithmus zur statistischen Analyse
von Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen. Siehe Karlin (1993) Proc. Natl. Acd. Sci.
USA 90:5873–5787.
Ein Maß für Ähnlichkeit,
welches durch den BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die
Wahrscheinlichkeit der kleinsten Summe (P(N)), welche einen Anzeigewert
für die
Wahrscheinlichkeit, dass zufällig
eine passende Stelle zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen
auftritt, bereitstellt. Alternativ ist ein anderer Anzeigewert,
dass zwei Nukleinsäuresequenzen ähnlich sind,
dass das Polypeptid, welches durch die erste Nukleinsäure codiert
wird, immunologisch kreuzreaktiv ist mit dem Polypeptid, welches
durch die zweite Nukleinsäure codiert
wird.
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Wie
hier verwendet, zeigt „spezifisch" exprimiert in vegetativem
Wachstumsgewebe an, dass ein beabsichtigtes Genprodukt in vegetativem
Wachstumsgewebe stärker
exprimiert wird als in mindestens einem anderen Gewebe oder Organ
derselben Pflanze. „Vegetatives
Wachstumsgewebe" betrifft
Gewebe, welches nicht direkt in die geschlechtliche Fortpflanzung
von Pflanzen einbezogen ist, einschließlich alle Gewebe-aufbauenden
vegetativen Organe, wie Wurzeln, Stämme und Blätter. „Spezifisch" exprimiert in vegetativem Wachstumsgewebe
zeigt an, dass zum Beispiel ein Genprodukt in mindestens mehr als
einem von Blumenorganen von Stamm und Blatt an jedweden anderen
Stellen derselben Pflanzen exprimiert wird. Die Spezifität einer
solchen Expression kann durch Herstellen von transformierten Pflanzen
unter Bedingungen, welche zu jenen ähnlich sind, die hier in den
Beispielen nachstehend beschrieben werden, bewertet werden.
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(Aufbau und Verwendung
einer Expressionskassette und eines rekombinanten Plasmids)
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Eine
Sequenz mit der Promotorregion des OsGA3ox2-Gens, dessen Aktivität bestätigt wurde,
oder ein aktives Protein davon können
in einen geeigneten Pflanzenexpressionsvektor eingebracht werden.
An das 3'-Ende der
Sequenz, welche in den Pflanzenexpressionsvektor eingebracht wurde,
wird eine geeignete Linkersequenz (z.B. ein Linker mit einer multiplen
Klonierstelle) gebunden, so dass eine Expressionskassette, die für einen
pflanzlichen Wirt geeignet ist, hergestellt werden kann. Deshalb
betrifft „Stelle
zum Einbringen eines exogenen Gens", wie hier verwendet, eine Stelle, welche
in einem Linker oder einer Sequenz mit einer Wirkung, die ähnlich zu
der des Linkers ist, enthalten ist. Diese Expressionskassette kann
gegebenenfalls ein anderes Regulatorelement enthalten. Zum Beispiel
kann eine Terminationssequenz für
den Zweck des Verbesserns der Expressionseffizienz oder dergleichen
enthalten sein. Diese Terminationssequenz kann an eine Promotorsequenz über die
vorstehend beschriebene Linkersequenz mit einer multiplen Klonierungsstelle
gebunden sein. Die Expressionskassete kann ferner ein auswählbares
Markergen enthalten, welches für
besondere verwendete Wirtorganismen geeignet ist.
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Ein
exogenes Gen, mit welchem beabsichtigt ist, dass es exprimiert wird,
ist exprimierbar an ein 3' strangabwärts eines
Promotors der vorstehend beschriebenen Pflanzenexpressionskassette,
wie eine multiple Klonierstelle, gebunden, was in einem rekombinanten
Plasmid resultiert. Wie hier verwendet, betrifft „exogenes
Gen" jedwedes Gen,
welches ein endogenes Gen von Reis oder anderen Pflanzen, unterschiedlich
von dem OsGA3ox2-Gen, oder ein fremdes Gen in Bezug auf Pflanzen
ist, und dessen Genproduktexpression für vegetatives Wachstumsgewebe
(insbesondere Stämme
und/oder Blätter)
wünschenswert
ist.
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Mit
dem resultierenden rekombinanten Plasmid können Pflanzenzellen transformiert
werden. Eine Transformation von Pflanzenzellen kann durch jedwedes
dem Fachmann bekannte Verfahren, wie ein Verfahren unter Verwendung
von Agrobakterium, Elektroporation in Protoplasten oder dergleichen,
durchgeführt
werden. Zum Beispiel können
Pflanzenzellenprotoplasten gemäß einem
Verfahren, welches in Kyozuka et al., Mol. Gen. Genet. 206:408–413 (1987)
beschrieben wird, hergestellt werden. Ein Beispiel eines Transformationsverfahrens
unter Verwendung von Agrobakterium, welches für monokotyle Pflanzen bevorzugt
ist, ist ein Verfahren, welches von den Erfindern der vorliegenden
Erfindung entwickelt wurde und in PCT/JP/03920 beschrieben wird.
