DE60036277T2

DE60036277T2 - Testgerät zur durchführung von nukleinsäure-amplifikationsreaktionen

Info

Publication number: DE60036277T2
Application number: DE60036277T
Authority: DE
Inventors: Brian Norwell KLUTTZ; Lawrence Framingham BURG; Garry Hazelwood TEGELER; Louis Rockland GRAZIANO; Christopher Charlestown COTTER; Michel Scituate GUY; James Rockland GREER; Geoff A. Duxbury MCKINLEY; Luigi Duxbury CATANZARITI; Robert West Warwick GLASSFORD; James Clement Columbia Bishop; Bruno Colin; Cecile Paris; Thomas Lexington WANG; Michael Dedham MORIN
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 1999-10-18
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2020-09-30
Also published as: IL141985A0; ATE372166T1; ES2292473T3; KR20010093850A; DE60036277D1; BR0007223A; AU753903B2; JP2003512032A; EP1146961A1; WO2001028683A1; US6410275B1; AU7731200A; WO2001028683A8; CA2348691A1; MXPA01003181A; EP1146961B1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet von Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen.
Auf Nukleinsäure basierende Amplifikationsreaktionen werden derzeit häufig in Forschung und Kliniklabors zur Erkennung genetischer und infektiöser Erkrankungen benutzt. Die gegenwärtig bekannten Amplifikationsschemata können allgemein in zwei Klassen eingeteilt werden, basierend darauf, ob nach einem üblicherweise bei einer Temperatur ≥ 65 °C durchgeführten anfänglichen Denaturierungsschritt für DNA-Amplifikationen oder für RNA-Amplifikationen, die einen hohen Betrag an anfänglichen Sekundärstrukturen enthalten, die Reaktionen über einen fortlaufenden Wechsel der Temperatur zwischen der Denaturierungstemperatur und einer Primer-Annealing- und Amplicon-Synthese-(oder Polymerase-Ablauf-) Temperatur („wechselnde Reaktionen") betrieben werden, oder die Temperatur während des ganzen enzymatischen Amplifikationsprozesses konstant gehalten wird („isothermische Reaktionen"). Typische wechselnde Reaktionen sind die Polymerase- und Ligase-Kettenreaktionen (PCR beziehungsweise LCR). Repräsentative isothermische Reaktionsschemata sind NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) und SDA (Strand Displacement Amplification). Bei den isothermischen Reaktionen erfolgt nach dem anfänglichen Denaturierungsschritt, sofern er benötigt wird, die Reaktion bei einer konstanten Temperatur, üblicherweise einer niedrigeren Temperatur, bei der die enzymatische Amplifikationsreaktion optimiert wird.
Vor der Entdeckung thermostabiler Enzyme waren Verfahren, bei denen wechselnde Temperaturen angewandt wurden, erheblich durch die Notwendigkeit behindert, nach jedem Denaturierungszyklus frische Polymerase in ein Amplifikationsröhrchen (wie z. B. ein Teströhrchen) abzugeben, weil die für die Denaturierung erforderliche erhöhte Temperatur die Polymerase bei jedem Zyklus inaktivierte. Eine erhebliche Vereinfachung des PCR-Untersuchungsablaufs wurde mit der Endeckung der thermostabilen Taq-Polymerase (von Thermophilus aquaticus) erreicht. Diese Verbesserung beseitigte die Notwendigkeit, die Amplifikationsröhrchen nach jedem Amplifikationszyklus zu öffnen und frische Enzyme hinzuzufügen. Dies führte zur Verringerung sowohl des Kontaminierungsrisikos als auch der enzymbezogenen Kosten. Die Einführung von thermostabilen Enzymen hat auch die relativ einfache Automation der PCR-Technik ermöglicht. Ferner ermöglichten diese neuen Enzyme die Anwendung einfacher Einwegvorrichtungen (wie z. B. ein einzelnes Röhrchen) zur Verwendung mit der Temperaturwechseleinrichtung.
Die TMA erfordert die kombinierten Aktivitäten von mindestens zwei (2) Enzymen, für die keine optimal thermostabilen Varianten beschrieben sind. Für ein optimales Primer-Annealing bei der TMA-Reaktion wird ein anfänglicher Denaturierungsschritt (bei einer Temperatur von > 65 °C) durchgeführt, um die Sekundärstruktur des Targets zu beseitigen. Das Reaktionsgemisch wird dann auf eine Temperatur von 42 °C heruntergekühlt, um ein Primer-Annealing zu ermöglichen. Diese Temperatur ist auch die optimale Reaktionstemperatur für die kombinierten Aktivitäten der T7 RNA-Polymerase und der reversen Transkriptase (RT), die eine endogene RNase-H-Aktivität enthält oder alternativ durch ein anderes Reagens vorgesehen ist. Die Temperatur wird während der ganzen folgenden isothermischen Amplifikationsreaktion auf 42 °C gehalten. Der Denaturierungsschritt, der dem Amplifikationszyklus vorangeht, zwingt jedoch den Anwender, dem Teströhrchen nach der Abkühlungsperiode Enzyme zuzufügen, um eine Inaktivierung der Enzyme zu vermeiden. Daher ist es erforderlich, den Denaturierungsschritt getrennt vom Amplifikationsschritt durchzuführen.
Gemäß derzeitiger Praxis wird nach Hinzufügen der Untersuchungsprobe oder der Stichprobe oder beider zum Amplifikationsreagensgemisch, das üblicherweise die Nukleotide und die Primer enthält, das Teströhrchen Temperaturen ≥ 65 °C ausgesetzt und dann auf die Amplifikationstemperatur von 42 °C heruntergekühlt. Das Enzym wird dann manuell hinzugefügt, um die Amplifikationsreaktion auszulösen. Dieser Schritt erfordert normalerweise das Öffnen des Amplifikationsröhrchens. Das Öffnen des Amplifikationsröhrchens, um das Enzym hinzuzufügen, oder das darauf folgende Hinzufügen eines Enzyms in ein offenes Röhrchen ist nicht nur unbequem sondern erhöht auch das Kontaminierungsrisiko.
Ein alternativer Ansatz zur Amplifikation einer DNA-Probe ist in der US-Patentschrift Nr. 5,270,183 von Corbett et al beschrieben. Bei dieser Technik wird ein Reaktionsgemisch in einen Strom einer Trägerflüssigkeit eingespritzt. Die Trägerflüssigkeit durchläuft dann eine Mehrzahl von Temperaturzonen, in denen die Polymerase-Kettenreaktionen stattfinden. Die Temperatur der verschiedenen Zonen und die abgelaufene Zeit der Trägerflüssigkeit für den Durchgang durch die Temperaturzonen werden gesteuert, so dass drei Ereignisse stattfinden: das Denaturieren der DNA-Stränge, das Annealing des oligonukleotiden Primers in komplementäre Sequenzen in der DNA und eine Synthese der neuen DNA-Stränge. Ein Röhrchen und zugehörige Temperaturzonen und Pumpeinrichtungen sind vorgesehen, um das Verfahren nach der Patentschrift '183 durchzuführen.
Die Erfindung vermeidet die Unbequemlichkeit und das Kontaminierungsrisiko, die zuvor beschrieben wurden, durch Schaffung einer neuen Testvorrichtung in Form eines Streifens, der ein „binäres" oder Doppelkammerreaktionsgefäß enthält, und einer Methode der Verwendung der Vorrichtung. Die Erfindung erreicht die Integration des Denaturierungsschritts mit dem Amplifikationsschritt ohne die Notwendigkeit eines manuellen Hinzufügens von Enzymen und ohne die Amplifikationskammer der Umgebung auszusetzen. Die Kontaminationsrisiken einer Probe-zu-Probe-Verunreinigung innerhalb der Verarbeitungsstation werden vermieden, weil die Amplifikationskammer abgedichtet ist und nicht geöffnet wird, um die Patientengrobe zum Enzym einzubringen. Die Kontamination durch Umgebungsquellen wird vermieden, weil die Amplifikationsreaktionskammer abgedichtet bleibt. Das Risiko der Kontamination ist bei Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen besonders kritisch, weil große Mengen des Amplifikationsprodukts hergestellt werden. Die Erfindung schafft eine Reaktionskammerbauform, welche diese Risiken im Wesentlichen beseitigt.
