ES2292473T3 - Dispositivos de ensayo desechables para realizar reacciones de amplificacion de acido nucleico. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo (10) de ensayo o de realización de reacción de amplificación de ácido nucleico, que comprende: un alojamiento que posee un primer extremo y un segundo extremo, teniendo el citado alojamiento una porción del mismo que define una pluralidad de pocillos (13) entre dichos primer y segundo extremos; comprendiendo además el citado alojamiento un vaso (12) de reacción de doble cámara para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico en el mismo, comprendiendo el citado vaso de reacción de doble cámara una primera cámara (A) en la que se lleva a cabo una primera parte de una reacción de amplificación de ácido nucleico, una segunda cámara (B) en la que se lleva a cabo una segunda parte de una reacción de amplificación de ácido nucleico, y un conducto de conexión operable que une la citada primera cámara con la citada segunda cámara; una membrana fijada a dicho alojamiento, estando la citada membrana aplicada a dicho alojamiento para cubrir las citadas primera y segunda cámaras y los citados pocillos tras la inserción de los reactivos en el citado dispositivo de ensayo, y un miembro (14) de cubierta asegurado a dicho alojamiento y que se superpone a la citada membrana y a la citada primera cámara, siendo el citado miembro de cubierta móvil en relación con la citada primera cámara para permitir con ello que un usuario acceda a la citada membrana e introduzca una muestra en la citada primera cámara, que se caracteriza porque el citado miembro de cubierta comprende un botón (41) accionado manualmente, que posee una superficie cortante, siendo el citado botón accionable para perforar la citada membrana.

Description

Dispositivos de ensayo desechables para realizar reacciones de amplificación de ácido nucleico.

Esta invención está relacionada con el campo de los procedimientos y los dispositivos para llevar a cabo reacciones de amplificación de ácido nucleico.

Las reacciones de amplificación basadas en ácido nucleico, son ahora ampliamente utilizadas en los laboratorios clínicos y de investigación para la detección de enfermedades genéticas e infecciosas. Los esquemas de amplificación actualmente conocidos, pueden ser agrupados, en sentido amplio, en dos clases, en base a si, después de una etapa inicial de desnaturalización (realizada típicamente a una temperatura \geq 65ºC) para amplificaciones de ADN o para amplificaciones de ARN que incluyen una cantidad elevada de estructura inicial secundaria, las reacciones son impulsadas por medio de una utilización cíclica continuada de la temperatura entre la temperatura de desnaturalización y la temperatura de síntesis de endurecimiento y amplificación de iniciador (o actividad de polimerasa) ("reacciones de generación cíclica"), o si la temperatura se mantiene constante durante el proceso de amplificación enzimática ("reacciones isotermas"). Las reacciones típicas de generación cíclica son la Reacción de Cadena de Polimerasa y la de Ligasa (PCR y LCR, respectivamente). Los esquemas representativos de reacción isoterma son
NASBA (Amplificación Basada en Secuencia de Ácido Nucleico), Amplificación Ajustada de Transcripción (TMA), y Amplificación de Desplazamiento de Filamento (SDA). En las reacciones isotermas, tras la etapa de desnaturalización inicial (si se requiere), la reacción ocurre a temperatura constante, típicamente una temperatura inferior a la que se optimiza la reacción de amplificación enzimática.

Con anterioridad al descubrimiento de las enzimas termoestables, las metodologías que utilizaban regulación cíclica de temperatura se vieron obstaculizadas seriamente por la necesidad de dispensar polimerasa fresca a un tubo de amplificación (tal como un tubo de ensayo) después de cada ciclo de desnaturalización, puesto que la elevada temperatura requerida para la desnaturalización inactivaba la polimerasa durante cada ciclo. Una simplificación considerable del procedimiento de ensayo PCR se alcanzó con el descubrimiento de la polimerasa Taq termoestable (a partir de Thermophilus aquaticus). Este perfeccionamiento eliminó la necesidad de abrir los tubos de amplificación después de cada ciclo de amplificación para añadir enzima fresca. Esto condujo a la reducción tanto del riesgo de contaminación como de los costes relativos a la enzima. La introducción de enzimas termoestables ha permitido también la automatización relativamente simple de la técnica PCR. Además, esta nueva enzima permitió la implementación de dispositivos simples desechables (tales como un simple tubo) para su uso con un equipo de regulación cíclica de la temperatura.

La TMA requiere las actividades combinadas de al menos dos (2) enzimas para las que no se han descrito variantes termoestables. Para un endurecimiento óptimo del iniciador en la reacción de TMA, se lleva a cabo una etapa de desnaturalización inicial (a una temperatura \geq 65ºC), para retirar la estructura secundaria del objetivo. La mezcla de reacción se enfría a continuación hasta una temperatura de 42ºC para permitir el endurecimiento del iniciador. Esta temperatura es también la temperatura de reacción óptima para las actividades combinadas de polimerasa T7 del ARN y de Transcriptasa Reversa (RT), lo que incluye una actividad H de RNasa endógena, o es proporcionada alternativamente por otro reactivo. La temperatura se mantiene a 42ºC durante la reacción de amplificación isoterma que sigue. La etapa de desnaturalización, que precede al ciclo de amplificación, sin embargo, fuerza al usuario a añadir la enzima al tubo de ensayo después del período de enfriamiento con el fin de evitar la inactivación de las enzimas. Por lo tanto, la etapa de desnaturalización necesita ser llevada a cabo separadamente de la etapa de amplificación.

De acuerdo con la práctica actual, tras la adición de la muestra de ensayo o de control, o ambas, a la mezcla de reactivo de amplificación (que contiene típicamente los nucleótidos y los iniciadores), el tubo de ensayo se somete a temperaturas \geq 65ºC, y a continuación se enfría hasta la temperatura de amplificación de 42ºC. La enzima se añade a continuación manualmente para iniciar la reacción de amplificación. Esta etapa requiere típicamente la apertura del tubo de amplificación. La apertura del tubo de amplificación para añadir la enzima o la adición posterior de enzima a un tubo abierto, no sólo resulta inconveniente, sino que también incrementa el riesgo de contaminación.