Mit diesem Verfahren können
auch monokotyle Pflanzen schneller und wirksamer transformiert werden.
Transformationsverfahren für
Pflanzen sind nicht so einschränkt.
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Transformierte
Pflanzenzellen können
durch ein allgemein verwendetes Verfahren zu transformiertem Pflanzengewebe,
und weiter einer ganzen Pflanze, redifferenziert werden. Bei der
Herstellung von rekombinanten Plasmiden für Transformation kann der OsGA3ox2-Genpromotor in einen
binären
Vektor, welcher sowohl in Bakterien- als auch Pflanzenwirten exprimiert
werden kann, eingebracht werden. Ein solcher binärer Vektor ist dem Fachmann
bekannt. Wenn zum Beispiel pBI-Vektoren oder dergleichen (einschließlich einem Agrobakterium-Expressionssystem)
verwendet werden, kann ein System zum Infizieren von Pflanzen mit
Mikroorganismen verwendet werden. Durch die Verwendung eines geeigneten
rekombinanten Plasmids kann ein exogenes Gen von Interesse in jedwede
transformierbare Pflanze, einschließlich monokotyle Pflanzen (z.B. Reis
und dergleichen) und dikotyle Pflanzen
(z.B. Tabak und dergleichen)
eingebracht werden.
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„Pflanzenzelle" kann jedwede Pflanzenzelle
sein. Eine Pflanzenzelle kann in jedweder Form einer Kulturzelle,
eines Kulturgewebes, eines Kulturorgans oder einer ganzen Pflanze,
bevorzugt einer Kulturzelle, eines Kulturgewebes oder eines Kulturorgan
oder stärker
bevorzugt einer Kulturzelle sein. Eine Pflanzenspezies, welche in
einem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet
werden kann, kann jedwede Pflanzenspezies sein, in welche ein Gen
eingebracht werden kann.
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Beispiele
von Pflanzenspezies, welche bei der Herstellung der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
schließen
Pflanzen der Familien Solanaceae, Poaeae, Brassicaceae, Rosaceae,
Leguminosae, Curcurbitaceae, Lamiaceae, Liliaceae, Chenopodiaceae
und Umbelliferae ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Solanaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Nicotiana,
Solanum, Datura, Lycopersion und Petunia ein. Spezielle Beispiele
schließen
Tabak, Aubergine, Kartoffel, Tomate, Cayennepfeffer und Petunie
ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Poaeae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Oryza,
Hordenum, Secale, Saccharum, Echinochloa und Zea ein. Spezielle
Beispiele schließen
Reis, Gerste, Roggen, Echinochloa crus-galli, Hirse und Mais ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Brassicaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Raphanus,
Brassica, Arabidopsis, Wasabia und Capsella ein. Spezielle Beispiele
schließen
Japanischen Weißen
Rettich, Rapssamen, Arabidopsis thaliana, Japanischen Meerrettich
und Capsella bursa pastoris ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Rosaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Orunus,
Malus, Pynus, Fragaria und Rosa ein. Spezielle Beispiele schließen Pflaume,
Pfirsich, Apfel, Birne, Niederländische
Erdbeere und Rose ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Leguminosae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Glycine,
Vigna, Phaseolus, Pisum, Vicia, Arachis, Trifolium, Alphalfa und
Medicago ein. Spezielle Beispiele schließen Sojabohne, Adzukibohne,
Weiße
Bohne, Erbse, Puffbohne, Erdnuss, Klee und Klette ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Cucurbitaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Luffa,
Cucurbita und Cucumis ein. Spezielle Beispiele schließen Flaschenkürbis, Kürbis, Gurke
und Melone ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Lamiaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Lavandula,
Mentha und Perilla ein. Spezielle Beispiele schließen Lavendel-,
Pfefferminz- und Beefsteakpflanze ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Liliaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Allium,
Lilium und Tulipa ein. Spezielle Beispiele schließen Zwiebel,
Knoblauch, Lilie und Tulpe ein.
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Beispiele
von Pflanzen der Chenopodiaceae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Spinacia
ein. Ein spezielles Beispiel ist Spinat.
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Beispiele
von Pflanzen der Umbelliferae-Familie schließen Pflanzen der Gattung Angelica,
Daucus, Cryptotaenia und Apitum ein. Spezielle Beispiele schließen Japanischen
Udo, Karotte, Honewort und Sellerie ein.
