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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von Gruppen
von Polypeptiden, wobei die Polypeptide in großer Nähe zu einem Zielmolekül oder zu
Zielmolekülen
translatiert werden, sodass Mitglieder der Gruppe, die mit dem Zielmolekül oder mit
den Zielmolekülen
interagieren, identifiziert werden können. Die Erfindung betrifft
insbesondere ein Verfahren zur Expression einer Gruppe von Polypeptiden
in situ in Form eines Arrays und den Nachweis der Interaktion derselben
mit immobilisierten Zielmolekülen.
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Einleitung
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Das
Screening von Antikörperfragmenten
in großen
Mengen auf eine Antigenbindung wurde zunächst unter Verwendung von lytischen
Plaques beschrieben (Huse et al., 1989; Mullinax et al., 1990). Diese
Bibliotheken wurden ausgehend von immunisierten Mäusen oder
immunaufgefrischten (immune-boosted) Individuen hergestellt, was
den Nachteil hat, dass für
jedes Zielantigen eine neue Bibliothek erstellt werden muss und
keine reproduzierbaren Duplikatfilter erzeugt werden können. Aus
diesem Grunde sind Phagendisplay-Bibliotheken aus Antikörperfragmenten
hergestellt worden, wobei von naiven (nicht-immunisierten Donoren
ausgegangen wurde (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581: Vaughan et
al. (1996) Nature Biotech., 14: 309; Sheets, M. D., Amersdorfer,
P., Finnern, R., Sargent, T., Lindqvist, E., Schier, R., Hemingsen,
G., Wong, C., Gerhart, J. C. & Marks,
J. D. (1998). Efficient construction of a large nonimmune phage
antibody library: the production of high-affinity human single-chain
antibodies to Protein antigens. Proc Natl Acad Sci USA 95: 6157-62)
oder von klonierten Genen für
die variable (V) Region mit synthetisch eingebrachten komplementaritätsbestimmenden
Regionen (complementarity determining regions; CDRs) (Griffiths
et al. (1994) EMBO J., 13: 3245), die eine große Vielfalt von Antikörpern enthalten
sollten. Tatsächlich
sind nach wiederholten Runden aus Selektion und Affi nitätsreinigung
mit Antigen Antikörperfragmente
gegen mehrere Antigene isoliert worden, bei denen dies zuvor als schwierig
angesehen wurde, wie beispielsweise Selbst-Antigene (Griffiths,
A. D., Malmqvist, M., Marks, J. D., Bye, J. M., Embleton, M. J.,
McCafferty, J., Baier, M., Holliger, K. P., Gorick, B. D., Hughes Jones,
N. C. & et al.
(1993). Human anti-self antibodies with high specificity from phage
display libraries. EMBO J, 12, 725-734; Griffiths et al., 1994;
De Wildt, R. M. T., Finnern, R., Ouwehand, W. H., Griffiths, A. D.,
Van Venrooij, W. J. & Hoet,
R. M. A. (1996). Characterization of human variable domain antibody
fragments against the U1 RNA-associated A Protein, selected from
a synthetic and a Patient-derived combinatorial V gene library.
Eur. J. Immunol. 26, 629-639) und MHC-Peptidkomplexe (Andersen et al., 1996).
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Das
experimentelle Vorgehen beim Phagendisplay umfasst wiederholte Runden
aus Phagenanzucht, Panning und Infektion, wobei dies oftmals zu einer
Neigung zu immundominanten Epitopen und dominanten Proteinen (in
Proteinmischungen) führt. Es
ist daher nützlich,
Klone so früh
wie möglich
zu analysieren, um den größten Teil
der Diversität
bezüglich
potentiell bindender Klone zu erhalten.
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Dies
erfordert ein Screening auf eine Antikörperbindung an ein Antigen
im großen
Maßstab.
Während
dies durch Anzüchten
und Induktion von rekombinanten Antikörpern in einem Format mit 96
Vertiefungen und anschließender
Durchführung
eines herkömmlichen
ELISA durch Transferieren der exprimierten Antikörper auf eine andere Platte,
die mit Antigen beschichtet ist, erreicht werden kann, ist es nicht
möglich,
mehr als 1000 verschiedene Antikörper
auf diese Weise in einem Screening zu untersuchen. Umfangreichere
Screenings können
durch robotergestütztes
Pipettieren von einzelnen exprimierten Antikörpern erreicht werden; dennoch
müssten die
Antikörper
während
der Induktion kompartimentiert werden, was die Anzahl von Antikör pern einschränkt, die
mit einem bestehendem Plattenformat und den gegenwärtigen Beschränkungen
hinsichtlich der Geschwindigkeit der Verarbeitung von Flüssigkeit in
einem Screening untersucht werden können. Um größere Screenings im Bereich
von 10
3 bis 10
5 zu
ermöglichen,
können
Antikörper-enthaltende
Bakterien in situ exprimiert werden und anschließend auf Filtern eingefangen
werden, um diese anschließend
mit markiertem Antigen als Sonde zu untersuchen. Skerra et al.,
Anal. Biochem. 196. 151-155 verwendeten einen Ansatz mit zwei Filtern,
um exprimierte Antikörperfragmente
einzufangen und somit zwischen bindenden und nicht-bindenden Antikörpern zu
unterscheiden, wobei die Verwendung eines zweiten Filters den durch
bakterielle Zelltrümmer
verursachten Hintergrund verringerte. Einfang-Reagenzien sind darüber hinaus
verwendet worden, um Antikörperfragmente
einzufangen, die in Plaques von λ-Phagen exprimiert
wurden, (Watkins, J. D., Beuerlein, G., Wu, H., McFadden, P. R.,
Pancook, J. D. & Huse,
W. D. (1998). Discovery of human antibodies to cell surface antigens
by capture lift screening of phage-expressed antibody libraries.
Anal Biochem 256, 169-77).
Beide Methoden basieren auf dem wahllosen Einfangen von Antikörpern, gefolgt
von der Verwendung eines markierten Antigens zum Detektieren von
Antigen-spezifischen Klonen. Dies erfordert nicht nur die Markierung
jedes Antigens, das im Screening untersucht werden soll, sondern
die Verwendung von generischen Einfang-Reagenzien mit geringer Affinität könnte auch
bedeuten, dass die Antikörper
von dem Filter entfernt werden, bevor die spezifische Interaktion
nachgewiesen werden kann. Um diesen Problemen zu begegnen, haben
wir einen neuen Ansatz entwickelt, bei dem das Zielmolekül selbst
auf einen festen Träger
immobilisiert wird, und die Polypeptidgruppe in großer Nähe exprimiert
wird, sodass die bindenden Polypeptide unmittelbar auf dem festen
Träger,
der die Zielmoleküle
enthält,
eingefangen werden können.
Darüber
hinaus haben wir ein System entwickelt, bei dem Duplikat-Filter,
die dieselbe Gruppe von Polypeptiden enthalten, hergestellt werden
können
und mit zwei oder mehr verschiedenen Zielmolekülen in einem Screening untersucht
werden können,
sodass Polypeptide identifiziert werden können, die mit einzelnen Zielmolekülen, mit
einigen jedoch nicht allen Zielmolekülen, mit allen Zielmolekülen oder
mit keinem der Zielmoleküle
interagieren. Neben der Verwendung beim Screening auf Bindungsinteraktionen
kann dieser direkte Expression/Interaktionsassay verwendet werden,
um beliebige biologische Screenings durchzuführen, die Polypeptide mit einer
biologischen Funktion betreffen. In unserem Ansatz werden Nukleinsäuremoleküle, die für die Polypeptidgruppe
kodieren, und die immobilisierten Zielmoleküle vor der Expression der Nukleinsäuremoleküle und der
anschließenden
Detektion der Polypeptid-Zielinteraktionen zueinander gebracht.
Andere existierende, Hochdichte-Screeningverfahren wie beispielsweise
WO 99/39210 beschreiben
die Expression der Nukleinsäuremoleküle, nachdem
der Bioliothek-Array gebildet wurde.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Wir
haben eine Methode entwickelt, durch die eine Gruppe von Polypeptiden,
einschließlich
Antikörperpolypeptiden,
verwendet werden kann, um ein Screening auf Reaktivität mit einem
oder mit mehreren Zielmolekülen
durchzuführen.
Wir haben Polypeptidexpression und Interaktionsscreening kombiniert
und einen Array von Polypeptiden erzeugt, der als Array angeordneten
Nukleinsäuren
entspricht, welche für
die Polypeptide kodieren. Dies hat gegenüber herkömmlichen Verfahren den Vorteil,
dass das exprimierte Polypeptid in der Lage ist, direkt mit dem Zielmolekül zu interagieren
und nicht für
ein späteres Screening
mit dem Zielmolekül
exprimiert und gelagert oder eingefangen werden muss. Die Herstellung von
solchen Arrays ermöglicht
ferner das parallele Screening derselben Gruppenmitglieder gegen
verschiedene Zielmoleküle.
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In
einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird somit ein Verfahren
zum Screening einer Gruppe von Polypeptiden bereitgestellt, um ein
oder mehrere Mitglieder daraus, die mit einem oder mehreren Zielmolekülen interagieren,
zu identifizieren, bei dem man:
- a) das (die)
Zielmolekül(e)
auf einem Träger
immobilisiert;
- b) eine Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die für die Gruppe von Polypeptiden
kodieren, als Array anordnet;
- c) das (die) Zielmolekül(e)
und die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander bringt;
- d) die als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle exprimiert, um die Polypeptide
zu erzeugen, sodass die Polypeptide in Kontakt mit dem (den) Zielmolekül(en) auf
dem Träger
kommen und eine Teilmenge der Polypeptide mit dem (den) Zielmolekül(en) interagiert;
und
- e) die Interaktion der Polypeptide mit den Zielmolekülen auf
dem Träger
detektiert,
wobei die Nukleinsäuremoleküle, die für die Gruppe von Polypeptiden
kodieren, und die immobilisierten Zielmoleküle als Array angeordnet sind,
und die Träger
vor der Expression der als Array angeordneten Nukleinsäuremoleküle zueinander
gebracht werden.
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Die
Erfindung umfasst den wesentlichen Vorteil des Phagen-Displays und anderer
Expressionsdisplay-Verfahren, nämlich
dass die Nukleinsäuren, die
für die
Mitglieder der Polypeptidgruppe kodieren, mit dem einzelnen von
diesen kodierten Polypeptid assoziiert sind, und daher auf Basis
der funktionellen Eigenschaften des einzelnen Polypeptids selektiert werden
kön nen.
Im Gegensatz zum Phagendisplay jedoch, bei dem diese Assoziation
durch Verknüpfung
der Nukleinsäuren
und der Polypeptide unter Verwendung eines Bakteriophagen erreicht
wird, welcher die Polypeptide auf der Außenseite präsentiert und die entsprechenden
Nukleotidvorläufer
im Inneren enthält,
nutzt die vorliegende Erfindung eine neue Array-Technik, um diese
Assoziation bereitzustellen. Durch Eliminieren des Erfordernisses,
wonach die Nukleinsäuren
und die Polypeptide in oder auf den bakteriellen Zellen beibehalten
werden oder während
der Expression kompartimentiert werden müssen (beispielsweise in Platten
mit 96 Vertiefungen oder unter Verwendung anderer Strategien zur Kompartimentierung),
ermöglicht
die vorliegende Erfindung, dass eine große Anzahl von Polypeptiden gleichzeitig
in einem Screening untersucht werden können. Somit befinden sich die
Nukleinsäure,
das entsprechende Polypeptid-Produkt
und die Interaktion des Polypeptid-Produkts mit (einem) Zielmolekül(en) alle
in großer
Nähe zueinander.
Wenn eine bestimmte Interaktion beobachtet wird, kann somit das
entsprechende Nukleinsäuremitglied
problemlos identifiziert werden. Folglich kann die Erfindung auf Bereiche
jenseits der Selektion von Bindungsaktivitäten erweitert werden, um eine
beliebige Polypeptidgruppe auf Basis einer beliebigen funktionellen
Eigenschaft der Polypeptide zu selektieren, einschließlich enzymatischer
Aktivität,
Konformation und anderer nachweisbarer Eigenschaften.
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Die
Zielmoleküle
werden auf einem Festphasen-Träger,
wie beispielsweise auf einem Membranfilter-Träger, immobilisiert und zu dem
Array aus Nukleinsäuremolekülen gebracht.
Dies kann die Anordnung lediglich der Zielmoleküle als Array umfassen, beispielsweise
wenn der Träger
mit einem gereinigten Protein beschichtet wird oder mit einem Zielmolekül in einer
komplexen Mischung mit anderen Molekülen, beispielsweise ganzen
Zellen oder Zellextrakten. Für
einige Screening-Untersuchungen kann die genaue Art des Zielmoleküls unbekannt
sein, wobei in die sem Fall ein beliebiges Polypeptid, das eine Interaktion
während
des Screenings erzeugt, verwendet werden kann, um das Zielmolekül weiter
zu charakterisieren. Da die Polypeptide, die durch Expression der
Nukleinsäuremoleküle erzeugt
wurden, zu den Zielmolekülen
gebracht werden, haben sie die Möglichkeit,
mit diesen zu interagieren. Die Interaktion kann unter Verwendung
geeigneter Detektionssysteme, die auf Basis der zu detektierenden
Interaktion ausgewählt
werden, nachgewiesen werden.
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Die
Detektion der Interaktion zwischen den Polypeptiden der Gruppe und
den Zielmolekülen kann
auf vielfältige
Weise erfolgen, abhängig
von der Art der Interaktion selbst. Wenn beispielsweise die Polypeptidgruppe
eine Antikörper-Molekül-Gruppe ist, und die
Zielmoleküle
Antigene sind, kann die Bindung zwischen den Antikörpern und
den Antigenen detektiert werden, indem der Zielmolekül-Träger unter
Verwendung eines geeignet markierten Anti-Immunglobulins, oder eines
markierten Superantigens, wie beispielsweise Protein A oder Protein
L, als Sonde untersucht wird. In einer alternativen Ausführungsform
können
die Zielmoleküle,
die verwendet werden, um die Polypeptidgruppe zu selektieren, in der
Lage sein, eine generische Interaktion mit korrekt gefalteten und
exprimierten Polypeptiden durchzuführen. Wenn beispielsweise das
Zielmolekül
Protein A oder Protein L ist, würde
die Untergruppe aller funktionellen Immunglobulinmoleküle aus einer
Immunglobulinmolekülgruppe
selektiert werden. Alternativ dazu kann die Interaktion zwischen
den Polypeptiden der Gruppe und den Zielmoleküllen durch einige physikalische Änderungen
in der Art des Zielmoleküls
oder anderer Moleküle,
mit denen diese interagieren können,
detektiert werden. Wenn beispielsweise das Zielmolekül ein Rezeptor
ist, der die Apoptose fördert,
und Zellen, die das Zielmolekül
enthalten, auf dem festen Träger
immobilisiert wurden, kann ein interagierendes Mitglied der Polypeptidgruppe
die Zelle abtöten,
was unter einem Mikroskop oder durch Verwendung einiger anderer
molekularen Marker der Apoptose detektiert werden kann. Alternativ
dazu könnte
das interagierende Mitglied der Polypeptidgruppe eine Farbveränderung
im Zielmolekül verursachen.