Una aproximación alternativa a la amplificación de una muestra de ADN, ha sido descrita por Corbett et al., en la Patente U.S. núm. 5.270.183. En esta técnica, se inyecta una mezcla de reacción en una corriente de fluido portador. El fluido portador pasa a continuación a través de una pluralidad de zonas de temperatura en las que tienen lugar las reacciones de cadena de polimerasa. La temperatura de las diferentes zonas y el tiempo transcurrido para que el fluido portador atraviese las zonas de temperatura, están controladas de manera que ocurren tres eventos: desnaturalización de las cadenas de ADN, endurecimiento de los iniciadores de oligonucleotina para secuencias complementarias en el ADN, y síntesis de las nuevas cadenas de ADN. Un tubo y zonas de temperatura asociadas y medios de bombeo, han sido previstos para llevar a cabo el proceso de la Patente núm. 5.270.183.

La presente invención evita los inconvenientes y el riesgo de contaminación descritos en lo que antecede, mediante la provisión de un novedoso dispositivo de ensayo o vaso de reacción "binario", y de una manera de uso del dispositivo. La invención consigue la integración de la etapa de desnaturalización con la etapa de amplificación sin necesidad de adición manual de enzima y sin exponer la cámara de amplificación al medio ambiente. Los riesgos de contaminación en cuanto a contaminación de muestra a muestra en el interior de la estación de procesamiento, son evitados debido a que la cámara de reacción de amplificación está hermetizada y no se abre para introducir la muestra de paciente en la enzima. La contaminación procedente de fuentes del ambiente exterior, se evita debido a que la cámara de reacción de amplificación se mantiene sellada. El riesgo de contaminación en las reacciones de amplificación de ácido nucleico es especialmente crítico debido a que se producen grandes cantidades del producto de amplificación. La presente invención proporciona un diseño de cámara de reacción que elimina sustancialmente esos riesgos.

La realización preferida de tira de ensayo permite que el dispositivo de ensayo sea utilizado en una base de instrumento instalado actualmente tras la realización de la reacción de amplificación, en especial el instrumento VIDAS^{TM} fabricado y distribuido por la cesionaria de la presente invención, bioMérieux, Inc. De ese modo, la provisión de dispositivos de ensayo con un tamaño y una configuración que puedan ser fácilmente utilizados en una base de instrumento ya existente, permite que los dispositivos sean comercializados y utilizados con un gasto económico reducido y sin tener que desarrollar un nuevo instrumento para el procesamiento de la reacción y la detección de los amplicones resultantes.

Un vaso de reacción relacionado de doble cámara, se encuentra descrito en el documento EP-A-0 875 291.

Sumario de la invención

La invención se encuentra definida en las reivindicaciones 1 y 7 independientes.

En una forma preferida de la invención, se proporciona un vaso de reacción de doble cámara que comprende una dosis simple o unitaria de reactivos para una reacción que requiere características de contención y de calor diferencial, tal como una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, reacción TMA), empaquetada, lista para su uso. El vaso de de reacción de doble cámara está diseñado en forma de unidad desechable de un sólo uso. El vaso de reacción está, con preferencia, moldeado integralmente según un dispositivo de ensayo, tal como una tira, que tiene un conjunto de pocillos de lavado y de reactivo para su uso en una estación de detección de producto. Alternativamente, el vaso de reacción puede estar hecho en forma de unidad autónoma con pestañas u otras estructuras adecuadas para que pueda ser instalado en un espacio designado, previsto en tal dispositivo de ensayo.

En el vaso de reacción de doble cámara, se proporcionan dos cámaras de reacción separadas en una forma preferida de la invención. Los dos reactivos principales para la reacción están almacenados de una forma espacialmente separada. Una cámara tiene la muestra estable al calor/reactivo de amplificación (que contiene los iniciadores, nucleótidos y otras sales y componentes amortiguadores necesarios en una solución de reacción), y la otra cámara contiene reactivos enzimáticos inestables con el calor, por ejemplo T7 y RT. Alternativamente, los reactivos enzimáticos inestables con el calor pueden estar almacenados en una cámara o pocillo intermedio, en comunicación de fluido con la segunda cámara, de tal modo que una solución de reacción procedente de la primera cámara fluye a través de la cámara intermedia en dirección a la segunda cámara.

Un canal de fluido que se extiende desde la primera cámara hasta la segunda cámara, enlaza las dos cámaras cada una con la otra. Se ha previsto un medio para controlar, o permitir, el flujo de fluido a través del canal de fluido desde la primera cámara hasta la segunda cámara. Se han contemplado diversos medios de control de flujo de fluido, tal como la provisión de una válvula en el canal de fluido, según se ha descrito en la solicitud serie núm. 09/053.823 depositada el 2 de Abril de 1998, ahora Patente U.S. núm. 5.989.499 y Patente U.S. núm. 5.786.182. En las mismas se describen varias realizaciones de válvula diferentes.

Durante el uso, la muestra de fluido se introduce en la primera cámara y la primera cámara se calienta hasta una temperatura de desnaturalización (por ejemplo, 95ºC). Una vez que los reactivos de amplificación presentes en la primera cámara han reaccionado con la muestra de fluido y se ha completado el proceso de desnaturalización, la primera cámara se enfría hasta 42ºC para el endurecimiento del iniciador. Las dos cámaras del vaso de reacción no se ponen en comunicación de fluido cada una con la otra antes de que termine la etapa de desnaturalización y de enfriamiento. Después de que se han completado estas etapas, se activan los medios de control del flujo de fluido, para permitir que la solución de reacción pase a través del canal de fluido, desde la primera cámara hasta la segunda cámara. Por ejemplo, la válvula presente en el canal de fluido se abre, y la muestra de fluido se dirige hacia la segunda cámara mediante técnicas de presión o bien de vacío. La solución de reacción se pone a continuación en contacto con la(s) enzima(s) de amplificación (por ejemplo, T7 y/o RT), y el proceso de amplificación enzimática continúa en la segunda cámara a 42ºC.