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„Pflanzen", bei welchen ein
Promotor der vorliegenden Erfindung wirkt, schließen jedwede
Pflanze ein, in welche ein Gen eingebracht werden kann. „Pflanzen" schließen monokotyle
und dikotyle Pflanzen ein. Solche Pflanzen schließen jedwede
nützlichen
Pflanzen, insbesondere Feldfruchtpflanzen, Gemüsepflanzen und blühende Pflanzen
von verschiedenen Gartengewächsen
ein. Bevorzugte Pflanzen schließen
Reis, Mais, Hirse, Gerste, Weizen, Roggen, Echinochloa crus-galli,
Fuchsschwanzhirse, Asparagus, Kartoffel, Japanischen Weißen Rettich,
Sojabohne, Erbse, Rapssamen, Spinat, Tomate und Petunie ein. Die
am stärksten
bevorzugte Pflanze, bei welcher die vorliegende Erfindung verwendet
wird, ist Reis, insbesondere Japonica-Reis.
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Wie
vorstehend beschrieben, kann der OsGA3ox2-Genpromotor spezifisch
in vegetativem Wachstumsgewebe (insbesondere Stämmen und/oder Blättern) exprimiert
werden. Deshalb können
unter Verwendung eines Gens mit einer Funktion von Unterdrücken der
Verlängerung
von Stämmen
und/oder Blättern
als ein exogenes Gen Zwergpflanzen hergestellt werden. Wie hier
verwendet, betrifft ein „Gen
mit einer Funktion von Hemmen der Verlängerung von Stämmen und/oder
Blättern" ein Gen, dessen
Genprodukt eine Verlängerung
von Stämmen
und/oder Blättern
unterdrücken
kann, zum Beispiel Gene, die Enzyme codieren, welche in ein Gibberellinabbausystem
einbezogen sind (insbesondere 2β Hydroxylase,
welche den Kohlenstoff an der Position 2 des Gibberellingerüsts hydroxyliert,
wobei aktiviertes Gibberellin (GA1 und GA4) in inaktiviertes Gibberellin
(GA8 und GA34) umgewandelt wird, wobei der Kohlenstoff an der Position
3 des Gibberellingerüsts durch
3β Hydroxylase
aktiviert wird, Enzyme, welche in die Expansion und Verlängerung
von Zellwänden
einbezogen sind, zum Beispiel verschiedene Polysaccharidsynthesezellwandenzyme
(z.B. Glucanase, Cellulase und Hemicellulase) und dergleichen; und
Gene mit einer Funktion von Unterdrücken der Verlängerung
von Stämmen
und/oder Blättern
durch sie selbst, zum Beispiel Antisense-RNA für endogene Gene, welche beim Verlängern von
vegetativem Wachstumsgewebe (insbesondere Stämmen und/oder Blättern) exprimiert
werden, wie Gene, welche in ein Gibberellinsynthesesystem einbezogen
sind (z.B. Arabidopsis thaliana Ga4-Gen), und Gene, welche Systeme codieren,
die in ein Gibberellinsynthesesystem einbezogen sind, wie 20 Oxidase
und 3β Hydroxylase,
und Ribozyme, welche solche endogenen Gene abbauen können. Verfahren zum
Durchmustern von Zwergpflanzen und Züchten von Pflanzen sind dem
Fachmann bekannt. Die vorstehend beschriebenen Gene, welche in das
Signaltransduktionssystem für
Gibberellin einbezogen sind, Gene, welche in das Brassinolidsynthesesystem
und ein Signaltransduktionssystem davon einbezogen sind, und dergleichen
können
in Zwergwuchs von Pflanzen einbezogen sein.
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Die
vorstehend beschriebene Herstellung von transformierten Pflanzen
kann verwendet werden, um Pflanzen Merkmale verschieden von Zwergwuchs
zu verleihen. Zum Beispiel ist es durch die Verwendung eines exogenen
Gens, welches ein toxisches Protein codiert, möglich, Insekten, welche Stämme und
Blätter fressen,
zu kontrollieren, und dergleichen. Die vorliegende Erfindung umfasst
die Herstellung einer jedweden nützlichen
Pflanze unter Verwendung einer Genexpression, welche spezifisch
für vegetatives
Wachstumsgewebe (insbesondere Stämme
und/oder Blätter)
ist. Ein Gen, welches durch den Promotor der vorliegenden Erfindung
exprimiert wird, kann auch ein Gen einschließen, das ein Protein codiert,
welches eine chemische Substanz abbaut. Ein veranschaulichendes
Beispiel eines solchen Proteins ist ein Protein, welches Herbizid
abbaut. Durch die Verwendung eines exogenen Gens, welches ein Protein
codiert, das Herbizid abbaut, kann eine gewünschte Pflanze durch Verwenden
von Herbizid herausgesiebt werden.