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In
einer spezifischen Ausführungsform
umfasst die Erfindung ein wie oben definiertes Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und
18 zum Screening einer Gruppe von Antikörperpolypeptiden, um ein oder mehrere
Mitglieder daraus, die an ein oder mehrere Zielmoleküle binden,
zu identifizieren, bei dem man:
- a) das (die)
Zielmolekül(e)
auf einem ersten Träger
immobilisiert;
- b) eine Vielzahl von Zellen mit Nukleinsäuremolekülen, die für die Gruppe von Antikörper-Polypeptiden
kodieren, transformiert und die bakteriellen Zellen auf einem zweiten
Träger
als Array anordnet;
- c) den ersten und den zweiten Träger zueinander bringt;
- d) die Nukleinsäuremoleküle exprimiert,
um die Antikörper
Polypeptide zu erzeugen, sodass die Polypeptide aus den Zellen auf
dem zweiten Träger
ausgeschieden werden und in Kontakt mit dem (den) Zielmolekül(en) auf
dem ersten Träger kommen,
und eine Teilmenge der Polypeptide an die Zielmoleküle bindet;
und
- e) die Bindung der Antikörper-Polypeptide
mit den Zielmolekülen
auf dem ersten Träger
detektiert.
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Die
Zellen können
prokaryontisch oder eukaryontisch sein, einschließlich bakterieller
Zellen, wie beispielsweise E. coli, niederer eukaryontischer Zellen,
wie beispielsweise Hefezellen, und höherer eukaryontischer Zellen,
wie beispielsweise Säugetierzellen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das Anordnen als Array
vorteilhafterweise durch robotergestütztes Kolonie-Picking in Kulturplatten durchgeführt, von
denen zahlreiche Duplikatfilter hergestellt werden können. Obwohl
der erste und der zweite Filter gleich sein können, sodass ein Zielmolekül zunächst an
den Filter angeheftet wird und anschließend die Bakterien als Array
angeordnet, angezüchtet
und auf einem Zielmolekülfilter
exprimiert werden, ist es vorteilhaft, den zweiten Filter, welcher die
in Array angeordneten Kolonien aufweist, auf einen ersten Filter
zu legen, der die Zielmoleküle
darauf immobilisiert aufweist, sodass der erste Filter in Kontakt
mit der Unterseite des zweiten Filters steht und nicht in Kontakt
mit den Kolonien selbst.
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Demgemäß ist es
vorteilhaft, dass der erste und der zweite Träger, die in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, Filter sind. Mindestens der zweite Filter ist
vorteilhafterweise ein poröser oder
mikroporöser
Filter, was es den von den Zellen ausgeschiedenen Polypeptiden ermöglicht,
durch diesen zu treten und Kontakt mit dem ersten Filter herzustellen.
Bevorzugte Filtermaterialien umfassen Nitrocellulose, PVDF und andere
künstliche
Membranen, die im Stand der Technik bekannt sind.
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Den
Polypeptiden, die von den Zellen exprimiert und ausgeschieden werden,
wird es erlaubt, durch den zweiten Filter zu treten, und mit den
immobilisierten Zielmolekülen
auf dem ersten Filter zu interagieren, indem sie an diese binden.
Gebundene Immunglobuline können
unter Verwendung von Anti-Immunglobulin-Reagenzien,
wie beispielsweise markierten Superantigenen, detektiert werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1. Beschreibung
eines Verfahrens zum Screening bakteriell exprimierter scFvs.
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(A)
Bakterien, die klonierte Antikörpergene enthalten,
werden auf einem Filter in einen Array eingeteilt und über Nacht
in Abwesenheit einer scFv-Produktion angezüchtet. Ein Filter, der mit
dem Zielantigen beschichtet ist, wird vorbereitet und auf eine zweite
Platte gelegt, die IPTG für
die Induktion von scFv umfasst, und dieser wird anschließend mit dem
Filter, der die gerasterten Bakterien enthält, bedeckt. Während der
Induktion werden die Antikörper durch
den oberen Filter treten und bei Antigenspezifität das Antigen auf dem unteren
Filter binden. Nach mehreren Stunden Induktion wird der untere Filter entfernt
und gebundenes scFvs wird unter Verwendung eines sekundären Reagenzes
detektiert. (B) Durch robotergestütztes Picking und Rastern (gridding)
können
geordnete Duplikat-Arrays hergestellt werden, die dann gegen zwei
oder mehrere verschiedene Zielmoleküle in einem Screening untersucht werden
können,
um Mitglieder der Gruppe zu identifizieren, die (in diesem Beispiel)
Antigen 1 und Antigen 2 (schwarze Kreise), Antigen 1 jedoch nicht
Antigen 2 (schattierte Kreise), Antigen 2 jedoch nicht Antigen 1
(schraffierte Kreise), kein Antigen (weiße Kreise) binden.
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2. Analyse
von BSA-spezifischen scFvs auf einem Makro-Array.
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(A)
Sandwich-Detektion von funktionellem scFvs unter Verwendung von
Protein L als Zielmolekül
und Protein A-HRP als Detektionsreagenz. (B) Screening auf BSA-bindende
scFvs unter Verwendung von immobilisiertem BSA zur Bindung von BSA-bindenden scFvs.
(C) Screening auf HSA-bindende scFvs unter Verwendung von immobilisiertem HSA
zur Bindung von HSA-bindenden
scFvs. Das hier dargestellte Bild besteht aus 6144 Klonen. Die Klone
wurden in einem 4 × 4
Muster aus dupli zierten Klonen von 8 Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen (384 × 8 × 2) in
einen Array eingeteilt.
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3. Filter-Screening
auf interagierende Proteinpaare
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(A)
Detektion eines Anti-M-scFv-Antigen M-Paars und eines Anti-T-scFv-Antigen
M-Paars (B) Detektion eines FRB-FKBP12-Paars. Interagierende Paare werden durch
Einfangen exprimierter GST-Fusionen mit einem Anti-GST-Antikörper nachgewiesen,
und der interagierende Ligand wird unter Verwendung des Proteins
L HRP detektiert. Die FRB-FKBP12-Interaktion wurde nur beobachtet, wenn
Rapamycin vorhanden war.
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4. ELISA-Detektion
eines interagierenden Proteinpaars
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(A)
Detektion eines scFv-Antigen M-Paars und eines scFv-Antigen T-Paars (B)
Detektion eines FRB-FKBP12-Paars. Interagierende Paare werden durch
Einfangen der exprimierten GST-Fusionen
mit einem Anti-GST-Antikörper
nachgewiesen, und der interagierende Ligand wird unter Verwendung
des Proteins L-HRP nachgewiesen. Die FRB-FKBP12-Interaktion wurde
nur beobachtet, wenn Rapamycin vorhanden war.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Definitionen
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Array:
Wie vorliegend verwendet ist ein Array eine räumliche Anordnung von Nukleinsäuremitgliedern
einer Gruppe, bei der verschiedene Nukleinsäuremitglieder an einzelnen
und vorbestimmten Positionen auf einem festen Träger angeordnet werden. Solche
geordneten Arrays können
unter Verwendung einer Raster-Methode
(gridding) erzeugt werden, beispielsweise durch robotergestütztes Picking,
um die Mitglieder an den gewünschten
Positionen anzuordnen. Arrays dieser Art haben den Vorteil, dass
jeder Klon seine eigene Position aufweist und mehrere Duplikatfilter
erzeugt und gegen verschiedene Zielmoleküle in einem Screening untersucht
werden können. Weitere
bevorzugte Methoden für
Arrays sind nachfolgend beschrieben.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in
beliebiger Form als Array angeordnet werden. Beispielsweise können sie
als nackte Nukleinsäuren
als Array angeordnet werden, entweder als RNA, DNA oder eine beliebige
andere Form von Nukleinsäure.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung jedoch werden sie in Form
von Zellen oder Aggregaten aus Zellen, die mit Nukleinsäuren transformiert
sind, als Array angeordnet. Geeignete Zellen umfassen bakterielle
Zellen, eukaryontische Zellen und höhere eukaryontische Zellen,
wie beispielsweise Säugetierzellen.
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Vorzugsweise
liegen die Nukleinsäuremoleküle in Form
von Expressionsvektoren vor, welche für die Mitglieder der Gruppe
von Polypeptiden kodieren, und die in funktionsfähiger Weise mit Kontrollsequenzen
verknüpft
sind, die ausreichen, um ihre Transkription und/oder Translation
zu steuern. Beispielsweise können
solche Kontrollsequenzen Promotorsequenzen und Enhancer umfassen,
die dem Fachmann bekannt sind, und die für die Transkription von DNA-Molekülen notwendig
sind.
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Beispielsweise
können
die Nukleinsäuremoleküle in Form
von Plasmiden, Viren, als Bakteriophage oder als lineare Nukleinsäuremoleküle vorliegen,
entweder in nackter oder in komplexierter Form. Sie werden anschließend transkribiert
(sofern sie auf DNA basieren) und/oder translatiert, um die Polypeptide
in situ auf dem Array zu erzeugen.
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Ein
Array kann eine beliebige geeignete Anzahl von Mitgliedern umfassen,
beispielsweise 10, 100 oder 500 Mitglieder. Vorzugsweise umfasst
ein im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren
zu verwendeter Array mindestens 1000 Mitglieder, vorteilhafter weise
104, 105, 106 oder mehr Mitglieder.
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Generischer
Ligand: Ein generischer Ligand ist ein Ligand, der einen wesentlichen
Teil der funktionellen Mitglieder in einer gegebenen Gruppe von Polypeptiden
bindet. Somit kann der gleiche generische Ligand zahlreiche Mitglieder
einer Gruppe binden, unabhängig
von deren Spezifitäten
und für
den Zielliganden (siehe unten). Im Allgemeinen weist das Vorhandensein
einer Bindungsstelle für
einen funktionellen generischen Liganden darauf hin, dass das Mitglied
der Gruppe exprimiert und korrekt gefaltet wird. Somit stellt die
Bindung des generischen Liganden an seine Bindungsstelle ein Verfahren
zur Vorselektion funktioneller Polypeptide aus einer Gruppe von
Polypeptiden bereit. Zielmmoleküle
können ebenfalls
generische Liganden aufweisen, die verwendet werden können, um
die Funktionalität
der Zielmoleküle
zu zeigen.
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Interaktion:
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich "interagieren" auf eine beliebige
nachweisbare Interaktion zwischen den Polypeptiden und den Zielmolekülen. Beispielsweise
kann im Falle von Antikörperpolypeptiden,
wie beispielsweise scFv, die Interaktion eine Bindungsinteraktion
sein und die Zielpolypeptide können
Antigene sein. Alternativ dazu kann die Interaktion eine enzymatisch
katalysierte Reaktion sein, bei der die Polypeptide Enzyme sein
können,
und die Zielmoleküle Substrate
für diese.
Oftmals umfasst die Bindung von Polypeptiden, wie beispielsweise
Enzymen oder Molekülen,
die an der Zellsignalübertragung
beteiligt sind, ein Bindungsereignis und eine Veränderung
in einer messbaren biochemischen Aktivität, wie beispielsweise einer
Kinaseaktivität
oder einer Phosphataseaktivität.
Solche Aktivitäten
werden unter Verwendung von Standardassayverfahren gemessen, die
im Stand der Technik bekannt sind.
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Zueinander
bringen (juxtaposition): Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
umfasst "zueinander
bringen" den physi kalischen
Kontakt, ist jedoch nicht auf diesen beschränkt. Die Gruppe und die Zielmoleküle werden
zueinander gebracht, sodass die Polypeptide, die auf dem Array exprimiert
werden, in der Lage sind, so mit den Zielmolekülen auf dem Träger zu interagieren,
dass die Stelle der Interaktion von jedem einzelnen Mitglied der Gruppe
mit dem Zielmolekül
mit seiner Position auf dem Array korreliert werden kann. In einem
bevorzugten Aspekt wird der Träger,
der die Zielmoleküle immobilisiert
darauf aufweist, in Kontakt mit dem Träger gebracht, auf dem die Nukleinsäuren, die
für die Gruppe
von Polypeptiden kodieren, als Array angeordnet sind.
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Polypeptid:
Der Begriff "Polypeptid" bezieht sich auf
jede Art von Polypeptid, wie beispielsweise Peptide, humane Proteine,
Fragmente von humanen Proteinen, Proteine oder Fragmente von Proteinen von
nicht-humanen Quellen, bearbeitete Versionen von Proteinen oder
Fragmenten von Proteinen, Enzyme, Antigene, Wirkstoffe, Moleküle die an
der Signalübertragung
in der Zelle beteiligt sind, wie beispielsweise Rezeptormoleküle, Antikörper, einschließlich Polypeptide
der Immunglobulin-Superfamilie, wie beispielsweise Antikörperpolypeptide
oder T-Zellrezeptorpolypeptide. Gemäß der vorliegenden Erfindung
sind alle diese "Polypeptide" in der Lage (oder
potentiell in der Lage) eine Interaktion mit einem Zielmolekül einzugehen,
das im Falle einer Bindungsinteraktion ein Zielligand sein würde.
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Die
Antikörperpolypeptide
können
vorteilhafterweise sowohl Polypeptide der schweren Kette (VH) als auch der leichten Kette (VL) oder Einzeldomänen-Antikörpergruppen umfassen, die entweder
Polypeptide der schweren Kette (VH) oder
Polypeptide der leichten Kette (VL) umfassen.
Ein Antikörperpolypeptid
ist wie vorliegend verwendet ein Polypeptid, das entweder ein Antikörper oder
ein Teil eines Antikörpers
ist, modifiziert oder unmodifiziert. Somit umfasst der Begriff Antikörper-Polypeptid
eine schwere Kette, eine leichte Kette, ein Dimer aus schwerer und leichter
Kette, ein Fab-Fragment, ein F(ab')2-Fragment,
eine Einzeldomäne
einer schweren Kette, eine Einzeldomäne einer leichten Kette, ein
Dab-Fragment und ein Fv-Fragment, einschließlich eines Einzelketten-Fv
(svFv). Verfahren zur Konstruktion solcher Antikörpermoleküle und Nukleinsäuren, die
für diese
kodieren, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt.
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Gruppe
(repertoire): Eine "Gruppe" ist eine Population
von verschiedenen Varianten, beispielsweise Nukleinsäurevarianten,
die sich in ihrer Nukleotidsequenz unterscheiden, oder Polypeptidvarianten,
die sich in ihrer Aminosäuresequenz
unterscheiden. Im Allgemeinen umfasst eine Gruppe eine große Anzahl
von Varianten, manchmal 1010, 1011, 1012 oder mehr.