Die bevorzugte Teststreifenausführungsform ermöglicht es, die Testvorrichtung nach Durchführung der Amplifikationsreaktion in einem derzeit eingebauten Messgeräteträger zu verwenden, und zwar dem VIDAS^®-Messgerät, das vom Begünstigten der Erfindung, der Firma bioMèrieux, Inc. hergestellt und vertrieben wird. Das Schaffen von Testvorrichtungen in einer Größe und Bauform, die leicht in einem vorhandenen Messgeräteträger verwendet werden können, ermöglicht so, die Vorrichtungen kaufmännisch zu verwerten und mit einem verringerten Investitionsaufwand zu verwenden und ohne ein neues Messgerät entwickeln zu müssen, um die Reaktion durchzuführen und die daraus folgenden Amplicons zu erfassen.
Ein verwandtes Doppelkammerreaktionsgefäß ist in der Druckschrift EP-A-0 875 291 offenbart.
Die Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen 1 und 7 definiert.
In einer bevorzugten Form der Erfindung ist ein Doppelkammerreaktionsgefäß vorgesehen, das eine gebrauchsfertig verpackte Einzel- oder Einheitsdosis von Reagenzien für eine Reaktion enthält, die unterschiedliche Wärme- und Eingrenzungsmerkmale erfordert, wie eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion (zum Beispiel TMA-Reaktion). Das Doppelkammerreaktionsgefäß ist als einmal zu verwendende Einwegeinheit ausgelegt. Das Reaktionsgefäß ist vorzugsweise integral in eine Testvorrichtung, wie einen Streifen, eingeformt, der einen Satz von Wasch- und Reagenswells zur Verwendung in einer Erfassungsstation für Amplifikationsprodukte aufweist. Alternativ kann das Reaktionsgefäß als Einzeleinheit ausgebildet sein mit einem Flansch oder anderen geeigneten Strukturen, damit es in einem bezeichneten Raum eingebaut werden kann, der in einer solchen Testvorrichtung vorgesehen ist.
Bei einer bevorzugten Form der Erfindung sind im Doppelkammerreaktionsgefäß zwei getrennte Reaktionskammern vorgesehen. Die zwei Hauptreagenzien für die Reaktion sind in räumlich getrennter Weise untergebracht. Eine Kammer weist das wärmestabile Proben-/Amplifikationsreagens auf, das Primer, Nukleotide und andere notwendige Salze und Pufferkomponenten in einer Reaktionslösung enthält, und die andere Kammer enthält das wärmelabile enzymatische Reagens, z. B. T7 und RT. Alternativ können die wärmelabilen enzymatischen Reagenzien in einer dazwischen liegenden Kammer oder einem Well untergebracht sein, die mit der zweiten Kammer in Flüssigkeitsverbindung steht, so dass eine Reaktionslösung von der ersten Kammer auf dem Weg zur zweiten Kammer durch die dazwischen liegende Kammer fließt.
Ein Flüssigkeitskanal, der sich von der ersten zur zweiten Kammer erstreckt, verbindet die zwei Kammern miteinander. Es ist ein Mittel zum Steuern oder Ermöglichen des Strömens von Flüssigkeit durch den Flüssigkeitskanal von der ersten Kammer zur zweiten Kammer vorgesehen. Verschiedene Flüssigkeitsstromsteuermittel werden in Erwägung gezogen, wie das Vorsehen eines Ventils im Flüssigkeitskanal, wie es in der Anmeldung mit der Serien-Nr. 09/053,823, eingereicht am 2. April 1998, jetzt US-Patent Nr. 5,789,499 und US-Patent Nr. 5,786,182 beschrieben ist. Mehrere verschiedene Ausführungsformen von Ventilen sind darin beschrieben.
Im Einsatz wird die flüssige Probe in die erste Kammer eingebracht und die erste Kammer wird auf eine Denaturierungstemperatur erwärmt (z. B. 95 °C). Nachdem die Amplifikationsreagenzien in der ersten Kammer mit der flüssigen Probe reagiert haben und der Denaturierungsprozess vollendet ist, wird die erste Kammer für das Primer-Annealing auf 42 °C abgekühlt. Die zwei Kammern des Reaktionsgefäßes stehen vor der Vollendung des Denaturierungsprozesses und dem Abkühlungsschritt nicht in Flüssigkeitsverbindung miteinander. Nachdem diese Schritte vollendet sind, wird das Mittel zum Steuern des Flüssigkeitsstroms betätigt, um der Reaktionslösung zu ermöglichen, durch den Flüssigkeitskanal von der ersten Kammer in die zweite Kammer zu laufen. Zum Beispiel wird das Ventil im Flüssigkeitskanal geöffnet und die flüssige Probe wird entweder durch Druck- oder Unterdrucktechniken in die zweite Kammer geleitet. Die Reaktionslösung wird dann mit dem/den Amplifikationsenzym/en (beispielsweise T7 und/oder RT) in Kontakt gebracht und der enzymatische Amplifikationsprozess schreitet in der zweiten Kammer bei 42 °C fort.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird nach Vollendung der Amplifikationsreaktion wird ein SPR^® (eine pipettenartige Flüssigkeitsübertragungsvorrichtung, die als Aufnahmebehälter für die feste Phase fungiert) in die zweite Kammer eingeführt. Der Teststreifen enthält eine Mehrzahl von Wells, die in einer Reihe angeordnet sind. Hybridisierung, Waschen und optische Analyse laufen dann in den Wells gemäß wohlbekannter Techniken ab, um die Amplifikationsprodukte zu ermitteln. Solche Prozesse können in benachbarten Wells einer Teststreifenausführungsform des Doppelkammerreaktionsgefäßes automatisch in einem automatisierten Messgerät, wie dem VIDAS^®-Messgerät der Firma bioMèrieux, Inc., stattfinden.
So weist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung einen Teststreifen zur Durchführung einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion auf. Der Teststreifen umfasst ein integrales gestrecktes Gehäuse, das als Streifen mit einem ersten und einem zweiten Ende ausgebildet ist, wobei ein Teil des Gehäuses eine Mehrzahl von Wells umgrenzt, die in einer geradlinigen Reihe im Streifen zwischen dem ersten und dem zweiten Ende angeordnet sind. Die Wells werden üblicherweise zur Hybridisierung, zum Waschen oder für andere Ermittlungs- oder Dekontaminisierungsschritte verwendet, nachdem die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion vollendet ist.
Das Teststreifengehäuse enthält ein Doppelkammerreaktionsgefäß für eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, die darin durchgeführt werden soll, welches angrenzend an das erste Ende des Teststreifens angeordnet ist. Das Doppelkammerreaktionsgefäß enthält (1) eine erste Kammer, in der ein erster Teil der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchgeführt wird (z.B., Denaturierung und Primer-Annealing), (2) eine zweite Kammer, in der ein zweiter Teil der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchgeführt wird (z.B., Amplifikation von Nukleotiden durch ein Amplifikationsenzym) und (3) eine zu öffnende Verbindungsleitung, welche die erste Kammer mit der zweiten Kammer verbindet.
