JP2003515745A - 直接的スクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
Description
法によって、そのレパートリーのメンバーが標的分子もしくは同定される分子と
相互作用することとなるように、そのポリペプチドは標的分子の近傍で翻訳され
る。特に、本発明は、ポリペプチドレパートリーをin situでアレイ状に発現さ
せ、それらと固定化された標的分子との相互作用を検出することに関する。本発
明はまた、種々の標的リガンドに対してスクリーニングするために固体支持体上
に空間的に配置させ、何千もの異なるポリペプチドからなる高濃度の抗体のアレ
イをも提供する。
ついての初めての報告は溶菌プラークを用いた方法であった(Huseら, 1989; Mul
linaxら, 1990)。これらのライブラリーは免疫したマウスもしくは追加免疫を受
けたヒトから作成したもので、それには標的抗原の各々に対して新たなライブラ
リーを作成しなければならず、再現性のある結果の得られる、同じフィルターが
得られないという欠点があった。従って、抗体フラグメントのファージディスプ
レイライブラリーを無処置の(免疫していない)ドナーから(Marksら, (1991), J.
Mol.Biol., 222:581; Vaughanら, (1996) Nature Biotech. 14:309; Sheets, M.
D., Amersdorfer, P., Finnem, R., Sargent, P., Lindqvist, E., Schier, R.,
Hemingsen, G., Wong, C., Gerhart, J.C. とMarks, J.D.(1998) 「大規模な非
免疫ファージ抗体ライブラリーの効率的な構築:タンパク質抗原に対する高アフ
ィニティー1本鎖抗体の産生」"Efficient construction of a large nonimmune
phage antibody library:the production of high-affinity human single-chai
n antibodies to protein antigens" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:6157-
62)、もしくは合成によって導入された補体決定領域(CDRs)を有するクローン化
された可変(V)領域遺伝子(Griffithsら, (1994) EMBO J. 13:3245)から構築され
てきたが、これらは非常に多様な抗体を含んでいるはずである。事実、抗原の選
択およびアフィニティーによる精製を何ラウンドか繰り返すと、例えば自己抗原
(Griffiths, A.D., Malmqvist, M., Marks, J.D., Bye, J. M., Embleton, M. J
., McCafferty, J., Baier, M., Holliger, K.P., Gorick, B.D., Hughes Jones
, N.C.ら, (1993), 「ファージディスプレイライブラリーから得た高い特異性を
有するヒト抗自己抗体」"Human aiti-self antibodies with high specificity
from phage displeay libraries", EMBO J. 12:725-734; Griffithsら, 1994; D
e Wildt, R.M.T., Finnern, R., Ouwchand, W.H., Griffiths, A.D., Van Venro
oij, W.J.とHoet, R.M.A.,(1996), 「合成および患者由来のコンビナトリアルV
遺伝子ライブラリーから選択したUI-RNA関連 Aタンパク質に対するヒト可変ドメ
イン抗体フラグメントの特徴」"Characterizationo of human variable domain
antibody fragments against the U1-RNA-associated A protein, selected fr
om a syntheitic and a patient derived combinatorial V gene library" Eur.
J.Immunol. 26, 629-639)およびMHC-ペプチド複合体(Andersenら, 1996)などの
ある範囲の抗原に対する抗体フラグメントが単離されるが、そのようなことは困
難であると以前は考えられていた。
、及び感染を含んでおり、この方法ではしばしばイムノドミナントなエピトープ
およびドミナントタンパク質(タンパク質の混合物中で)に対してのバイアスがか
けられる結果となる。従って、結合クローンである可能性のあるクローンの多様
なものの大部分を保持するためには、出来る限り早期にクローンを分析すること
が有用である。
それは96ウエルのフォーマットで組換え抗体を増殖および誘導させ、その後抗原
をコートした別のプレートに発現した抗体を移し、従来法のELISAで行いうるが
、1000種を超える種々の抗体をこの方法でスクリーニングすることは実際的でな
い。発現された個々の抗体をロボットを用いてピペッティングすることによって
より大規模なスクリーニングを行うことができるが、その抗体は誘導の際にコン
パートメント化することが依然として必要である。しかし、それにより現行のプ
レートフォーマットおよび現在の液体取り扱いのスピードの制限の下でのスクリ
ーニングしうる抗体の数を限定する。103から105のレンジのより大規模なスク
リーニングを行うためには、抗体を含有する細菌をin situで発現させ、次いで
標識抗原を用いて探索するために、フィルター上で捕捉した。Skerraら(Anal. B
iochem. 196:151-155)は結合抗体と非結合抗体とを区別するために発現した抗体
フラグメントを2枚のフィルターを用いるアプローチで捕捉したが、その第2のフ
ィルターの使用によって細菌の細片によるバックグラウンド値が低減される。捕
捉剤はまた、λファージのプラーク中に発現された抗体フラグメントの捕捉にも
用いられた(Watkins, J.D., Beuerlein, G., Wu, H., McFadden, P.R., Pancook
, J. D. とHuse, W.D. (1998) 「ファージによって発現させた抗体ライブラリー
の捕捉リフトスクリーニングによる細胞表面抗原に対するヒト抗体の発見」"Dic
sovery of human antibodies to cell surface antigens by capture lift scre
ening of phage-expressed antibody libraries" Anal. Biochem. 256:169-77)
。これらの技法のどちらも抗体の無差別の捕捉、およびその後の抗原特異的クロ
ーンを検出するための標識抗原の使用に依存している。このことにはスクリーニ
ングしようとする各抗原の標識を必要とするばかりでなく、低アフィニティーの
包括的な捕捉剤の使用によって、特異的な相互作用が検出可能となる前に抗体が
フィルター上から離れてしまうこととなる可能性がある。
よれば、標的分子それ自体が固相支持体上に固定化され、結合するポリペプチド
がその標識分子を含有する固相支持体上で直接的に捕捉されうるように、ポリペ
プチドレパートリーはその近傍で発現される。さらに我々は個々の標的分子の全
てではないがいくつかと相互作用するポリペプチド、全ての標的分子と相互作用
するポリペプチド、もしくは標的分子とは全く相互作用しないポリペプチドを同
定することができるように、同一のポリペプチドレパートリーを含有する全く同
じ2つのフィルターを作成して2種以上の異なる標的分子を用いてスクリーニング
できるようなシステムを考案した。さらに、結合の相互作用のスクリーニング用
いられる他、この直接的発現/相互作用アッセイ法は、生物学的機能を有するポ
リペプチドが関与するいかなる生物学的スクリーニングにも用いることができる
。
分子との反応性についてスクリーニングするために用いる方法論を開発した。我
々はポリペプチドの発現と相互作用のスクリーニングを組み合わせ、ポリペプチ
ドをコードするアレイさせた核酸と対応するポリペプチドのアレイを作った。こ
のことは、従来の技法ではポリペプチドは発現させた後、標的分子とのスクリー
ニングをその後に行うために保存もしくは捕捉しておかねばならないが、そのよ
うな技法と比べると、発現されたポリペプチドが標的分子と直接的に相互作用で
きるという点で好都合である。そのようなアレイを作成すると同じレパートリー
のメンバーを異なる標的分子に対して平行してスクリーニングすることが可能と
なる。本発明はまた、多数の種々のポリペプチドからなる抗体のアレイをも提供
し、それは種々の標的リガンドに対してスクリーニングするために固相支持体上
に空間的に配置されている。
ーニングする方法が提供され、それは1種以上の標的分子と相互作用するそのポ
リペプチドの1つ以上のメンバーを同定するための方法であり: a) 標的分子を支持体上に固定化し; b) ポリペプチドレパートリーをコードする多数の核酸分子をアレイさせ; c) そのアレイさせた核酸分子と標的分子を並置し; d) 該ポリペプチドが該標的分子と支持体上で接触してそのポリペプチドのあ
るサブセットが標的分子と相互作用することとなるように、そのアレイさせた核
酸分子を発現させて該ポリペプチドを産生させ; e) 該ポリペプチドと該標的分子の支持体上での相互作用を検出すること、 を含んでなる方法である。
利点を取り入れており、すなわち、あるポリペプチドレパートリーのメンバーを
コードする核酸は、それによってコードされる個々のポリペプチドと会合し、そ
れによって個々のポリペプチドの機能的特徴に基づいて選択されうる。しかし、
この会合が外表にポリペプチドをディスプレイし、内部に対応するヌクレオチド
前駆体を含有しているバクテリオファージを用いて、核酸とポリペプチドを連結
することにより行われるファージディスプレイとは異なり、本発明ではこの会合
を提供するための新規のアレイ技法を開発している。核酸とポリペプチドが細菌
細胞中もしくは外表上に保持されているか、または発現の際にコンパートメント
化されていなければならない(例えば96ウエルのプレート、もしくはその他のコ
ンパートメント化策を用いて)、という要求事項を排除することによって、本発
明では、非常に多数のポリペプチドを同時にスクリーニングすることが可能とな
っている。このように、核酸、その対応するポリペプチド産物、およびこのポリ
ペプチド産物の標的分子との相互作用は全てが非常に近い距離の範囲内の位置で
行われる。ある特定の相互作用が認められれば、それに対応する核酸のメンバー
は容易に同定することができる。このように、本発明は結合活性の選択にとどま
らず酵素活性、コンホメーションもしくはその他の検出可能な特性のいかなるも
のをも含むポリペプチドの機能的性質に基づいたポリペプチドレパートリーの選
択をも行うことができる。
れ核酸分子のアレイに並置される。このことは標的分子のみをアレイさせること
をも含み、それは例えば、他の分子との複雑な混合物、例えば細胞全体もしくは
細胞抽出物中にある精製されたタンパク質もしくは標的分子で支持体をコートし
た場合などである。事実、ある種のスクリーンでは標的分子の性質が正確には知
られていないこともあり、そのような場合にはスクリーンで相互作用を起こすよ
うないかなるポリペプチドをも標的分子をさらに特徴づけるために用いることが
できる。該核酸分子の発現によって産生されたポリペプチドは標的分子に対して
並置されるので、それらのポリペプチドは標的分子と相互作用する可能性がある
。検出しようとしている相互作用に基づいて選択される適切な検出システムを用
いて、その相互作用を検出することができる。
うことができ、それは相互作用それ自体の性質の如何による。例えば、そのポリ
ペプチドレパートリーが抗体分子レパートリーで標的分子が抗原である場合には
、抗体と抗原との間の結合は、適切な標識抗免疫グロブリン、もしくはプロテイ
ンAもしくはプロテインLなどの標識スーパー抗原を用いて標的分子支持体を探索
することによって検出することができる。また別の1実施形態においては、ポリ
ペプチドレパートリーを選択するために用いられる標的分子は正しく折り畳まれ
発現されたポリペプチドとジェネリックな相互作用をすることができる。例えば
、標的分子がプロテインAもしくはプロテインLの場合には、機能を有する免疫グ
ロブリン分子の全てを含んでいるサブセットがある免疫グロブリン分子レパート