En una realización preferida, después de la terminación de la reacción de amplificación, se introduce un SPR^{TM} (un dispositivo de transferencia de fluido, a modo de pipeta, que funciona como receptáculo de fase sólida) en la segunda cámara. La tira de ensayo contiene una pluralidad de pocillos dispuestos en batería. A continuación siguen los análisis de hibridación, lavado y ópticos en los pocillos de acuerdo con técnicas bien conocidas, con el fin de detectar los productos de amplificación. Tales procesos pueden ocurrir en pocillos adyacentes de una realización de tira de ensayo del vaso de reacción de doble cámara en forma automática, en un instrumento automatizado, tal como el instrumento VIDAS^{TM} de bioMerieux, Inc.

De ese modo, una forma preferida de la presente invención comprende una tira de ensayo para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico. La tira de ensayo incluye un alojamiento integral, alargado, formado en una tira que tiene un primer extremo y un segundo extremo, teniendo el alojamiento una porción del mismo que define una pluralidad de pocillos dispuestos según una batería lineal situada en la tira entre el primer y el segundo extremos. Los pocillos se utilizarán típicamente para las etapas de hibridación, lavado u otras etapas de detección y descontaminación después de que se haya completado la reacción de amplificación de ácido nucleico.

El alojamiento de la tira de ensayo incluye un vaso de reacción de doble cámara para que se lleve a cabo en el mismo una reacción de amplificación de ácido nucleico, posicionado adyacente al primer extremo de la tira de ensayo. El vaso de reacción de doble cámara comprende (1) una primera cámara en la que se lleva a cabo una primera parte de una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, la desnaturalización y el endurecimiento del iniciador), (2) una segunda cámara en la que se lleva a cabo una segunda parte de la reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, amplificación de nucleótidos mediante una enzima de amplificación), y (3) un conducto de conexión susceptible de apertura, que enlaza la primera cámara con la segunda cámara.

En la fabricación de la tira de ensayo, se introduce un primer reactivo (por ejemplo, iniciadores y/o nucleótidos) en la primera cámara para la primera parte de la reacción de amplificación de ácido nucleico, y un segundo reactivo (por ejemplo, una enzima de amplificación) o bien se introduce en, o bien se sitúa en comunicación de fluido con, la segunda cámara. Después de que los reactivos han sido cargados en las dos cámaras del vaso de reacción de doble cámara (y cualquier reactivo(s) introducido(s) en los restantes pocillos de la tira de ensayo), se fija una membrana al alojamiento de la tira de ensayo. La membrana se aplica al alojamiento para cubrir la primera y la segunda cámaras, y los pocillos. Se pueden prever etapas separadas de carga de reactivo y de cobertura. Se pueden utilizar otros reactivos en otras etapas de reacción para el análisis de la muestra de ensayo.

Con el fin de prolongar la vida propia de las tiras de ensayo y de los reactivos contenidos en la misma, se puede disponer un desecante en la tira de ensayo, con preferencia en comunicación con cualquiera de las cámaras primera y segunda del vaso de reacción de doble cámara. Alternativamente, el desecante puede estar moldeado con el material que forma el alojamiento de la tira de ensayo.

Con el fin de proporcionar un medio para la descontaminación de la tira de ensayo con anterioridad a su extracción desde el instrumento, se proporciona una solución de descontaminación o de lavado y desteñido en uno de los pocillos estanquizados.

Breve descripción de los dibujos

Una realización actualmente preferida de la invención va a ser descrita ahora junto con las figuras de los dibujos anexos, en los que los mismos números de referencia se refieren a elementos iguales en las diversas vistas, y en los que:

La Figura 1 es una vista en perspectiva de una tira de ensayo que incorpora un vaso de reacción de doble cámara para una reacción de amplificación de ácido nucleico y un miembro de cubierta asociado de acuerdo con una realización actualmente preferida de la invención, que muestra el miembro de cubierta con anterioridad a su fijación a la tira de ensayo en las proximidades del vaso de reacción de doble cámara;

la Figura 2 es otra vista en perspectiva de la tira de ensayo y del miembro de cubierta de la Figura 1, que muestra el miembro de cubierta sujeto a la tira de ensayo, y con una porción del miembro de cubierta en posición levantada o elevada, permitiendo el acceso a la primera cámara de reacción del vaso de reacción de doble cámara existente en la misma;

la Figura 3 es otra vista en perspectiva de la tira de ensayo de la Figura 2;

la Figura 4 es una vista en perspectiva, aislada, del miembro de cubierta de las Figuras 1-3, mostrado desde abajo;

las Figuras 4A y 4B son vistas en perspectiva de una realización alternativa del miembro de cubierta;

las Figuras 4C y 4D son vistas de otra realización alternativa adicional del miembro de cubierta;

las Figuras 4E, 4F y 4G son vistas detalladas del botón de las Figuras 4C y 4D;

la Figura 5 es una vista superior de la tira de ensayo de las Figuras 1-3;

la Figura 6 es una vista en sección transversal de la tira de ensayo de la Figura 5, mostrada a lo largo de las líneas 6-6 de la Figura 5;

la Figura 7 es una vista en sección transversal de la tira de ensayo de la Figura 5, mostrada a lo largo de las líneas 7-7 de la Figura 5;

la Figura 8 es una vista en alzado lateral de la tira de ensayo de la Figura 5;