Bei der Herstellung des Teststreifens wird ein erstes Reagens (z. B. Primer und/oder Nukleotide) für den ersten Teil der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in die erste Kammer eingebracht und ein zweites Reagens (z. B. ein Amplifikationsenzym) wird entweder in die zweite Kammer eingebracht oder in Flüssigkeitsverbindung mit ihr angeordnet. Nachdem die Reagenzien in die zwei Kammern des Doppelkammerreaktionsgefäßes eingegeben sind (und ein oder mehrere beliebige erforderliche Reagenzien in die übrigen Wells des Teststreifens eingebracht sind), wird eine Membrane am Teststreifengehäuse angebracht. Die Membrane wird am Gehäuse appliziert, um die ersten und zweiten Kammern und die Wells abzudecken. Reagenseingabeschritte und Abdecken können getrennt vorgesehen werden. Solche anderen Reagenzien können bei anderen Reaktionsschritten zur Analyse der Untersuchungsprobe verwendet werden.
Zur Verlängerung der Lagerfähigkeit der Teststreifen und der darin enthaltenen Reagenzien kann ein Trockenmittel in den Teststreifen eingebracht werden, vorzugsweise entweder in Verbindung mit der ersten oder zweiten Kammer des Doppelkammerreaktionsgefäßes. Alternativ kann das Trockenmittel in den das Teststreifengehäuse bildenden Werkstoff eingegossen werden.
Um ein Mittel zum Dekontaminieren des Teststreifens vor dem Entnehmen aus dem Messgerät bereitzustellen, ist eine Dekontaminierungslösung oder Bleichbadwäsche in einem der abgedichteten Wells vorgesehen.
Eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird im Folgenden in Verbindung mit den Figuren der beigefügten Zeichnung beschrieben, wobei sich gleiche Bezugszeichen in den verschiedenen Ansichten auf gleiche Elemente beziehen. Es zeigen:
1 eine perspektivische Darstellung eines Teststreifens, der ein Doppelkammerreaktionsgefäß für eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion und ein zugehöriges Abdeckteil gemäß einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält, wobei das Abdeckteil vor der Befestigung am Testatreifen in der Nähe des Doppelkammerreaktionsgefäßes dargestellt ist;
2 eine andere perspektivische Darstellung des Teststreifens und des Abdeckteils der 1, wobei das Abdeckteil am Teststreifen befestigt und ein Teil des Abdeckteils in angehobener oder hochgehobener Stellung dargestellt ist, die einen Zugang zur ersten Reaktionskammer des Doppelkammerreaktionsgefäßes darin ermöglicht;
3 eine andere perspektivische Darstellung des Teststreifens der 2; 4 eine vereinzelte perspektivische Darstellung des Abdeckteils der 1–3, von unten gesehen;
4A und 4B perspektivische Darstellungen einer alternativen Ausführungsform des Abdeckteils;
4C und 4D Darstellungen noch einer anderen alternativen Ausführungsform des Abdeckteils;
4E, 4F und 4G eingehende Darstellungen des Knopfes der 4C und 4D;
5 eine Draufsicht des Teststreifens der 1–3;
6 eine Schnittzeichnung des Teststreifens der 5 entlang den Linien 6-6 der 5;
7 eine Schnittzeichnung des Teststreifens der 5 entlang den Linien 7-7 der 5;
8 eine Seitenaufrissdarstellung des Teststreifens der 5;
9 eine eingehende Aufrissdarstellung des oberen Teils des Teststreifens im Bereich angrenzend an die zweite Reaktionskammer, wobei die Einrichtungen an der Seite des Teststreifens dargestellt sind, die fest von den federnden Schenkeln des Abdeckteils ergriffen werden, um das Abdeckteil am Teststreifen zu arretieren;
10 eine eingehende Schnittzeichnung des Teststreifens, der teilweise weggebrochen ist, wobei die in 9 gezeigten Arretiereinrichtungen dargestellt werden;
11 eine Schnittzeichnung des Teststreifens der 5; die entlang den Linien 11-11 der 5, der teilweise weggebrochen ist, wobei das Trockenmittelwell und Enzympelletwells dargestellt sind;
12 eine genaue Draufsicht des Trockenmittelwells und benachbarte Strukturen im Teststreifen der 5;
13 eine genaue Schnittdarstellung des Trockenmittelwells und eines Teils der zweiten Reaktionskammer des Teststreifens der 5;
14 eine perspektivische Darstellung eines in 3 gezeigten Kappenelements, das den Boden der ersten Reaktionskammer verschließt und einen Flüssigkeitsweg zur Verbindung der ersten Reaktionskammer mit der vertikal angeordneten Verbindungsleitung bereitstellt, die zur zweiten Reaktionskammer führt;
15 eine Draufsicht des Kappenelements der 14;
16 eine genaue Draufsicht der Oberseite des Teststreifens der 5 im Bereich der Verbindungsleitung, die die erste Reaktionskammer mit der zweiten Reaktionskammer verbindet;
17 eine Schnittzeichnung eines Teils des Teststreifens der 5 und 16, das heißt, entlang der Längsachse des Teststreifens im Bereich der Verbindungsleitung, die die erste Reaktionskammer mit der zweiten Reaktionskammer verbindet, wobei die Anordnung einer Kugel innerhalb der Verbindungsleitung dargestellt ist, die als Ventil zum Verschließen der Verbindungsleitung wirkt;
18 eine Schnittzeichnung eines Teils des Teststreifens der 5, wobei der Schnitt in einer Richtung rechtwinklig zur Längsachse der Kapsel entlang der Linien 18-18 der 16 und 17 verläuft;
19 eine perspektivische Darstellung eines Teststreifens der in 5 gezeigten Art mit einer Gabel als Hilfsmittel, die verwendet wird, um die Verbindungsleitung zu öffnen, wobei der Pfeil die Relativbewegung der Gabel in Bezug auf den Teststreifen anzeigt und die gepunkteten Linien das Einfügen der Zinken der Gabel in den Teststreifen anzeigen, um das Kugelventil in der Verbindungsleitung zu öffnen;
20 eine schematische Darstellung einer Unterdruckstation, in der ein thermoelektrischer Kühl-(TEC)-/Kühlkörper-Wärmeregler für den Teststreifen aufgenommen ist und die ein Gehäuse aufweist, das mit einer Tragkonstruktion in Eingriff steht, um eine Unterdruckkammer um die Teststreifen zu bilden, wobei jeder Teststreifen einer Gabel zugeord net ist, um die Verbindungsleitung zu öffnen, wenn das Unterdruckkammergehäuse nach unten bewegt wird und mit der Tragkonstruktion in Eingriff steht;
21 eine Schnittzeichnung des Teststreifens der 5, bei welcher der Schnitt in einer Richtung quer zur Längsachse des Teststreifens in der Nähe der Verbindungsleitung angeordnet ist, und welche die Wirkung der Gabeln der 19 und 20 beim Verformen des Werkstoffs der Verbindungsleitung darstellt, um dadurch das Ventil zu öffnen;
22 eine Schnittzeichnung des Teststreifens der 21, welche die Verformung der Verbindungsleitung und die Strömung der Flüssigkeit durch die Verbindungsleitung darstellt; und
23 eine perspektivische Darstellung einer alternativen Ausführungsform eines Teststreifens, bei dem die Wände des Teststreifens, welche die erste und zweite Reaktionskammer bilden, Außenflächen aufweisen, die zum Eingriff mit beheizten Flächen einer die Teststreifen verarbeitenden Nukleinsäure-Amplifikationsstation gestaltet sind, um beim Halten der zwei Kammern auf den gewünschten Temperaturen mitzuwirken.