リーから選択されることとなろう。あるいはまた、該レパートリーのポリペプチ
ドと標的分子との相互作用は、標的分子もしくはその他の分子でポリペプチドと
標的分子の相互作用がそれを用いて行われるような分子の性質の何らかの物理的
な変化によって検出することができる。従って、例えば、その標的分子がアポト
ーシスの引き金を引くレセプターであり、その標的分子を含んでいる細胞が固相
支持体上に固定化されている場合には、そのポリペプチドレパートリー中の相互
作用するメンバーは細胞を殺すことができ、そのことは顕微鏡下で、もしくはア
ポトーシスの他の何らかの分子性マーカーを用いて検出することができる。ある
いはまた、該ポリペプチドレパートリーの相互作用するメンバーは標的分子で色
の変化をもたらしうる。
クリーニングして1種以上の標的分子と結合する1つ以上のレパートリーのメンバ
ーを同定する方法を含んでなり、その方法は: a) 第1の支持体に標的分子を固定化し; b) 抗体ポリペプチドのレパートリーをコードする核酸を用いて多数の細胞を形
質転換させその細菌細胞を第2の支持体上にアレイさせ; c) 第1および第2の支持体を並置させ; d) 該ポリペプチドが第2の支持体上の細胞から分泌されて第1の支持体上の標的
分子と接触しそのポリペプチドのあるサブセットが標的分子と結合するようにそ
の核酸分子を発現させて該抗体ポリペプチドを産生させ; e) 第1の支持体上での該抗体ポリペプチドと該標的分子との結合を検出する、
ことを含んでなる方法である。
細胞などの高級な真核細胞などの原核細胞もしくは真核細胞とすることができる
。本発明のこの実施形態においては、アレイはロボットを用いてコロニーをつま
み上げ培養プレート中に移すことによって行うことが好都合であり、その方法で
全く同じ2つのフィルターを多数作成しうる。標的分子を最初にフィルターに付
着させ、次いで細菌を標的分子フィルター上でアレイ、増殖および発現させた第
1のフィルターと第2のフィルターは同じものであるが、標的分子が固定化された
第1のフィルターと同じものの上にアレイさせたコロニーを含ませた第2のフィル
ターを置いて第1のフィルターを第2のフィルターの下側に接触させ、コロニーそ
のものとは接触しないようにすることは好都合である。
少なくとも第2のフィルターは有孔性のまたは微小な孔を持つフィルターである
ことが好都合であり、それによって細胞から分泌されるポリペプチドがそのフィ
ルターを通過して第1のフィルターと接触することができる。好ましいフィルタ
ー材料としてはニトロセルロース、PVDF、およびその他の当業界で既知の人工膜
が含まれる。
第1のフィルター上の固定化された標的分子と結合することによって相互作用す
ることができる。結合した免疫グロブリンは標識スーパー抗原などの抗免疫グロ
ブリン試薬を用いて検出することができる。
と相互作用する1つ以上のメンバーを同定するスクリーニングのための装置を提
供し、その装置は: 該レパートリーをコードする核酸分子のアレイさせたもの;および 支持体上に標的分子を固定化した支持体、 を含んでなる。
もしくは道具と共に供給することができる。
間的配置であって、それによって種々の核酸メンバーが固相支持体上で別々のあ
らかじめ規定された位置に配置される。そのように配置されたアレイは、ロボッ
トによるピッキング(picking)などの格子配置技法を用いてそのメンバーを所望
の位置に配置して作製することができる。このタイプのアレイは各クローンがそ
の独自の位置にあり、多数の二重のフィルターを作製して種々の標的分子に対し
てのスクリーニングを行うことができるという利点を有する。さらに好ましいア
レイ技法は下記でさらに説明する。
ば、核酸分子は裸の核酸、つまりRNA、DNA、もしくは核酸の他のいかなる形態の
ものとして配置させることができる。しかし、本発明の好ましい1態様において
は、それらの核酸で形質転換させた細胞もしくは細胞の凝集物の形態でそれらの
核酸をアレイさせることができる。適切な細胞としては細菌細胞、真核細胞、お
よび哺乳動物細胞などの高等真核細胞が含まれる。
プチドのレパートリーのメンバーをコードし、そのメンバーの転写および/もし
くは翻訳を指令するために十分な制御配列と機能しうる形で連結されたものであ
る。例えば、そのような制御配列としては、当業者であれば既知であるとおり、
プロモーター配列およびエンハンサーを挙げることができ、それらはDNA分子の
転写のために必要である。
核酸分子(それは裸の形態でも複合体化した形態のどちらでもよいが)の形態で
あってよい。次いでその核酸分子は転写され(それがDNAをベースとしたものであ
る場合)および/もしくは翻訳されてそのアレイ上にin situでポリペプチドを産
生する。
例えば10、100、もしくは500のメンバーを含むことができる。好ましくは本発明
のアレイは少なくとも1000のメンバーを含み、104、105、106もしくはそれ以上
のメンバーを含むことが有利である。
イさせることが有利である。好ましくは、その抗体アレイは103個以上の抗体分
子を含んでいる高密度のアレイである。その抗体はIgGもしくはIgAなどの抗体の
全体、Fv、scFv、Fab、および一価の抗体ドメインなどの抗体フラグメント、な
らびにラマ(Llama)もしくはラクダ(Camelid)抗体などの天然の1本鎖抗体とする
ことができる。
レパートリー中の機能的メンバーのかなりの割合と結合するリガンドである。従
って、この同一のジェネリックなリガンドがそのレパートリーの多数のメンバー
とそれらのメンバーの標的リガンドの特異性と無関係に結合することができる(
下記参照)。通常は、機能的なジェネリックなリガンド結合部位が存在すること
はそのレパートリーのメンバーが発現され正しく折り畳まれていることを示して
いる。従ってジェネリックなリガンドの結合部位への結合を利用することによっ
て、あるポリペプチドのレパートリーから機能的ポリペプチドをあらかじめ選択
するための方法が得られる。標的分子もまたその標的分子の機能性を示すために
用いることのできるジェネリックなリガンドを有していてもよい。
間の何らかの検出可能な相互作用を意味する。例えば、scFvなどの抗体ポリペプ
チドの場合には相互作用とは結合性の相互作用で、標的ポリペプチドは抗原とす
ることができる。あるいはまた、相互作用は酵素的に触媒された反応とすること
もでき、その反応ではポリペプチドは酵素で標的分子はその酵素の基質とするこ
とができる。しばしば、酵素もしくは細胞シグナル伝達に関与する分子などのポ
リペプチドの結合には、結合事象と測定可能な生化学的活性、例えばキナーゼ活
性またはホスファターゼ活性における変化が含まれる。そのような活性は当業界
で公知の標準的なアッセイ方法を用いて測定することができる。
まれる。レパートリーと標的分子は、アレイ上で発現したポリペプチドが支持体
上の標的分子と相互作用できるように、そのレパートリーの各々個々のメンバー
と標的分子との相互作用部位が列上の位置と相関しうるような様式で並置される
。好ましい1態様においては、標的分子を固定化させてある支持体は、ポリペプ
チドのレパートリーをコードする核酸がアレイされている支持体と接触するよう
に置かれる。
トタンパク質の断片、もしくはヒト以外の供給源に由来するタンパク質もしくは
タンパク質の断片、操作された形のタンパク質もしくはタンパク質の断片、酵素
、抗原、薬剤、受容体分子などの細胞シグナル伝達に関与する分子、抗体ポリペ
プチドもしくはT細胞受容体ポリペプチドなどの免疫グロブリンスーパーファミ
リーのポリペプチドを含む抗体などの、いかなる種類のポリペプチドをも意味す
る。本発明ではそのような「ポリペプチド」は全て標的分子と相互作用すること
ができ(もしくはできる可能性があり)、その標的分子とは結合による相互作用の
場合には標的リガンドとなるであろう。
含むか、もしくは重鎖(VH)もしくは軽鎖(VL)のいずれかのポリペプチドを含んで
いる単一ドメイン抗体レパートリーを含むことができる。本明細書で用いている
抗体ポリペプチドは、改変された、もしくは改変されていない抗体、または抗体
の一部分であるポリペプチドである。従って、抗体ポリペプチドという用語には
、重鎖、軽鎖、重鎖-軽鎖二量体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、重
鎖単一ドメイン、軽鎖単一ドメイン、Dabフラグメント、または1本鎖Fv(scFv)を
含むFvフラグメントが含まれる。このような抗体分子およびそれらをコードする
核酸の構築方法は当業界では周知である。
異体、またはアミノ酸配列が異なるポリペプチド変異体などの多様な変異体の集
団である。通常は、あるレパートリーには非常に多数の変異体が含まれ、その数
は時には1010、1011、1012もしくはそれ以上となる。大規模なレパートリーは生
じうる変異体を最大限の数、選択のために含んでいる。より小規模なレパートリ
ーを構築することができ、それは特に望ましくないメンバー、例えば停止コドン
を含んでいるもの、正しい折り畳みのできないもの、もしくは他の点で不活性な
ものなどを除去するためにあらかじめ選択する場合には非常に有用である。その
ようなより小規模のレパートリーは10、102、103、104、105、106、もしくはそ
れ以上の核酸もしくはポリペプチドを含むものとすることができる。より小規模
なレパートリーは、102から105個の間の核酸もしくはポリペプチドを含んでいる
ことが有利である。本発明では、ヌクレオチドのレパートリーは対応するポリペ
プチドのレパートリーをコードするように設計されることが好ましい。
レパートリーのあるサブセットのみが標的分子と相互作用することができ、従っ
てレパートリーのあるサブセットのみがアレイ上で検出可能な相互作用を生ずる
こととなるだろう。例えば、標的分子がある抗体に対する特異的なリガンドであ
る場合には、その標的リガンドに結合することのできる、抗体のサブセットが単
離される。
索される分子である。従って「標的分子」という用語には、抗原、抗体、酵素、
酵素の基質、脂質、いずれの細胞もしくは細胞内器官の中もしくは表面上に発現
されるいずれの分子、いずれの有機もしくは無機小分子、およびそのポリペプチ
ドレパートリーのメンバーと相互作用しうるその他のいかなる分子が含まれる。
標的分子はそれ自体がポリペプチドであってもよく、その場合にはレパートリー
と標的が双方ともポリペプチドとなる。そのような場合にはレパートリーが抗原
もしくは酵素の基質のレパートリーであることができ、そのレパートリーが1つ
以上の抗体もしくは酵素分子に対してスクリーニングされる、またはその逆であ
る。相互作用が結合による相互作用である場合には、標的分子は標的リガンドと
することができる(下記参照)。
リーのメンバーが同定されることとなる分子である。そのポリペプチドレパート
リーのメンバーが抗体分子である場合には、標的リガンドは抗原とすることがで
き、レパートリーのメンバーが酵素である場合には、標的リガンドは基質とする
ことができる。ポリペプチドレパートリーのメンバーがcDNAが発現されたもので
ある場合には、標的リガンドはそれ自体を抗体もしくは何らかのその他のポリペ
プチド分子とすることができる。
リーは、ファージディスプレイのライブラリーを構築するために用いられる方法
と類似の方法を用いて構築することができる。そのような方法は当業界では周知
である(McCaffertyら, (1990) Nature, 348:552; Kangら, (1991)Proc. Natl. A
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roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1066-1070; McCaffertyら, (1990) 前掲; C
lacksonら, (1991) 前掲; Marksら, (1991) 前掲; Chiswellら, (1992) Trends
Biotech., 10:80; Marksら, (1992) 前掲)。
ョンに基づいて設計することができる。そのようなライブラリーは国際特許出願
WO 99/20749に記載されているように構築することができ、この出願の内容は本
明細書に参照により組み入れることとする。
核酸のライブラリーは、ファージのコートタンパク質遺伝子との融合体として構
築されるものではなく、また、必ずしもバクテリオファージベクター中に構築さ
れない。ファージもしくはファージミドベクターが用いられる場合には、ポリペ
プチドはコートタンパク質に融合されずにそれから分離されていることが有利で
ある。例えば、停止コドンを配列中に導入してそのポリペプチドが融合体として