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Eine
Wirkung des Promotors der vorliegenden Erfindung kann durch die
Primärgeneration
von transformierten Pflanzen sowie darauffolgende Generationen der
Pflanzen vererbt werden. Die Wirkung des Promotors kann in der Primärgeneration
der transformierten Pflanzen und darauffolgenden Generationen der Pflanzen,
Verbreitern davon (z.B. Pollen) und Samen, welche von den Verbreitern
hergestellt werden, gezeigt werden. Eine Vererbung eines eingebrachten
Promotorgens an darauffolgende Generationen kann durch Southernanalyse
unter Verwendung einer Sequenz des Promotors der vorliegenden Erfindung
als eine Probe bestätigt
werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung eines praktischen Promotors von einem Reisgen,
welcher einen hohen Aktivitätslevel
in vegetativem Wachstumsgewebe (insbesondere Stämmen und/oder Blättern) aufweist,
bereitgestellt. Deshalb kann die vorliegende Erfindung nicht nur
zum Züchten
von Reis verwendet werden, sondern auch beim Züchten von anderen verschiedenen
Pflanzen.
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(Beispiele)
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Die
vorliegende Erfindung wird über
Beispiele im Detail beschrieben. Mit diesen Beispielen ist nicht beabsichtigt,
die vorliegende Erfindung einzuschränken. Materialien, Reagenzien
und dergleichen, welche in den Beispielen verwendet werden, sind
von kommerziellen Quellen erhältlich,
wenn nichts Anderes erwähnt ist.
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(Beispiel 1: Expression
des GUS-Gens durch den Reis-OsGA3ox2-Promotor)
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1. Isolierung eines Reis-OsGA3ox2-Genomgens:
Durchmustern einer Genombibliothek (Pflanzenmaterialien)
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Reissamen
(Oryza sativa, Japonica-Sorte: „Nipponbare", „Dontokoi", „Koshihikari" und dergleichen) wurden
in 1% Natriumhypochlorit für
1 Stunde sterilisiert und gründlich
in sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Samen ließ man auf
Erde keimen und in einem Treibhaus wachsen.
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(Verfahren)
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PCR
wurde durchgeführt,
unter Verwendung der Reisgenom-DNA als ein Templat und von Degeneratprimern
(ein 5'-Primer:
5'-GTNGTNAARGTNGGNGARRT-3' (SEQ ID Nr. 2);
und ein 3'-Primer:
5'-AYYTARTCRTTGGANGTNAC-3' (SEQ ID Nr. 3)),
designed von der konservierten Region unter den berichteten GA 3β Hydroxylasesequenzen.
Ein putativer Aminosäuresequenzprimer
der resultierenden Produkte war ähnlich
zu einer entsprechenden Region in der berichteten GA 3β Hydroxylase.
Ein DNA-Fragment mit 210 bp wurde erhalten, welches der Größe entspricht,
die von der berichteten GA 3β Hydroxylasesequenz erwartet
wurde. Dieses PCR-Produkt wurde als eine Probe zum Durchmustern
einer Reisgenombibliothek verwendet. Mehrere Klone wurden isoliert
und, bezogen auf eine Restriktionskarte von jedem Genomklon, in
zwei Gruppe eingeteilt. Schließlich
wurde ein Klon von jeder Gruppe sequenziert und wurde als OsGA3ox1
oder OsGA3ox2 bezeichnet (OsGA3ox1 und OsGA3ox2 betreffen Oryza
sativa GA 3β Hydroxylase-1
beziehungsweise Oryza sativa GA 3β Hydroxylase-2).
So wurden die Klone OsGA3ox1 und OsGA3ox2, welche das gesamte GA
3β Hydroxylasegen
enthalten, isoliert. OsGA3ox1 teilte eine Sequenz gemeinsam mit
dem Fragment, welches in der vorliegenden Erfindung als eine Probe
verwendet wurde.