Eine bevorzugte Form der Erfindung sieht ein Doppelkammer- oder „binäres" Reaktionsgefäß vor, das in einem Teststreifen oder einer anderen Konfiguration enthalten ist. Der Begriff „binär" bezieht sich auf die Besonderheit des Gefäßes, mindestens zwei verschiedene Reagenzien, zum Beispiel ein wärmestabiles Proben-/Amplifikationsreagens bzw. -Reagenzien, das zum Beispiel Primer und Nukleotide enthält, in einer Kammer und ein wärmelabiles Enzym bzw. wärmelabile Enzyme wie T7 und RT in der zweiten Kammer räumlich getrennt aufzubewahren. Die Reagenzien in den zwei Kammern stehen vor der Vollendung des Denaturierungs- und des Kühlungsschritts nicht in Kontakt. Die erste Kammer ist über einen Deckelverschluss zugänglich, der eine durchbohrbare Membrane oder ein anderes Mittel überlagert, um so zu ermöglichen, dass eine Analyse- oder Klinik- oder Stichprobe oder mehrere von diesen in flüssiger Form in der ersten Kammer hinzugefügt werden. Die zweite Kammer ist abgedichtet und enthält die enzymatischen Komponenten der Amplifikationsreaktion. Die Reagenzien können verschiedene physikalische Formen, wie flüssig, pelletiert, lyophiliert usw. in einheitlichen Dosiermengen aufweisen. Nachdem der Inhalt der ersten Kammer mit der zweiten Kammer in Kontakt gebracht ist, kann dann die Amplifikationsreaktion stattfinden, so wie in der zweiten Kammer.
Bei einer möglichen Form der Erfindung können die zwei Kammern Teil einer integrierten Einwegeinheit sein. Bei einer anderen möglichen Ausführungsform können die zwei Kammern zwei ausgeprägte Einheiten sein, die komplementäre Eingriffsflächen aufweisen oder Eigenschaften, die es ermöglichen, die zwei Einheiten zu einer einzigen Einheit zu vereinigen. In der ersten Ausführungsform, wo die zwei Kammern Teil eines einheitlichen Gegenstandes sind, muss die Einheit so gefertigt sein, dass der Austausch von Stoffen zwischen den zwei Kammern während des Versands und vor dem Denaturierungs-(Erwärmungs-)Schritt verhindert wird. Bei beiden Ausführungsformen ist eine Einrichtung erforderlich, durch die der Inhalt der ersten Kammer (eine Lösung, welche das Patienten- oder Untersuchungsproben und Amplifikationsreagens- bzw. Amplifikationsreagenziengemisch nach der Denaturierung und dem Primer-Annealing enthält) mit dem Enzym bzw. den Enzymen in der zweiten Kammer in Kontakt gebracht wird. Die Einrichtung bewirkt das Einbringen des Inhalts der ersten Kammer in die zweite Kammer, das der Vollendung des Denaturierungsschritts in der ersten Reaktionskammer bei einer Temperatur von ≥ 65 °C und dem Kühlen des Patientenproben/Amplifikationsgemischs auf die dazugehörige Temperatur für die enzymatische Amplifikationsreaktion, z. B. 42 °C folgt. Mehrere unterschiedliche Einrichtungen sind in der US-Patenschrift 5,786,182 im Einzelnen beschrieben.
1 ist eine perspektivische Darstellung eines Teststreifens 10, der ein Doppelkammerreaktionsgefäß 12 für eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, eine Mehrzahl von Wells und ein zugehöriges Abdeckteil gemäß einer gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält. Der Teststreifen 10 der 1 ist vorzugsweise aus einem gegossenen Polymerwerkstoff, wie Polypropylen gefertigt.
Eine dichtende Membrane ist bzw. dichtende Membranen sind auf der oberen Fläche 15 des Teststreifens angebracht, um die Wells und das Doppelkammerreaktionsgefäß 12 abzudecken, nachdem die Wells und das Gefäß 12 vorab mit den entsprechenden Enzymen, Reagenzien, Wasch- oder Pufferlösung, Dekontaminationslösung usw. versehen worden sind. Die Membrane ist in 1 nicht dargestellt, um den Aufbau des Teststreifens 10 besser zu veranschaulichen. Das Abdeckteil 14 ist vor dem Befestigen am Teststreifen in der Nähe des Doppelkammerreaktionsgefäßes 12 dargestellt.
Ein Teststreifen der 1 kann verwendet werden, um eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, z. B. eine TMA-Reaktion, gemäß einer möglichen Ausführungsform der Erfindung durchzuführen. Die Kammer A des Doppelkammerreaktionsgefäßes 12 enthält die Amplifikationsreagenzien bzw. das Amplifikationsgemisch, nämlich Nukleotiden, Primer, MgCl₂ und andere Salze und Pufferkomponenten. Die Kammer B steht in Flüssigkeitsverbindung mit einem Enzympelletwell 52, welches das Amplifikationsenzym bzw. die Amplifikationsenzyme enthält, welches bzw. welche die Amplifikationsreaktion katalysiert bzw. katalysieren, z. B. T7 und/oder RT. Bei einer alternativen Ausführungsform wird das Amplifikationsenzym direkt in die Kammer B eingebracht.
Nach Hinzufügen der Targets (oder der Untersuchungsprobe) in die Kammer A, wird Wärme auf die Kammer A aufgebracht, um die DNA-Nukleinsäure-Targets zu denaturieren und/oder die RNA-Sekundärstruktur zu minimieren. Die Temperatur der Kammer A wird dann heruntergekühlt, um ein Primer-Annealing zu ermöglichen. Anschließend wird die Lösung der Kammer A in Kontakt mit einem Enzympellet in dem Pelletwell 52 gebracht und die Lösung wird in die Kammer B eingebracht. Die nun in Flüssigkeitsverbindung miteinander stehende Kammern A und B werden dann auf der optimalen Temperatur für die Amplifikationsreaktion gehalten, z. B. 42 °C. Durch räumliches Trennen der Kammer A von der Kammer B und Aufbringen der Wärme für die Denaturierung nur auf die Kammer A werden die thermolabilen Enzyme während des Denaturierungsschritts vor einer Inaktivierung geschützt.
Die kontrollierte Erwärmung des Doppelkammerreaktionsgefäßes 12 in dem zuvor beschriebenen Teststreifen und die Überführung der Lösung von der Kammer A zur Kammer B wird vorzugsweise in einer Amplifikationsstation oder einem Amplifikationsinstrument durchgeführt, die bzw. das zum Verarbeiten des Teststreifens 10 ausgelegt ist. Eine bevorzugte Amplifikationsstation ist in der US-Patentschrift 5,786,182 beschrieben.
Nachdem die Reaktion vollendet ist, wird der Teststreifen dann in einem Gerät wie dem VI-DAS^®-Messgerät, das von der Firma bioMèrieux, Inc. gewerblich erhältlich ist, verarbeitet.
Der Teststreifen 10 der 1 erhält einen speziellen Formfaktor (z. B. Form, Länge, Breite, Höhe, Endeinrichtungen 18A und 18B, usw.), um zu ermöglichen, dass der Teststreifen mit einer vorhandenen oder ausgewählten Gerätebasis kompatibel ist, die einen Feststoffbehälter oder andere strömungstechnische Übertragungsmittel und andere Betriebsmittel aufweist, um die Ergebnisse der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion im Teststreifen an sich zu verarbeiten. So weist die bevorzugte Ausführungsform des Teststreifens 10 eine Größe und Form auf, die für die VIDAS^®-Messgerätebasis des Begünstigten der Erfindung, der Firma bioMèrieux, Inc. geeignet ist. Es versteht sich, dass eine unterschiedliche Größe, Form, Gestaltung und andere technische Merkmale der Testvorrichtung, welche das Doppelkammerreaktionsgefäß enthält, erreicht werden können, um zu anderen Analysegeräten zu passen und zu anderen Geräten, welche die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion in dem Doppelkammerreaktionsgefäß durchführen würden.