la Figura 9 es una vista en alzado detallada de la porción superior de la tira de ensayo en la región adyacente al segundo vaso de reacción, que muestra las características por el lado de la tira de ensayo que es agarrado de forma segura por las patas resilientes del miembro de cubierta para enclavar el miembro de cubierta con la tira de ensayo;

la Figura 10 es una vista detallada en sección transversal de la tira de ensayo, parcialmente rota, que ilustra las características de fijación mostradas en la Figura 9;

la Figura 11 es una vista en sección transversal de la tira de ensayo de la Figura 5, tomada a lo largo de las líneas 11-11 de la Figura 5, mostrada parcialmente rota, que ilustra el pocillo de desecante y los pocillos de bolitas de enzima;

la Figura 12 es una vista en planta detallada del pocillo de desecante y de las estructuras adyacentes de la tira de ensayo de la Figura 5;

la Figura 13 es una vista en sección detallada del pocillo de desecante y de una porción de la segunda cámara de reacción de la tira de ensayo de la Figura 5;

la Figura 14 es una vista en perspectiva de un miembro de tapa mostrado en la Figura 3, que cierra la parte de fondo de la primera cámara de reacción y que proporciona una trayectoria de fluido para enlazar la primera cámara de reacción con el conducto de conexión dispuesto verticalmente que lleva hasta la segunda cámara de reacción;

la Figura 15 es una vista en planta del miembro de tapa de la Figura 14;

la Figura 16 es una vista en planta detallada de la parte superior de la tira de ensayo de la Figura 5, en la región del conducto de conexión que enlaza la primera cámara de reacción con la segunda cámara de reacción;

la Figura 17 es una vista en sección transversal de una porción de la tira de ensayo de las Figuras 5 y 16, es decir, a lo largo del eje longitudinal de la tira de ensayo en la región del conducto de conexión que enlaza la primera cámara de reacción con la segunda cámara de reacción, que muestra la colocación de una bola en el interior del conducto de conexión, que actúa a modo de válvula para cerrar el conducto de conexión;

la Figura 18 es una vista en sección transversal de una porción de la tira de ensayo de la Figura 5, tomada en una dirección ortogonal al eje longitudinal de la cápsula, a lo largo de las líneas 18-18 de las Figuras 16 y 17;

la Figura 19 es una vista en perspectiva de una tira de ensayo del tipo mostrado en la Figura 5, con un accesorio de horquilla utilizado para abrir el conducto de conexión, con una flecha que indica el movimiento relativo de la horquilla con respecto a la tira de ensayo y con líneas de puntos que indican la inserción de las puntas de la horquilla en la tira de ensayo para abrir la válvula de bola existente en el conducto de conexión;

la Figura 20 es una ilustración esquemática de una estación de vacío que incorpora un sistema de enfriamiento termoeléctrico (TEC)/control térmico de sumidero de calor para la tira de ensayo, y que posee un alojamiento que encaja con una estructura de soporte para formar una envolvente de vacío alrededor de las tiras de ensayo, estando cada tira de ensayo asociada a una horquilla para la apertura del conducto de conexión cuando el alojamiento de la cámara de vacío desciende y encaja con la estructura de soporte;

la Figura 21 es una vista en sección transversal de la tira de ensayo de la Figura 5, tomada en dirección transversal al eje longitudinal de la tira de ensayo en las proximidades del conducto de conexión, que muestra la acción de las horquillas de las Figuras 19 y 20 en la deformación del material del conducto de conexión para abrir con ello la válvula;

la Figura 22 es una vista en sección transversal de la tira de ensayo de la Figura 22, que muestra la deformación del conducto de conexión y el flujo de fluido a través del conducto de conexión, y

la Figura 23 es una vista en perspectiva de una realización alternativa de una tira de ensayo en la que las paredes de la tira de ensayo que forman la primera y la segunda cámaras de reacción tienen superficies exteriores configuradas para encajar con superficies calentadas en una estación de amplificación de ácido nucleico que procesa las tiras de ensayo para ayudar a mantener las dos cámaras a las temperaturas deseadas.

Descripción detallada de la realización preferida

Una forma preferida de la invención proporciona un vaso de reacción de doble cámara o "binario", materializado en una tira de ensayo u otra configuración. El término "binario" se refiere a la característica de almacenar de una forma espacialmente separada al menos dos reactivos diferentes, por ejemplo una muestra estable con el calor/reactivo(s) de amplificación que contiene(n), por ejemplo, iniciadores y nucleótidos en una cámara, y enzima(s) inestable(s) con el calor tales como T7 y RT en la segunda cámara. Los reactivos del interior de las dos cámaras no se ponen en contacto antes de que terminen las etapas de desnaturalización y de enfriamiento. La primera cámara es accesible a través de una tapa de cierre que se superpone a una membrana perforable o a otro medio, de modo que permite que se añada(n) muestra(s) analítica(s) o clínica(s) o de control en forma líquida, a la primera cámara. La segunda cámara está estanquizada y contiene los componentes enzimáticos de la reacción de amplificación. Los reactivos pueden estar según varias formas físicas, tal como en forma líquida, en forma de bolitas, liofilizados, etc., en cantidades de dosis unitarias. Una vez que el contenido de la primera cámara se pone en contacto con la segunda cámara, la reacción de amplificación puede tener lugar a continuación, tal como en la segunda cámara.