Große
Gruppen umfassen die größte Anzahl von
möglichen
Varianten für
die Selektion. Kleinere Gruppen können konstruiert werden und
sind extrem nützlich,
insbesondere wenn sie vorselektiert wurden, um unerwünschte Mitglieder
zu entfernen, wie beispielsweise solche, die Stoppkodons umfassen, nicht
in der Lage sind, sich korrekt zu falten oder die auf andere Weise
inaktiv sind. Solche kleineren Gruppen können 10, 102,
103, 104, 105, 106 oder mehr Nukleinsäuren oder
Polypeptide umfassen. Zweckmäßigerweise
umfassen kleinere Gruppen zwischen 102 und
105 Nukleinsäuren oder Polypeptide. Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist eine Gruppe von Nukleotiden vorzugsweise so gestaltet,
dass sie für
eine entsprechende Gruppe von Polypeptiden kodiert.
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Teilmenge:
Eine "Teilmenge" ist ein Teil der Gruppe.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist lediglich eine Teilmenge
der Gruppe in der Lage, mit dem Zielmolekül zu interagieren, und somit
wird lediglich eine Teilmenge der Gruppe zu einer nachweisbaren
Interaktion auf dem Array führen.
Wenn beispielsweise das Zielmolekül ein spezifischer Ligand für einen
Antikörper
ist, wird eine Teilmenge von Antikörpern isoliert, die in der
Lage ist, an den Zielliganden zu binden.
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Zielmolekül: Ein Zielmolekül ist ein
Molekül, für das eine
Interaktion mit einen oder mehreren Mitgliedern der Gruppe vorgesehen
ist. Somit umfasst der Begriff „Zielmolekül" Antigene, Antikörper, Enzyme, Substrate für Enzyme,
Lipide, ein beliebiges Molekül,
das in oder auf einer beliebigen Zelle oder einem zellulären Organismus
exprimiert wird, beliebige organische oder anorganische kleine Moleküle und beliebige
andere Moleküle,
die in der Lage sind, mit einem Mitglied der Polypeptidgruppe zu
interagieren. Diese Zielmoleküle
können
selbst Polypeptide sein, wobei dann sowohl die Gruppe als auch die
Ziele Polypeptide sind. In einem solchen Fall kann die Gruppe eine
Gruppe von Antigenen, oder Substraten von Enzymen sein, die gegen
ein oder mehrere Antikörper oder
Enzymmoleküle
gescreent werden sollen; oder umgekehrt. Wenn die Interaktion eine
Bindungsinteraktion ist, kann das Zielmolekül ein Zielligand sein (siehe
unten).
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Zielligand:
Der Zielligand ist ein Molekül,
für das
Mitglieder der Polypeptidgruppe, die eine spezifische Bindungsaktivität aufweisen,
identifiziert werden sollen. Wenn die Mitglieder der Polypeptidgruppe
Antikörpermoleküle sind,
kann der Zielligand ein Antigen sein, und wenn die Mitglieder der
Gruppe Enzyme sind, kann der Zielligand ein Substrat sein. Wenn
die Mitglieder der Polypeptidgruppe exprimierte cDNAs sind, können die
Zielliganden selbst Antikörper
oder andere Polypeptidmoleküle
sein.
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Konstruktion von Nukleinsäuren, die
für Polypeptidgruppen
kodieren
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Im
Allgemeinen können
Nukleinsäurebibliotheken,
die für
die erfindungsgemäßen Gruppen
von Polypeptiden kodieren, unter Verwendung von Verfahren konstruiert
werden, die analog zu denjenigen sind, die bei der Konstruktion
von Bibliotheken für das
Phagendisplay verwendet werden. Solche Verfahren sind im Stand der
Technik hinreichend bekannt (McCafferty et al. (1990). Nature, 348:
552; Kang et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363;
Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624; Lowman et al. (1991) Biochemistry.
30: 10832; Burton et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88:
10134; Hoogenboom el al. (1991). Nucleic Acids Res., 19: 4133; Chang
et al. (1991) J. Immunol., 147: 3610, Breitling et al. (1991) Gene;
104: 147, Marks et al. (1991) oben; Barbas et al. (1992) oben: Hawkins
und Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al., 1992, J. Biol.
Chem., 267: 16007; Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313.
-
Ein
besonders vorteilhafter Ansatz ist die Konstruktion von scFv-Phagen-Bibliotheken
gewesen (Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85:
5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.,
87: 1066-1070; McCafferty et al. (1990) oben; Clackson et al. (1991)
supra; Marks et al. (1991) oben; Chiswell et al. (1992) Trends Biotech.,
10: 80; Marks et al. (1992) oben).
-
Bibliotheken
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
vorteilhafterweise so ausgestaltet sein, dass sie auf einer vorbestimmten
Konformation der Hauptkette basieren. Solche Bibliotheken können beispielsweise
konstruiert werden, wie es in der internationalen Patentanmeldung
WO 99/20749 beschrieben
ist.
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Entgegen
den beim Phagendisplay verwendeten Ansätzen werden die Nukleinsäurebibliotheken
gemäß der vorliegenden
Erfindung jedoch nicht als Fusionen mit einem Gen für ein Phagen-Hüllprotein konstruiert, und
sie werden nicht notwendigerweise in Bakteriophagenvektoren konstruiert.
Wenn ein Phage oder ein Phagemidvektor verwendet wird, wird das
Polypeptid vorteilhafterweise nicht mit dem Hüllprotein fusioniert, sondern
getrennt von diesem. Beispielsweise kann ein Stoppkodon in die Sequenz eingebracht
werden, um sicherzustellen, dass die Poly peptide nicht als Fusion
exprimiert werden. Jeder Vektor, der in der Lage ist, ein rekombinantes
Polypeptid darin zu exprimieren ist geeignet. Die Polypeptide werden
in vorteilhafter Weise von den Wirtszellen ausgeschieden.
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Im
Allgemeinen sind die Nukleinsäuremoleküle und Vektorkonstrukte,
die zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, im Stand der Technik
verfügbar
und können
konstruiert und manipuliert werden, wie es in Standardlaborhandbüchern beschrieben
wird, wie beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA.
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Die
Manipulation von Nukleinsäuren
wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung üblicherweise in rekombinanten
Vektoren ausgeführt.
Wie vorliegend verwendet, bezieht sich ein Vektor auf ein einzelnes Element,
das verwendet wird, um heterologe DNA in Zellen für die Expression
und/oder die Replikation derselben einzubringen. Verfahren, durch
die solche Vektoren ausgewählt
oder konstruiert und anschließend
verwendet werden, sind dem Durchschnittsfachmann hinreichend bekannt.
Zahlreiche Vektoren sind öffentlich
verfügbar,
einschließlich
bakterieller Plasmide, Bakteriophagen, artifizieller Chromosomen
und episomaler Vektoren. Solche Vektoren können für eine einfache Klonierung
und Mutagenese verwendet werden; alternativ dazu wird ein Genexpressionsvektor
verwendet, wie es bei Vektoren üblich
ist, in denen erfindungsgemäße Mitglieder
einer Gruppe (oder einer Vorgruppe) enthalten sind. Ein Vektor zur
Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung kann so ausgewählt
sein, dass er eine für
ein Polypeptid kodierende Sequenz einer gewünschten Größe aufnimmt, üblicherweise
mit einer Länge
von 0,25 Kilobasen (kb) bis 40 kb. Eine geeignete Wirtszelle wird
mit dem Vektor nach in vitro Klonierungsmanipulationen transformiert.
Jeder Vektor umfasst verschiedene funktionelle Komponenten, die
im Allgemeinen eine Klonierungs- (oder "Polylin ker-")Stelle, einen Replikationsursprung
und mindestens ein selektierbares Markergen umfassen. Wenn der jeweilige
Vektor ein Expressionsvektor ist, besitzt er darüber hinaus eine oder mehrere
der folgenden Elemente: Enhancer-Element, Promotor, Transkriptionsterminationssequenzen
und Signalsequenzen, wobei alle in der Nähe der Klonierungsstelle liegen, sodass
sie in funktionsfähiger
Weise mit dem Gen verknüpft
sind, das für
ein erfindungsgemäßes Mitglied
der Polypeptidgruppe kodiert.
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Sowohl
die Klonierungsvektoren als auch die Expressionsvektoren enthalten
im Allgemeinen Nukleinsäuresequenzen,
die es dem Vektor ermöglichen, sich
in einer oder in mehreren ausgewählten
Wirtszellen zu replizieren. Typischerweise ist diese Sequenz in
Klonierungsvektoren eine Sequenz, die es dem Vektor ermöglicht,
sich autonom von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren,
und die Replikationsursprünge
und autonom replizierende Sequenzen umfasst. Solche Sequenzen sind
für eine Vielzahl
von Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung
des Plasmids pBR322 ist für die
meisten Gramnegativen Bakterien geeignet, der Replikationsursprung
des 2 μ-Plasmids ist für Hefe geeignet,
und zahlreiche virale Replikationsursprünge (z. B. SV 40, Adenovirus)
sind für
Klonierungsvektoren in Säugetierzellen
nützlich.
Im Allgemeinen ist der Replikationsursprung für Säugetierexpressionsvektoren
nicht notwendig, außer
wenn diese in Säugetierzellen
verwendet werden, die in der Lage sind, hohe Menge von DNA zu replizieren,
wie beispielsweise COS-Zellen.
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Ein
Klonierungsvektor oder Expressionsvektor kann zweckmäßigerweise
ein Selektionsgen enthalten, das auch als Selektionsmarker bezeichnet wird.
Dieses Gen kodiert für
ein Protein, das für
das Überleben
oder das Wachstum von transfomierten Wirtszellen, die in einem selektiven
Kulturmedium angezüchtet
werden, notwendig ist. Wirtszellen, die nicht mit einem Vektor transformiert
sind, der das Selektionsgen enthält,
werden da her in dem Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene
kodieren für
Proteine, die resistent gegen Antibiotika und andere Toxinen vermitteln
(z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat und Tetracyclin), die auxotrophe Mängel komplementieren
oder entscheidende Nährstoffe
liefern, die nicht im Wachstumsmedium enthalten sind.
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Da
die Replikation von Vektoren gemäß der vorliegenden
Erfindung praktischerweise in E. coli durchgeführt wird, ist ein in E. coli
selektierbarer Marker nützlich,
wie beispielsweise das Gen für
die β-Lactamase,
welches Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vermittelt.
Dies kann aus E. coli-Plasmiden, wie beispielsweise pBR322, oder
aus einem pUC-Plasmid, wie beispielsweise pIC18 oder pUC19, erhalten
werden.
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Expressionsvektoren
enthalten üblicherweise
einen Promotor, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und der
in funktionsfähiger
Weise mit der kodierenden Sequenz von Interesse verknüpft ist. Ein
solcher Promotor kann induzierbar oder konstitutiv sein. Der Begriff "in funktionsfähiger Weise
verknüpft" bezieht sich auf
eine nebeneinander erfolgende Anordnung, wobei die beschriebenen
Bestandteile in einem Zusammenhang stehen, der es ihnen erlaubt,
in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz,
die "in funktionsfähiger Weise" mit einer kodierenden
Sequenz verknüpft
ist, ist auf solche Weise ligiert, dass die Expression der kodierenden
Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die kompatibel mit den
Kontrollsequenzen sind.
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Promotoren,
die für
die Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignet sind, umfassen
beispielsweise die β-Lactamase
und die Lactose-Promotorsysteme, alkalische Phosphatase, das Tryptophan
(trp)-Promotorsystem und Hybridpromotoren, wie beispielsweise den
tac-Promotor. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen
werden ferner im Allgemeinen eine Shine- Delgarno-Sequenz enthalten, die in funktionsfähiger Weise
mit der kodierenden Sequenz verknüpft ist.
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In
der Bibliothek von Nukleinsäurenmolekülen, die
in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen,
sind bevorzugte Vektoren Expressionsvektoren, die die Expression
einer Nukleotidsequenz, welche für
ein Mitglied einer Polypeptidgruppe kodiert, ermöglichen. Die Konstruktion solcher
Vektoren umfasst herkömmliche
Ligationsverfahren. Isolierte Vektoren oder DNA-Fragmente werden
gespalten, zugeschnitten und in der Form wieder ligiert, die gewünscht ist,
um den benötigten
Vektor zu erzeugen. Sofern dies gewünscht ist, kann eine Analyse
in bekannter Weise durchgeführt
werden, um zu bestätigen,
dass die korrekten Sequenzen in dem konstruierten Vektor vorliegen.
Geeignete Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, zur
Herstellung von in vitro-Transkripten, zur Einbringung von DNA in
Wirtszellen und zur Durchführung von
Analysen zur Bestimmung der Expression und der Funktion sind dem
Fachmann bekannt. Das Vorhandensein einer Gensequenz in einer Probe
wird detektiert, oder seine Amplifikation und/oder Expression wird
durch herkömmliche
Verfahren quantifiziert, wie beispielsweise durch Southern- oder
Northern-Analyse,
Western-Blot, Dot-Blot von DNA, RNA oder Protein, in situ-Hybridisierung,
Immunzytochemie oder Sequenzanalyse von Nukleinsäure oder Proteinmolekülen. Der
Fachmann wird problemlos erkennen, wie diese Verfahren modifiziert
werden können,
sofern dies gewünscht
ist.
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Mutagenese unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion
(PCR)
-
Sobald
ein Vektorsystem ausgewählt
ist und eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen, die für Mitglieder
der Polypeptidgruppe kodieren, in den Vektor kloniert sind, kann
die Diversität
innerhalb der klonierten Moleküle
erzeugt werden, indem vor der Expression eine Mutagenese durchgeführt wird.
Die Mutagenese von Nukleinsäurensequenzen,
die für Polypeptidgruppen
kodie ren, wird durch molekulare Standardverfahren durchgeführt. Von
besonderer Verwendung ist die Polymerasekettenreaktion oder PCR
(Mullis und Faloona (1987) Methods Enzymol., 155: 335. Die PCR,
die mehrere Zyklen einer DNA-Replikation, welche durch eine thermostabile, DNA-abhängige DNA-Polymerase
katalysiert werden, zur Amplifikation der Zielsequenz von Interesse verwendet,
ist im Stand der Technik bekannt.
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Bei
den Oligonukleotidprimern, die gemäß der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, handelt es sich um einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die an eine Nukleinsäurematrize
hybridisieren, um die enzymatische Synthese eines zweiten Nukleinsäurestrangs
zu starten. Der Primer ist komplementär zu einem Teil eines Zielmoleküls, das
in einem Pool von Nukleinsäuremolekülen vorliegt,
der bei der Herstellung von Gruppen von erfindungsgemäßen Arrays
verwendet werden. Es wird vorgeschlagen, dass ein solches Molekül durch
synthetische Verfahren hergestellt wird, entweder chemisch oder
enzymatisch. Alternativ dazu tritt ein solches Molekül oder ein
Fragment davon natürlich
auf, und es wird aus seiner natürlichen
Quelle isoliert oder von einem kommerziellen Anbieter bezogen. Mutagene
Oligonukleotidprimer sind 15 bis 100 Nukleotide lang, idealerweise
20 bis 40 Nukleotiden, obwohl Oligonukleotide unterschiedlicher
Länge verwendet
werden können.