発現されないことを確実にすることができる。その点で、組換えポリペプチドを
発現することができるいかなるベクターも好適である。そのポリペプチドは宿主
細胞から分泌されることが有利である。
手可能であり、標準的な実験室マニュアル、例えばSambrookら, (1989) 「分子
クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」,
Cold Spring Harbor, USAなどに示されている方法で構築および操作することが
できる。
ているベクターとは、異種DNAを細胞中に発現および/もしくは複製のために導入
するために用いられる独立のエレメントを意味する。そのようなベクターを選択
もしくは構築し、次いでそれを用いるための方法は当業者には周知である。非常
に多数のベクターが一般に入手可能であり、そのようなものとしては細菌プラス
ミド、バクテリオファージ、人工染色体、およびエピソームベクターが含まれる
。そのようなベクターは単純クローニングおよび突然変異誘発に用いることがで
きる:あるいはまた、本発明のレパートリーのメンバー(もしくはプレレパート
リーのメンバー)を中に有しているベクターに典型的に見られるとおり、遺伝子
発現ベクターが用いられる。本発明で使用するベクターは、所望のサイズ、典型
的には0.25キロベース(kb)〜40kbの長さのポリペプチドコード配列を収めるため
に選択することができる。適切な宿主細胞が、in vitroのクローニング操作後そ
のベクターを用いて形質転換される。各ベクターは種々の機能的コンポーネント
を含んでおり、それは通常はクローニング(もしくはポリリンカー)部位、複製起
点、および少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含んでいる。所定のベクター
が発現ベクターである場合には、そのベクターは次のものの1つ以上をさらに有
している:エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結およびシグナル配
列。各々は、それらが本発明のポリペプチドレパートリーのメンバーをコードす
る遺伝子に機能しうる形で連結されることとなるようにクローニング部位の近傍
に位置している。
種以上の選択した宿主細胞中で複製できるような核酸配列を含んでいる。典型的
には、クローニングベクター中では、この配列はそのベクターが宿主の染色体DN
Aとは独立に複製することを可能とするもので、複製起点、もしくは自己複製配
列が含まれる。そのような配列は種々の細菌、酵母、およびウイルスで周知であ
る。プラスミドpBR322由来の複製起点は大多数のグラム陰性細菌に適したもので
、2ミクロンプラスミドの複製起点は酵母に適しており、種々のウイルスの複製
起点(たとえば、SV40、アデノウイルス)は哺乳動物細胞でのクローニングベクタ
ーに有用である。通常は哺乳動物の発現ベクターには、そのベクターをCOS細胞
などの高レベルのDNAを複製することのできる哺乳動物細胞中で用いるのでない
限りは複製起点は必要ではない。
選択マーカーとも呼ばれる)を含むことができる。この遺伝子は選択培地中で増
殖させる形質転換された宿主細胞の生存もしくは増殖に必要なタンパク質をコー
ドする。従って、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換がなされていない宿
主細胞はその培地中で生存できないだろう。典型的な選択遺伝子は、例えばアン
ピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、もしくはテトラサイクリンなどの
抗生物質およびその他の毒素に対する耐性を付与するか、栄養要求性欠損を補足
するか、または増殖培地からは得ることのできない不可欠な栄養素を供給するタ
ンパク質をコードする。
腸菌の選択マーカー、例えば抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ-
ラクタマーゼ遺伝子が有用である。それらは大腸菌プラスミド、例えばpBR322、
またはpUC18もしくはpUC19などのpUCプラスミドから得ることができる。
で連結されたプロモーターを含んでいる。そのようなプロモーターは誘導性のも
のもしくは構成性のものとすることができる。「機能しうる形で連結された」と
いう用語は、記載されたコンポーネントがそれらの意図された様式で機能するこ
とができるような関係を取る並置を意味する。あるコード配列に「機能しうる形
で連結された」制御配列は、そのコード配列の発現がその制御配列と適合した条
件下で成し遂げられるように連結される。
ラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プ
ロモーター系、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げ
られる。また細菌系で用いられるプロモーターは、通常はコード配列に機能しう
る形で連結されたシャイン・ダルガーノ配列を含んでいるだろう。
ートリーのメンバーをコードする核酸配列の発現を可能とする発現ベクターであ
る。本発明のベクターの構築には従来の連結技法を用いる。単離したベクターも
しくはDNA断片を切断し、目的に合わせて作り変え、必要とするベクターを生成
するために望ましい形態に再連結する。所望により、その構築されたベクター中
に正しい配列が存在することを確認するための分析は既知の様式で行うことがで
きる。発現ベクターを構築し、in vitroで転写産物を調製し、宿主細胞中にDNA
を導入し、発現と機能を評価するための分析を行うための好適な方法は当業者に
は公知である。サザンもしくはノーザン分析法、ウエスタンブロッティング、DN
A、RNA、もしくはタンパク質のドットブロッティング、in situハイブリダイゼ
ーション、免疫細胞化学的方法、または、核酸分子もしくはタンパク質分子の配
列決定分析などの従来法によって、あるサンプル中のある遺伝子配列の存在が検
出されるか、またはその遺伝子配列の増幅および/もしくは発現が定量される。
当業者であれば、これらの方法を所望により改変する方法は容易に考えうるであ
ろう。
ドする1つ以上の核酸配列がベクター中にクローニングされれば、発現に先だっ
て突然変異誘発を行うことによって、そのクローニングされた分子内に多様性を
与えることができる。ポリペプチドレパートリーをコードする核酸配列の突然変
異誘発は、標準的な分子的方法で行われる。特に有用なのはポリメラーゼ連鎖反
応、すなわちPCRである(MullisおよびFaloona(1987) Methods Enzymol., 155:33
5、これは本明細書に参照により組み入れることとする)。PCRは熱安定性のDNA依
存性DNAポリメラーゼによって触媒されるDNA複製の多数回のサイクルを用いて対
象の標的配列を増幅するもので、当業界では周知である。
子で、核酸鋳型とハイブリダイズして第2の核酸の鎖の酵素的合成をプライミン
グさせるものである。プライマーは本発明のアレイのセットの調製に用いられる
核酸分子のプール中に存在する標的分子の一部分に対して相補的である。そのよ
うな分子が化学的もしくは酵素的に合成方法によって調製されることは意図され
ている。あるいはまた、そのような分子もしくはその断片は天然のものであり、
その天然の供給源から単離されるかまたは商業的供給者から購入したものである
。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプライマーは、長さが15〜100個のヌクレ
オチドで、異なる長さのオリゴヌクレオチドも有用ではあるが、理想的には20〜
40個のヌクレオチドである。
クレオチドの一続きにわたって少なくとも約65%相補的であり、好ましくは少な
くとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%相補的なことである)場合に選択
的ハイブリダイゼーションが起こる。Kanehisa (1984) Nucleic Acids Res., 12
:203を参照されたいが、これは本明細書に参照により組み入れることとする。こ
の結果として、プライミング部位でのある程度のミスマッチが許容されるものと
考えられる。そのようなミスマッチはおそらく小さなもので、モノ、ジ、もしく
はトリヌクレオチドの大きさであろう。あるいはまた、ミスマッチはヌクレオチ
ドのループを含む場合があり、それを本発明者らはミスマッチが4個以上のヌク
レオチドが連続した一連を包含する領域と定義する。
と選択性に影響を及ぼす5つの要素がある。それらの要素とは、(i)プライマーの
長さ、(ii)ヌクレオチド配列および/もしくは組成、(iii)ハイブリダイゼーショ
ン温度、(iv)バッファーの化学的特性、および(v)プライマーがハイブリダイズ
するために必要な領域における立体障害の可能性であるが、これらはランダムで
ないプライミング配列を設計する際には重要な検討項目である。
性の双方との間には正の相関がある;配列がより長くなれば、短いものより融解
温度(TM)が高くなり、その長い配列が所定の標的配列中で繰り返して存在する可
能性は低くなるが、そのことによって乱雑なハイブリダイゼーションを最小限と
する。G-C含量の高いプライマー配列、もしくはパリンドロームの配列を含んで
いるプライマー配列はそれが意図された標的部位とハイブリダイズするのと同様
に自己ハイブリダイズする傾向があるが、それは2分子性のものよりも単分子性
のハイブリダイゼーションは反応速度論的に見て溶液中では通常起こりやすいた
めである;同時に、標的配列に強固に結合するためにはG-Cヌクレオチド対の数
が十分含まれているプライマーを設計することが重要であるが、それはそのよう
な対の各々が、AとTの塩基対の場合に見られる2個ではなく、3個の水素結合で結
合するためである。ハイブリダイゼーションの温度の変動はプライマーのアニー
リング効率に反比例するが、それはハイブリダイゼーション混合物中に含まれう
る有機溶媒、例えばホルムアミドの濃度についても同様であるが、一方、塩濃度
が高くなれば結合しやすくなる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下では、より長いプローブは短いもの(それはより許容性のある条件下では十
分なものではある)よりも効率的にハイブリダイズする。ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件としては典型的には、塩濃度が約1M未満、より通常に
は約500mM未満、好ましくは約200mM未満であることが挙げられる。ハイブリダイ
ゼーション温度は、0℃から22℃を超え、約30℃を超え、(最も多くの場合)約37
℃を超えた範囲である。断片の長さが長ければ長いほど特異的ハイブリダイゼー
ションにはより高いハイブリダイゼーション温度が必要となりうる。ハイブリダ
イゼーションのストリンジェンシーにはいくつかの要素が影響を及ぼすので、そ
のうちのいずれか1つのみの絶対値よりも各パラメーターの組み合わせがより重
要である。
れば非常に多数の配列の相対的な利点を頭で推測することができるであろうが、
これらのいくつかのパラメーターの評価とプライマー配列の最適化を助けるため
のコンピュータープログラムが設計されている。そのようなプログラムの例とし
ては、DNAStarTM ソフトウエアパッケージの「PrimerSelect」(DNAStar, Inc.,
Madison, WI)およびOLIGO 4.0(National Biosciences, Inc.)が挙げられる。い
ったん設計されれば、適切なオリゴヌクレオチドは、例えば、BeaucageおよびCa
rruthers (1981) Tetrahedron Lett., 22:1859に記載されたホスホロアミダイト
法、もしくはMatteucciおよびCaruthers (1981) J. Am. Chem. Soc., 103:3185
に従ったトリエステル法(この2つの文献は本明細書に参照により組み入れること
とする)などの適切な方法によって、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成
器もしくはVLSIPSTM技法のいずれかを用いる他の化学的方法によって調製される
。
のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。プライマープールが非常に
不均質である場合には、各配列はそのプールの分子の小さな部分を表しているに
すぎないので、より多量のプライマーを用いることが有利である場合があり、そ