Die 2 und 3 sind zusätzliche perspektivische Darstellungen des Teststreifens 10 und des Abdeckteils 14 der 1. 4 ist eine vereinzelte perspektivische Darstellung des Abdeckteils. Bezug nehmend auf die 2–4 weist das Abdeckteil 14 ein Paar federnder Schenkel 20 mit einer Klemmeinrichtung 21 auf, die an entsprechenden Leisten einrasten, die all der Oberkante des Teststreifens ausgebildet sind, wie später in Verbindung mit den 7–10 erläutert wird. Die Schenkel 20 ermöglichen es, den hinteren Teil 22 des Abdeckteils 14 fest und sicher am Teststreifen 10 zu befestigen, während ein zweiter oder vorderer Teil 24 des Abdeckteils 14 relativ zum hinteren Teil 22 gehoben und gesenkt werden kann. Das Abdeckteil 14, das aus einem gegossenen Polymerwerkstoff gefertigt ist, enthält einen integralen Scharnierteil 26, der die Teile 22 und 24 miteinander verbindet. Das Abdeckteil enthält auch eine zentrale Öffnung 28, in der ein poröses Siebgewebefilter angeordnet ist, damit Luft in die Kammer A eintreten oder aus ihr entfernt werden kann (nach dem Entfernen der dichtenden Membrane von der Oberseite der Kammer A), während das Entweichen von Flüssigkeiten oder Reagenzien aus der Kammer A oder der Eintrag von Fremdstoff in die Kammer A im Wesentlichen abgeblockt wird.
Der Zweck des Abdeckteils 14 besteht darin, den Zugang zur Kammer A durch den Anwender zu steuern und während der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion eine schützende Barriere vor der Umgebung zu bilden. Während der Herstellung des Teststreifens werden die Reagenzien in die Kammern A und B eingebracht (und in die Wells 13) und dann wird eine dichtende Membrane auf der oberen Fläche 15 des Teststreifens 10 angebracht, welche die gesamten Wells 13 und die Kammern A und B bedeckt. Bei einer möglichen Ausführungsform hat die Membrane eine Perforation oder Reißlinie angrenzend an die Kammer A erhalten. Dann wird das Abdeckteil 14 auf dem Teststreifen 10 eingebaut. Wenn der Techniker bereit ist den Teststreifen 10 zu benutzen, hebt der Anwender den vorderen Teil 24 des Abdeckteils in die in 2 dargestellte Stellung an. Die Kante 30 weist eine bogenförmige Ausnehmung zur Unterstützung der Finger des Anwenders beim Anheben des Teils 24 auf. Dann ergreift der Techniker die freie Kante 32 der Membrane, die in 2 weggebrochen dargestellt ist, um den Aufbau des Teststreifens darzustellen, und zieht die Membrane weg, so dass die Membrane an der Perforation abgetrennt wird, die bei 34 angedeutet ist. Dieser Vorgang legt die Kammer A des Doppelkammerreaktionsgefäßes 12 frei. Dann führt der Techniker die flüssige Probe in die Kammer A ein und schließt das Abdeckteil 14. Das Abdeckteil 14 weist ein zusätzliches Paar von federnden Greifschenkeln 36 und 38 auf, die an Randeinrichtungen an gegenüberliegenden Kanten des Teststreifens einrasten, was zum sicheren Eingriff des Abdeckteils 14 am Teststreifen 10 führt.
Es wird auf die 4A und 4B Bezug genommen. Optimal und bei der bevorzugten Ausführungsform bleiben der Film oder die Membrane über der Kammer A am Platz und es ist keine Reißlinie vorhanden, wie sie gerade beschrieben wurde. Das Abdeckteil enthält einen von Hand betätigbaren Knopf 41, der an seiner Unterseite eine hervorstehende Spitze oder Fläche 41B aufweist, so dass bei durch den Anwender geschlossenem Abdeckteil 14 der Anwender den Knopf 41 betätigen und nach unten drücken kann und dadurch die hervorstehende Spitze 41B zum Durchbohren der die Oberseite des Teststreifens oberhalb der Kammer A bedeckenden Membrane veranlasst, um eine kleine Öffnung zum Einführen der Untersuchungsprobe bereitzustellen. Bei dieser Ausführungsform wird die Folienmembrane nicht durch den Techniker entfernt sondern eher am Platz gelassen. Die Wirkung des Knopfes/der hervorstehenden Spitze ist die Einrichtung, durch welche die Kammer A zum Zeitpunkt der Verwendung zugänglich gemacht wird. Bei dieser Ausführungsform ist die Wahrscheinlichkeit verringert, dass irgendeine Flüssigkeit oder Reaktionslösungen unbeabsichtigt aus der Kammer B ziehen oder heraus in die Umgebung wandern. Wie in 4A zu sehen ist, ist der Knopf 41 mit dem übrigen Abdeckteil mittels federnder Schenkel 41A verbunden, die eine Bewegung des Knopfes 41 und der hervorstehenden Spitze 41B relativ zum Abdeckteil und dadurch ein Durchbohren der Membrane ermöglichen. Sobald er in die untere Stellung bewegt ist, passt die Seitenwand 4D bequem in den entsprechenden kreisrunden Wandteil 41E des Abdeckteils 14, wie am besten in 4B gezeigt ist. In diesen Figuren ist auch die zentrale Öffnung 28 dargestellt, die ein poröses Siebgewebefilter aufnimmt.
Eine andere alternative Ausführungsform für das Abdeckteil 14 ist in den 4C und 4D dargestellt. Der Knopf 41 ist von einer oberen in 4C gezeigten Stellung, in der sich die hervorstehende schneidende Fläche 41B oberhalb der nicht dargestellten Membrane befindet, welche die Kammer A bedeckt, in eine in 4D gezeigte untere Stellung bewegbar, in der die hervorstehende schneidende Fläche 41B durch die Membrane schneidet. Der Anwender hebt dann das Ende 30 des Abdeckteils an und fügt die Untersuchungsprobe in das kleine Loch ein, das in der Membrane durch die Schneideinrichtung 41B geformt ist. Ein federnder Einschnapprand 41F am unteren Teil des Knopfes 41 erfasst einen vorstehenden Absatz am oberen Ende der Kammer A, wie in 4D dargestellt ist, wodurch ein eindeutiges Gefühl für den Eingriffs des Knopfes mit der Membrane gegeben ist. Der Anwender kann dennoch das Ende des Abdeckteils 14 leicht anheben, um die Probe in die Kammer A einzuführen.
Insbesondere auf die 2 und 4 Bezug nehmend weist das Abdeckteil 14 einen Lückenbereich 40 auf, der eine Zugang für eine Gabel bietet, die in einer Verarbeitungsstation relativ zum Teststreifen hin- und herbewegbar ist. Die Gabel, die anschließend in Verbindung mit den 19–22 erörtert wird, bewirkt ein Öffnen eines Kugelventils in einer im Teststreifen vorgesehenen Verbindungsleitung, welche die Kammern A und B im Doppelkammerreaktionsgefäß 12 verbindet.
Figur ist 5, eine Draufsicht des Teststreifens der 1–3, wobei das Abdeckteil entfernt ist, um die Einrichtungen des Teststreifens an sich besser zu veranschaulichen. Unter Bezugnahme auf die rechte Seite der 5 ist eine dichtende Membrane 42, wie eine Aluminiumfolie, auf der Oberseite des Teststreifens 10 angebracht. Die Membrane 42, die teilweise weggebrochen dargestellt ist, erstreckt sich von der in der rechten Seite der 5 dargestellten Stelle über die gesamte Oberseite des Teststreifens. Die Membrane endet in einem freien Ende 32 angrenzend an die Kammer A des Doppelkammerreaktionsgefäßes 12 in der Nähe des Endes 18A. So bedeckt die Membrane 42 die Wells 13 des Teststreifens vollständig und dichtet sie ab. Das rechte Ende 18B des Teststreifens enthält eine Öffnung 44 zur Aufnahme einer optischen Küvette für Zwecke der optischen Analyse eines Nachweises von Reaktionsprodukten, die bei einem analytischen Arbeitsverfahren für den Teststreifen in bekannter Weise verwendet werden. Die Reaktionsprodukte resultieren aus einer oder mehreren Hybridisierungsreaktionen unter Verwendung einer stabilen Auflage, um Erfassung für Erfassung das Reakti onsprodukt zu untersuchen, das heißt den Hybridisierungskomplex der Amplicon- und Abtastuntersuchung. Zusätzliche Typen von Konkurrenzuntersuchungen können ebenso angewendet werden, aber nicht bei der bzw. den Hybridisierungsreaktion(en) aufgespürt werden.