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Üblicherweise
tritt eine selektive Hybridisierung auf, wenn zwei Nukleinsäuresequenzen
im Wesentlichen komplementär
sind (mindestens etwa 65% Komplementarität über einen Abschnitt von mindestens
14 bis 25 Nukleotide, vorzugsweise mindestens etwa 75%, stärker bevorzugt
mindestens etwa 90% Komplementarität). Siehe Kanehisa (1984) Nucleic
Acids Res. 12: 203. Es wird daher erwartet, dass ein bestimmtes
Ausmaß an
Fehlpaarung an der Primingstelle toleriert wird. Eine solche Fehlpaarung kann
klein sein, wie beispielsweise ein Mono-, Di- oder Trinukleotid.
Alternativ dazu kann sie Nukleotidschleifen umfassen, die von uns
als Regionen definiert werden, in denen die Fehlpaarung eine ununterbrochene
Folge von 4 oder mehr Nukleotiden umfasst.
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Insgesamt
beeinflussen fünf
Faktoren die Wirksamkeit und Selektivität der Hybridisierung des Primers
an ein zweites Nukleinsäuremolekül. Diese Faktoren,
bei denen es sich um die folgenden handelt: (i) Primerlänge, (ii)
die Nukleotidsequenz und/oder -Zusammensetzung, (iii) die Hybridisierungstemperatur,
(iv) Pufferchemie und (v) die Möglichkeit
einer sterischen Behinderung in der Region, an die der Primer hybridisieren
muss, sind wichtige Erwägungen,
wenn nicht zufällige
Primingsequenzen erstellt werden.
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Es
gibt eine positive Korrelation zwischen Primerlänge und der Effizienz und Genauigkeit,
mit der sich ein Primer an eine Zielsequenz anlagern wird; längere Sequenzen
haben eine höhere Schmelztemperatur
(TM) als kürzere, und es ist weniger wahrscheinlich,
dass sie innerhalb einer gegebenen Zielsequenz wiederholt werden,
wodurch eine gemischte Hybridisierung minimiert wird. Primersequenzen
mit einem hohen G-C-Gehalt oder diejenigen, die palindromische Sequenz
umfassen, neigen zur Hybridisierung mit sich selbst, wie auch ihre
beabsichtigten Zielstellen, da unimolekulare Hybridisierungskinetiken
in Lösung
allgemein gegenüber
bimolekularen bevorzugt werden; gleichzeitig ist es wichtig, einen
Primer zu erstellen, der eine ausreichende Anzahl von G-C Nukleotidpaarungen
aufweist, um die Zielsequenz fest zu binden, da jedes dieser Paare durch
3 Wasserstoffbindungen verbunden ist, und nicht durch die zwei,
die in A-T Basenpaaren gefunden werden. Die Hybridisierungstemperatur
verändert
sich invers mit der Primeranlagerungseffizienz, wie auch die Konzentration
an organischen Lösungsmitteln,
z. B. Formamid, das in eine Hybridisierungsmischung zugegeben werden
kann, wohingegen Erhöhungen
der Salzkonzentration die Bindung erleichtern. Unter stringenten
Hy bridisierungsbedingungen hybridisieren längere Sonden effizienter als
kürzere, die
unter freizügigeren
Bedingungen ausreichend sind. Stringente Hybridisierungsbedingungen
umfassen üblicherweise
Salzkonzentrationen von weniger als etwa 1 M, wobei weniger als
etwa 500 mM üblicher
sind, und vorzugsweise weniger als etwa 200 mM. Die Hybridisierungstemperatur
reicht von 0°C bis
zu mehr als 22°C,
mehr als etwa 30°C
und (in den häufigsten
Fällen)
bis zu mehr als etwa 37°C.
Längere
Fragmente können
höhere
Hybridisierungstemperaturen für
eine spezifischen Hybridisierung erfordern. Da mehrere Faktoren
die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen, ist die Kombination
der Parameter wichtiger als die absolute Messung jedes einzelnen
allein.
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Vor
dem Hintergrund dieser Erwägungen werden
die Primer gestaltet. Während
Einschätzungen
bezüglich
der relativen Werts zahlreicher Sequenzen mental vom Fachmann durchgeführt werden
können,
sind Computerprogramme entwickelt worden, um bei der Bewertung dieser
zahlreichen Parameter und bei der Optimierung der Primersequenzen
zu helfen. Beispiele für
solche Programme sind "PrimerSelect" aus dem DNAStarTM-Softwarepaket (DNAStar, Inc.; Madison,
WI) und OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.). Sobald sie konzipiert
sind, werden geeignete Oligonukleotide durch ein geeignetes Verfahren
hergestellt, z. B. durch das von Beaucage und Carruthers (1981)
Tetrahedron Lett., 22: 1859) beschriebene Phosphoramiditverfahren
oder das Triesterverfahren nach Matteucci und Caruthers (1981) J.
Am. Chem. Soc. 103: 3185, oder durch andere chemische Verfahren,
entweder unter Verwendung eines kommerziellen, automatisierten Oligonukleotid-Synthesegeräts oder
unter Verwendung der VLSIPSTM-Technologie.
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Die
PCR wird unter Verwendung von Matrizen-DNA (mindestens 1 fg; üblicherweise
1–1000
ng) und mit mindestens 25 pmol der Oligonukleotidprimer durchgeführt; es
kann zweckmäßig sein, größere Mengen
des Primers zu verwenden, wenn der Primerpool stark heterogen ist,
da jede Sequenz lediglich in einem geringen Anteil unter den Molekülen des Pools
vertreten ist, und die Mengen in späteren Amplifikationszyklen
beschränkend
werden können. Eine
typische Reaktionsmischung umfasst: 2 μl DNA, 25 pmol Oligonukleotidprimer,
2,5 μl 10 × PCR-Puffer 1
(Perkin-Elmer, Foster
City, CA), 0,4 μl
1,25 μM dNTP,
0,15 μl
(oder 2,5 Einheiten) Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City,
CA) und deionisiertes Wasser in einem Gesamtvolumen von 25 μl. Es wird mit
Mineralöl überschichtet,
und die PCR wird unter Verwendung eines programmierbaren Thermocyclers
durchgeführt.
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Die
Länge und
Temperatur jedes Schritts eines PCR-Zyklus sowie auch die Anzahl
der Zyklen wird gemäß den tatsächlichen
Stringenzerfordernisse angepasst. Die Anlagerungstemperatur und
das Timing werden sowohl durch die Effizienz bestimmt, die man bei
Anlagerung des Primers an eine Matrize erwartet, als auch vom Ausmaß der Fehlpaarung,
die toleriert werden muss; wenn Nukleinsäuremoleküle gleichzeitig amplifiziert
und mutagenisiert werden, ist offensichtlich eine Fehlpaarung erforderlich,
zumindest in der ersten Runde des Synthese. Beim Versuch der Amplifikation
einer Population von Molekülen
unter Verwendung eines gemischten Pools aus mutagenen Primern wird
unter stringenten (hohe Temperatur) Anlagerungsbedingungen der Verlust von
potentiell mutierten Produkten, die lediglich von niedrigschmelzenden
Temperaturen resultieren würden,
gegen die gemischte Anlagerung von Primern an Sequenzen gewichtet,
welche nicht der Zielstelle entsprechen. Die Fähigkeit zur Optimierung der Stringenz
der Primeranlagerungsbedingungen liegt im Bereich des durchschnittlichen
Könnens
des Fachmanns. Eine Anlagerungstemperatur von zwischen 30°C und 72°C wird verwendet.
Die anfängliche
Denaturierung der Matrizenmoleküle
tritt normalerweise bei zwischen 92°C und 99°C für 4 Minuten auf, gefolgt von
20 bis 40 Zyklen, die aus Denaturierung (94–99°C für 15 Sekunden bis 1 Minute),
Anlagerung (Temperatur wie oben beschrieben bestimmt; 1–2 Minuten)
und Extension (72°C
für 1–5 Minuten bestehen,
abhängig
von der Länge
des zu amplifizierenden Produkts). Die finale Extension wird üblicherweise
für 4 Minuten
bei 72°C
durchgeführt,
und es kann eine unbestimmter (0–24 Stunden) Schritt bei 4°C gefolgt
werden.
-
Expression der Nukleinsäuren
-
Nukleinsäuremoleküle, die
für eine
Gruppe von Polypeptiden gemäß der vorliegenden
Erfindung kodieren, können
nach mehreren Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind,
exprimiert werden. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Expression" die Transkription
und/oder Translation von Nukleinsäuren in Proteine.
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Wenn
die Nukleinsäuren
in Form von nackter Nukleinsäure
oder in Form von komplexierter Nukleinsäure außerhalb der Umgebung einer
Zelle als Array angeordnet werden, sind Bestandteile eines biologischen
in vitro Systems erforderlich, um die Nukleinsäuren zu exprimieren. Diese
werden anhand der Erfordernisse eines spezifischen Systems nach
folgenden Merkmalen ausgewählt:
ein geeigneter Puffer, ein in vitro-Transkriptions-/Replikationssystem und/oder
ein in vitro-Translationssystem, das alle notwendigen Inhaltsstoffe,
Enzyme und Co-Faktoren, RNA-Polymerase, Nukleotide, Nukleinsäuren (natürlich oder
synthetisch), Transfer-RNAs, Ribosomen und Aminosäuren und
die Substrate der Reaktion von Interesse umfasst, um die Selektion
des modifizierten Genprodukts zu ermöglichen.
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Ein
geeigneter Puffer wird ein solcher sein, in dem alle gewünschten
Bestandteile des biologischen Systems aktiv sind und somit von den
Erfordernissen jedes spezifischen Reaktionssystems abhängen wird.
Puffer, die für
die biologische Reaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik
bekannt und Protokolle werden in verschiedenen Laborbüchern bereitgestellt,
wie beispielsweise Sambrook et al, 1989.
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Das
in vitro-Translationssystem wird üblicherweise einen Zellextrakt
umfassen, typischerweise von Bakterien (Zubay, 1973: Zubay, 1980;
Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), Kaninchen-Retikulozyten (Pelham
und Jackson, 1976) oder Weizenkeimen (Anderson et al., 1983). Zahlreiche
geeignete Systeme sind kommerziell verfügbar (beispielsweise von Promega)
einschließlich
solcher, die eine gekoppelte Transkription/Translation erlauben
werden (alle bakteriellen Systeme und das Retikulozytensystem und das
Weizenkeim-TNTTM-Extraktsystem von Promega).
Die verwendete Mischung von Aminosäuren kann synthetische Aminosäuren umfassen,
sofern dies gewünscht
ist, um die mögliche
Anzahl oder Vielfalt von Proteinen, die in der Bibliothek produziert werden,
zu erhöhen.
Dies kann erreicht werden, indem tRNAs mit künstlichen Aminosäuren beladen werden
und diese tRNAs für
die in vitro-Translation der zu selektierenden Proteine verwendet
wird (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et a. 1995).
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Wenn
die Nukleinsäuren
in Form von Zellen oder Zellkolonien als Array angeordnet werden,
findet die Expression in der Zelle selbst statt. Geeignete Wirtszellen
sind im Stand der Technik bekannt. Wirtszellen, wie beispielsweise
prokaryontische Zellen, Hefezellen oder höhere eukaryontische Zellen
können
verwendet werden, um die DNA zu replizieren und die Polypeptidgruppe
zu produzieren. Geeignete Prokaryonten umfassen Eubakterien, wie
beispielsweise Gram-negative oder Gram-positive Organismen, wie
beispielsweise E. coli, wie beispielsweise E. coli K-12-Stämme, DH5α und HB101,
oder Bacilli. Weitere Wirte, die für die Vektoren geeignet sind, welche
für die
Polypeptidgruppe kodieren, umfassen eukaryontische Mikroben, wie
beispielsweise filamentöse
Pilze oder Hefe, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Höhere eukaryontische
Zellen umfassen Insekten- und
Vertebratenzellen, insbesondere Säugetierzellen, einschließlich humaner
Zellen oder kernhaltiger Zellen von ande ren multizellulären Organismen.
Die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist
ein Routineverfahren. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien sind
epitheliale oder fibroblastische Zelllinien, wie beispielsweise Chinese
hamster ovary (CHO)-Zellen, NIH 3T3-Zellen, HeLa-Zellen oder 293T-Zellen.
Die Wirtszellen, die in dieser Offenbarung erwähnt werden, umfassen Zellen
in in vitro-Kultur sowie auch Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstieres
befinden.
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DNA
kann stabil in Zellen eingebracht werden, oder sie kann transient
unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren exprimiert werden.
Stabil transfizierte Säugetierzellen
können hergestellt
werden, indem Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert werden,
der ein selektierbares Markergen umfasst, und die transfizierten
Zellen unter Bedingungen angezüchtet
werden, die selektiv für Zellen
sind, die das Markergen exprimieren. Um transiente Transfektanten
zu produzieren, werden Säugetierzellen
mit einem Reportergen transfiziert, um die Transfektionseffizienz
zu verfolgen.
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Um
solche stabil oder transient transfizierten Zellen herzustellen,
sollten die Zellen mit einer ausreichenden Menge der Nukleinsäure transfiziert
werden. Die präzisen
Mengen der DNA, die für
die Mitglieder der Polypeptidgruppe kodiert, welche erforderlich
sind, kann empirisch bestimmt und für eine bestimmte Zelle und
für einen
bestimmten Assay optimiert werden.
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Wirtszellen
werden mit den obigen Expressions- oder Klonierungsvektoren der
vorliegenden Erfindung transfiziert oder transformiert und in herkömmlichen
Nährmedien
kultiviert, die soweit erforderlich modifiziert wurden, um Promotoren
zu induzieren, Transformanten zu selektieren und die Gene zu amplifizieren,
die für
die gewünschten
Sequenzen kodieren. Heterologe DNA kann durch ein beliebiges im
Stand der Technik bekanntes Verfahren in eine Wirtszelle eingebracht
werden, wie bei spielsweise Transfektion mit einem Vektor, der für eine heterologe
DNA kodiert, durch das Calciumphosphat-Co-Präzipitationsverfahren oder durch
Elektroporation. Zahlreiche Verfahren der Transfektion sind dem Fachmann
bekannt. Eine erfolgreiche Transfektion wird üblicherweise daran erkannt,
dass ein beliebiges Anzeichen für
das Funktionieren des Vektors in der Wirtszelle auftritt. Eine Transformation
wird unter Standardmethoden erreicht, die sich für die jeweils verwendete Wirtszellen
eignen.
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Die
Einbringung von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor,
die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder
eine Kombination von Plasmidvektoren, wobei jeder für ein oder
mehrere verschiedene Gene kodiert, oder mit linearer DNA sowie die
Selektion von transfizierten Zellen sind im Stand der Technik hinreichend
bekannt (siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
-
Transfizierte
oder transformierte Zellen werden unter Verwendung von Medien und
Kultivierungsverfahren kultiviert, die im Stand der Technik bekannt
sind, vorzugsweise unter Bedingungen, bei denen die Polypeptidgruppe,
die von den Nukleinsäuremolekülen kodiert
wird, exprimiert wird. Die Zusammensetzung von geeigneten Medien
ist im Stand der Technik bekannt, sodass diese problemlos hergestellt
werden können.
Geeignete Kultivierungsmedien sind darüber hinaus kommerziell verfügbar.