の量が後の増幅サイクルを限定することとなる。典型的な反応物中には、2μLの
DNA、25ピコモルのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μLの10X PCRバッファー
1(Perkin-Elmer, Foster City, CA)、0.4μLの1.25μM dNTP、0.15μL(もしく
は2.5ユニット)のTaq DNA ポリメラーゼ(Perkin-Elmer, Foster City, CA)が含
まれ、脱イオン水を加えて総容量を25μLとする。鉱物油を重層し、プログラム
できる熱サイクラーを用いてPCRを行う。
トリンジェンシーの要求性に従って調整される。アニーリング温度とタイミング
は、プライマーが鋳型とアニーリングする際に期待される効率、および許容しう
るミスマッチの程度の双方によって決定される:明らかなことは、核酸分子が同
時に増幅および突然変異誘発される場合には、ミスマッチが少なくとも第1ラウ
ンドの合成の際には必要なことである。突然変異誘発性のプライマーの混合プー
ルを用いて分子の集団の増幅を試みる際に、ストリンジェントな(高温)アニーリ
ング条件下で、低い融解温度の時のみ得られる可能性のある変異体産物が失われ
ることを、標的部位以外の配列に対するプライマーの雑然としたアニーリングと
比較して評価する。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適
化する能力は、当業者であればその知識の範囲内で十分行えることである。30℃
〜72℃の間のアニーリング温度が用いられる。鋳型分子の初回の変性は通常は92
℃〜99℃、4分間で生じ、次いで変性(94〜99℃で15秒間〜1分間)、アニーリング
(上記で論じたように決定した温度:1〜2分間)、および伸長(72℃で1〜5分間だ
が、増幅産物の長さに依存する)からなる20〜40サイクルが行われる。最終伸長
操作は通常は72℃で4分間で、その後不定の(0〜24時間)のステップを4℃で行う
ことができる。
数の技法に従って発現させることができる。本明細書で用いている「発現」とは
核酸からタンパク質への転写および/もしくは翻訳を意味する。
体化された核酸の形態でアレイされている場合、その核酸を発現するためにin v
itroの生物系のコンポーネントが必要である。これらのコンポーネントは特定の
系の要求に沿って以下のものから選択される:適切なバッファー、必要な成分の
全てを含んでいるin vitroの転写/複製系、および/もしくはin vitro翻訳系、酵
素と補因子、RNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、核酸(天然もしくは合成の)、転
移RNA、リボソームおよびアミノ酸、ならびに改変された遺伝子産物の選択がで
きるようにするための対象の反応の基質。
ファー中で活性な状態とするものであり、それ故に特定の反応系の各々の要求に
依存するものとなろう。生物学的反応に適したバッファーは当業界では公知であ
り、その配合表は種々の実験室テキスト、例えばSambrookら, 1989などに記され
ている。
y, 1980; Lesleyら, 1991: Lesley, 1995)、 ウサギ網状赤血球(PelhamおよびJa
ckson, 1976)、もしくはコムギ胚芽(Andersonら, 1983)から得たものを含んでい
るだろう。適切な系の多くが市販されており(例えばPromegaから)、そのような
ものとしては連結した転写/翻訳のできるもの(細菌系の全てならびにPromegaか
ら市販されている網状赤血球およびコムギ胚芽TNTTM抽出物系)が含まれる。用い
られるアミノ酸の混合物は、所望によりライブラリー中に産生されるタンパク質
の数もしくは多様性の可能性を増加させるために合成アミノ酸を含むことができ
る。このことはtRNAに人工のアミノ酸を負荷させ、そのようなtRNAを選択しよう
としているタンパク質のin vitroでの翻訳に用いることによって行うことができ
る(Ellmanら, 1991; Benner, 1994; Mendelら, 1995)。
現は細胞それ自体の内部で起こる。適切な宿主細胞は当業界では公知である。原
核生物、酵母、および高等真核生物細胞などの宿主細胞を、DNAを複製してポリ
ペプチドレパートリーを産生するために用いることができる。適切な原核生物と
しては、グラム陰性もしくはグラム陽性生物、例えば大腸菌K-12株、DH5αおよ
びHB101などの大腸菌、または桿菌などの真正細菌が挙げられる。さらにポリペ
プチドレパートリーをコードするベクターに適した宿主としては、真核生物の微
生物、例えば糸状菌、もしくは例えばサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharom
yces cerevisiae)などの酵母が挙げられる。高等真核細胞としては、昆虫および
脊椎動物の細胞、特にヒトの細胞を含む哺乳動物細胞、またはその他の多細胞生
物から得た有核細胞が挙げられる。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は
日常的な方法である。有用な哺乳動物宿主細胞系の例としては、上皮細胞もしく
は線維芽細胞系、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NIH 3T3細胞、
HeLa細胞、もしくは293T細胞などが挙げられる。本開示では宿主細胞とはin vit
roの培養物中の細胞ならびに宿主動物の体内にある細胞を含んでいる。
たは一過性に発現させることができる。安定的にトランスフェクトされた哺乳動
物細胞は、選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターを用いて細胞をトランスフ
ェクトし、そのトランスフェクトされた細胞をそのマーカー遺伝子を発現する細
胞に対する選択的な条件下で増殖させることによって調製することができる。一
過性のトランスフェクタントを調製するためには、トランスフェクションの効率
をモニターするためのリポーター遺伝子を用いて哺乳動物細胞をトランスフェク
トする。
るためには、細胞を十分な量の核酸を用いてトランスフェクトしなければならな
い。必要とされるポリペプチドレパートリーのメンバーをコードするDNAの正確
な量は経験的に決定することができ、特定の細胞およびアッセイに対して最適化
することができる。
ンスフェクトもしくは形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し
、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように改変された
従来の栄養培地中で培養する。当業界で公知のいずれの方法、例えば異種DNAを
コードするベクターを用いたリン酸カルシウム共沈法もしくはエレクトロポレー
ション法によるトランスフェクションによって異種DNAを宿主細胞中に導入する
ことができる。非常に多数のトランスフェクション法が当業者には知られている
。通常は宿主細胞内でこのベクターが機能していることを示すいずれのものが見
られたときにトランスフェクションの成功は認識される。形質転換は用いている
特定の宿主細胞に対して適切な標準的な技法を用いて行われる。
クター、もしくは組み合わせの各々が1種以上の個別の遺伝子をコードしている
プラスミドベクターの組み合わせ、または直鎖状DNAを用いる真核細胞のトラン
スフェクション、およびトランスフェクトされた細胞の選択の方法は当業界では
周知である(例えば、Sambrookら, (1989) 「分子クローニング:実験室マニュア
ル(Molecular Cloning:A Laboratory Mannual)」第2版, Cold Spring Harbor L
aboratory Pressを参照せよ)。
および培養方法を用いて培養することができるが、好ましくは該核酸分子によっ
てコードされるポリペプチドレパートリーが発現される条件下で培養される。適
切な培地の組成は当業者には知られており、容易に調製することができる。また
適切な培地は市販されている。
かに依るが、様々な方法のいずれによりアレイさせてもよい。
成では、それぞれ異なる核酸(例えばユニークな核酸配列)をアレイ内の区切ら
れて予め規定された位置に配置するやり方で、ある表面上に核酸のアレイを合成
する。それぞれの核酸の同一性は、アレイ内のその空間位置により決定される。
これらの方法は、米国特許第5.143,854号;WO90/15070およびWO92/10092;Fodor
ら (1991) Science, 251:767;DowerおよびFodor (1991) Ann. Rep. Med. Chem.
, 26:271に記載の方法を適用することができる。
ることができる。細胞を単純に細菌増殖培地上に置かれたフィルター上にまいて
増殖するとよいが、ロボット技術を使うと細胞コロニーの最も精密でかつ高密度
の格子配置が可能になるので、ロボット・ピッキング(robotic picking)によ
り細胞をアレイさせるのが有利である;しかし、マニュアルの技術を含め、細胞
または細胞コロニーを支持体上の区切られた位置に配置するいずれの適当な技術
を利用してもよい。
離にあってもよいしまたは無作為であってもよい。もしコロニーを無作為に配置
するのであれば、選んだ支持体上でコロニーがオーバーラップする確率を統計的
に減少させるかまたは無くするようにその密度を調節してもよい。
ており、この特許の内容は本明細書に参照により組み入れられる。
利用しうる市販技術を使ってアレイさせるか、または例えば上記のようにアレイ
させた抗体産生細胞アレイからin situで発現させてもよい。ロボット・アレイ
ング(robotic arraying)は当業界で周知であり、その機械はGenetix、Genetic
MicroSvstemsおよびBioRoboticsなどの会社から市販されており、高速度かつ高
精度で狭いまたは広い表面全体にアレイさせることができる。そのような機械は
、精製タンパク質、上清または細胞を多孔質または非多孔質表面上にスポットし
、もし安定したアレイを作る必要があれば、次いでそれらをそこに固定すること
ができる。アレイは、もし必要があれば、複製することができ、複数の標的リガ
ンドを用いる同時スクリーニングが可能になる。細胞に基づくアレイを溶解して
ポリペプチドをin situで放出させてもよいし、および/または発現したポリペ
プチドを固体支持体に公知の方法により固定してもよい。
的相互作用をする能力があるか、またはジェネリック相互作用をする能力がある
。特異的相互作用をする能力のある標的分子は、レパートリーから選択されるべ
き所望の活性を有するポリペプチドとだけ相互作用する能力がある。そのような
標的分子は、抗体に対する特異的抗原、または酵素に対する基質が挙げられる。
ジェネリック相互作用をする能力のある標的分子は一般的に、所望の特性をもつ
よりいくらか大きなレパートリーのサブセット、例えば正確にフォールドされて
いるかそうでなければ理論的に機能する能力のある機能性メンバーと相互作用し
うる。特に抗体ポリペプチドに対する特異的およびジェネリックリガンドの利用
は、国際特許出願WO99/20749に詳細に記載されており、その内容は参照により本
明細書に組み入れられる。
の性質によって様々なジェネリックリガンドを用いて検出することができる。従
って、もし標的分子が抗原であれば、レパートリーの特異的結合メンバーの検出
に標識したプロテインLを使ってもよいし、あるいはもし標的分子がプロテインL
であれば、レパートリーの機能性メンバーの検出に標識したプロテインAを使っ
てもよい。
原、または適当な抗体分子の形態をとってもよい。もし適当な抗体が公けに利用
できなければ、ファージディスプレイ手法によりまたは次のように作ることがで
きる。
標準技術を利用して抗体を作製することができる。例えば、タンパク質(または
「免疫原」)を、サル、ヤギ、ウサギまたはマウスなどの哺乳類に投与してチャ
レンジする。得られる抗体をポリクローナル血清として回収してもよいし、また
はチャレンジ動物からの抗体産生細胞を不死化して(例えば、不死化融合パート
ナーとの融合によりハイブリドーマを作って)、それらの細胞がその後モノクロ
ーナル抗体を産生するようにしてもよい。
ンジュゲートして使用し、ペプチド-担体コンジュゲートに対する抗血清を上記
のように動物に産生させる。ペプチドと担体タンパク質のカップリングおよび免
疫感作は記載されたように実施することができる(Dymeckiら, (1992) J Biol.