En una posible forma de la invención, las dos cámaras pueden ser parte de una unidad desechable. En otra realización posible, las dos cámaras pueden ser dos unidades distintas, que tienen superficies de encaje complementarias, o características que permiten que las dos unidades sean combinadas en una sola unidad. En la primera realización, en la que las dos cámaras son parte de un artículo unitario, la unidad debe estar hecha de modo que impida el intercambio de materiales entre las dos cámaras durante el transporte y con anterioridad a la etapa de desnaturalización (calentamiento). En ambas realizaciones, se requiere un mecanismo mediante el que el contenido de la primera cámara (una solución que contiene mezcla de muestra de paciente o de ensayo y reactivo(s) de amplificación tras la desnaturalización y endurecimiento del iniciador), se pone en contacto con la(s) enzima(s) de la segunda cámara. El mecanismo opera de modo que introduce el contenido de la primera cámara en la segunda cámara, a continuación de la terminación de la etapa de desnaturalización en la primera cámara de reacción a una temperatura de \geq 65ºC, y el enfriamiento de la muestra de paciente/mezcla de amplificación hasta la temperatura apropiada para la reacción de amplificación enzimática, por ejemplo, 42ºC. Varios mecanismos diferentes han sido descritos con detalle en la Patente U.S. núm. 5.786.182.

La Figura 1 es una vista en perspectiva de una tira de ensayo 10 que incorpora un vaso 12 de reacción de doble cámara para una reacción de amplificación de ácido nucleico, una pluralidad de pocillos 13, y un miembro 14 de tapa asociada, de acuerdo con una realización actualmente preferida de la invención. La tira 10 de ensayo de la Figura 1 está hecha con preferencia a partir de un material polimérico moldeado, tal como polipropileno.

Una(s) membrana(s) de hermetización se apli-
ca(n) a la superficie 15 superior de la tira de ensayo, para cubrir los pocillos y el vaso 12 de reacción de doble cámara, después de que los pocillos y el vaso 12 han sido pre-cargadas con la enzima apropiada, los reactivos, la solución de lavado o amortiguadora, la solución de descontaminación, etc. La membrana no se muestra en la Figura 1 con el fin de ilustrar mejor la estructura de la tira 10 de ensayo. El miembro 14 de tapa ha sido mostrado con anterioridad a la fijación a la tira de ensayo en las proximidades del vaso 12 de reacción de doble cámara.

La tira de ensayo de la Figura 1 puede ser utilizada para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, una reacción TMA, de acuerdo con una posible realización de la invención. La cámara A del vaso 12 de reacción de doble cámara contiene los reactivos de amplificación o mezcla, en particular nucleótidos, iniciadores, MgCl_{2}, y otros componentes salinos y amortiguadores. La cámara B está en comunicación de fluido con un pocillo 52 para bolitas de enzima, que contiene la(s) enzima(s) de amplificación que cataliza(n) la reacción de amplificación, por ejemplo T7 y/o RT. En una realización alternativa, la enzima de amplificación se sitúa directamente en la cámara B.

Tras la adición de los objetivos (o muestra de ensayo) a la cámara A, se aplica calor a la cámara A para desnaturalizar los objetivos de ácido nucleico de ADN y/o minimizar la estructura secundaria de ARN. La temperatura de la cámara A se enfría a continuación para permitir el endurecimiento del iniciador. A continuación, la solución de la cámara A se pone en contacto con una bolita de enzima en el pocillo 52 de bolita, y la solución se introduce en la cámara B. Las cámaras A y B, ahora en comunicación de fluido cada una con la otra, se mantienen entonces a la temperatura óptima para la reacción de amplificación, por ejemplo 42ºC. Separando espacialmente la cámara A de la cámara B, y aplicando el calor para desnaturalización a la cámara A solamente, las enzimas termo - inestables se protegen respecto a su inactivación durante la etapa de desnaturalización.

El calentamiento controlado del vaso 12 de reacción de doble cámara de la tira de ensayo que se ha descrito en lo que antecede, y la transferencia de solución desde la Cámara A hasta la Cámara B, se realizan con preferencia en una estación de amplificación o instrumento diseñado para procesar la tira 10 de ensayo. Una estación de amplificación preferida ha sido descrita en la Patente U.S. núm. 5.785.182.

Una vez que la reacción se ha completado, la tira 10 de ensayo es procesada a continuación en una máquina tal como el instrumento VIDAS^{TM} disponible comercialmente en bioMerieux, Inc.

A la tira 10 de ensayo de la Figura 1 se le da un factor de conformación particular (por ejemplo, una forma, una longitud, una anchura, una altura, unas características de extremos 18A y 18B, etc.), de modo que permita que la tira de ensayo sea compatible con una base de instrumento seleccionado o existente, que tenga un receptáculo de fase sólida u otros medios de transferencia de fluido y otro equipamiento para procesar los resultados de la reacción de amplificación de ácido nucleico en la propia tira de ensayo. De ese modo, la realización preferida de la tira 10 de ensayo tiene un tamaño y una forma adecuados para la base de instrumento VIDAS^{TM} de bioMerieux, Inc., cesionaria del inventor. Se apreciará que se podría lograr otro tamaño, forma, configuración y otras características físicas diferentes del dispositivo de ensayo que incorpora el vaso de reacción de doble cámara, para que se ajusten a otros instrumentos analíticos, y otros instrumentos que podrían conducir la reacción de amplificación de ácido nucleico en el vaso de reacción de doble cámara.

Las Figuras 2 y 3 son vistas en perspectiva adicionales de la tira 10 de ensayo y del miembro 14 de cubierta de la Figura 1. La Figura 4 es una vista en perspectiva aislada del miembro de cubierta. Con referencia a las Figuras 2-4, el miembro 14 de cubierta posee un par de patas 20 resilientes con una formación 21 de cuña que se acopla con rebordes correspondientes formados en el borde superior de la tira de ensayo, como se explicará posteriormente junto con las Figuras 7-10. Las patas 20 permiten que la porción 22 trasera de la cubierta 14 sean sujetadas de manera firme y segura con la tira 10 de ensayo, mientras que permiten que una segunda porción 24, o delantera, de la cubierta 14 sea levantada y bajada con relación a la porción 22 trasera. La cubierta 14, hecha con un material polimérico moldeado, incluye una porción 26 de bisagra integral que une las porciones 22 y 24 entre sí. La cubierta incluye también una abertura 28 central que tiene un filtro de malla porosa ubicado en la misma para permitir que entre el aire en, o que sea extraído desde, la cámara A (tras la retirada de la membrana de hermetización desde la parte superior de la cámara A), mientras que bloquea sustancialmente el escape de fluidos o de reactivos desde la cámara A o la entrada de materia extraña en la cámara A.