Nun auf die linke Seite der 5 Bezug nehmend enthält der Teststreifen 10 die Kammer A des Doppelkammerreaktionsgefäßes, eine vertikal angeordnete Verbindungsleitung 50, die von der Basis des Teststreifens 10 hinauf zu dessen oberem Bereich führt, und ein Enzympelletwell 52, welches das Amplifikationsenzym bzw. die Amplifikationsenzyme enthält. Ein Ventil, das anschließend in Verbindung mit den 19–22 beschrieben wird, ist in der Verbindungsleitung 50 angeordnet und ist wahlweise zu öffnen, um zu ermöglichen, dass eine Lösung von der Kammer A aufwärts durch die Verbindungsleitung 50 und in das Enzympelletwell 52 läuft. Der Durchfluss der Lösung durch das Enzympelletwell löst das Pellet auf. Die Lösung tritt in die Kammer B ein und die Amplifikation findet in der Kammer B statt.
Der Teststreifen 10 enthält ferner ein Paar von Trockenmittelwells 54 und 56, die in Luft- oder Flüssigkeitsverbindung mit der Kammer B stehen. Das Trockenmittelwell 54 ist auch in 6 dargestellt, die eine Schnittzeichnung des Teststreifens entlang den Linien 6-6 der 5 ist. Die Trockenmittelwells 54 und 56 sind dafür ausgelegt, ein einzelnes oder eine Vielzahl von kleinen Trockenmittelpellets bereitzuhalten, die in den Wells übereinander gestapelt sind. Während des Zusammenbaus des Teststreifens bestätig eine maschinelle Kontrolle der Trockenmittelwells die Menge der Trockenmittelpellets in den Wells 54 und 56. Der Zweck des Trockenmittels besteht darin, die Lagerfähigkeit der in den Teststreifen eingebrachten Amplifikationsenzyme zu verlängern, insbesondere, wenn das Amplifikationsenzym in Pelletform vorliegt und in Gegenwart einer feuchten Umgebung degradationsanfällig ist. Das Trocknungsmittel ist besonders wichtig für die Verträglichkeit von Reagens- oder Enzympellets gegenüber Feuchtigkeit bei der extrem kritischen Größenordnung von Enzym- und Reagenskonzentrationen, die in einem gasdurchlässigen Werkstoff, beispielsweise einem Teststreifen bereitgehalten werden. Falls die Nukleotiden, MgCl₂, Primer und andere Reagenzien, die in die Kammer A eingebracht sind, in flüssiger Form vorliegen, dann müssen die Trockenmittelwells 54 und 56 nicht in direkter Luft- oder Flüssigkeitsverbindung mit der Kammer A angeordnet werden. Falls jedoch die Reagenzien in der Kammer A ebenfalls in Pelletform vorliegen oder ansonsten in Gegenwart einer feuchten Umgebung degradationsanfällig sind, dann werden die Trockenmittelwells so ausgelegt und konstruiert, dass sie mit der Kammer A zusätzlich zur Kammer B in Verbindung stehen, oder es kann alternativ ein zweiter Satz von Trockenmittelwells angrenzend an die Kammer A vorgesehen werden, um die Reagenzien in der Kammer A zu warten.
Unter Bezugnahme besonders auf die 6 und 13 enthält der extrem seitliche Teil des Trockenmittelwells 54 einen Durchlass, der durch die Pfeile 58 in 13 angedeutet ist, welche die Luftverbindung mit der Kammer B und letztendlich die Luftverbindung mit dem im Enzympelletwell 52 angeordneten Enzympellet bezeichnen. Der Durchlass 58 ist oberhalb einer Wand 60 gebildet, welche den seitlichen Teil des Trockenmittelwells 54 von der Kammer B trennt. Die zwei Trockenmittelwells können verschiedene Zusammensetzungen von Trockenmitteln mit unterschiedlichen Absorptionscharakteristiken aufnehmen. Drei in dem Trockenmittelwell 54 angeordnete Trockenmittelkugeln 62 sind in 13 in durchsichtiger Darstellung angedeutet. Alternativ kann das Trockenmittel die Form eines einzigen vereinheitlichten Körpers aufweisen. Alternativ könnten die Trockenmittelkugeln ohne nachteilige Wirkung auf die Amplifikationsreaktion direkt in der Kammer B angeordnet oder in den Werkstoff eingegossen sein, der das Doppelkammerreaktionsgefäß 12 bildet.
Bezug nehmend auf die 5 und 6 weist die obere Fläche 15 des Teststreifens 10 eine Öffnung 70 auf, die dafür ausgelegt sind, die Gabeln der 19–21 während des Vorgangs des Öffnens der Verbindungsleitung 50 aufzunehmen. Das Abdeckteil 14 der 3 und 4 ist über dem Teststreifen 10 so eingebaut, dass die Öffnung 40 des Abdeckteils direkt über der Öffnung 70 des Testreifens angeordnet ist. In 5 sind auch die Absatzeinrichtungen 72 dargestellt, die den federnden Schenkeln 20 des Abdeckteils ermöglichen, an dem Teststreifen einzurasten, wenn das Abdeckteil auf dem Teststreifen eingebaut wird. Diese Einrichtungen sind ebenfalls in den 8–12 dargestellt. Bezug nehmend auf die 9 und 10 weist der Teststreifen einen abgeschrägten Teil 74 auf, über den die Klemmeinrichtung 21 (4) des Abdeckteils gleitet, bis die Klemmeinrichtung 21 unter dem Absatz 76 einschnappt und gegen den Wandteil 78 drückt. Die federnde Art der Schenkel 20 des Abdeckteils und die Wirkung der Klemmeinrichtung 21 gegen den Absatz 76 verhindern, dass das Abdeckteil 14 während des Vorgangs des Anhebens und Absenkens des vorderen Teils 24 des Abdeckteils vom Teststreifen gelöst wird. Die abgeschrägte Fläche 80 der 9 unterstützt den Einbau des Abdeckteils und das Ausrichten der Schenkel 20 relativ zur Absatzeinrichtung 72.
Bezug nehmend auf die 6 und 8 weist der Teststreifen ein Paar an den Boden des Teststreifens angeformter sich quer erstreckender Leisten 84 auf, die es ermöglichen, den Teststreifen in einer stabilen ebenen Lage auf einer Platte anzuordnen.
Die 2 und 8 stellen eine Bodenverschlusskappe 86 dar, die getrennt gefertigt und mit Ultraschall an den Boden des Teststreifens 10 geschweißt ist. Die Kappe 86 bedeckt den extrem untersten Teil der Kammer A und bildet eine Flüssigkeitsleitung für eine Lösung, die von der Kammer A zur Basis der vertikal angeordneten Verbindungsleitung 50 hindurchlaufen soll, und schafft einen engen Kontakt mit einem TEC/Kühlkörper-Wärmeregler. Die Kappe 86 ist mehr im Einzelnen in den 14 und 15 dargestellt. Bezug nehmend auf die 8 und 14–15 weist die Kappe 86 einen halbrunden Teil 88 auf, der an den Fuß der Kammer A geschweißt ist. Ein Paar gegenüberliegender Randelemente 90 ist an ein Rippenteil 87 (8) geschweißt, das die Kammer A mit der Verbindungsleitung 52 verbindet. Die Kappe weist einen anderen halbrunden Teil 92 auf, der an eine entsprechende halbrunde Fläche am Fuß der Verbindungsleitung 50 geschweißt ist. So bildet die Kappe einen Durchgang 94, der es einer Flüssigkeit ermöglicht, vom Fuß der Kammer A zum Fuß der Verbindungsleitung 50 durchzulaufen, wie durch die Pfeile in 14 angedeutet ist.