Chem. 267:4815)。血清はタンパク質抗原に対してELISAによりまたは代わりに
ドットもしくはスポットブロッティングにより滴定する(BoersmaおよびVan Lee
uwen (1994) J. Neurosci. Methods, 51:317)。血清が適当なペプチドと強く反
応することはELISAにより、例えばGreenら, (1982) Cell. 28:477の方法によっ
て示されている。
しくは担体と結合した任意の候補抗原を用いて、Arnheiterら, (1981) Nature, 294 ,278に記載のように調製することができる。モノクローナル抗体は典型的に
は、ハイブリドーマ組織培養からまたはハイブリドーマ組織を導入した動物から
得た腹水液から取得される。それでも、モノクローナル抗体はあるタンパク質「
に対して産生された」または「より誘導された」と記載することができる。
異性について試験する。ファージディスプレイまたは他のin vitro選択技術によ
り作られた組換え抗体を試験するのと同様な方法も使うことができる。モノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ(またはポリクローナル血清)を免疫原と結合す
る抗体についてスクリーニングすることもできる。特に好ましい免疫学的試験は
、酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、免疫ブロットおよび免疫沈降(Voller, (
1978) Diagnostic Horizons. 2:1, Microbiological Associates Quarterly Pub
lication. Walkersville, MD;Vollerら, (1978), J. Clin. Pathol., 31:507;
米国再発行特許第31,006号;英国特許第2,019,408号;Butler (1981) Methods E
nzymol., 73:482;Maggio. E.(編), (1980) 「酵素イムノアッセイ(Enzyme Imm
unoasscry)」, CRC Press, Boca Raton, FLを参照)、またはラジオイムノアッ
セイ(RIA)(Weintraub, B., 「ラジオイムノアッセイの原理、放射性リガンドア
ッセイ技術に関する第7回訓練コース(Principles of radioimmunoassays, Sev
enth Training Course on Radioligand Assay Techniques)」, The Endocrine
Society, March 1986, pp. 1-5, 46-49および68-78)が挙げられ、全て、抗体と
その抗体を産生させた免疫原との結合を検出する試験である。当業者であれば、
抗体分子または免疫原はその検出を容易にするために標識しなければならないこ
とは明白であろう。抗体分子を標識するための技術は当業者には周知である(Ha
rlour and Lane (1989),「抗体(antibodies)」, Cold Spring Harbor Laborat
ory, pp.1-726を参照)。
度を確認することもできる。これらの技術は、SDS PAGE、等電点電気泳動、ウェ
スタンブロット、HPLCおよびキャピラリー電気泳動が挙げられる。
(可変部)を利用する構築物として定義される。従って、本発明に利用しうる抗
体は、全抗体、抗体フラグメント、多機能性抗体集合体、または一般的に抗体由
来の1以上の特異的結合部位を含んでなるいずれの物質であってもよい。抗体フ
ラグメントはフラグメント、例えばFv、FabおよびF(ab')2フラグメント、または
それらのいずれかの誘導体、例えば一本鎖Fvフラグメントであってもよい。抗体
または抗体フラグメントは非組換え体、組換え体またはヒト化抗体であってもよ
い。抗体はいずれの免疫グロブリンアイソタイプ、例えばIgG、IgMなどであって
もよい。さらに、適当な場合には、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメント
の集合体、ポリマー、誘導体およびコンジュゲートを使ってもよい。
ドであるか特異的抗原であるかを問わず、当業界で周知の技術によって標識する
ことができる。プローブを標識する方法は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E
. F. & Maniatis, T. (1989)「分子クローニング、実験マニュアル(Molecular
Cloning. A Laboratory Manual)」 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N
.Y.)、またはAusubelら編, (1990)「分子生物学の現行プロトコル(Current Pro
tocols in Molecular Biology)」, John Wiley & Sons Inc.に記述されている
。
おいて使用することもできる。ポリペプチドが抗体ポリペプチドである場合、こ
れらをリガンド-ポリペプチド結合に関わるいずれの方法に使用してもよく、in
vivo治療および予防の応用、in vitroおよびin vivo診断の応用、in vitroアッ
セイおよび試薬の応用、その他が挙げられる。例えば、抗体の場合、抗体分子を
、当業者が周知する方法によってELISA技術などの抗体に基づくアッセイ技術に
利用してもよい。
法において利用しうる。例えば、酵素変異体を作製し本発明の方法により選択し
、当業界で周知の技術を使ってin vitroもしくはin vivoで活性について検定し
てもよく、その場合、それらを候補基質分子とともにインキュベートして基質の
産物への転化を分析する。選択された細胞表面受容体もしくは接着分子を培養細
胞中に発現させ、次に、それらの生化学的刺激に対する応答能力についてまたは
未多様化接着分子が結合すると予想される細胞表面分子を発現する他の細胞型と
の親和性について、それぞれ試験してもよい。本発明により選択される抗体は診
断としてウェスタン分析におよび標準免疫組織化学的方法によるin situタンパ
ク質検出に利用され;これらの応用に使用するに当たって、選択されたレパート
リーの抗体を当業界で周知の技術によって標識してもよい。さらに、そのような
抗体ポリペプチドは、樹脂などのクロマトグラフィー支持体と複合化して分取用
のアフィニティクロマトグラフィーに利用してもよい。これらの技術は全て当業
者には周知である。
選択されたポリペプチドのヒトなどの受給哺乳類動物への投与に関わる。これに
関して特に使われるのは、抗体、他の受容体(限定されるものでないが、T細胞
受容体を含む)および、抗体または受容体をジェネリックまたは標的リガンドと
して使う場合は、それらと結合するタンパク質である。
な抗体またはそれらの結合タンパク質が好ましく、製薬用途については、特に哺
乳類動物がヒトであるとき、98〜99%以上の均質性が最も好ましい。部分的にま
たは所望の均質性に精製されれば、選択されたポリペプチドを診断にまたは治療
に(体外を含めて)またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などを開発しかつ実施す
るのに利用することができる(LefkoviteおよびPernis. (1979および1981) 「免
疫学的方法(Immunological Methods)」, Volumes IおよびII. Academic Press
. NY)。
症状、アレルギー過敏症、癌、細菌もしくはウイルス感染および自己免疫傷害(
限定されるものでないが、I型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リューマチ、全
身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が挙げられる)を予防し
、抑制しまたは治療するのに用途を見出しうる。
与に関わる。「抑制」は疾患の誘導事象後であるが臨床外観に先行した組成物の
投与を意味する。「治療」は疾患症候が明白になった後の保護組成物の投与に関
わる。
有効性をスクリーニングするために使う動物モデル系を利用できる。感受性マウ
スにおける全身性エリテマトーデス(SLE)の試験方法は当業界で周知である(K
nightら, (1978) J. Exp. Med., 147:1653;Reinerstenら, (1978) New Eng. J.
Med., 299:515)。重症筋無力症(MG)はSJL/J雌マウスにおいて他の種由来の
可溶性AchRタンパク質を用いて疾患を誘導することによって試験される(Lindst
romら, (1988) Adv. Immunol., 42:233)。関節炎はマウスの感受性株においてI
I型コラーゲンの注射により誘導される(Stuartら, (1984) Ann. Rev. Immunol.
, 42:233)。アジュバント関節炎は感受性ラットにおいて放線菌熱ショックタン
パク質の注射によって誘導されたモデルが記載されている(Van Edenら, (1988)
Nature, 331:171)。甲状腺炎は記載されたようにマウスにおいてチログロブリ
ンの投与によって誘導される(Maronら, (1980) J. Exp. Med. 152:1115)。イ
ンスリン依存性糖尿病(IDDM)は自然に生じるかまたはKanasawaら, (1984) Dia
betologia, 27:113に記載されたマウスのある特定の株において誘導し得る。マ
ウスおよびラットのEAEはヒトのMSに対するモデルの役割を果たす。このモデル
においては、脱髄性疾患がミエリン塩基性タンパク質の投与により誘導される(
Paterson (1986) 「免疫病理学教科書(Textbook of Immunopathology)」, Mis
cherら編, GruneおよびStratton. New York, pp.179-213;McFarlinら, (1973)
Science. 179:478;およびSatohら, (1987) J. Immunol., 138:179を参照)。
む)またはそれらの結合タンパク質はまた、疾患の原因となるヒト細胞上の他の
マーカーと反応性のある他の抗体、特にモノクローナル抗体(MAb)と組合せて
使ってもよい。例えば、適当なT細胞マーカーは、第1国際白血球分化作業会(Be
rnhardら, (1984) 「白血球分類(Leukocvte Typing)」, Springer Verlag. NY
)により名付けられたいわゆる「分化のクラスター(Clusters of Differentiat
ion)」に分類されたマーカーが挙げられる。
れた形態で薬理学的に適当な担体と一緒に利用し得る。典型的には、これらの担
体として、塩類および/または緩衝化媒質などを含む水溶液もしくはアルコール
/水溶液、乳化液または懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとして、塩化ナト
リウム溶液、ブドウ糖入りリンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウム入りリン
ゲル液ならびに乳酸加リンゲル液が挙げられる。もしポリペプチド複合体を懸濁
液で保持する必要があれば、生理学的に許容される適当なアジュバントを、カル
ボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジン、ゼラチンおよびアルギン酸塩
などの濃厚剤から選択してもよい。
および電解質補充剤が挙げられる。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不
活性ガスなどの保存剤および他の添加剤が存在してもよい(Mack (1982) 「レミ
ントンの製薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」,第16版)。
の薬剤と一緒に使用することができる。これらには、シクロスポリン、メトトレ
キセート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの様々な
免疫治療薬が含まれうる。製薬組成物は、本発明の選択された抗体、受容体もし
くはそれらの結合タンパク質と一緒に、または異なる標的リガンドを使って選択
したポリペプチドなどの異なる特異性を有する本発明により選択されたポリペプ
チドの組合せとすら一緒に、様々な細胞傷害性または他の薬剤の「カクテル」を
含んでなってもよく、それらが投与前にプールされてもまたはされなくてもよい
。
。限定されるものでないが免疫治療を含む治療のために、本発明の選択された抗
体、受容体またはその結合タンパク質を、いずれの患者に標準技術によって投与
してもよい。投与は適当ないずれの方式によってもよく、非経口、静脈内、筋内
、腹腔内、経皮、肺経路経由、または適当であればカテーテルを用いる直接注入
が挙げられる。投与の用量と頻度は、患者の年齢、性および症状、他の薬物の併
用投与、反対症状および臨床医が考慮に入れるべき他のパラメーターに依存する
。
て適当な担体中で再構成してもよい。この技術は通常の免疫グロブリンについて
効果的であることが示されており、当業界で知られる凍結乾燥および再構築技術
を利用することができる。当業者であれば、凍結乾燥と再構成は様々な程度の抗