-
Anordnen von Nukleinsäuren als Array
-
Nukleinsäuren können als
Array angeordnet werden, indem eines von einer Vielzahl von verschiedenen
Verfahren verwendet wird, abhängig
davon, ob die Nukleinsäuren
als solche oder als Bestandteil innerhalb von Zellen als Array angeordnet
werden.
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(a) Synthese von Nukleinsäurearrays
-
Arrays
aus Nukleinsäuren
können
durch direkte chemische Synthese von Nukleinsäuremolekülen hergestellt werden. Die
chemische Synthese umfasst die Synthese von Arrays aus Nukleinsäuren auf einer
Oberfläche
in einer Weise, bei der jede unterschiedliche Nukleinsäure (z.
B. einzeln vorkommende Nukleinsäuresequenz)
an einem getrennten, vorbestimmten Ort in dem Array platziert wird.
Die Identität
jeder Nukleinsäure
wird durch die räumliche
Lokalisierung im Array identifiziert. Diese Verfahren sind ausgehend
von denjenigen angepasst, die in
US-Patent
Nr. 5,143,854 ;
WO 90/15070 und
WO 92/10092 ; Fodor et al.
(1991) Science, 251: 767; Dower und Fodor (1991) Ann. Rep. Med.
Chem., 26: 271 beschrieben sind.
-
(b) Anordnen von Zellen als Array
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In
einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung können Arrays
aus Nukleinsäuren durch
Anordnen von Zellen als Array hergestellt werden. Obwohl Zellen
problemlos auf einem Filter ausgestrichen und angezüchtet werden
können,
der auf einem bakteriellen Wachstumsmedium platziert ist, ist es
vorteilhaft, Zellen durch robotergestütztes Picking als Array anzuordnen,
da robotergestützte
Verfahren die genaueste und dichteste Raster aus Zellkolonien ermöglichen;
es sind jedoch beliebige Verfahren, einschließlich manueller Verfahren,
verwendbar, die für
die Lokalisierung von Zellen oder Kolonien von Zellen an getrennten
Orten auf einem Träger geeignet
sind.
-
Das
Rastern von Zellen kann regulär
sein, sodass jede Kolonie sich in einem bestimmten Abstand von der
nächsten
befindet, oder es kann zufällig
verteilt ist. Wenn die Kolonien auf Zufallsbasis voneinander beabstandet
werden, kann ihre Dichte angepasst werden, um die Wahrscheinlichkeit
von Kolonien, die auf dem gewählten
Träger überlappen, statistisch
zu verringern oder zu eliminieren.
-
-
(c) Anordnen von Antikörpern als Array
-
Antikörper können durch
robotergestütztes Rastern
als Array angeordnet werden, wobei eine kommerzielle Technologie
verwendet wird, wie sie allgemein im Stand der Technik verfügbar ist,
oder sie können
in situ von als Array angeordneten Antikörper-produzierenden Zellen
exprimiert werden, die beispielsweise wie oben beschrieben als Array
angeordnet wurden. Die robotergestützte Arraybildung ist im Stand
der Technik hinreichend bekannt, und Geräte sind von Firmen wie Genetix,
Genetic MicroSystems und BioRobotics verfügbar, wobei diese in der Lage
sind, mit einer hohen Geschwindigkeit und einer großen Genauigkeit
Arrays über
eine kleine oder über
eine große
Oberfläche
zu bilden. Solche Geräte sind
in der Lage, gereinigtes Protein, Überstand oder Zellen auf poröse oder
nicht-poröse
Oberflächen
aufzutropfen, sodass diese anschließend auf diesen befestigt werden
können,
sofern dies notwendig ist, um stabile Arrays zu bilden. Die Arrays
können
falls erforderlich repliziert werden, um das gleichzeitige Screening
mit mehreren Zielliganden zu ermöglichen.
Auf Zellen basierende Arrays können
lysiert werden, um die Polypeptide in situ freizusetzen und/oder
exprimierte Polypeptide können
an den festen Träger
nach bekannten Verfahren fixiert werden.
-
Selektion von Polypeptiden, die an Zielmoleküle gebunden
haben
-
Wie
oben aufgeführt
können
die Zielmoleküle
in der Lage sein, mit Mitgliedern einer Polypeptidgruppe spezifisch
zu interagieren, oder sie können
zu einer generischen Interaktion in der Lage sein. Zielmoleküle, die
in der Lage sind, spezifisch zu interagieren, werden lediglich mit
denjenigen Polypeptiden interagieren, die eine erwünschte,
aus der Gruppe zu selektierende Aktivität aufweisen. Solche Zielmoleküle umfassen
spezifische Antigene für
Antikörper oder
Substrate für
Enzyme.
-
Zielmoleküle, die
in der Lage sind, eine generische Interaktion einzugehen, werden
im allgemeinen mit einer vergleichsweise größeren Teilmenge der Gruppe,
welche eine erwünschte
Eigenschaft hat, interagieren, beispielsweise mit funktionellen Mitgliedern,
die korrekt gefaltet sind oder auf andere Weise theoretisch in der
Lage sind, eine Funktion auszuüben.
Insbesondere Verwendung von spezifischen und generischen Liganden
für Antikörperpolypeptide
ist ausführlich
in der internationalen Patentanmeldung
WO 99/20749 beschrieben.
-
Sobald
die Antikörper-Polypeptide
die Zielmoleküle
gebunden haben, können
sie unter Verwendung von verschiedenen generischen Liganden, die
von der Art der verwendeten Zielmoleküle abhängen, detektiert werden. Wenn
somit das Zielmolekül ein
Antigen ist, kann markiertes Protein L für die Detektion von spezifischen
bindenden Mitgliedern der Gruppe verwendet werden, wohingegen markiertes Protein
A zur Detektion von funktionellen Mitgliedern der Gruppe verwendet
werden kann, wenn das Zielmolekül
Protein L ist.
-
Generische
Liganden können
die Form von Superantigenen annehmen, wie beispielsweise Protein
A oder Protein L oder geeignete Antikörpermoleküle. Wenn ein geeigneter Antikörper nicht öffentlich verfügbar ist,
kann er durch Phagendisplayverfahren oder wie nachfolgend erläutert hergestellt
werden.
-
Rekombinante
Proteine oder Proteine, die von natürlichen Quellen stammen, können verwendet
werden, um Antikörper
unter Verwendung von Standardverfahren, die im Stand der Technik
hinreichend bekannt sind, zu erzeugen. Beispielsweise wird das Protein
(oder "Immunogen") verabreicht, um in
einem Säugetier,
wie beispielsweise in einem Affen, einer Ziege, einem Kaninchen
oder einer Maus eine Reaktion auszulösen. Die resultierenden Antikörper können als
polyklonale Seren oder als Antikörper-produzierende
Zellen von dem Tier, in dem die Reaktion ausgelöst wurde, eingesammelt und
immortalisiert werden (z. B. durch Fusion mit einem immortalisierten
Fusionspartner, wobei ein Hybridom gebildet wird), wobei die Zellen
anschließend
monoklonale Antikörper
produzieren.
-
(a) Polyklonale Antikörper
-
Das
Antigen-Protein wird entweder allein verwendet oder an einen herkömmlichen
Träger
konjugiert, um seine Immunigenizität zu erhöhen, und ein Antiserum gegen
das Peptid-Träger-Konjugat
wird wie oben beschrieben in einem Tier erzeugt. Die Kopplung eines
Peptids an ein Trägerprotein
und die Immunisierungen können
wie beschrieben durchgeführt
werden ((Dymecki et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 4815). Das Serum
wird gegen das Protein-Antigen in einem ELISA oder alternativ mittels
Dot-Blot oder Spot-Blut
titriert (Boersma und Van Leeuwen (1994) J. Neurosci. Methods. 51:
317). Es zeigt sich, dass das Serum stark mit geeigneten Peptiden
in einem ELISA reagiert, beispielsweise nach dem Verfahren von Green
et al. (1982) Cell. 28: 477.
-
(b) Monoklonale Antikörper
-
Verfahren
zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind hinreichend bekannt,
und monoklonale Antikörper
können
unter Verwendung von beliebigen Kandidaten-Antigenen hergestellt
werden, vorzugsweise gebunden an einen Träger, wie es beispielsweise
von Arnheiter et al. (1981) Nature, 294, 278, beschrieben wird.
Monoklonale Antikörper
werden üblicherweise
von Hybridom-Gewebekulturen oder von Aszitesflüssigkeit erhalten, die von
Tieren erhalten wird, in die das Hybridomgewebe eingebracht wurde.
Dennoch können
monoklonale Antikörper
dadurch beschrieben werden, dass sie "gegen ein Protein erzeugt" oder "von einem Protein
induziert" wurden.
-
Nach
ihrer Erzeugung werden monoklonale Antikörper durch ein beliebiges von
mehreren Mitteln auf ihre Funktion und Spezifi tät getestet. Ähnliche Vorgehensweisen
können
auch verwendet werden, um rekombinante Antikörper zu testen, die durch Phagendisplay
oder durch andere in vitro Selektionsverfahren produziert wurden.
Hybridome, die monoklonale Antikörper
(oder polyklonale Seren) produzieren, können ebenfalls in einem Screening
auf einer Antikörperbindung
an das Immunogen untersucht werden. Besonders bevorzugte immunologische Tests
umfassen Enzym-gebundene Immunassays (ELISA), Immunblot und Immunpräzipitation
(siehe Voller, (1978) Diagnostic Horizons, 2: 1, Microbiological
Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller et al.
(1978) J. Clin. Pathol., 31: 507;
US-Reissue
Pat. Nr. 31,006 ;
GB-Patent
2,019,408 ; Butler (1981) Methods Enzymol., 73: 482; Maggio,
E. (Hrsg.), (1980) Enzyme Immunoassay., CRC Press, Boca Raton, FL)
oder Radioimmunassays (RIA) (Weintraub, B., Principles of radioimmunoassays, Seventh
Training Course an Radioligand Assay Techniques; The Endocrine Society,
März 1986,
Seiten 1-5, 46-49 und 68-78), wobei alle der Detektion einer Bindung
des Antikörpers
an das Immunogen dienen, gegen das dieser erzeugt wurde. Es wird dem
Fachmann ersichtlich sein, dass entweder das Antikörpermolekül oder das
Immunogen markiert sein müssen,
um eine solche Detektion zu ermöglichen.
Techniken zur Markierung von Antikörpermolekülen sind dem Fachmann hinreichend
bekannt (siehe Harlour und Lane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor
Laboratory, Seiten 1-726).
-
Alternativ
dazu können
andere Verfahren verwendet werden, um die Bindung an das Immunogen
zu detektieren, wobei die Integrität des Antikörpers bestätigt wird. Diese umfassen chromatographische
Verfahren, wie beispielsweise SDS-PAGE, isoelektrische Fokussierung,
Western-Blot, HPLC und Kapillarelektrophorese.
-
"Antikörper" werden vorliegend
als Konstruktionen definiert, welche die bindende (variable) Region
eines solchen Antikör pers
und weitere Antikörpermodifikationen
verwenden. Somit kann ein im Rahmen der Erfindung nützlicher
Antikörper
vollständige Antikörper, Antikörperfragmente,
polyfunktionelle Antikörperaggregate
oder allgemein eine beliebige Substanz umfassen, die ein oder mehrere
spezifische Bindungsstellen von einem Antikörper umfasst. Die Antikörperfragmente
können
Fragmente sein, wie beispielsweise Fv-, Fab- und F(ab')2-Fragmente oder beliebige
Derivate davon, wie beispielsweise ein einzelkettiges Fv-Fragment.
Die Antikörper
oder Antikörperfragmente
können
nicht-rekombinant, rekombinant oder humanisiert sein. Der Antikörper kann von
jedem Immunglobulin-Isotyp sein, z. B. IgG, IgM, usw. Darüber hinaus
können
Aggregate, Polymere, Derivate und Konjugate von Immunglobulin oder
deren Fragmenten verwendet werden, sofern dies geeignet erscheint.
-
Sonden
für die
Detektion von gebundenem Immunglobulin können nach im Stand der Technik bekannten
Verfahren markiert werden, wobei diese entweder generische Liganden
oder spezifische Antigene sein können.
Verfahren zur Markierung von Sonden werden beispielsweise in Sambrook,
J., Fritsch, E. F. & Maniatis,
T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, N.Y.) oder Ausubel, et al., Hrsg. (1990) Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Inc., beschrieben.
-
Verwendung von Polypeptiden die gemäß der vorliegenden
Erfindung selektiert werden
-
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren selektierte
Polypeptide können
im Wesentlichen in einem beliebigen Verfahren verwendet werden.
Wenn die Polypeptide Antikörper-Polypeptide
sind, können sie
in einem beliebigen Verfahren verwendet werden, das eine Liganden-Polypeptid-Bindung
umfasst, einschließlich
therapeutischer und prophylaktischer Anwendungen in vivo, diagnostischen
Anwendungen in vitro und in vivo, in einem in vitro-Assay und in Reagenzapplikationen
und Ähnlichen.
Beispielswei se können
im Falle von Antikörpern
Antikörpermoleküle in auf
Antikörpern
basierenden Assay-Verfahren verwendet werden, z. B. als ELISA-Methoden,
nach den im Stand der Technik bekannten Verfahren.
-
Wie
oben erwähnt
sind die Moleküle,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung selektiert werden, bei diagnostischen, prophylaktischen
und therapeutischen Verfahren nützlich.
Beispielsweise können
Enzymvarianten, die durch diese Verfahren erzeugt und selektiert
werden, auf ihre Aktivität
untersucht werden, entweder in vitro oder in vivo unter Verwendung von
im Stand der Technik bekannten Verfahren, bei denen sie mit Kandidatensubstratmolekülen inkubiert werden,
und die Umsetzung des Substrats zum Produkt analysiert wird. Selektierte
Zelloberflächenrezeptoren
oder Adhäsionsmoleküle können in
kultivierten Zellen exprimiert werden, die anschließend auf
ihre Fähigkeit
untersucht werden, auf biochemische Stimuli zu reagieren, oder auf
ihre Affinität
mit anderen Zelltypen, welche Zelloberflächenmoleküle exprimieren, von denen angenommen
wird, dass das unveränderte
Adhäsionsmolekül daran
binden würde.
Antikörperpolypeptide,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung selektiert werden, sind in Western-Analysen und bei der
in situ-Proteindetektion durch
immunhistochemische Standardverfahren diagnostisch nützlich;
für die
Verwendung in diesen Anwendungen können die Antikörper einer
ausgewählten
Gruppe mit im Stand der Technik bekannten Verfahren markiert werden.
Darüber
hinaus können
solche Antikörperpolypeptide
in präparativen
Affinitätschromatographieverfahren
verwendet werden, wenn sie an einen chromatographischen Träger komplexiert
werden, wie beispielsweise an eine Säule. All diese Verfahren sind
dem Fachmann bekannt.
-
Therapeutische
und prophylaktische Verwendungen von Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren
selektiert wurden, umfassen die Verabreichung von erfindungsgemäß selektierten Polypeptiden
an einen Empfängersäugetier,
wie beispielsweise einen Menschen. Von besonderer Verwendung in
dieser Hinsicht sind Antikörper,
andere Rezeptoren (einschließlich,
jedoch nicht beschränkt auf
T-Zellrezeptoren) und in dem Falle, dass ein Antikörper oder
ein Rezeptor entweder als generischer Ligand oder als Zielligand
verwendet wurde, Proteine, die an diese binden.