11 ist eine ausführliche Schnittzeichnung des Teststreifens der 5 entlang den Linien 11-11 der 5, der teilweise weggebrochen ist, wobei das Trockenmittelwell 56 und das Enzympelletwell 52 dargestellt sind. 16 ist eine ausführliche Draufsicht des Teststreifens 10, welche die Strukturen des Doppelkammerreaktionsbehälters 12 darstellt. Bezug nehmend auf diese Figuren in Verbindung mit den 17–22 werden nun die Funktion des Ventils in der Verbindungsleitung 50 und das Fließen der Lösung von der Reaktionskammer A zur Reaktionskammer B im Einzelnen beschrieben.
Nachdem die Denaturierung und das Primer-Annealing der flüssigen Probe in der Reaktionskammer A bei der ersten Reaktionstemperatur stattgefunden hat, wird ein in den 17 und 18 allgemein mit 102 bezeichnetes Kugelventil geöffnet. Das Kugelventil besteht aus einer Metallkugel 104, die in der Verbindungsleitung 50 in einem zylindrisch geformten Zwischenbereich 106 angeordnet ist. Die Kugel 104 ist so bemessen, dass ihr Durchmesser ein wenig größer als der Durchmesser des Zwischenbereichs 106 ist, so dass sie normalerweise eine vollständige Blockierung der Verbindungsleitung bildet. Die Wände 108 der Verbindungsleitung 50 sind aus einem verformbaren Werkstoff hergestellt (und Polypropylen ist für die derzeitigen Zwecke ausreichend verformbar). Diese Verformbarkeit der Wände 108 ist derart, dass beim Quetschen der Wände 108 auf entgegengesetzten Seiten der Kugel 104 die Wand 108 in der Richtung senkrecht zur Quetschkraft an entgegengesetzten Seiten der Kugel verformt wird, wodurch um die Kugel ein Durchgang für Flüssigkeit erzeugt wird.
Zum Erzeugen diese Quetschwirkung an den Wänden 108 und der Kugel 104 wird eine Gabel 110 mit zwei Zinken 112 durch die Öffnung 40 des Abdeckteils (wie am besten in 19 dargestellt ist) und durch die Öffnung 70 in der Oberseite des Teststreifens (wie am besten in 16 dargestellt ist) abgesenkt. Die Zinken 112 der Gabel kommen mit den Wänden 108 der Verbindungsleitung 50 direkt auf entgegengesetzten Seiten der Kugel 104 in quetschenden Kontakt, wie in 21 am besten dargestellt ist. Dieser Quetschvorgang verformt die Wände 108, wie in 22 dargestellt ist, um Durchgänge 116 auf entgegengesetzten Seiten der Kugel 104 zu bilden.
Gleichzeitig mit dem Öffnen des Kugelventils, wie es soeben beschrieben wurde, werden der Teststreifen und insbesondere die erste Reaktionskammer A mit Unterdruck beaufschlagt. Dies wird erreicht, indem der Teststreifen in einer Reaktionsverarbeitungsstation angeordnet wird, die eine Unterdruckkammer um den Teststreifen aufweist und die in der Unterdruckkammer befindliche Luft evakuiert. Die Saugwirkung des Unterdrucks senkt den Druck sowohl in der ersten Kammer A als auch der zweiten Kammer B, weil sie nun in Luft- und Flüssigkeitsverbindung miteinander stehen. Wenn der Unterdruck ausgeschaltet wird, ist ein Druckgradient zwischen der Kammer A und der Kammer B vorhanden, wobei die Kammer A unter einem höheren Druck steht. Der Druckgradient treibt die flüssige Lösung in der Kammer A durch den Durchgang 94 in der Kappe 86 (siehe 14 und 15), aufwärts und durch die Durchgänge 116 in der Verbindungsleitung 50, wie durch die Pfeile in 22 angedeutet ist, und aufwärts zum Oberteil der Verbindungsleitung 50.
Sobald die flüssige Lösung den Oberteil der Verbindungsleitung 50 erreicht hat, tritt die Flüssigkeit in einen Kanal 100 ein (siehe 16 und 17), der zum Enzympelletwell 52 führt. Die Flüssigkeit löst das Enzympellet 130 (17) in dem Well 52 auf und bringt die Ampli fikationsenzyme in die Kammer B. Die Amplifikation der Nukleinsäure in der flüssigen Probe findet in der Kammer B bei der festgelegten Temperatur, z. B. 42 °C, statt.
Nun auf die 19 und 20 Bezug nehmend ist die hin- und hergehende Wirkung der Gabel 110, die das Kugelventil öffnet, schematisch dargestellt. In 19 ist der Teststreifen 10 dargestellt, wobei die Membrane 42 auf der Oberseite des Teststreifens in der zuvor beschriebenen Weise angebracht ist, wie es sein würde, wenn die Vorrichtung hergestellt und gebrauchsfertig ist. Die Membrane 42 trägt einen Barkode, der die Art des Teststreifens bezeichnet, der verwendet wird oder andere zweckdienliche Informationen.
In 20 sind die Gabeln 110 in Verbindung mit einer Amplifikationsverarbeitungsstation der in der US-Patentschrift Nr. 5,786,182 beschriebenen Art dargestellt. Die Station ist in einer Endansicht, teilweise im Schnitt dargestellt, wobei zwei Teststreifen 10 in die Station eingesetzt sind. Die Gabeln sind integral an einem Querelement 132 dargestellt, das seinerseits an das Oberteil eines Unterdruckdeckelgehäuses 134 in der Amplifikationsverarbeitungsstation geschraubt ist. Die Teststreifen sind auf einer TEC/Kühlkörperbaugruppe 136 angebracht, welche die zwei Kammern des Doppelkammerreaktionsgefäßes in den Teststreifen 10 auf der genauen Temperatur hält, wie es im Einzelnen in der US-Patentschrift Nr. 5,786,182 beschrieben ist. Das Unterdruckdeckelgehäuse 134 ist an einer mechanischen Antriebseinrichtung befestigt, welche das Unterdruckdeckelgehäuse relativ zu einem horizontalen Tragelement 138 hebt und senkt. Das Deckelgehäuse 134 und das Tragelement 138 bilden eine Unterdruckkapsel oder -kammer 140. Das Unterdruckdeckelgehäuse 134 enthält ferner nicht dargestellte Öffnungen zum Absaugen von Luft aus der Unterdruckkapsel 140 und zum Zurückleiten von Luft in die Unterdruckkapsel 140. Wenn das Unterdruckdeckelgehäuse 134 nach unten auf das Tragelement 138 abgesenkt wird, bildet es unter Verwendung einer geeigneten Dichtkonstruktion im Bereich 139 eine luftdichte Abdichtung mit dem Tragelement 138, die es ermöglicht, in der Kapsel durch Absaugen Unterdruck zu erzeugen. Das Erzeugen von Unterdruck in der Kapsel 140 veranlasst, dass über die Öffnung 28 im Abdeckteil 14 und ein darin angeordnetes luftdurchlässiges Filter (siehe 19) Luft aus dem Doppelkammerreaktionsgefäß gesaugt wird. Wenn dann der Unterdruck in der Kapsel 140 ausgeschaltet wird, wobei das Gehäuse 134 während des Ausschaltens des Unterdrucks in der unteren Position bleibt, bewirkt die Druckdifferenz zwischen den Kammern A und B, dass die flüssige Lösung in der Kammer A in der zuvor beschriebenen Weise durch die Verbindungsleitung, die durch die Wirkung der Gabeln 110 geöffnet ist, und in das Enzympelletwell und die Kammer B wandert.
Weitere Einzelheiten einer gegenwärtig bevorzugten Amplifikationsstation, welche die Unterdruck- und andere Einrichtungen der 20 enthält, sind in der Anmeldung von Bryan Kluttz et al beschrieben, die gleichzeitig eingereicht und zuvor angeführt wurde.