体活性損失(例えば、通常の免疫グロブリンについては、IgM抗体はIgG抗体より
大きな活性損失を伴いがちである)をもたらすので、補償するために使用レベル
を上方調節すべきであることを理解するであろう。
予防および/または治療処置用に投与することができる。ある特定の治療応用に
おける、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅、
または複数の他の測定可能なパラメーターを達成するための十分な量を「治療上
有効な用量」として定義する。この用量を達成するために必要な量は、疾患の重
篤度および患者自身の免疫系の総合的状態に依存するが、一般的に体重1キログ
ラム当たり選択された抗体、受容体(例えばT細胞受容体)またはそれらの結合
タンパク質の0.005〜5.0mgの範囲であり、さらに通常は0.05〜2.0mg/kg/用量が
使用される。予防の応用に対しては、本発明の選択されたポリペプチドまたはそ
れらのカクテルを含有する組成物を類似したまたは若干低い用量で投与してもよ
い。
れた標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または除去を促進する予防および治療
設定において利用することができる。さらに、本明細書に記載の選択されたレパ
ートリーのポリペプチドは、体外またはin vitroで、細胞の不均一なコレクショ
ンから標的細胞集団を選択的に死滅するかまたは効果的に除去するために使って
もよい。哺乳類動物からの血液を、選択された抗体、細胞表面受容体またはそれ
らの結合タンパク質と体外で組合せ、それによって望ましくない細胞を死滅させ
るかまたは血液から除去し、そして標準技術によって哺乳類動物に戻してもよい
。
解物のいずれかに対して1ラウンドのファージ選択により標的リガンドとの結合
について濃縮した単一フォールドに基づくscFvライブラリーを利用した。この抗
体フォールドは両方のジェネリックリガンド、プロテインLおよびAと結合する。
本発明者らはツーフィルター(two-filter)法を使用したが、この方法では細菌
を1つのフィルター上で増殖し、分泌されたscFvを他のフィルター上に捕捉する
。フィルター上の標的分子は、選択に使われる抗原、他の(恐らく関係する)抗
原またはプロテインLのいずれかであった。従って、スクリーニングは、特異的
標的結合抗体(この場合、結合した抗体の検出はプロテインL-HRPを使った)ま
たは、後者の場合、機能性でかつよく発現された抗体(この場合、結合した抗体
の検出はプロテインA-HRPを使った)のいずれかに対して実施した。全事例でラ
イブラリーの0.1-1%に当たる特異的抗体結合分子が同定され、かつジェネリック
リガンドを標的分子として用いて確認すると、5-50%が機能性として検出されか
つよく発現されたことが同定された。
電流インデューサータンパク質(D)、α-2グロビン(H)およびユビキチン(T
)をヒト脳cDNAライブラリーhEX1(Bussowら,1998)から取り、(Luekingら,199
9)に記載のように発現した。粗細胞溶解物を収穫して選択に使った。各クロー
ンの発現レベルは、各溶解物の連続希釈物をドット-ブロット装置に移し、ニト
ロセルロース膜上に固定して測定した。このフィルターを2%スキムミルク粉PBS
(MPBS)中で30分間ブロックし、PBSを用いて3回洗浄した。組換えタンパク質を
抗RGS-His抗体(Qiagen;2% MPBS中に1/2000)と続いて抗マウスHRP抗体(Dako
;2% MPBS中に1/2000)を用いて検出し、そして化学発光検出試薬(ECL, Amersh
am)を用いて発色させた。各タンパク質の等モル量を各選択物中およびその10、
100および1000倍希釈物と混合した。
)をもつVH(V3-23/DP-47およびJH4b)およびVκ(O12/O2/DPK9およびJκ1)に
対する単一ヒトフレームワークに基づき、VHおよびVκは既知構造の抗原と接触
しかつ成熟レパートリーが高度に多様である抗原結合部位の位置に組込まれてい
る。使用したフォールドは頻度高くin vivoで発現してジェネリック結合リガン
ドプロテインLおよびAと結合するので、scFvの捕捉と検出が容易でありかつ抗原
結合部位を妨害しない。ライブラリーはファージミド/scFvフォーマットでプロ
テインAおよびプロテインLとの結合についてプレスクリーニングしておいたので
、未選択ライブラリー中の大多数のクローンは機能性であった(Tomlinsonら,未
開示の結果)。このライブラリーを、KM13ヘルパーファージ(プロテアーゼ切断
部位をもつ遺伝子3タンパク質(gene 3 protein)を含有する)を使用しかつフ
ァージをトリプシンで溶出したことを除くと、本質的に(Marksら,1991)に記
載された通り選択した。この選択はscFv融合を有しない全ての遺伝子3タンパク
質を切断し、バックグラウンドファージ感染の除去をもたらし、c-mycタグにお
けるタンパク質分解切断によってscFv融合をもつファージを溶出する(Kristens
enおよびWinter,1998)。1ラウンドの選択を、BSA(10μg/ml PBS)、5つの未精
製組換えタンパク質(C、D、H、MまたはT、それぞれ100μg/mlまたはその10倍希
釈物)混合物またはHeLa細胞(100μg/ml)をコートした免疫チューブ(Nunc, M
axisorp)上で実施した(Verheijenら,1990)。
、TYE、100μg/mlアンピシリン、1%グルコースを含有する)上に104コロニー/プ
レートをプレーティングし、一夜、30℃で増殖した。コロニーを拾って(BioRob
oticsコロニーピッカー)、384ウエルプレート(Genetix、2xTY、100μg/mlアン
ピシリン、1%グルコース、8%グリセロールを含有する)中に入れ、一夜37℃にて
増殖した。プレートは直接使用するかまたは凍結して-70℃で保存した。384ウエ
ルプレートを二重クローンの4x4パターンで大きな正方形プレート(Genetix Qト
レイ、TYE、100μg/mlアンピシリン、1%グルコースを含有する)上に格子配置し
(Genetix、Q-bot)、ニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuell)を
用いて覆った。プレートに移す前に、このフィルターを2%スキムミルク粉PBS(M
PBS)中で30分間室温(RT)でブロックし、簡単にPBSを用いて洗浄し、2 x TYに
浸漬した。格子配置したプレートを一夜37℃にて増殖した。その間に、他のニト
ロセルロースフィルターを、0.5μg/mlプロテインL(Actigen)、100μg/mlウシ
血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)、細菌タンパク質C、D、H
、MもしくはT、またはHeLa細胞タンパク質(107細胞から(Verheijenら, 1990)
)を含む100ml PBSを用いて一夜、4℃でコートした。このフィルターを2% MPBS
中で1時間ブロックし、3 x PBS中で洗浄し、2 x TY中に浸漬し、次いで大きな正
方形プレート(230 x 230mm、Nuncプレート、TYE、100μg/mlアンピシリン、1mM
イソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)を含有する)上に移した。コロニ
ーを含有する第2のフィルターを、第1の標的分子フィルターで覆ったプレート上
に移した。これらのプレートを3時間30℃にてインキュベートした。この方法の
模式図による概要を掲げる(図1)。
T)を用いて洗浄し、そして2% MBPSを用いて30分間室温でブロックした。フィル
ターを3 x PBSTを用いて洗浄した。特異的抗原結合の場合には、フィルターをプ
ロテインL HRPコンジュゲート(Actigen、1/4000)を含む2% MPBSを用いて1時間
室温にてインキュベートした。ジェネリックアッセイの場合には、ブロッキング
後にフィルターをプロテインA HRPコンジュゲート(Amersham、1/5000)を用い
てインキュベートしたことを除いて、フィルターを上記のように処理した。フィ
ルターを3 x PBSTを用いて洗浄し、ストレプトアビジン-HRP(Pierce)1/5000を
含むPBSTを用いて15分間室温でインキュベートした。フィルターを洗浄し、そし
てECL試薬を用いて発色させた。全てのインキュベーションは静かに攪拌するシ
ェーカー上の50mlのバッファー中で実施した。
と結合するかどうかを確認するため、2 x TY(100μg/mlアンピシリンおよび0.1
%グルコースを含有する)に一夜培養からの1/100容積を接種した。これらを37℃
でOD600がほぼ0.9になるまで増殖した。1mM IPTGを加え、培養を30℃にて一夜振
とうした。培養をスピンにかけ、上清をELISAに使った。96ウエルEISAプレート
を10μg/ml BSAを用いて一夜4℃にてコートした。プレートを3回PBSを用いて洗
浄し、2% Tween/PBSを用いて2時間室温にてブロックした。プレートを3回PBSを
用いて洗浄し、50μlの上清を50μlの2%Tween/PBSを用いて1.5時間室温にてイン
キュベートした。プレートを5回PBSTを用いて洗浄し、プロテインL HRPコンジュ
ゲート(2% Tween PBS中に1/4000)を用いて1時間室温にてインキュベートした
。プレートを5回PBSTを用いて洗浄し、反応物を3,3',5,5'-テトラメチルベンジ
ジンを用いて発色させ、硫酸を用いて停止した。
を用いて増幅しかつPCR精製カラム(Qiagen, CA)を使って精製したPCR産物を配
列決定のテンプレートとして使用した。配列決定反応は、重鎖に対してプライマ
ーLMB3をそして軽鎖に対してpHENを用いて、ABI PRISM Big Dye Terminator Cyc
leシーケンシングキット(Perkin Elmer, CA)を使って実施した。反応は自動シー
ケンサー(Applied Biosystems 373A, Perkin Elmer)上で実施した。
れたscFvファージミドライブラリーを得る目的で、1つの精製抗原(BSA)につい
て選択されたライブラリーを使用した。ロボットを使って8448クローン(22 x 3
84ウエルプレート)をピッキングして格子配置したが、この数は1ラウンドの選
択後(約104ファージを溶出した)に存在するほとんど全ての回収クローンを含
む。機能的scFvを発現するクローンの画分を決定するため、プロテインLをコー
ティングしたフィルター上でscFvを捕捉し、プロテインA HRPコンジュゲートを
用いて検出した。この結果は、クローンの約50%が機能的で、よく発現されたこ
とを示した(図2)。特異的に結合するとともに交差反応性のあるクローンを同
定するため、スクリーニングをBSA、HSAおよび無関係なタンパク質(HeLa細胞タ
ンパク質)の混合物について実施した。BSA、HSAまたはHeLa細胞タンパク質をフ
ィルター上にコーティングし、結合性のscFvをプロテインLコンジュゲートを用
いて検出した。アレイしたscFvとBSAおよびHSAとの反応性の典型的なパネルをそ
れぞれ図2Bおよび2Cにそれぞれ示す。本発明者らはアレイされた8448クローンの
うち50クローンがBSAを認識することを見出した。これら50クローンのうちの1つ
はまたHSAを認識し、そして1つのクローンはHeLa細胞のタンパク質と反応した(
データは示してない)。BSAまたはHSAを認識しなかった大多数のクローンはHeLa
細胞抽出物中に存在するタンパク質を認識し(データは示してない)、「粘着性
」クローンの選択を示した。このように、異なる標的分子についての平行した直
接スクリーニングを利用すると、BSA特異的抗体、BSAおよびHSAの両方と結合す
るが広い交差反応性のない抗体、交差反応性(粘着性)抗体、ならびに標的分子
と結合しない抗体の同定が可能になる。
LISAでBSAとの結合について試験した。これらのクローンのほとんどはELISAで確
かに陽性であったので、これらの中の16クローンをさらに配列決定分析により特
性を決定した。ELISAでBSAを認識しなかったクローンはscFvを低レベルで発現し
たかまたは全長インサートを有していなかった。単一ドメインを発現するクロー
ンの最初のスクリーニングにおける陽性同定は、恐らく通常VH/VLインターフェ
ースに埋められた疎水性残基による。BSA特異的な16クローンのVHおよびVLの配
列決定分析により、異なる5クローンが存在することが示された(表1)。2クロ
ーンは複数回存在した。クローン29IJ11は2回、またクローン29IJ7は11回見出さ
れた。他の3クローンは1回だけであった。これらの抗BSA scFvのVH CDR3領域の
配列は、無作為化残基におけるコンセンサスを示す。コンセンサスCDR残基は他
抗原に対して特異的なAbにおいて典型的に見出されるので、この結果はこれらの
クローンが特異的であることを確証する(Clacksonら,1991;De Wildtら,1997)
。
希釈物の混合物について選択されたscFvライブラリーをスクリーニングした。12
288クローン(32 x 384)を格子配置し、このライブラリーの多重コピーを5つの
組換えタンパク質との結合について別々にスクリーニングした。最初のスクリー