-
Im
Wesentlichen reine Antikörper
oder bindende Proteine davon mit mindestens 90 bis 95% Homogenität sind für die Verabreichung
an ein Säugetier
bevorzugt, und 98 bis 99% oder mehr Homogenität ist für pharmazeutische Verwendungen
am meisten bevorzugt, insbesondere wenn das Säugetier ein Mensch ist. Sobald
die selektierten Polypeptide aufgereinigt sind (je nach Wunsch partiell
oder bis zur Homogenität),
können
diese diagnostisch oder therapeutisch (einschließlich extrakorporal) oder bei der
Entwicklung und Durchführung
von Assayverfahren, Immunfluoreszenzfärbung und Ähnlichem verwendet werden (Lefkovite
und Pernis (1979 und 1981) Immunological Methods, Bände I und
II, Academic Press, NY).
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Die
nach den erfindungsgemäßen Verfahren selektierten
Antikörper
oder bindenden Proteine davon werden typischerweise Verwendung bei
der Vorbeugung, Suppression oder Behandlung von inflammatorischen
Zuständen,
allergischer Hypersensitivität,
Krebs, bakteriellen und viralen Infektionen und Autoimmunerkrankungen
(einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Diabetes Typ I, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, systemischer
Lupus erythematosus, Morbus Crohn und Myasthenia gravis).
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Im
Rahmen der vorliegenden Anmeldung umfasst der Begriff "Vorbeugung" die Verabreichung einer
schützenden
Zusammensetzung vor der Induktion der Erkrankung. "Suppression" bezieht sich auf die
Verabreichung einer Zusammensetzung nach dem indukti ven Ereignis,
jedoch vor dem klinischen Auftreten der Erkrankung. "Behandlung" betrifft die Verabreichung
einer schützenden
Zusammensetzung, nachdem die Krankheitssymptome offensichtlich geworden
sind.
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Tiermodellsysteme
können
verwendet werden, um die Wirksamkeit der Antikörper oder der bindenden Proteine
davon beim Schutz vor der Erkrankung oder bei der Behandlung der
Erkrankung verwendet werden. Verfahren zur Untersuchung von systemischem
Lupus erythematosus (SLE) in empfindlichen Mäusen sind im Stand der Technik
bekannt (Knight et al. (1978) J. Exp. Med., 147: 1653; Reinersten
et al. (1978) New Eng. J. Med., 299: 515). Myasthenia gravis (MG)
wird in weiblichen SJL/J Mäusen
durch Induzieren der Erkrankung mit löslichem AchR-Protein aus anderen
Spezies untersucht (Lindstrom et al. (1988) Adv. Immunol., 42: 233).
Arthritis wird in einem empfindlichen Mäusestamm durch Injektion von
Kollagen Typ II induziert (Stuart et al. (1984) Ann. Rev. Immunol.,
42: 233). Es ist ein Modell beschrieben worden, durch das eine adjuvante
Arthritis in empfindlichen Ratten durch Injektion von Hitzeschockprotein
aus Mycobakterien induziert wird (Van Eden et al. (1988) Nature,
331: 171). Thyroiditis wird in Mäusen
durch Verabreichung von Thyreoglobulin induziert, wie es beschrieben
ist (Maron et al. (1980) J. Exp. Med., 152: 1115). Insulin-abhängige Diabetes
mellitus (IDDM) tritt natürlicherweise auf
oder kann in bestimmten Mäusestämmen induziert
werden, wie beispielsweise in denjenigen, die von Kanasawa et al.
(1984) Diabetologia, 27: 113 beschrieben wurden. EAE in Mäusen und
Ratten dient als Modell für
MS in Menschen. In diesem Modell wird die demyelinisierende Erkrankung
durch Verabreichung von Myelin-Basisprotein (siehe Paterson (1986)
Textbook of Immunopathology, Mischer et al., Hrsg., Grune und Stratton,
New York, Seiten 179-213; McFarlin et al. (1973) Science, 179, 478; und
Satoh et al. (1987) J. Immunol., 138: 179) induziert.
-
Die
durch die erfindungsgemäßen Verfahren selektierten
Antikörper,
Rezeptoren (einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf T-Zellrezeptoren) oder bindenden Proteine davon können in
Kombination mit anderen Antikörpern,
insbesondere mit monoklonalen Antikörpern (mAbs), verwendet werden,
die reaktiv mit anderen Markern auf humanen Zellen sind, welche
für die
Erkrankung verantwortlich sind. Beispielsweise können geeignete T-Zellmarker
diejenigen umfassen, die in die sogenannten "Clusters of Differentiation" gruppiert wurden,
wie sie durch den ersten internationalen Workshop der Leukozyten-Differenzierung
benannt wurden (Bernhard et al. (1984) Leukocyte Typing, Springer
Verlag, NY).
-
Im
Allgemeinen werden die vorliegend selektierten Antikörper, Rezeptoren
oder bindenden Proteine in aufgereinigter Form zusammen mit pharmakologisch
geeigneten Trägern
verwendet werden. Üblicherweise
umfassen diese Träger
wässrige
oder alkoholische/wässrige
Lösungen,
Emulsionen oder Suspensionen, von denen jede Salzlösungen und/oder
gepufferte Medien enthält.
Parenterale Vehikel umfassen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose
und Natriumchlorid und mit Laktat versetzte Ringerlösung. Geeignete
physiologisch akzeptable Adjuvantien (sofern diese notwendig sind um
den Polypeptidkomplex in Suspension zu halten) können aus Verdickern wie beispielsweise
Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und Alginaten
ausgewählt
werden.
-
Intravenöse Vehikel
umfassen Flüssigkeit und
Nährstoff-Ergänzungslösungen und
Elektrolyt-Ergänzungslösungen,
wie beispielsweise diejenigen, die auf Ringer-Dextrose basieren.
Konservierungsstoffe und andere Zusätze, wie beispielsweise antimikrobielle
Substanzen, Antioxidantien, chelatierende Mittel und inerte Gase
können
ebenfalls vorhanden sein (Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage).
-
Die
selektierten Polypeptide können
als separat verabreichte Zusammensetzungen oder in Zusammenhang
mit anderen Mitteln verwendet werden. Diese können verschiedene immuntherapeutische Wirkstoffe,
wie beispielsweise Cyclosporin, Methotrexat, Adriamycin oder Cisplatin
und Immunotoxine umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen können "Cocktails" aus verschiedenen
zytotoxischen Mitteln oder anderen Mitteln in Kombination mit den erfindungsgemäß selektierten
Antikörpern,
Rezeptoren oder bindenden Proteinen davon umfassen, oder sogar Kombinationen
aus erfindungsgemäß selektierten
Polypeptiden mit verschiedenen Spezifitäten, wie beispielsweise Polypeptiden,
die unter Verwendung verschiedener Zielliganden selektiert wurden, unabhängig davon,
ob sie vor der Verabreichung vereinigt werden.
-
Die
Verabreichungsart der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann eine
beliebige der Verabreichungsarten sein, die dem Fachmann bekannt
sind. Für
die Therapie (die ohne Einschränkung
eine Immuntherapie einschließt)
können
die selektierten erfindungsgemäßen Antikörper, Rezeptoren
oder bindenden Proteine davon nach Standardverfahren an einen beliebigen
Patienten verabreicht werden. Die Verabreichung kann nach einer
beliebigen, geeigneten Methode erfolgen, einschließlich parenteral,
intravenös,
intramuskulär,
intraperitoneal, transdermal, pulmonal oder auch (sofern geeignet) durch
direkte Infusion mit einem Katheter. Die Dosierung und Frequenz
der Verabreichung wird vom Alter, Geschlecht und Zustand des Patienten
abhängen, von
einer gleichzeitigen Verabreichung anderer Wirkstoffe, von Gegenindikationen
und anderen Parametern, die vom Arzt in Betracht gezogen werden
müssen.
-
Die
selektierten Polypeptide können
für die Lagerung
lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert
werden. Es hat sich gezeigt, dass diese Methode bei herkömmlichen Immunglobulinen
wirksam ist, und es können
im Stand der Technik bekannte Verfahren der Lyophilisation und Rekonstitution
verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Lyophilisation und
Rekonstitution zu unterschiedlichen Ausmaßen von Aktivitätsverlust
in Bezug auf den Antikörper
führen
können
(beispielsweise tendieren bei herkömmlichen Immunglobulinen IgM-Antikörper zu
einem größeren Aktivitätsverlust
als IgG-Antikörper),
und dass die verwendeten Mengen nach oben angepasst werden müssen, um
dies auszugleichen.
-
Die
Zusammensetzungen, welche die vorliegend selektierten Polypeptide
oder einen Cocktail davon umfassen, können für prophylaktische und/oder
therapeutische Behandlungen verabreicht werden. In bestimmten therapeutischen
Applikationen ist eine geeignete Menge zur Erreichung einer mindestens
partiellen Inhibierung, Suppression, Modulation, Abtötung oder
weiterer anderer messbarer Parameter einer Population von selektierten
Zellen als eine "therapeutisch
wirksame Dosis" definiert. Mengen,
die benötigt
werden, um diese Dosierung zu erreichen, werden von der Schwere
der Erkrankung und vom allgemeinen Zustand des Immunsystems des
Patienten abhängen;
sie werden jedoch im Allgemeinen von 0,005 bis 5,0 mg des selektierten
Antikörpers,
Rezeptors (z. B. ein T-Zellrezeptor) oder der bindenden Proteinen
davon pro Kilogramm Körpergewicht
betragen, wobei Dosen von 0,05 bis 2,0 mg/kg/Dosis häufiger Verwendung
finden werden. Für
prophylaktische Applikationen können
die Zusammensetzungen, welche die vorliegend selektierten Polypeptide
oder Cocktails davon umfassen ferner in ähnlichen oder geringfügig niedrigeren
Dosierungen verabreicht werden.
-
Eine
Zusammensetzung, die ein Polypeptid umfasst, welches nach einem
Verfahren der vorliegenden Erfindung selektiert wurde, kann unter
prophylaktischen und therapeutischen Bedingungen verwendet werden,
um bei der Veränderung,
Inaktivierung, Abtötung
oder Entfernung einer ausgewählten
Zielzellpopulation in einem Säugetier
zu helfen. Darüber
hinaus können
die vorlie gend beschriebenen selektierten Gruppen von Polypeptiden
extrakorporal oder in vitro selektiv verwendet werden, um eine Zielzellpopulation
aus einer heterogenen Sammlung von Zellen abzutöten, zu entreichern oder in
anderer Weise wirksam zu entfernen. Blut aus einem Säugetier
kann extrakorporal mit selektierten Antikörpern, Zell-Oberflächenrezeptoren
oder bindenden Proteinen davon kombiniert werden, wodurch die unerwünschten
Zellen abgetötet
oder in anderer Weise aus dem Blut entfernt werden, wobei das Blut
dem Säugetier
gemäß Standardverfahren
zurückgeführt wird.
-
Die
Erfindung wird lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung in den
folgenden Beispielen weiter beschrieben.
-
Beispiel 1:
-
Selektion von scFv-Polypeptiden
-
Wir
haben eine scFv-Bibliothek verwendet, die auf einer einzelnen Ansammlung
(fold) beruhte, welche hinsichtlich der Bindung an den Zielliganden durch
eine Runde Phagenselektion entweder mit BSA, einer Mischung von
ungereinigten rekombinanten Proteinen oder einem HeLa-Gesamtzelllysat
angereichert wurde. Diese Antikörperansammlung
bindet an beide generischen Liganden, die Proteine L und A. Wir
haben ein Zweifilterverfahren verwendet, in dem Bakterien auf einem
Filter angezüchtet
werden, und die ausgeschiedenen scFvs auf einem anderen Filter eingefangen
werden. Das Zielmolekül auf
dem Filter war entweder das Antigen, das für die Selektion verwendet wurde,
ein anderes (möglicherweise
verwandtes) Antigen oder Protein L. Somit richtet sich das Screening
entweder auf spezifische Ziel-bindende Antikörper (in diesem Fall verwendete die
Detektion von gebundenem Antikörper
Protein L-HRP) oder im letztgenannten Fall auf funktionelle und
gut exprimierte Antikörper
(in diesem Fall verwendete die Detektion von gebundenem Antikörper Protein
A-HRP). Spezifische Antigen-bindende Moleküle, die 0,1 bis 1% der Bibliothek
ausmachen, wurden in allen Fällen
identifiziert, wobei zwischen 5–50%
als funktionell und hinreichend exprimiert detektiert wurden, was
unter Verwendung des generischen Liganden als Zielmolekül bestimmt
wurde.
-
Verfahren
-
Proteine
-
Fünf Klone,
von denen zwei keine bekannte Funktion aufwiesen (C und M), ein
humanes Chloridionenstrominduktionsprotein (D) und α-2-Globin
(H) und Ubiquitin (T) wurden aus der humanen cDNA-Bibliothek des
Gehirns hEXI (Bussow et al., 1998) genommen und wie beschrieben
exprimiert (Lueking et al., 1999). Ungereinigte Zelllysate wurden
gesammelt und für
die Selektion verwendet. Die Expressionsmengen jedes Klons wurden
durch Transfer von seriellen Verdünnungen jedes Lysats in ein Dot-Blot-Gerät und Immobilisierung
auf einer Nitrocellulosemembran bestimmt. Dieser Filter wurde in 2%
Magermilchpulver PBS (MPBS) für
30 Minuten geblockt und dreimal mit PBS gewaschen. Rekombinantes
Protein wurde mit Anti-RGS-His-Antikörper (Qiagen: 1/2000 in 2%
MPBS) gefolgt von Anti-Maus-HRP-Antikörper (Dako: 1/2000 in 2% MPBS) detektiert
und mit chemilumineszenten Detektionsreagenz (ECL, Amersham) entwickelt. Äquimolare Mengen
jedes Proteins wurden bei jeder Selektion gemischt und 10- 100-
und 1000-fache Verdünnungen
davon wurden erzeugt.