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OsGA3ox2
enthielt eine unterschiedliche Sequenz von dem Fragment in einer
entsprechenden Region. Die vollständige Länge des cDNA-Klons, welcher
GA 3β Hydroxylase
codiert, wurde durch Umkehrtranskriptions-PCR (RT-PCR) unter Verwendung
der gesamten RNA, die aus Reisstammspitzen und Blumenorganen, welche
nicht blühten,
unter Verwendung eines speziellen Primers isoliert worden waren,
erhalten. Für RNA-Gelblottinganalyse
und DNA-Gelblottinganalyse wurden ein BssHII-PvuII (519 bp)-Fragment,
welches von der gesamten OsGA3ox2-cDNA abgeleitet ist, und ein KpnI-PvuII
(310 bp)-Fragment, welches von
OsGA3ox1 abgeleitet ist, (genspezifische
Proben) verwendet. Als jede spezifische Probe als eine Probe für Southern-Genomhybridisierung
verwendet wurde, wurde eine Kreuzhybridisierung nicht nachgewiesen
(Daten nicht gezeigt). Jede cDNA (OsGA3ox1 oder OsGA3ox2) enthielt
einen offenen Leserahmen, welcher ein Polypeptid mit 379 Aminosäuren oder
370 Aminosäuren
codierte (Daten nicht gezeigt). Das Genom-OsGA3ox2 enthielt ein
Intron mit einer kurzen Länge
(110 bp). Dieses Intron war an der gleichen Stelle lokalisiert,
wie die von GA 3β Hydroxylase,
welche vorhergehend für
dikotyle Pflanzen berichtet wurde. Der andere Klon OsGA3ox1 schließt zwei
Introns ein. Ein Intron war an der gleichen Stelle lokalisiert,
wie die von OsGA3ox2. Das eine Intron hatte im Wesentlichen die
gleiche Länge,
wie die das andere Intron (110 bp). Das andere Intron war an einer
Stelle lokalisiert, an welcher ein Cofaktor (z.B. ein Cofaktor 2-Oxoglutarsäure (400
bp)) an eine Bindungsstelle bindet (Daten nicht gezeigt). Putative
Aminosäuresequenzen
von beiden Klonen hatten einen hohen Ähnlichkeitslevel zu anderen
GA 3β Hydroxylasen
und den höchsten Ähnlichkeitslevel
zueinander (56,6% Identität
und 88,2% Ähnlichkeit).
-
2. Herstellung eines rekombinanten
Plasmids mit einem OsGA3ox2-Genpromotor
-
1 zeigt
die Herstellung eines Vektors mit einem Reis-OsGA3ox2-Genpromotor.
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Um
Fragmente zu erhalten, welche eine 5'-Nichttranslationsregion des Reis-OsGA3ox2-Gens
enthalten, wurde der in Abschnitt 1 erhaltene Klon mit BamHI und
HindIII kloniert und Fragmente mit ungefähr 2,5 Kbp wurden durch Agaroseelektrophorese
gewonnen. Eine Funktion des Promotors des OsGA3ox2-Gens wurde unter
Verwendung eines Pflanzenzellenexpressionsvektors pBI101 (CLONTECH
Laboratories Inc., Palo Alto, CA) bestätigt. Dieser Vektor wies einen
Nopalinsynthasepromotor (NOS-Pro), eine Neomycinphosphotransferase-II-Codierregion
(NPTII(KON R)) zum Verleihen von Kanamycinresistenz, einen Terminator
für Nopalinsynthase
(NOS-T), eine β-Glucuronidase
(GUS)-Codierregion und einen Terminator für Nopalinsynthase (NOS-T) in
dieser Reihenfolge auf. Dieses pBI101 wurde mit HindIII und SmaI
verdaut. Die OsGA3ox2-Genfragmente
wurden mit SmaI verdaut, um sie in den Expressionsvektor einzusetzen.
Das resultierende Fragment enthielt eine Sequenz von Position 1
bis 2406 der Insertionssequenz in dem Klon, eine 5'-Nichttranslationssequenz,
ein erstes Exon, ein erstes Intron und einen Teil eines zweiten
Exons (2A bis 2C). Der 5'-Terminus des Fragments
ist eine BamHI-Stelle und der 3'-Terminus
davon ist eine SmaI-Stelle.
Dieses Fragment wurde an den Expressionsvektor gebunden, welcher,
wie vorstehend beschrieben, restriktionsverdaut worden war, was
in einer pBI101-Hm3-enthaltenden Verschmelzung mit einem GUS-Reportergen
resultierte. In diesen Expressionsvektor wurde auch das Hygromycinphosphotransferase
(HPT)-Gen (lokalisiert zwischen dem Blumenkohlmosaikvirus 35S (35S)
und einem Terminator für
das Nopalinsynthasegen (Tnos)) strangabwärts der GUS-Codierregion eingesetzt,
um Hygromycinresistenz zu verleihen.
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3. Transformation
von Reissamen und Expression des GUS-Gens
-
Samen
von Nipponbare, welches eine repräsentative Reissorte ist, wurden
in 70%igen Ethanol für
10 sec getaucht, wobei die Samen nach dem Entfernen ihrer Spreu
intakt blieben. Die Samen wurden mit Wasser gewaschen, gefolgt von
Tauchen in eine wässrige
Lösung
von 0,1% Tween20 und 2,5% Natriumhypochlorit (NaClO) für 30 min
zum Sterilisieren. Nach gründlichem
Waschen mit Wasser, wurde der Reis den folgenden sterilen Manipulationen
unterworfen.