ニングにおける潜在特異的scFvクローンを、組換えタンパク質との結合について
ELISAで試験した。D(15クローン)、M(12クローン)およびT(20クローン)に
ついて特異的scFvを同定したので、タンパク質混合物の1000倍希釈物を使ってこ
れらのscFvのいくつかを単離した。これらのクローンの配列を表1に記述したが
、抗ユビキチンクローンの大部分はそれらのVHCDR3残基にコンセンサス配列を示
す。複数のクローンは異なるヌクレオチド配列を有するが、同じCDR3アミノ酸残
基をコードする。
グした。18,342クローンを格子配置し、HeLa細胞溶解物、酵母細胞溶解物または
無関係なタンパク質(FITC-BSA)でコーティングしたフィルターとの結合につい
て試験した。数個の潜在scFvクローンを、HeLa細胞または酵母細胞のウェスタン
ブロットにおいて試験した。5クローンがHeLa細胞に存在するタンパク質を認識
するが、酵母細胞に存在するタンパク質を認識しないことを見出した。
ことを実証している。本発明者らは2つのアプローチを用いた:第1のアプローチ
、すなわち抗原のフィルター上のコーティングおよび特異的に結合したscFvだけ
の直接検出は、標的分子のビオチン化またはタグ付けを必要としない利点を有す
る。このフォーマットは2回のインキュベーション工程(ブロッキングと検出)
しか含まず、scFvが二量化して多重プロテインLコンジュゲートの結合を生じが
ちであることを考慮すると、感度の増加をもたらす。このアプローチはまた、対
応核酸配列を宿す細菌を同じまたは異なるフィルター上に二重スポットできるの
で、大多数のscFvを同時に1以上の抗原についてスクリーニングする可能性も提
供する:一般に、18,342コロニーを1つのマクロアレイ上に二重スポットすると
、38496ウエルELISAプレートと等価である。またこれらのアプローチは示差特異
的scFvおよび交差反応性scFvの同定を可能にするのであって、これをBSAだけを
認識するクローン、BSAとHSAの両方を認識するクローン、およびHeLa細胞中のタ
ンパク質を認識するが酵母のタンパク質を認識しないクローンによって示す。BS
AとHSAは75%を上回る相同性があるので、複数の抗体が両方のタンパク質に存在
するエピトープを認識することは驚くに足らない。さらにこれらのアレイを用い
て不純な抗原をスクリーニングすることができ、これを組換えタンパク質D、Mお
よびTに対して特異的なscFvを同定して実証する。他のタンパク質アレイとは対
照的に(Bussowら, 1998)、これらの抗体アレイはタンパク質を固定するための
いずれの変性工程も必要としない。実際、標的分子は未変性であっても、変性さ
れていても、タンパク質分解されていてもまたは底部のフィルターにコーティン
グするに先立っていずれか他の方法で前処理されていてもよい。
得た結果と比較すると、ここで同定した3つのscFvは3〜4ラウンドのファージ選
択後でも単離されることが示される。しかし、ただ1回のファージ選択後に直接
アレイスクリーニングを実施することによって、本発明者らは2つのさらなるク
ローン(クローン29IJ11および29IJ12)を見出したが、これらはラウンド3およ
びラウンド4選択の広範なスクリーニング後に見られないものであった。このこ
とは、3または3ラウンドのファージ選択に関わる多重感染、増殖およびファージ
産生ステップ期間に、異なるクローン間の競合によってこれらが失われたことを
示す。陽性50クローンのうち16だけしか配列決定してないので、これらの陽性50
クローン中にはさらにユニークなBSA特異的scFvが存在したと思われる。これら
の2つのユニークなクローンのアレイ上のECLシグナルは、例えばナノモル親和性
を有するクローン29IJ1と比較しうる強度である。このことは、複数ラウンドの
ファージディスプレイを実施することによって潜在的に有用なscFvが失われ、従
って、結合クローンの最も多様なコレクションを単離するには、本明細書に記載
した形式のハイスループットスクリーニングが必須であることを示す。
突然変異もしくは転写後改変など)を認識する抗体をスクリーニングするか、ま
たは細胞表面上に発現された分子などの不純な抗原に対する結合体をスクリーニ
ングすることができる。複数ラウンドのファージ選択はしばしば他の免疫優性な
エピトープもしくは他の細胞表面分子に対する結合体を生じる(Hoogenboomら,
1999)。これを避けるため、不純な抗原に対する選択は、枯渇もしくはサブトラ
クションストラテジー(De Kruifら, 1995;Cai & Garen, 1996)、または「パ
スファインダー(Pathfinder)」と呼ばれるリガンド指向技術(Osbournら, 199
8)を使って実施されている。本明細書に記載した直接ハイスループットスクリ
ーニングはこれらの技術のいずれにも応用できる。スクリーニング方法はまた、
複数の標的リガンドを用いて実施してもよい。標的リガンドは、お互いに混合し
た異なるタンパク質であってもまたは細胞タンパク質の抽出物であってもよい。
混合物中にそれぞれの標的タンパク質が存在しかつ十分な量が固定されていれば
、特異的scFvの検出は可能である。
(Marksら, 1992)またはCDR多様化(Schierら, 1996)のいずれかにより作製し
た所定の抗体の突然変異体のライブラリーからより高い親和性結合体を同定する
ことができる。ヒト化またはより高い親和性抗体フラグメントを作製するために
、抗体フラグメントのライブラリーを、オリゴヌクレオチドまたは誤りがちなポ
リメラーゼを用いて指定または無作為突然変異誘発により生成することができる
。これらのライブラリーまたはこれらのライブラリーの部分をアレイフォーマッ
トで容易に増殖しかつ発現することができ、その後、それらの標的リガンドとの
結合のまたは結合の改善についてスクリーニングすることができる。
においてこれらのタンパク質の改変を含めたタンパク質の発現の特性決定に有用
な用途がある。cDNAアレイを通してmRNA発現レベルを研究するゲノミックス(ge
nomics)とは対照的に、プロテオミックスはタンパク質機能性を直接、取り扱う
。この領域では現在、2D電気泳動が主に使用されている。組換え抗体のアレイを
使うことで、タンパク質混合物(例えば、細胞抽出物)中の1以上のタンパク質
の発現を分析する既存技術を補うことができる。
組換えタンパク質のリガンド結合についてハイスループット分析をすることが可
能になる。特に、ヒット率が従来のELISAを用いて検出するにはあまりに低いが
アレイを用いて同定できるだけ十分高い(>10-4)場合、およびファージ選択の
ラウンドの繰り返しが有利でない場合である。しかし、このアプローチは抗体-
抗原相互作用に制限されるものでなく、活性酵素のスクリーニングを含む他の機
能的タンパク質-リガンド相互作用を研究するために使うことができる。例えば
、転写因子変異体または他のDNA結合タンパク質のライブラリーを、特定のDNA配
列と結合する能力について試験することができる。例えば、ジンクフィンガーは
、多数の真核生物転写因子に存在することが著名な小さいDNA結合モジュールで
あり、ある特定数のDNA配列と結合する。過去に、BCR-ABL融合発癌遺伝子のユニ
ークな9塩基対領域と特異的に結合するジンクフィンガーが遺伝子工学的に作製
されており、このジンクフィンガーはこの発癌遺伝子の転写を妨害する(Chooら
, 1994)。アレイスクリーニングは、腫瘍増殖に必須な因子の産生を阻害しうる
このような配列特異的DNA結合ペプチドまたはタンパク質を同定するために有用
であることができる。
トの酵素ライブラリーの増殖および発現を、他のフィルター上に固定した標的リ
ガンドに密接した近位において行うことを含む。次に、転化した基質を、標的リ
ガンドフィルター上の特定の抗産物親和性試薬を用いて検出する。酵素とその基
質が数時間、密接した近位に存在するので、これにより高い代謝回転率をもつ酵
素だけでなくもっと低い代謝回転率をもつ酵素の検出も可能になると期待される
。この方法において、本発明者らは、産物結合に基づく既存の触媒のファージ選
択技術、例えばアルドラーゼの選択(Barbasら, 1997)などを改善することがで
きる。
る。例えば、HeLaなどの真核生物細胞系を増殖してフィルター上に固定してもよ
い。次いで接着分子のライブラリーを、細胞表面分子CD95(APO-1、FAS)を介す
るアポトーシスの誘導などの機能的相互作用についてスクリーニングしてもよい
。読み出し(readout)はホスファチジルセリンの転位またはp53の発現などの下
流事象であってもよい。CD95受容体を認識するCD95リガンドの無作為化ライブラ
リーをスクリーニングし、細胞表面ホスファチジルセリンのアネキシン-V検出(
Boehringer Mannheim)またはp53検出(Boehringer Mannheim)によりアッセイ
してもよい。
否かを決定するため、本発明者らは相互作用することが知られるタンパク質の対
、すなわち、プロテインMと抗M scFv M12、プロテインTと抗T scFv T15、ならび
にFKBP-ラパマイシン付随タンパク質(FRAP)のFKBP 12ラパマイシン結合(FRB
)ドメインとヒトイムノフィリンFKBP12 (12 kD FK506 結合ドメイン)について
研究した。FRB-FKBP12相互作用は小分子ラパマイシンの存在に依存する。M、Tま
たはFKBP12をコードする遺伝子は、pACYC(クロラムフェニコール耐性)中にグ
ルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)とのC末端融合体としてクローニング
した。M12(抗M scFv)およびT15(抗T scFv)を、pHEN誘導体pIT2(アンピシリ
ン耐性)中にクローニングした。FRBおよびFKBP12を、pIT2中にVκ単一ドメイン
とのC末端融合体としてクローニングした。
培養(TYE、100μg/mlアンピシリンまたは10μg/mlクロラムフェニコール、1%グ
ルコース)で増殖した。これらの培養の複数の組合せを一緒に混合して(相互作
用するパートナーまたは対照)、寒天プレート(TYE、1%グルコース)上にスポ
ットし、ニトロセルロースフィルターで覆った(SchleicherおよびSchuell)。
プレート上に移す前に、このフィルターを2%スキムミルク粉末PBS(MPBS)中で3
0分間、室温(RT)にてブロッキングし、PBS中で簡単に洗浄し、そして2 x TYに
浸漬した。格子配置したプレートを一夜37℃にて増殖した。その間に、別のニト
ロセルロースフィルターを、2μg/mlの抗GST抗体(Pharmacia Biotech)を含むP
BSを用いて一夜4℃にてコーティングした。このフィルターを2% MPBS中で1時間
、室温にてブロッキングし、PBSで3回洗浄し、2 x TYに浸漬し、そして寒天プレ
ート(TYE、1mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG))上に移した。FRB-F
KBP12相互作用の検出については、プレートに0.1μg/mlのラパマイシンを加える
かまたは加えなかった。細菌クローンを含有する第2のフィルターを抗GSTをコー
ティングしたフィルターで覆ったプレート上に移した。これらのプレートを5時
間、30℃にてインキュベートした。
を用いて3回洗浄し、そして2% MPBSを用いて30分間室温でブロッキングした。フ
ィルターをPBSTを用いて3回洗浄し、プロテインL HRPコンジュゲート(Actigen
、1/4000)を含む2% MPBSを用いて1時間室温にてインキュベートした。フィルタ
ーを洗浄し、ECL試薬(Amersham)を用いて顕色した。全てのインキュベーショ
ンは静かに攪拌するシェーカー上で実施した。
るか否かを確認するため、2 x TY(100μg/mlのアンピシリンまたは10μg/mlの
クロラムフェニコールおよび0.1%グルコースを含有する)に一夜培養からの1/10
0容積を接種した。これらを37℃でOD600が約0.9になるまで増殖した。1mM IPTG
を加え、培養を25℃または30℃(scFv)にて一夜、振とうした。培養をスピンに
かけ、上清をELISAに使った。96ウエルEISAプレートを抗GST 2μg/mlを含むPBS
を用いて一夜4℃にてコーティングした。プレートをPBSを用いて3回洗浄し、2%
Tween/PBS(scFv-抗原対に対して)または2% BSA/PBS(FRB-FKBP12対に対して)
を用いて2時間室温にてブロッキングした。プレートをPBSを用いて3回洗浄した
。pACYC-GSTクローンからの上清50μlおよびpIT2クローンからの上清50μlを2%
Tween/PBSまたは2% BSA/PBSの50μlと混合し、1.5時間室温にてインキュベート
した。FRB-FKBP12対の検出には、アッセイを0.1ng/mlのラパマイシンの存在また
はラパマイシンの非存在下で実施した。プレートをPBSTを用いて5回洗浄し、プ
ロテインL HRPコンジュゲート(1/4000)を用いて1時間、室温にてインキュベー
トした。プレートをPBSTを用いて5回洗浄し、反応物を3,3',5,5'-テトラメチル
ベンジジンを用いて顕色し、硫酸を用いて停止した。
)ならびにラパマイシンの存在下でのFRB-FKBP12の特異的結合(図4)を明白に
示す。