-
Phagenbibliothek
-
Die
Bibliothek, die wir verwendet haben, basiert auf einem einzelnen
humanen Grundgerüst
für VH (V3-23/DP-47 und JH4b)
und Vκ (O12/O2(DPK9 und
Jκ1)
mit einer Seitenkettendiversität
(kodierend für
NNK oder DVT), welche an Positionen der Antigenbindungsstelle eingebaut
ist, die anhand von bekannten Strukturen zu dem Antigen Kontakt
aufnehmen und in der reifen Gruppe stark divers sind. Die Ansammlung,
die verwendet wird, wird häufig
in vivo exprimiert und bindet an die generischen Bin dungsliganden
Protein L und A, die das Einfangen oder die Detektion der scFvs
ermöglichen
und nicht mit der antigenen Bindungsstelle interferieren. Die Bibliotheken
sind im Phagemid/scFv-Format auf die Bindung an Protein A und Protein
L in einem Vorscreening untersucht worden, sodass die Mehrzahl der
Klone in den unselektierten Bibliotheken funktionell sind (Tomlinson
et al. unveröffentlichte
Ergebnisse). Diese Bibliothek wurde im Wesentlichen ausgewählt, wie
es beschrieben worden ist (Marks et al., 1991), außer dass
KM13-Helferphage (der das Gen 3-Protein mit Proteasespaltstelle
enthält)
verwendet wurde, und die Phagen mit Trypsin eluiert wurden. Dies
spaltet alle Gen 3-Proteine, die keine scFv-Fusionen aufweisen,
was dazu führt,
dass der Hintergrund der Phageninfektion entfernt wird, und die
Phagen mit scFv-Fusion durch proteolytische Spaltung im c-myc-tag
(Kristensen & Winter,
1998) eluiert werden. Eine Runde Selektion wurde auf Immunröhrchen (Nunc,
Maxisorp) durchgeführt,
die mit BSA beschichtet waren (10 μg/ml PBS), mit einer Mischung aus
fünf ungereinigten
rekombinanten Proteinen (C, D, H, M oder T, jedes bei 100 μg/ml oder
bei einer 10-fachen Verdünnungen
davon) oder mit einem Lysat aus HeLa-Zellen (100 μg/ml) (Verheijen
et al., 1990).
-
Rastern/Picking
-
Die
selektierte Bibliothek wurde auf eine große rechteckige Platte (230 × 230 mm,
Nunc Platten, die TYE, 100 μg/ml
Ampicillin, 1% Glucose enthielten) mit 104-Kolonien/Platte
ausplattiert und o/n bei 30°C
angezüchtet.
Die Kolonien wurden in Platten mit 384 Vertiefungen (Genetix, enthaltend
2 × TY,
100 μg/ml
Ampicillin, 1% Glucose, 8% Glycerol) gepickt (Bio-Robotics Kolonie-Picker)
und über
Nacht bei 37°C
angezüchtet.
Die Platten wurden entweder direkt verwendet oder eingefroren und
bei –70°C gelagert.
Die Platten mit 384 Vertiefungen wurden auf einer großen rechteckigen
Platte (Genetix Q-tray, enthaltend TYE, 100 μg/ml Ampicillin, 1% Glucose),
die mit einem Nitrocellulosefilter bedeckt war (Schleicher & Schuell), in ein
4 × 4
Muster aus Duplikat-Klonen gerastert (gridding) (Genetix, Q-bot).
Vor dem Transfer auf die Platte wurde dieser Filter in 2% Magermilchpulver
PBS (MPBS) für
30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) geblockt, kurz in PBS gewaschen und
in 2 × TY
getränkt.
Die gerasterten Platten wurden über
Nacht bei 37°C
angezüchtet.
In der Zwischenzeit wurden weitere Nitrocellulosefilter mit 0,5 μg/ml Protein
L (Actigen), 100 μg/ml
bovinem Serumalbumin (BSA), humanem Serumalbumin (HSA), den bakteriellen
Proteinen C, D, H, M oder T oder mit HeLa-Zellprotein (von 107-Zellen, (Verheijen et al., 1990)) in 100
ml PBS über
Nacht bei 4°C
beschichtet. Dieser Filter wurde in 2% MPBS für 1 Stunde bei RT geblockt,
3 × in
PBS gewaschen, in 2 × PY
getränkt und
anschließend
auf eine große
rechteckige Platte (230 × 230
mm, Nunc Platten, enthaltend TYE, 100 μg/ml Ampicillin, 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG)) überführt. Der
zweite Filter, der die Kolonien enthielt, wurde auf die Platte überführt, welche
mit dem ersten Zielmolekülfilter
bedeckt war. Diese Platten wurden für drei Stunden bei 30°C inkubiert.
Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist gezeigt (1).
-
Untersuchungen der Filter
mit einer Sonde
-
Der
obere Filter wird entfernt, und der untere Filter wurde dreimal
mit PBS/0,05% Tween (PEST) gewaschen und mit 2% MPBS für 30 Minuten
bei Raumtemperatur geblockt. Die Filter wurden dreimal mit PEST
gewaschen. Im Falle einer spezifischen Antigenbindung wurden die
Filter mit Protein-L-HRP-Konjugat (Actigen 1/4000) in 2% MPBS für eine Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert. Im Falle des generischen Assays wurden
die Filter wie oben beschrieben verarbeitet, mit der Ausnahme, dass nach
dem Blocken die Filter mit Protein A-HRP-Konjugat (Amersham 1/5000)
inkubiert wurden. Die Filter wurden dreimal mit PEST gewaschen und
mit Streptavidin-HRP (Pierce) 1/5000 in PEST für 15 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Filter wurden ge waschen und mit ECL-Reagenz entwickelt.
Alle Inkubationen wurden in 50 ml Puffer auf einem sich leicht bewegenden
Schüttler
durchgeführt.
-
ELISA
-
Um
zu bestimmen, ob Klone, die unter Verwendung des direkten Capture-Screenings
identifiziert wurden, in einem herkömmlichen ELISA an BSA binden,
wurde 2 × TY,
das 100 μg/ml
Ampicillin und 0,1% Glucose enthielt, mit 1/100 Volumen einer Übernacht-Kultur inokuliert.
Diese wurde bei 37°C angezüchtet, bis
eine OD600 von ungefähr 0,9 erreicht wurde. Es wurde
1 mM IPTG zugesetzt, und die Kulturen wurden bei 30°C über Nacht
geschüttelt.
Die Kulturen wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden in einem ELISA verwendet.
Eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit 10 μg/ml BSA über Nacht
bei 4°C
beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit
2% Tween/PBS für zwei
Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Die Platten wurden dreimal
mit PBS gewaschen, und 50 μl Überstand
wurden mit 50 μl
mit 2% Tween/PBS für 1,5
Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal mit
PEST gewaschen und mit Protein-L-HRP-Konjugat (1/4000 in 2% Tween/PBS) für eine Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden fünfmal mit
PEST gewaschen, und die Reaktionen wurden mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
entwickelt und mit Schwefelsäure
abgestoppt.
-
Sequenzierung
-
PCR-Produkte,
die mit LMB3 (CAG GAA ACA GCT ATG AC) und pHEN seq (CTA TGC GGC CCC
ATT CA) amplifiziert wurden und unter Verwendung von PCR-Aufreinigungssäulen (Qiagen,
CA) gereinigt wurden, wurden als Matrize für die Sequenzierung verwendet.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit den Primern LMB3 für die schweren
Ketten und pHEN seq für
die leichten Ketten durchgeführt,
wobei ein "ABI PRISM
Big Dye Terminator Cycle"-Sequenzierungskit
(Perkin Elmer, CA) verwendet wurde. Die Reaktionen wurden auf einem
automatischen Sequenziergerät
durchgeführt
(Applied Biosystems 373A, Perkin Elmer).
-
Ergebnisse
-
Um
eine scFv Phagemid-Bibliothek zu erhalten, die im Hinblick auf bindende
Moleküle
gegen den Zielliganden durch eine Runde Phagenselektion angereichert
war, wurde eine Bibliothek verwendet, die mit einem gereinigten
Antigen (BSA) selektiert war. Unter Verwendung von Robotergeräten wurden
8448 Klone (22 Platten mit 384 Vertiefungen) gepickt und gerastert
(gridding), eine Zahl, die fast alle erhaltenen Klone umfaßte, welche
nach einer Runde Selektion vorhanden waren (ungefähr 104 Phagen wurden eluiert). Um den Anteil von
Klonen zu bestimmen, die funktionelle scFvs exprimieren, wurden
scFvs mit einem mit Protein L beschichteten Filter eingefangen und
mit Protein A-HRP-Konjugat
detektiert. Dies zeigte, dass etwa 50% der Klone funktionell waren und
gut exprimiert wurden (2). Um spezifisch bindende Klone
sowie auch kreuzreaktive Klone zu identifizieren, wurde ein Screening
mit BSA, HSA und einer Mischung von irrelevanten Proteinen (HeLa-Zellproteine)
durchgeführt.
BSA, HSA oder HeLa-Zellproteine wurden auf den Filter geschichtet
und bindende scFvs wurden mit Protein-L-Konjugat detektiert. Eine
typische Gruppe von scFvs, die als Array angeordnet sind, und ihre
Reaktivität
mit BSA und HSA ist in 2B bzw. 2C gezeigt. Wir haben herausgefunden, dass
50 der 8448 als Array angeordneten Klone BSA erkennen. Es wurde
herausgefunden, dass einer dieser 50 auch HSA erkennt und ein Klon mit
einem Protein in HeLa-Zellen reagierte (Daten nicht gezeigt). Eine
große
Anzahl von Klonen, die BSA oder HSA nicht erkannten, erkannte Proteine, die
in einem Extrakt von HeLa-Zellen
vorhanden sind (Daten nicht gezeigt), was auf die Selektion von "klebrigen" Klonen hinweist.
Somit ermöglichte
die Verwendung eines parallelen direkten Screenings auf verschiedene
Zielmoleküle
die Identifizierung von BSA-spezifischen Antikörpern, Antikörpern, die
sowohl BSA als auch HSA binden und nicht stark kreuzreaktiv sind,
kreuzreaktiven (klebrigen) Antikörpern und
Antikörpern,
die keines der Zielmoleküle
binden.
-
Um
ferner zu bestätigen,
ob die BSA-positiven Klone spezifisch waren, wurden sie in einem
ELISA auf die Bindung an BSA untersucht. Die meisten dieser Klone
waren tatsächlich
positiv im ELISA, und von diesen Klonen wurden 16 weitere durch
Sequenzierung charakterisiert. Klone, die BSA im ELISA nicht erkannten,
exprimierten scFv in geringen Mengen oder hatten kein Insert vollständiger Länge. Die positive
Identifizierung von Einzeldomänen
exprimierenden Klonen im anfänglichen
Screening ist vermutlich auf die hydrophoben Reste zurückzuführen, die normalerweise
an der VH/VL Schnittstelle
verdeckt sind. Die Sequenzierung der VH-
und VL-Gene von 16 BSA-spezifischen Klonen
zeigte, dass fünf
verschiedene Klone vorhanden waren (Tabelle 1). Zwei Klone waren
mehrere Male vorhanden. Klon 29IJ11 wurde zweimal gefunden, und
Klon 29IJ7 wurde elfmal gefunden. Drei weitere Klone wurden einmal
gefunden. Die Sequenz der VH-CD3-Region dieser Anti-BSA-scFvs
zeigte einen Konsensus an den randomisierten Resten. Dies bestätigt, dass
diese Klone spezifisch sind, da Konsensus-CDR-Reste üblicherweise
in spezifischen Antikörpern
gegen andere Antigene gefunden werden (Clackson et al., 1991, De Wildt
et al., 1997).
-
Als
nächstes
haben wir eine scFv-Bibliothek, die mit einer Mischung von fünf ungereinigten
rekombinanten Proteinen C, D, H, M oder T oder 10-fachen Verdünnungen
davon selektiert war, in einem Screening untersucht. 12288 Klone
(32 × 384)
wurden gerastert und mehrere Kopien dieser Bibliothek wurden einzeln
in einem Screening auf die Bindung an die fünf rekombinanten Proteine untersucht.
Potentiell spezifische scFv-Klone aus dem ersten Screening wurden
im ELISA auf eine Bindung an die re kombinanten Proteine untersucht.
Spezifische scFvs wurden für
D (15 Klone), M (12 Klone) und T (20 Klone) identifiziert, und einige
dieser scFvs wurden unter Verwendung von 1000-fachen Verdünnung der
Proteinmischung isoliert. Die Sequenzen dieser Klone sind in der
Tabelle 1 dargestellt, und der Hauptteil der Anti-Ubiquitin-Klone
zeigte eine Konsensussequenz in ihren VH-CDR3-Resten. Einige
Klone wiesen unterschiedliche Nukleotidsequenzen auf, obwohl sie
für die
gleichen CDR3-Aminosäurereste
kodierten.
-
Als
letztes haben wir eine scFv-Bibliothek, die mit einem Lysat von
HeLa-Zellen selektiert war, in einem Screening untersucht. 18342
Klone wurden gerastert und auf die Bindung an Filter untersucht, die
mit HeLa-Zelllysat, Hefezelllysat oder mit einem irrelevanten Protein
(FITC-BSA) beschichtet waren. Mehrere potentielle scFv-Klone wurden
auf einem Western-Blot von HeLa-Zellen oder Hefezellen untersucht.
Es wurde herausgefunden, dass fünf
Klone ein Protein in HeLa-Zellen erkennen, jedoch nicht in Hefezellen.
-
-
Tabelle
1: VH und VL-CDR-Sequenzen
von Klonen, die aus einer Bibliothek selektiert wurden, welche auf
einem einzelnen humanen Grundgerüst basiert.
Unterstrichene Reste sind in der Bibliothek randomisiert. 1Bibliothek (NNK/DVT Diversität), von der
die Klone erhalten wurden. 2Zahl, die angibt,
wie oft die gleiche Sequenz beobachtet wurde. 3Alle
Nukleotid-(Aminosäure-)Änderungen, die sich von VH (V3-23/DP-47 und JH4b)
und Vκ (O12/02/DPK9
und Jκ1)
Keimlinien-Genen unterscheiden, und die nicht an spezifisch randomisierten
Positionen vorliegen.
-
Im
vorhergehenden Beispiel ist gezeigt, dass rekombinante Antikörper für ein direktes
Array-Screening verwendet werden können. Wir haben zwei Ansätze verwendet:
Im ersten Ansatz hat das Beschichten des Antigens auf den Filter
und die direkte Detektion von ausschließlich spezifisch bindenden
scFvs den Vorteil, dass eine Biotinylierung des Zielmoleküls oder
eine Modifizierung mit einem Anhängsel
(tagging) nicht erforderlich sind. Dieses Format führt zu einer
erhöhten
Sensitivität,
weil es lediglich zwei Inkubationsschritte umfaßt (Blocken und Detektion),
und weil scFvs zur Dimerisierung neigen, was in der Bindung von
mehreren Protein-L-Konjugaten resultiert. Dieser Ansatz bietet ferner
die Möglichkeit,
eine große
Anzahl von scFvs gleichzeitig mit einem oder mit mehreren Antigenen
in einem Screening zu untersuchen, da die Bakterien, welche die entsprechende
Nukleinsäuresequenzen
beinhalten, in Duplikaten auf den gleichen oder auf verschiedene Filter
aufgetropft werden können:
gegenwärtig
werden 18342 Kolonien doppelt auf einem Makroarray aufgetragen,
der äquivalent
zu 384 ELISA-Platten
mit 96 Vertiefungen ist. Sie erlauben ferner die Identifizierung
von verschiedenen spezifischen scFvs und kreuzreaktiven scFvs, was
durch die Klone gezeigt ist, die lediglich BSA, oder sowohl BSA
als auch HSA erkennen, und die Klone, die Proteine in HeLa-Zellen,
jedoch nicht in Hefe erkennen. BSA und HSA sind mehr als 75% homolog,
und es ist daher nicht überraschend,
dass einige Antikörper
Epitope erkennen, die in beiden Proteinen vorkommen. Ferner können diese
Arrays verwendet werden, um unreine Antigene in einem Screening
zu untersuchen, was dadurch gezeigt wird, dass die Identifizierung
von scFv spezifisch für
die rekombinanten Proteine D, M und T ist. Im Gegensatz zu anderen
Protein-Arrays (Bussow et al., 1998), erfordern diese Antikörper-Arrays keine
Denaturierungsschritte, um die Proteine zu immobilisieren. Das Zielmolekül kann tatsächlich nativ, denaturiert,
proteolysiert und auf andere Weise vorbehandelt sein, bevor es auf
den unteren Filter geschichtet wird.