El propósito de la cubierta 14 consiste en controlar el acceso por parte del usuario, a la cámara A, y proporcionar una barrera protectora frente al ambiente durante la realización de la reacción de amplificación de ácido nucleico. Durante la fabricación de la tira de ensayo, los reactivos se cargan en las cámaras A y B (y en los pocillos 13), y a continuación se aplica una membrana de hermetización a la superficie 15 de la tira 10 de ensayo, que cubre todos los pocillos 13 y las cámaras A y B. En una realización posible, la membrana se dota de una línea de perforación o desgarro adyacente a la cámara A. A continuación, se instala el miembro 14 de cubierta sobre la tira 10 de ensayo. Cuando el técnico está preparado para usar la tira 10 de ensayo, el usuario levanta la porción 24 delantera de la cubierta hasta la posición mostrada en la Figura 2. El borde 30 posee una formación de rebaje curvo para el dedo del usuario, para ayudar a levantar la porción 24. A continuación, el técnico agarra el borde 32 libre de la membrana (que se ha mostrado rota en la Figura 2 para ilustrar la estructura de la tira de ensayo), y tira hacia fuera de la membrana de tal modo que la membrana se separa en la perforación, indicada con 34. Esta acción deja al descubierto la cámara A del vaso 12 de reacción de doble cámara. A continuación, el técnico introduce la muestra de fluido en la cámara A y cierra el miembro 14 de cubierta. El miembro 14 de cubierta tiene pares adicionales de patas 36 y 38 resilientes de agarre que se acoplan sobre formaciones de pestaña realizadas en los bordes opuestos de la tira de ensayo, lo que da como resultado el enganche seguro de la cubierta 14 con la tira 10 de ensayo.

Haciendo referencia a las Figuras 4A y 4B, óptimamente, y en la realización preferida, la película o membrana se mantiene en su lugar sobre la cámara A y no existe línea de desgarro como se acaba de describir. El miembro de cubierta incluye un botón 41 accionado manualmente que posee una horquilla saliente o superficie 41B por el lado inferior del mismo, de tal modo que cuando el usuario cierra el miembro 14 de cubierta, el usuario puede accionar y depresionar el botón 41, y provocar con ello que la horquilla 41B sobresaliente perfore la membrana que cubre la parte superior de la tira de ensayo por encima de la Cámara A, con el fin de proporcionar una pequeña abertura para la introducción de la muestra de ensayo. En esta realización, la membrana laminada no es retirada por el técnico sino que, por el contrario, se mantiene en su lugar. La acción del botón/horquilla sobresaliente, constituye el mecanismo mediante el que se accede a la cámara A en el momento de uso. Esta realización reduce la probabilidad de que algún fluido o las soluciones de reacción puedan contaminar accidentalmente, o migrar hacia fuera de la cámara B y hacia, el ambiente. Según se aprecia en la Figura 4A, el botón 14 está conectado al resto de la cubierta por medio de patas 41A resilientes que permiten que el botón 41 y la horquilla 41B sobresaliente se muevan en relación al miembro de cubierta, y perforen con ello la membrana. Una vez que se ha movido hasta la posición más baja, la pared 41D lateral del botón se acopla ajustadamente con la porción 41E correspondiente de pared circular del miembro 14 de cubierta, mostrado mejor en la Figura 4B. Estas Figuras muestran también la abertura 28 central que recibe un filtro de malla porosa.

Otra realización alternativa para el miembro 14 de cubierta, ha sido mostrada en las Figuras 4C y 4D. El botón 41 es móvil desde una posición superior, mostrada en la Figura 4C, en la que la superficie 41B de corte sobresaliente está por encima de la membrana (no representada) que cubre la cámara A, hasta una posición inferior, mostrada en la Figura 4D, en la que la superficie 41 de corte sobresaliente realiza el corte a través de la membrana. El usuario eleva entonces el extremo 30 del miembro de cubierta, e inserta la muestra de ensayo en el pequeño orificio formado en la membrana mediante la formación 41B de corte. Una formación 41F de pestaña resiliente de acoplamiento en la porción inferior del botón 41, encaja con una repisa sobresaliente de la parte superior de la cámara A, según se muestra en la Figura 4D, proporcionando con ello la sensación positiva de encaje del botón con la membrana. El usuario puede levantar fácilmente el extremo del miembro 14 de cubierta para introducir la muestra en la cámara A.

Haciendo referencia en particular a las Figuras 2 y 4, el miembro 14 de cubierta posee una región 40 hueca que proporciona acceso para una horquilla que se mueve alternativamente en relación a la tira de ensayo en una estación de procesamiento de la tira de ensayo. La horquilla, discutida posteriormente junto con las Figuras 19-22, actúa para abrir una válvula de bola dispuesta en un conducto de conexión previsto en la tira de ensayo, que une las cámaras A y B del vaso 12 de reacción de doble cámara.