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(Vorkultivierung)
-
Die
Samen wurden auf 2,4-D-enthaltendem N6D-Medium (30 g/l Saccharose,
0,3 g/l Casaminosäure, 2,8
g/l Prolin, 2 mg/l 2,4-D, 4 g/l Gelrite, pH-Wert 5,8) ausgesät und für 5 Tage
bei 27°C
bis 32°C
inkubiert. Während
dieser Zeitdauer keimten die Samen.
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(Pflanzenexpressionsvektor)
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Agrobakterium
EHA101 wurde mit pBI101-Hm3, wie vorstehend hergestellt, transformiert
(Hood et al., J. Bacteriol., 168:1291–1301 (1986)). EHA101 ist ein
Bakterium, in welchem die Vir-Region eines Heiferplasmids vom potenten
pathogenen Agrobakterium A281 abgeleitet ist. Das Agrobakterium
wurde in einem AB-Medium, welches mit Hygromycin (50 mg/l) ergänzt worden
war, (Glucose (5 g/l), K2HPO4 (3
g/l), NaH2PO4·2H2O (1,3 g/l), NH4Cl
(1 g/l), KCl (150 mg/l), CaCl2·2H2O (10 mg/l), F2SO4·7H2O (2,5 mg/l), pH-Wert 7,2, Baktoagar (1,5%)
(3 g/200 ml), 1 M MgSO4·7H2O
(120 μl/100
ml)), für
2 bis 3 Tage bei 25°C
im Dunkeln kultiviert.
-
(Infektion mit Agrobakterium)
-
Das
transformierte Agrobakterium wurde suspendiert in AAM-Medium (AA-1
(× 1000)
1 ml (MnSO4·4–6H2O
(1000 mg/100 ml), H3BO3 (300
mg/100 ml), ZnSO4·7H2O
(200 mg/100 ml), Na2MoO4·2H2O (25 mg/100 ml), CuSO4·5H2O (2,5 mg/100 ml), CoCl2·6H2O (2,5 mg/100 ml), KI (75 mg/100 ml)), AA-2
(× 1000)
1 ml (CaCl2·2H2O
(15,0 g/100 ml)), AA-3 (× 1000)
1 ml (MgSO4·7H2O
(25 g/100 ml)), AA-4 (× 1000)
1 ml (Fe-EDTA (4,0 g/100 ml)), AA-5 (× 1000) 1 ml (NaH2PO4·2H2O (15,0 g/100 ml)), AA-6 (× 200) 5
ml (Nikotinsäure
(20 mg/100 ml), Thiamin HCl (200 mg/100 ml), Pyridoxin HCl (20 mg/ml),
Myoinositol (2000 mg/100 ml)), AA-Sol (× 100) 10 ml (L-Arginin (5300
mg/300 ml), Glycin (225 mg/300 ml)), AA-KCl (× 50) 20 ml (KCl (3 g/20 ml)), Casaminosäure (500
mg/l), Saccharose (68,5 g/l), Glucose (36 g/l), L-Glutamin (900
mg/l), L-Asparaginsäure (300
mg/l), pH-Wert 5,2), ergänzt
mit 2 μg/ml
Acetosyringon. Die vorstehend beschriebenen vorkultivierten Samen
wurden in diese Suspension für
90 Sekunden getaucht und danach auf ein
2N6-AS-Medium (30 g/l
Saccharose, 10 g/l Glucose, 0,3 g/l Casaminosäure, 2 mg/l 2,4-D, 10 mg/l
Acetosyringon, 4 g/l Gelrite, pH-Wert 5,2) überführt. Eine Cokultivierung wurde
im Dunkeln für
3 Tage durchgeführt,
während
bei 25°C
inkubiert wurde.
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(Entfernen von Bakterien
und Durchmustern)
-
Nach
der Vollendung der Cokultivierung wurde das Agrobakterium von den
Samen durch Waschen mit N6D-Medium, welches 500 mg/l Carbenicillin
enthielt, entfernt. Danach wurde ein Durchmustern für transformierte
Samen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
-
Erstes
Durchmustern: die Samen wurden auf N6D-Medium, welches 2 mg/l 2,4-D
enthielt und mit Carbenicillin (500 mg/l) und Hygromycin (50 mg/l)
ergänzt
worden war, gegeben und bei 30°C
für 7 Tage
inkubiert.
-
Zweites
Durchmustern: die Samen wurden auf N6D-Medium, welches 2 bis 4 mg/l
2,4-D enthielt und mit Carbenicillin (500 mg/l) und Hygromycin (50
mg/l) ergänzt
worden war, gegeben und bei 30°C
für weitere 7
Tage inkubiert.
-
(Redifferenzierung)
-
Ausgewählte transformierte
Samen wurden unter den folgenden Bedingungen redifferenziert.