Während die obige Kugelventilausführungsform eine gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform ist, versteht es sich dass zahlreiche andere äquivalente oder Ersatzeinrichtungen in eine Testvorrichtung für Zwecke des Ermöglichens des Wanderns oder Übergehens von Flüssigkeit von der Kammer A zur Kammer B eingebaut werden können. Mehrere unterschiedliche Einrichtungen sind in der US-Patentschrift Nr. 5,786,182 beschrieben. Noch andere unterschiedliche Ventileinrichtungen können vorhanden sein oder können von Fachleuten entwickelt werden. Die besonderen Einzelheiten der Ventileinrichtung werden als nicht besonders wichtig für die Erfindung betrachtet. Wenn eine unterschiedliche Ventileinrichtung verwendet wird, dann kann die Amplifikationsreaktions-Verarbeitungsstation, welche den Teststreifen verarbeitet, offensichtlich eine unterschiedliche Art von Ventilöffnungseinrichtung außer den Gabeln der 20 haben. Demzufolge können die Einzelheiten der die Testvorrichtung verarbeitenden Station unterschiedliche Funktionsmerkmale aufweisen, um mit der speziellen Ventileinrichtung oder Verbindungsleitungseinrichtung zu arbeiten, die in das Doppelkammerreaktionsgefäß eingebaut ist.
23 ist eine perspektivische Darstellung einer alternativen Ausführungsform des Teststreifens, bei der die Kammer A des Doppelkammerreaktionsgefäßes eine Außenflächengestaltung aufweist, die dafür ausgelegt ist, in enge Nähe oder engen Kontakt von bzw. mit einer TEC/Kühlkörperbaugruppe in einer Amplifikationsreaktions-Verarbeitungsstation zu kommen, um einen schnellen Wärmeübergang zwischen der Kammer A und der TEC/Kühlkörperbaugruppe zu fördern. Insbesondere weist die Wandstruktur, welche die Kammer A bildet, gegenüberliegende Seiten 200 auf, die einen ausgedehnten Oberflächenbereich bilden, um eine beheizte Fläche in der Amplifikationsstation zu berühren und Wärme von ihr ins Innere der Kammer A zu übertragen. Ähnlich weist die Wandstruktur 202, welche die Kammer B bildet, ausgedehnte ebene Flächen 202 an ihren gegenüberliegende Seiten auf, um Wärme ins Innere der Kammer B zu übertragen. Es ist zu bemerken, dass die 23 den Teststrei fen von unten darstellt, bevor die Bodenverschlusskappe 86 (siehe 8, 14 und 15) an den Einrichtungen befestigt wird, welche die Kammer A mit der vertikal angeordneten Verbindungsleitung 50 verbinden.

Claims

Testvorrichtung (10) zur Durchführung einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, die Folgendes umfasst: ein Gehäuse, das ein erstes und ein zweites Ende aufweist, wobei ein Teil des Gehäuses zwischen dem ersten und dem zweiten Ende eine Mehrzahl von Wells (13) umgrenzt; wobei das Gehäuse ferner ein Doppelkammerreaktionsgefäß (12) enthält, um darin eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchzuführen, und das Doppelkammerreaktionsgefäß eine erste Kammer (A), in dem ein erster Teil der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchgeführt wird, eine zweite Kammer (B), in dem ein zweiter Teil der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durchgeführt wird und eine betriebsbereite Verbindungsleitung aufweist, welche die erste Kammer mit der zweiten Kammer verbindet; eine am Gehäuse befestigte Membran, wobei die Membran so am Gehäuse angebracht ist, dass sie die ersten und zweiten Kammern und die Wells nach Einbringung von Reagenzien in die Testvorrichtung bedeckt; und ein Abdeckteil (14), das am Gehäuse befestigt ist und auf der Membran und der ersten Kammer aufliegt, wobei das Abdeckteil relativ zu der ersten Kammer bewegbar ist, um dadurch einem Benutzer zu ermöglichen, auf die Membran zuzugreifen und eine Probe in die erste Kammer einzuführen; dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckteil einen manuell betätigbaren Knopf (41) mit einer Schneidfläche aufweist, wobei der Knopf betriebsbereit ist, um die Membran zu durchstoßen.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Membran einen ersten Teil aufweist, der die erste Kammer abdeckt und einen zweiten Teil, der die zweite Kammer abdeckt, und einen dritten Teil, der den ersten und den zweiten Teil trennt, und wobei das Abdeckteil relativ zu der ersten Kammer bewegbar ist, um dadurch einem Benutzer zu ermöglichen, den dritten Teil zu zerreißen oder zu durchbohren und dadurch den ersten Teil der Membran von der Testvorrichtung abzunehmen.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Abdeckteil ferner enthält: einen ersten Teil, ein Scharnier und einen zweiten Teil, wobei der erste Teil die erste Kammer in einer ersten Stellung bedeckt, der erste Teil über das Scharnier relativ zur ersten Kammer in eine angehobene Stellung bewegbar ist, um einem Benutzer zu ermöglichen, auf die erste Kammer zuzugreifen und der zweite Teil mit der Testvorrichtung in Eingriff steht.
Testvorrichtung nach Anspruch 3, wobei der erste Teil des Abdeckteils ferner eine Öffnung in dem ersten Teil aufweist, die in Deckung mit der ersten Kammer angeordnet ist, wenn sich der erste Teil in der ersten Stellung befindet, und ein absorbierendes Siebfilter innerhalb der Öffnung angeordnet ist.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Abdeckteil ferner eine ein poröses Filter aufnehmende Öffnung aufweist und das Abdeckteil an dem Gehäuse so befestigbar ist, dass sich das poröse Filter mit der ersten Kammer des Doppelkammerreaktionsgefäßes in Deckung befindet.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Abdeckteil ferner eine elastische Einrasteinrichtung zum lösbaren Eingriff des Abdeckteils mit dem Gehäuse aufweist.
Verfahren zum Aufbauen einer Einheitsdosis-Nukleinsäure-Amplifikationsreaktions-Testvorrichtung, das Folgendes umfasst: Ausbilden einer Testvorrichtung (10) mit einem Doppelkammerreaktionsgefäß (12), das (1) eine erste Kammer (A), eine zweite Kammer (B) und eine die erste Kammer und mit der zweiten Kammer verbindende Verbindungsleitung und (2) mindestens einen dazwischen liegenden Entwicklungswell (52) aufweist; Hinzufügen eines ersten Reagens zur ersten Kammer; Hinzufügen eines zweiten Reagens in die Testvorrichtung entweder in die zweite Kammer oder eine dazwischen liegende Kammer, die mit der zweiten Kammer in Flüssigkeitsverbindung steht; Befestigen einer dichtenden Membran an der Testvorrichtung in einer Weise, dass die erste und die zweite Kammer bedeckt sind; und Befestigen eines Abdeckteils (14) an der Testvorrichtung, wobei das Abdeckteil relativ zu der ersten Kammer bewegbar ist, um dadurch einen Zugang zur dichtenden Membran zu ermöglichen; dadurch gekennzeichnet, dass das Abdeckteil einen manuell betätigbaren Knopf (41) mit einer Schneidfläche aufweist, wobei der Knopf betriebsbereit ist, um die Membrane zu durchstoßen.
Verfahren nach Anspruch 7, welches ferner das Befestigen einer Bodenverschlusskappe an der Testvorrichtung umfasst, wobei die Verschlusskappe einen Kanal zwischen der ersten Kammer und der Verbindungsleitung bildet.
Verfahren nach Anspruch 8, welches ferner das Hinzufügen eines Trockenmittels in die Testvorrichtung in Verbindung mit entweder dem ersten Reagens oder dem zweiten Reagens oder sowohl dem ersten als auch dem zweiten Reagens umfasst.