-
Vergleichsbeispiel 2
-
Vergleich mit herkömmlichen Phagen-Display
-
Der
Vergleich unserer Ergebnisse mit denjenigen, die durch mehrere Runden
einer herkömmlichen
Phagen-Display-Selektion erhalten wurden, zeigt, dass drei der vorliegend
identifizierten scFvs auch nach 3–4 Runden Phagenselektion isoliert
wurden. Bei Verwenden des direkten Array-Screenings wurden jedoch
bereits nach einer Runde Phagenselektion zwei zusätzliche
Klone (Klon 29IJ11 und 29IJ12) gefunden, die nach einem ausführlichen Screening
der r3- und r4-Selektion nicht beobachtet wurden. Dies zeigt, dass
diese durch Kompetition zwischen den verschiedenen Klonen während der multiplen
Infektion, dem Anzüchten
und des Phagen-Herstellungsschritts, die an 3 oder 3 Runden der Phagenselektion
beteiligt sind, verloren werden. Da lediglich 16 von 50 positiven
Klonen sequenziert wurden, ist es wahrscheinlich, dass mehr einzigartige BSA-spezifische
scFvs unter den 50 positiven Klonen vorhanden waren. Die ECL-Signale dieser zwei einzigartigen
Klone auf dem Array sind von vergleichbarer Intensität wie beispielsweise
Klon 29IJ1, der eine nanomolare Affinität aufweist. Dies zeigt, dass potentiell
nützliche
scFvs bei Anwendung mehrerer Runden Phagendisplay verloren werden,
und somit Hochdurchsatz-Screenings vom vorliegend beschriebenen
Typ essentiell für
die Isolierung der am stärksten
diversen Sammlung von bindenden Klonen ist.
-
Duplikat-Arrays
aus Antikörpern
können
verwendet werden, um ein Screening nach Antikörpern vorzunehmen, die geeignete
Modifikationen eines gegebenen Proteins erkennen (wie beispielsweise Einzelmutationen
von Aminosäuren
oder post-translationale Modifikationen), oder um ein Screening nach
bindenden Molekülen
gegen unreine Antigene durchzuführen,
wie beispielsweise mit Molekülen,
die auf zellulären
Oberflächen
exprimiert werden. Mehrere Runden Phagenselektion führen oftmals
zu bindenden Molekülen
gegen andere immundominante Epitope oder andere Zelloberflächenmoleküle (Hoogenboom
et al., 1999). Um dies zu verhindern, wurden die Selektionen gegen
unreine Antigene unter Verwendung von Entreicherungs- oder Subtraktionsstrategien
durchgeführt
(De Kruif et al., 1995: Cai & Garen.
1996), oder es wurde eine ligandengestützte Technik angewendet, die "Pathfinder" genannt wird (Osbourn
et al., 1998). Das direkte Hochdurchsatz-Screening, das vorliegend
beschrieben ist, kann auf zahlreiche dieser Verfahren angewendet
werden. Die Screening-Verfahren können ferner unter Verwendung
mehrerer Zielliganden durchgeführt
werden. Die Zielliganden können
aus unterschiedlichen Proteinen bestehen, die miteinander vermischt
sind, oder es kann sich um einen Extrakt von zellulären Proteinen
handeln. Vorausgesetzt, dass jedes Zielprotein in der Mischung vorhanden
und im ausreichenden Maß immobilisiert
ist, sollte dies die Detektion von spezifischen scFvs ermöglichen.
-
Das
Screening kann verwendet werden, um bindende Moleküle mit höherer Affinität aus der
Bibliothek von Mutanten eines gegebenen Antikörpers zu identifizieren, die
entweder durch Ketten-Vermischung (Marks et al., 1992) oder durch
CDR-Diversifizierung
(Shier et al., 1996) erzeugt wurden. Um Antikörperfragmente zu humanisieren
oder Antikörperfragmente
mit höherer
Affinität
zu erzeugen, können Bibliotheken
aus Antikörperfragmenten
durch direkte oder zufällige
Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden oder fehleranfälligen Polymerasen erzeugt
werden. Diese Bibliotheken oder Teile dieser Bibliotheken können problemlos
angezüchtet
und in einem Arrayformat exprimiert werden und anschließend in
einem Screening auf eine Bindung oder eine verbesserte Bindung an
ihre Zielliganden untersucht werden.
-
Arrays
aus rekombinanten Antikörpern
haben nützliche
Applikationen bei der Charakterisierung einer Proteinexpression
einschließlich
von Modifikationen dieser Proteine, einem Gebiet das auch als Proteomik
bekannt ist. Im Gegensatz zur Genomik, die mRNA-Expessionsmengen
durch cDNA-Arrays untersucht, liefern Proteomics einen direkten Hinweis
auf die Proteinfunktionalität.
Dieses Gebiet wird gegenwärtig
durch die 2D-Elektrophorese dominiert. Arrays aus rekombinanten
Antikörpern
können verwendet
werden, um die bestehenden Technologien zu komplimentieren, um die
Expression von einem oder von mehreren Proteinen in einer Mischung
von Proteinen (z. B. in einem Zellextrakt) zu analysieren.
-
Im
allgemeinen ermöglicht
dieses Verfahren die Hochdurchsatzanalyse für eine Ligandenbindung von
rekombinanten Antikörpern
oder anderen rekombinanten Proteinen, die in einem bakteriellen
Periplasma exprimiert werden. Insbesondere diejenigen Fälle, in
denen die Trefferrate zu gering ist, um mit einem herkömmlichen
ELISA zu detektieren, jedoch hoch genug ist, um mit Arrays zu identifizieren
(> 10–4),
und wenn wiederholte Runden der Phagenselektion nicht vorteilhaft
sind. Dieser Ansatz ist jedoch nicht auf Antikörper-Antigen-Interaktionen
beschränkt,
und er kann verwendet werden, um andere funktionelle Protein-Liganden-Interaktionen
zu untersuchen, einschließlich
bei einem Screening auf aktive Enzyme. Beispielsweise kann eine
Bibliothek von Transkriptionsfaktor-Varianten oder anderer DNA- bindender Enzyme
auf ihre Fähigkeit
untersucht werden, an eine bestimmte DNA-Sequenz zu binden. Zinkfinger
sind beispielsweise kleine DNA-bindende Moleküle, von denen bekannt ist, dass
sie in einer großen
Anzahl von eukaryontischen Transkriptionsfaktoren auftreten, und
sie binden eine bestimmte Anzahl von DNA-Sequenzen. In der Vergangenheit
sind Zinkfinger erstellt worden, die spezifisch an eine einzigartige
9-Basenpaar-Region des BCR-ABL Fusionsonkogens binden, und es führt zur Blockade
der Transkription dieses Onkogens (Choo et al., 1994). Das Array-Screening
kann nützlich
sein, um solche sequenzspezifischen DNA-bindenden Peptide oder Proteine
zu identifizieren, welche die Produktion von Faktoren, die für das Tumorwachstum
essentiell sind, inhibieren können.
-
Eine
Strategie für
die Selektion von aktiven Katalysatoren umfaßt das Anzüchten und die Expression einer
Bibliothek von Enzymen im Arrayformat auf einem Filter, in großer Nähe zu einem
Zielliganden, der auf einem anderen Filter immobilisiert ist. Als
nächstes
wird umgewandeltes Substrat detektiert, wobei spezifische Anti-Produkt-Affinitätsreagenzien
auf dem Zielligandenfilter detektiert werden. Da die Enzyme und
ihre Substrate für
einige Stunden in großer
Nähe sind,
hofft man, dass dies die Detektion von Enzymen mit hohen Turnover-Raten
ermöglicht,
jedoch auch von solchen mit geringeren Turnover-Raten. Auf diesem
Weg können
wir bestehende Phagenselektionsmethoden für Katalysatoren, die auf einer
Produktbindung beruhen, verbessern, wie beispielsweise eine Selektion
von Aldolasen (Barbas et al., 1997).
-
Vollständige Zellen
können
als Zielligand in einem Array-Screening
verwendet werden. Eine eukaryontische Zelllinie, wie beispielsweise
HeLa, kann auf Filtern angezüchtet
und immobilisiert werden. Eine Bibliothek von Adhesionsmolekülen kann
dann in einem Screening auf eine funktionelle Interaktion untersucht
werden, wie beispielsweise auf die Induktion einer Apoptose über die
Zelloberflächenmoleküle CD95
(APO-1, FAS). Die ausgelesenen Ergebnisse können ein nachgelagertes Ereignis
darstellen, wie beispielsweise die Translokation von Phosphatidylserin
oder die Expression von p53. Eine randomisierte Bibliothek aus CD95-Liganden,
die den CD95-Rezeptor erkennen, kann in einem Screening untersucht
und in einem Assay durch Annexin-V-Detektion von Zelloberflächen-Phosphatidylserin
(Boehringer Mannheim) oder durch p53-Detektion (Boehringer Mannheim)
getestet werden.
-
Beispiel 3
-
Detektion interagierender Proteinpaare
-
Um
zu bestimmen, ob das Filter-Screening verwendet werden kann, um
zwei interagierende Proteine zu detektieren, haben wir Paare von
Proteinen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie interagieren.
Protein M und ein Anti-M-scFv M12, Protein T und ein Anti-T-scFv-T15
und die FKBP12-Rapamycin-Bindungsdomäne (FRB)
des FKBP-Rapamycin-assoziierten Proteins (FRAP) und humanes Immunophilin
FKBP12 (FK506-Bindungsdomäne
von 12 kD). Die FRB-FKBP12-Interaktion hängt vom Vorhandensein des kleinen
Moleküls
Rapamycin ab. Gene, die für
M, T oder FKBP12 kodieren, wurden als C-terminale Fusion an eine
Glutathion-S-Transferase (GST) in pACYC (resistent gegen Chloramphenicol) kloniert.
M12 (Anti-M-scFv) und T15 (Anti-T-scFv) werden in das pHEN-Derivat
pIT2 (resistent gegen Ampicillin) kloniert. FRB und FKBP12 wurden
als C-terminale Fusion an eine V-Kappa-Einzeldomäne in pIT2 kloniert.
-
Einzelne
Kolonien wurden ausgehend von einer frischen Agarplatte gepickt
und o/n bei 37°C
in Flüssigkultur
(TYE, 100 μg/ml
Ampicillin oder 10 μg/ml
Chloramphenicol, 1% Glucose) angezüchtet. Mehrere Kombinationen
dieser Kulturen wurden zusammengemischt (interagierende Partner
oder Kontrollen) und auf eine Agarplatte aufgetropft (TYE, 1% Glucose),
die mit ei nem Nitrozellulosefilter (Schleicher & Schuell) bedeckt war. Vor dem Transfer
auf die Platte wurde dieser Filter in 2% Magermilchpulver PBS (MPBS)
für 30
Minuten bei Raumtemperatur (RT) geblockt, kurz in PBS gewaschen
und in 2 × TY getränkt. Die
gerasterten Platten wurden über
Nacht bei 37°C
angezüchtet.
In der Zwischenzeit wurde ein weiterer Nitrozellulosefilter mit
2 μg/ml
Anti-GST-Antikörper
(Pharmacia Biotech) in PBS über
Nacht bei 4°C
beschichtet. Dieser Filter wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur
in 2% MPBS geblockt, 3 × in PBS
gewaschen, in 2 × TY
getränkt
und anschließend
auf eine Agarplatte (TYE, 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG)) überführt. Für die Detektion
der FRB-FKBP12-Interaktion wurde 0,1 ng/ml Rapamycin oder kein Rapamycin
zu den Platten gegeben. Der zweite Filter, der die Bakterien-Klone
enthielt, wurde auf die Platte überführt, die
mit dem Anti-GST-beschichteten Filter bedeckt war. Diese Platten
wurden für
fünf Stunden
bei 30°C
inkubiert.
-
Untersuchung der Filter mit
einer Sonde
-
Der
obere Filter wird entfernt und der untere Filter wurde dreimal mit
PBS/0,05% Tween (PEST) gewaschen und mit 2% MPBS für 30 Minuten
bei Raumtemperatur geblockt. Die Filter wurden dreimal mit PEST
gewaschen und mit Protein-L-HRP-Konjugat (Actigen, 1/4000) in 2%
MPBS für
eine Stunde bei Raumtemperatur gewaschen. Die Filter wurden gewaschen
und mit ECL-Reagenz (Amersham) entwickelt. Alle Inkubationen wurden
auf einem sich leicht bewegenden Schüttler durchgeführt.
-
ELISA
-
Um
zu bestätigen,
dass Klone, die unter Verwendung des direkten Capture-Screenings
identifiziert wurden, auch im ELISA binden, wurde 2 × TY, welches
100 μg/ml
Ampicillin oder 10 μg/ml
Chloramphenicol und 0,1% Glucose enthielt, mit 1/100 Volumen einer Übernachtkultur
inokuliert. Diese wurden bei 37°C
angezüchtet,
bis eine OD600 von ungefähr 0,9 erreicht wurde. Es wurde
1 mM IPTG zugesetzt, und die Kulturen wurden bei 25°C oder 30°C (scFvs) über Nacht
geschüttelt.
Die Kulturen wurden zentrifugiert, und die Überstände wurden im ELISA verwendet.
Eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde über Nacht bei 4°C mit Anti-GST,
2 μg/ml
in PBS beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen
und für
zwei Stunden bei Raumtemperatur mit 2% Tween/PBS (für die scFv-Antigen-Paare)
oder mit 2% BSA/PBS (für
das FRB-FKBP12-Paar) geblockt. Die Platten wurden dreimal mit PBS
gewaschen. 50 μl Überstand
der pACYC-GST-Klone
und 50 μl Überstand
der pIT2-Klon wurden mit 50 μl
2% Tween/PBS oder mit 2% BSA/PBS gemischt und für 1,5 Stunden bei RT inkubiert.
Für die
Detektion des FRB-FKBP12-Paars wurde der Assay in Gegenwart von
entweder 0,1 ng/ml Rapamycin oder in Abwesenheit von Rapamycin durchgeführt. Die
Platten wurden fünfmal
mit PEST gewaschen und mit Protein-L-HRP-Konjugat (1/4000) für eine Stunde bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Platten wurden fünfmal
mit PEST gewaschen und die Reaktionen wurden mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
entwickelt und mit Schwefelsäure
abgestoppt.
-
Ergebnisse
-
Die
direkte Screening-Strategie zeigt deutlich die spezifische Bindung
von M an Anti-M und von T an Anti-T (3) und die
spezifische Bindung von FRB-FKBP12 in Gegenwart von Rapamycin (4).
-
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