-
Erste
Redifferenzierung: die ausgewählten
Samen wurden auf Redifferenziermedium (MS-Medium (30 g/l Saccharose,
30 g/l Sorbitol, 2 g/l Casaminosäure,
2 mg/l Kinetin, 0,002 mg/l NAA, 4 g/l Gelrite, pH-Wert 5,8), welches
mit Carbenicillin (500 mg/l) und Hygromycin (25 mg/l) ergänzt worden
war, bei 30°C
für zwei
Wochen gegeben.
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Zweite
Redifferenzierung: die Samen wurden bei 30°C für weitere zwei Wochen in Redifferenzierungsmedium,
welches identisch war zu dem, das bei der ersten Redifferenzierung
verwendet worden war, inkubiert.
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(Eintopfen)
-
Die
redifferenzierte Transformante wurde in Wurzelbildungsmedium (hormonfreies
MS-Medium, welches mit Hygromycin (25 mg/l) ergänzt worden war) überführt. Nachdem
das Wachstum von Wurzeln bestätigt worden
war, wurde die Pflanze eingetopft.
-
4. Spezifische Gewebeexpression,
die durch GUS-Färbung
beobachtet wurde
-
Eine
histochemische Analyse der GUS-Aktivität wurde durchgeführt, um
die Genexpression durch den vorstehend beschriebenen Promotor in
Pflanzengewebe zu untersuchen. Eine solche histochemische Analyse wurde
durch ein Verfahren, welches in Syokubutsu-saibokogaku [Plant Cell
Engineering], Bd. 4, Nr. 4, S. 281–286 beschrieben wird, durchgeführt. Dieses
Verfahren basiert auf Jefferson et al. (EMBO J 6:3901–3907 (1987))
mit Verbesserungen von Kosugi et al., Plant Science 70:133–140 (1990).
Kurz, ein herausgeschnittener Abschnitt wurde in 5% (w/w) Agar eingebettet
und der Agarblock wurde unter Verwendung einer Mikroschneidevorrichtung
aufgeschnitten. Gewebeschnitte mit einer Dicke von 100 bis 130 μm wurden
in histochemische Substratlösung,
welche 1 mM 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid
(X-Gluc), 7% (v/v) Methanol und 50 mM Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert
7,0) enthielt, getaucht und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. 2 mM
DTT wurden sofort nach dem Schneiden zugegeben; in der Stufe des
Einbettens des Abschnitts in Agar; in der Stufe des Aufschneidens
des Abschnitts; oder in der Stufe des Entfernens von Luft von dem Abschnitt
unter verringertem Druck. 5 mM DTT wurden in eine GUS-Umsetzung
bei 37°C
gegeben. Danach wurde die Umsetzung durch Zugabe von Ethanol abgebrochen,
gefolgt von Entfärben.
Der Schnitt wurde unter einem Mikroskop beobachtet. Als ein Ergebnis
wurde ein hoher GUS-Aktivitätslevel
in einem Reisstamm beobachtet. Als der Stamm durch ein Mikroskop
beobachtet wurde, war die Stammwand aufgrund der GUS-Aktivität (3)
blau gefärbt.
-
(Beispiel 2: Expression
des 2β Hydroxylasegens
durch den Reis-OsGA3ox2-Promotor)
-
Reissamen
wurden transformiert und regeneriert, um in der gleichen Weise,
wie der von Beispiel 1, transgene Pflanzen herzustellen, außer, dass
in Abschnitt 2 von Beispiel 1 anstelle der Region von der BamHI-Stelle
zu der SmaI-Stelle des Reis-OsGA3ox2-Gens eine Region von einer
XbaI-Stelle zu einer SmaI-Stelle des Reis-OsGA3ox2-Gens als eine
Reis-OsGA3ox2-Genpromotorregion
verwendet wurde (siehe 2A bis 2C) und
anstelle der GUS-Codierregion die Codierregion einer Gen (OsGA2ox1)-codierenden
2β Hydroxylase
verwendet wurde.
-
Die
Herstellung eines Pflanzenexpressionsvektors wird nachstehend beschrieben.