La Figura 5 es una vista en planta superior de la tira de ensayo de las Figuras 1-3, con el miembro de cubierta retirado con el fin de ilustrar mejor las características de la tira de ensayo en sí misma. Con referencia al lado derecho de la Figura 5, un miembro de hermetización, tal como una película 42 de aluminio, se aplica a la superficie superior de la tira 10 de ensayo. La membrana 42, mostrada parcialmente rota, se extiende desde la posición mostrada en el lado derecho de la Figura 5 hasta el izquierdo, a través de la superficie superior completa de la tira de ensayo. La membrana termina en un extremo 32 libre adyacente a la cámara A del vaso 12 de reacción de doble cámara, en las proximidades del extremo 18A. La membrana 42 cubre así completamente, y hermetiza, los pocillos 13 de la tira de ensayo. El extremo 18B a la derecha de la tira de ensayo, incluye una abertura 44 para recibir una probeta óptica a los efectos de análisis óptico de detección de productos de reacción utilizados en el procedimiento analítico para la tira de ensayo de manera conocida. Los productos de reacción resultan de la(s) reacción(es) de hibridación que utilizan un soporte sólido para capturar, mediante sonda de captura, el producto de reacción, es decir, el complejo de hibridación de amplicón y la sonda detectora. Tipos adicionales de sondas de la competencia, pueden ser utilizadas también, aunque no detectadas en la(s) reacción(es) de hibridación.

Haciendo ahora referencia al lado izquierdo de la Figura 5, la tira 10 de ensayo incluye la cámara A del vaso de reacción de doble cámara, un conducto 50 de conexión dispuesto verticalmente que conduce desde la base de la tira 10 de ensayo hasta la región superior de la misma, y un pocillo 52 de bolita de enzima que contiene la(s) enzima(s) de amplificación. Una válvula, descrita posteriormente junto con las Figuras 19-22, se encuentra situada en el conducto 52 de conexión, y es abierta selectivamente para permitir que una solución pase desde la cámara A, a través del conducto 50 de conexión, y hacia el pocillo 52 de bolita de enzima. El paso de la solución a través del pocillo de bolita de enzima disuelve la bolita de enzima. La solución entra en la cámara B y tiene lugar la amplificación en la cámara B.

La tira 10 de ensayo incluye además un par de pocillos 54 y 56 de desecante que están dispuestos en comunicación aérea o de fluido con la cámara B. El pocillo 54 de desecante ha sido mostrado también en la Figura 6, la cual es una vista en sección transversal de la tira de ensayo, tomada a lo largo de las líneas 6-6 de la Figura 5. Los pocillos 54 y 56 de desecante están diseñados de modo que mantienen una sola, o una pluralidad de bolitas de desecante apiladas unas encima de otras, en los pocillos. Durante el ensamblaje de la tira de ensayo, la inspección a máquina de los pocillos de desecante podrá confirmar la calidad de las bolitas de desecante presentes en los pocillos 54 y 56. El objeto de las bolitas de desecante consiste en ampliar la vida propia de la enzima de amplificación cargada en la tira de ensayo, en particular cuando la enzima de amplificación está en forma de bolita y es susceptible de degradación en presencia de un entorno húmedo. El desecante es particularmente importante en cuanto a la tolerancia de las bolitas de enzima o de reactivo a la humedad para la proporción extremadamente crítica de concentraciones de enzima y de reactivo previstas en un material permeable al gas, por ejemplo, una tira de ensayo. En el caso de que los nucleótidos, el MgCl_{2}, los iniciadores y otros reactivos cargados en la cámara A, estén en forma líquida, entonces los pocillos 54 y 56 de desecante no necesitan estar dispuestos en comunicación directa aérea o de fluido con la cámara A. Sin embargo, en el caso de que los reactivos presentes en la cámara A estén también en forma de bolita o de otra forma susceptible de degradación en un ambiente húmedo, entonces los pocillos de desecante estarán diseñados y construidos de manera que comuniquen con la cámara A además de con la cámara B, o, alternativamente, se puede proporcionar un segundo conjunto de pocillos de desecante adyacentes a la cámara A, para dar servicios a los reactivos de la cámara A.

Haciendo referencia en particular a las Figuras 6 y 13, la porción lateral extrema del pocillo 54 de desecante incluye un paso indicado mediante la flecha 58 en la Figura 13, que indica la comunicación aérea con la cámara B (y finalmente, la comunicación aérea con la bolita de enzima situada en el pocillo 52 de bolita de enzima). El paso 58 ha sido proporcionado por encima de una pared 60 que separa la porción lateral del pocillo 54 de desecante de la cámara B. Los dos pocillos de desecante pueden albergar diferentes composiciones de desecante que tengan diferentes características de absorción. Tres bolas 62 de desecante colocadas en el pocillo 54 de desencante, han sido indicadas con líneas discontinuas en la Figura 13. Alternativamente, el desecante podría estar en forma de un único cuerpo de desecante unificado. Alternativamente, las bolas de desecante podrían estar situadas directamente en la cámara B sin ningún efecto adverso sobre la reacción de amplificación, o moldeadas en el material que forma el vaso 12 de reacción de doble cámara.

Con referencia a las Figuras 5 y 6, la superficie 15 superior de la tira 10 de ensayo incluye una abertura 70 diseñada para albergar las horquillas de las Figuras 19-21 durante el proceso de apertura del conducto 50 de conexión. El miembro 14 de cubierta de las Figuras 3 y 4 está instalado por encima de la tira 10 de ensayo de tal modo que la abertura 40 del miembro de cubierta está directamente sobre la abertura 70 de la tira de ensayo. La Figura 5 muestra también las formaciones 72 de patas que permiten que las patas 20 resilientes del miembro 14 de cubierta se fijen a la tira de ensayo cuando el miembro de cubierta es instalado sobre la tira de ensayo. Estas formaciones han sido también mostradas en las Figuras 8-12. Con referencia a las Figuras 9 y 10, la tira de ensayo tiene una porción 74 inclinada sobre la que se desliza la formación 21 de cuña (Figura 4) del miembro de cubierta hasta que la formación 21 de cuña se acopla bajo la pata 76 y presiona contra la porción 78 de pared. La naturaleza resiliente de las patas 20 del miembro de cubierta y la acción de la cuña 21 contra la repisa 76, impide que el miembro 14 de cubierta llegue a desengancharse de la tira de ensayo durante la operación de elevación y descenso de la porción 24 delantera del miembro de cubierta. La superficie 80 inclinada de la Figura 9 ayuda a la instalación del miembro de cubierta y al alineamiento de las patas 20 con relación a la formación 72 de reborde.