Buus, S. (1996). 「T細胞の抗原特異的、主要組織適合遺伝子複合体に制限さ
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は本明細書に参照により組み入れられる。
明の方法およびシステムの様々な改正と変法は明白であろう。本発明は特定の好
ましい実施形態と関係づけて記載されているが、特許請求の範囲に記載された本
発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されてはならないことは理解され
なければならない。実に、本発明を実施するための分子生物学または関連分野の
当業者に明白である記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に
包含されることが意図されている。
。 (A) クローニングされた抗体遺伝子を含んでいる細菌をフィルター上にアレイ
させて、一晩、scFvの産生がない状態で増殖させる。標的抗原でコーティングし
たフィルターを調製し、scFvを誘導するためのIPTGを含有する第2のプレート上
に置き、次いで、それを格子配置した細菌を含有するフィルターで覆う。誘導の
間に抗体は上部のフィルターを通過し、抗原特異的であれば底部のフィルター上
のその抗原と結合するだろう。数時間誘導させた後、底部のフィルターを取り出
し、結合したscFvを二次試薬を用いて検出する。(B) ロボットによるピッキング
と格子配置を適用することによって二重の順序づけられたアレイが作製され、そ
れを2種以上の異なる標的分子に対してスクリーニングすることで、(この実施例
では)抗原1および抗原2と結合する(黒色の丸印)、抗原1とは結合するが抗原2と
はしない(影つきの丸印)、抗原2とは結合するが抗原1とはしない(斜線入り丸印)
、どちらの抗原とも結合しない(白丸)レパートリーのメンバーを同定することが
できる。
機能的scFvのサンドイッチ検出。B) BSA結合性scFvを結合させるために固定化BS
Aを用いた、BSA結合性scFvについてのスクリーニング。C) HSA結合性scFvを結合
させるために固定化HSAを用いた、HSA結合性scFvについてのスクリーニング。こ
こに示したパネルは6144個のクローンからなる。クローンは8個の384ウエルのマ
イクロタイタープレートから二重のクローンの4x4のパターンでアレイさせた(38
4x8x2)。
示す。 (A) 抗M scFv-抗原M、および抗T scFv-抗原M対の検出。(B) FRB-FKBP12対の検
出。相互作用している対は発現されたGST-融合体を抗GST抗体で捕捉することに
よって検出し、相互作用しているリガンドはプロテインL HRPを用いて検出する
。FRB-FKBP12相互作用はラパマイシンが存在する場合にのみ観察された。
用している対は発現されたGST-融合体を抗GST抗体で捕捉することによって検出
し、相互作用しているリガンドはプロテインL HRPを用いて検出される。FRB-FKB
P12相互作用はラパマイシンが存在する場合にのみ観察された。
Claims (29)
- 【請求項1】 1種以上の標的分子と相互作用するポリペプチドレパートリ
ーの1個以上のメンバーを同定するための該ポリペプチドレパートリーをスクリ
ーニングする方法であって: a) 該標的分子を支持体上に固定化し; b) 該ポリペプチドレパートリーをコードする多数の核酸分子をアレイさせ; c) そのアレイさせた核酸分子と該標的分子を並置し; d) 該ポリペプチドが該標的分子と支持体上で接触してそのポリペプチドのあ
るサブセットが該標的分子と相互作用することとなるように、そのアレイさせた
核酸分子を発現させて該ポリペプチドを産生させ; e) 該ポリペプチドと該標的分子の支持体上での相互作用を検出する、 ことを含んでなる方法。 - 【請求項2】 該核酸分子が該ポリペプチドレパートリーの該メンバーをコ
ードする発現ベクターの形態であって、その転写を指令するために十分な制御配
列に機能しうる形で連結されているものである、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 該発現ベクターがバクテリオファージである、請求項2記載
の方法。 - 【請求項4】 該発現ベクターがプラスミドである、請求項2記載の方法。
- 【請求項5】 該発現ベクターが直鎖状の核酸分子である、請求項2記載の
方法。 - 【請求項6】 該相互作用が、結合による相互作用、シグナル伝達イベント
、触媒反応、酵素反応、リン酸化イベント、糖付加イベント、タンパク分解酵素
による切断、および化学反応からなる群から選択されるものである、請求項1か
ら5のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項7】 該ポリペプチドレパートリーが免疫グロブリン分子のレパー
トリーである、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項8】 該核酸が細胞内に含まれ細胞内で発現される、請求項1から
7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】 該細胞が、細菌細胞、下等な真核細胞、および高等な真核細
胞からなる群から選択されたものである、請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 該核酸分子が裸の、もしくは複合体化された核酸の形態で
固定化されたものである、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 該ポリペプチドレパートリーをコードする核酸分子が、標
的分子を含有する支持体とは異なる支持体上にアレイさせられており、その2つ
の支持体がそのアレイさせた核酸分子の発現に先だって並置される、上記の請求
項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項12】 該ポリペプチドレパートリーをコードする核酸分子のアレ
イを含んでいる支持体が、該ポリペプチドレパートリーに対して透過性である、
請求項11に記載の方法。 - 【請求項13】 該ポリペプチドレパートリーをコードする核酸分子が、固
定化された該標的分子を含んでいる支持体と同一の支持体上に、該核酸分子の発
現に先立ってアレイさせられている、請求項1から10のいずれか1項に記載の方
法。 - 【請求項14】 該支持体がフィルターメンブレンである、請求項1から1
3のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項15】 該標的分子が、精製タンパク質、組換えタンパク質、ポリ
ペプチド、酵素、酵素の基質、アミノ酸、細胞全体、細胞抽出物、小さな有機分
子、および金属イオンからなる群から選択されたものである、請求項1から14
のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項16】 該ポリペプチドレパートリーが2種以上の標的分子に対し
て別個にスクリーニングされる、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法
。 - 【請求項17】 全く同じ核酸分子のアレイが2つ以上作成され、その各々
が異なる標的分子と並置される、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法
。 - 【請求項18】 1種以上の標的分子と結合する抗体ポリペプチドレパート
リーの1個以上のメンバーを同定するために該抗体ポリペプチドレパートリーを
スクリーニングする請求項1記載の方法であって: a) 該標的分子を第1の支持体上に固定化し; b) 該抗体ポリペプチドレパートリーをコードする核酸分子を用いて多数の細
胞を形質転換し、および該細菌細胞を第2の支持体上にアレイさせ; c) 第1の支持体と第2の支持体を並置させ; d) 該ポリペプチドが第2の支持体上の細胞から分泌され、第1の支持体上の該
標的分子と接触し、該ポリペプチドのあるサブセットが該標的分子と結合するこ
ととなるように該核酸分子を発現させて該抗体ポリペプチドを産生させ; e) 該抗体ポリペプチドと第1の支持体上の該標的分子との結合を検出する、
ことを含んでなる方法。 - 【請求項19】 2つのポリペプチドレパートリーのお互いに対してスクリ
ーニングして特異的結合ペアを単離するための方法であって: a) 第1のレパートリーのメンバーの全て、もしくは実質的に全てと結合する
ことのできるジェネリックな第1のリガンドを支持体上に固定化し; b) 核酸分子のアレイの各ポイントが第1および第2のレパートリーのポリペプ
チドをそれぞれコードする第1のレパートリーの1メンバーおよび第2のレパート
リーの1メンバーを含むこととなるように多数の核酸分子をアレイさせ; c) 第1のジェネリックなリガンドとアレイさせた核酸分子を並置させ; d) 第1のレパートリーのポリペプチドが第1のジェネリックなリガンドに結合
し第2のレパートリーのポリペプチドのあるサブセットが第1のレパートリーのポ
リペプチドと結合するように、そのアレイさせた核酸を発現させてポリペプチド
のアレイを作成し; e) 該支持体上の第2のポリペプチドと第1のポリペプチドの相互作用を第2の
レパートリーのメンバーの実質的に全てと結合しうる第2のジェネリックなリガ
ンドを用いて検出する、 ことを含んでなる方法。 - 【請求項20】 ある基質分子を産物分子に転換する酵素のレパートリーの
1個以上のメンバーを同定するためにその酵素のレパートリーをスクリーニング
する方法であって: a) 産物分子とのみ結合しうるリガンドを第1の支持体上に固定化し; b) 核酸分子のアレイの各ポイントが該酵素レパートリーおよび基質分子の1
核酸メンバーを含むこととなるように、多数の核酸分子を第2の支持体上にアレ
イさせ; c) 第1の支持体と第2の支持体を並置させ; d) 該産物分子が第1の支持体上に固定化された特異的リガンドと結合しうる
ように酵素ポリペプチドが該基質分子を該産物分子に転換するが、その転換が行
われることとなるようにアレイさせた該核酸分子を発現させて酵素ポリペプチド
のアレイを作成し; e) 第1の支持体上の該産物分子の存在を検出する、 ことを含んでなる方法。 - 【請求項21】 該方法によって、該基質分子があるポリペプチドレパート
リーでコードされ、該アレイの各ポイントが酵素と基質のレパートリーのメンバ
ーの種々の組み合わせを含んでいる、請求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 ある酵素分子によって転換されて産物のポリペプチドを形
成させる、基質のレパートリーの1個以上のメンバーを同定するために、その基
質のレパートリーをスクリーニングする方法であって: a) 産物ポリペプチドとのみ結合しうるリガンドを第1の支持体上に固定化し
; b) 核酸分子のアレイの各ポイントが該基質レパートリーおよび該酵素分子の
1核酸メンバーを含むこととなるように、多数の核酸分子を第2の支持体上にアレ
イさせ; c) 第1の支持体と第2の支持体を並置させ; d) 該産物ポリペプチドが第1の支持体上に固定化された特異的リガンドと結
合しうるように酵素分子が該基質ポリペプチドを産物ポリペプチドに転換するが
、その転換が行われることとなるようにアレイさせた該核酸分子を発現させて基
質ポリペプチドのアレイを作成し; e) 第1の支持体上の該産物ポリペプチドの存在を検出する、 ことを含んでなる方法。 - 【請求項23】 該方法によって、該酵素分子があるポリペプチドレパート
リーによりコードされ、該アレイの各ポイントが基質と酵素のレパートリーのメ
ンバーの種々の組み合わせを含んでいる、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 該方法によって第1の支持体上に固定化されたリガンドが
基質および産物分子の双方と結合し、次いで産物および/もしくは基質特異的検
出法が基質もしくは産物の存在を区別するために用いられる、請求項20から23の
いずれか1項に記載の方法。 - 【請求項25】 1種以上の標的分子と相互作用するあるポリペプチドレパ
ートリーの1個以上のメンバーを同定するためにそのポリペプチドレパートリー
をスクリーニングするための装置であって: a) 該ポリペプチドレパートリーをコードする核酸分子のアレイ; b) 支持体上に該標的分子が固定化された支持体; c) 該ポリペプチドと該支持体との間の相互作用を検出するための試薬、 を含んでなる装置。 - 【請求項26】 該核酸分子が透過性のフィルター支持体上にアレイされて
いる、請求項25に記載の装置。 - 【請求項27】 複数の標的リガンドに対して抗体のアレイを作成しスクリ
ーニングするための方法であって、それによって抗体もしくは抗体フラグメント
をあらかじめ定められた固体支持体上の位置にアレイせしめ、次いで種々の標的
リガンドに対して探索される方法。 - 【請求項28】 該方法によってある単一の抗体のアレイが1000種以上の異
なる抗体もしくは抗体フラグメントを含有することとなる、請求項27に記載の方
法。 - 【請求項29】 1000種以上の種々の抗体もしくは抗体フラグメントからな
り、単一の固体支持体上に空間的に配置された抗体のアレイ。
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