-
Um
Genom-DNA, welche sich von Reis (Oryza sative L., Sorte: Nipponbare)
ableitet, zu amplifizieren, wurden zwei Degenerat-Oligonukleotidprimer
(ein Vorwärtsprimer:
5'-GGNTTYGGNGARCAYWCNGAYCC-3' (SEQ ID Nr. 4);
und ein Rückwärtsprimer
5'-GGISHISCRAARTADATIRTISWIA-3' (SEQ ID Nr. 5))
aus konservativen Regionen eines putativen Arabidopsis GA 2β Hydroxylasegens,
Dioxygenase Marah MacrocarpamRNA (Zugangsnr. Y09113; MacMillan,
Plant Physiol. 113, 1369–1377
(1997)), Reis-GA20 Oxidasegen (Zugangsnr. U 50333; Toyomasu et al.,
Physiol. Plant. 99, 111–118
(1997)), Reis-GA
3β Hydroxylasegen
und anderen 2-Oxoglutarsäure-abhängigen Dioxygenaseenzymen
designed. Amplifizierte Fragmente (ungefähr 80 bp) wurden in pCRII (Invitrogen,
Carlsbad, CA) cloniert und wurden sequenziert. Einer von 64 unabhängigen Klonen
enthielt eine neue Aminosäure, ähnlich zur
von 2-Oxoglutarsäure
abhängigen,
und es wurde gefolgert, dass er ein Reis-GA 2β Hydroxylasegen codiert. Die
DDBJ-Nukleotidsequenzdatenbank wurde unter Verwendung der Teilaminosäuresequenz
durchsucht, um einen Reis-EST-Klon (Zugangsnr. C72618) zu erhalten.
Oligonukleotidprimer (ein Vorwärtsprimer:
5'-GCGGCGTTCTTCGCG-3' (SEQ ID Nr. 6);
und ein Rückwärtsprimer:
5'-CTATTGTGAATGAGTACATT-3' (SEQ ID Nr. 7)),
basierend auf der Sequenz des EST-Klons, wurden als ein Templat für Reisgenom-DNA
bei PCR verwendet. Das amplifizierte Fragment wurde in pCRII (Invitrogen,
Carlsbad, CA) kloniert und wurde sequenziert. Das Fragment mit 230
bp wurde als eine Probe zum Durchmustern von cDNA-Klonen und Genomklonen
verwendet.
-
Eine
cDNA-Bibliothek, welche aus unausgereiften Reissamen aufgebaut worden
war, und eine Genombibliothek, welche aus teilweise mit Sau3AI verdauter
Reisgenom-DNA aufgebaut worden war, wurden einer Durchmusterung
unter Verwendung der wie vorstehend beschrieben hergestellten Probe
unterzogen. Eine Hybridisierung wurde bei 65°C für 14 Stunden in 5xSSC (1xSSC:
0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat), 5xDenhardt-Lösung (1xDenhardt-Lösung: 0,02%
Ficoll, 0,02% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0,02% BSA (Rinderserumalbumin)),
0,5% (w/v) SDS und 20 mg/l Lachssperma-DNA durchgeführt. Danach
wurde ein Filter in 2xSSC, 0,1% (w/v) SDS, bei Raumtemperatur gewaschen.
cDNA, welche durch das Durchmustern erhalten wurde, wird als OsGA2ox1
bezeichnet und enthielt einen offenen Leserahmen von 1.146 bp, welcher
eine Sequenz von 382 Aminosäuren
enthielt (Daten nicht gezeigt). Ein 5'-terminaler Teil der OsGA2ox1-cDNA wurde mit
einem Restriktionsenzym EcoRI herausgeschnitten, wogegen ein 3'-Teil davon mit einem
Restriktionsenzym EcoRV herausgeschnitten wurde. Die resultierende
cDNA wies ein glattes Ende auf, so dass sie in den Rahmen eines
pBI101-Vektors gebunden wurde. Danach wurde dieser Vektor an eine
SmaI-Stelle gebunden. Das XbaI-HindIII-Fragment des in Abschnitt
2 von Beispiel 1 erhaltenen Reis-OsGA3ox2-Gens wurde weiter mit
XbaI und SmaI verdaut. In dem pBI101-Vektor war das OsGA3ox2-Fragment
an eine XbaI-SmaI-Stelle strangaufwärts von
OsGA2ox1 gebunden.
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Gewachsene
Pflanzen sind in 4 gezeigt. Eine Pflanze, welche
aus einem transformierten Samen erhalten wurde, ist rechts in 4 gezeigt,
wogegen eine Kontrollpflanze (nicht behandelt) links in 4 gezeigt
ist (Nipponbare). Die transformierte Pflanze hatte klar eine niedrige
Höhe und
war verglichen mit der Kontrollpflanze zwergwüchsig. Dies zeigt, dass 2β Hydroxylase
im Stamm durch den Promotor der vorliegenden Erfindung exprimiert
wurde.
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INDUSTRIELLE
ANWENDBARKEIT
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Der
OsGA3ox2-Genpromotor der vorliegenden Erfindung hat einen ziemlich
hohen Aktivitätslevel
in Stämmen
und Blättern.
Deshalb ist die vorliegende Erfindung zum Züchten von Pflanzen, wie Reis
und dergleichen, durch Genmanipulation von vegetativem Wachstumsgewebe
nützlich. SEQUENZLISTING