Con referencia a las Figuras 6 y 8, la tira de ensayo tiene un par de pestañas 84 que se extienden transversalmente, moldeadas en la parte inferior de la tira de ensayo, que permiten que la tira de ensayo sea colocada en una posición nivelada, estable, encima de una mesa.

Las Figuras 2 y 8 ilustran una tapa 86 de base que se ha fabricado por separado y que se ha soldado ultrasónicamente a la base de la tira 10 de ensayo. La tapa 86 cubre la porción extrema más inferior de la cámara A, y proporciona un paso de fluido para que la solución pase desde la cámara A hasta la base del conducto 50 de conexión dispuesto verticalmente, y proporciona un contacto cercano con un sistema de control térmico de sumidero de calor/TEC. La tapa 86 ha sido mostrada con mayor detalle en las Figuras 14 y 15. Con referencia a las Figuras 8 y 14-15, la tapa 86 incluye una porción 88 semicircular que está unida a la base de la cámara A. Un par de elementos 90 de reborde opuestos, se encuentran unidos a una porción 87 de tabique (Figura 8) que conecta la cámara A con el conducto 52 de conexión. La tapa incluye otra porción 92 semicircular que está unida a una superficie semicircular correspondiente formada en la base del conducto 50 de conexión. De ese modo, la tapa forma un paso 94 que permite que pase el fluido desde la base de la cámara A hasta la base del conducto 50 de conexión, según se indica mediante las flechas de la Figura 14.

La Figura 11 es una vista detallada en sección transversal de la tira de ensayo de la Figura 5, tomada a lo largo de las líneas 11 de la Figura 5, mostrada parcialmente rota, que ilustra el pocillo 56 de desecante y el pocillo 52 de bolita de enzima. La Figura 16 es una vista en planta detallada de la tira 10 de ensayo, que muestra las estructuras del vaso 12 de reacción de doble cámara. Con referencia a estas Figuras, junto con las Figuras 17-22, la operación de la válvula del conducto 50 de conexión y el flujo de solución desde el vaso A de reacción hasta el vaso B de reacción, van a ser descritos ahora con detalle.

Después de que haya tenido lugar la desnaturalización y el endurecimiento del iniciador de la muestra de fluido presente en el vaso de reacción A a la primera temperatura de reacción, una válvula de bola, indicada en general mediante el número 102 de referencia en las Figuras 17 y 18, se abre. La válvula de bola consiste en una bola 104 metálica que se encuentra dispuesta en el conducto 50 de conexión en una zona 106 intermedia de forma cilíndrica. La bola 104 está dimensionada de tal modo que su diámetro es ligeramente mayor que el diámetro de la zona 106 intermedia, de modo que forma una obstrucción completa del conducto de conexión. Las paredes 108 del conducto 50 de conexión están hechas de un material deformable (y el polipropileno es suficientemente deformable para los propósitos actuales). Esta deformabilidad de las paredes 108 es tal que cuando las paredes 108 son apretadas sobre los lados opuestos de la bola 104, la pared 108 se deforma en dirección perpendicular a la fuerza de compresión, por los lados opuestos de la bola, para crear con ello un paso para el fluido alrededor de la bola.

Para crear la acción de apriete sobre las paredes 108 y la bola 104, una horquilla 110 que tiene dos punta 112, se hace descender a través de la abertura 40 de la tapa (según se muestra mejor en la Figura 19), a través de la abertura 70 de la parte superior de la tira de ensayo (mostrada mejor en la Figura 16). Las puntas 112 de la horquilla llegan a un contacto presionador con las paredes 108 del conducto 50 de conexión, directamente sobre los lados opuestos de la bola 104, como se muestra mejor en la Figura 21. Esta acción presionadora deforma las paredes 108, como se muestra en la Figura 22, para formar pasos 116 por los lados opuestos de la bola 104.

De manera simultánea con la apertura de la válvula de bola según se acaba de describir, se provoca un vacío sobre la tira de ensayo, y en particular sobre la primera cámara A de reacción. Esto se consigue colocando la tira de ensayo en una estación de procesamiento de reacción que incluye una envolvente de vacío alrededor de la tira de ensayo, y evacuando el aire de la envolvente de vacío. Al provocar el vacío se rebaja la presión tanto en la primera como en la segunda cámaras A y B, puesto que ahora están en comunicación aérea y de fluido cada una con la otra. Cuando se deja de ejercer el vacío, existe un gradiente de presión entre la cámara A y la cámara B, estando la cámara A a una presión más alta. El gradiente de presión fuerza a la solución de fluido de la cámara A a través del paso 94 de la tapa 86 (véanse las Figuras 14 y 15), hacia arriba y alrededor de los pasos 116 del conducto 50 de conexión, como se indica mediante las flechas de la Figura 22, y hasta la parte superior del conducto 50 de conexión.

Una vez que la solución de fluido ha alcanzado la parte superior del conducto 50 de conexión, el fluido entra en un canal 100 (véanse las Figuras 16 y 17) que conduce hasta el pocillo 52 de bolita de enzima. El fluido disuelve la bolita 130 de enzima (Figura 17) presente en el pocillo 52, y lleva la enzima de amplificación hacia la cámara B. La amplificación del ácido nucleico de la muestra ocurre en la cámara B a la temperatura especificada, por ejemplo a 42ºC.

Haciendo ahora referencia a las Figuras 19 y 20, la acción recíproca de la horquilla 110 que abre la válvula de bola ha sido mostrada esquemáticamente. En la Figura 19, se ha mostrado la tira 10 de ensayo con la membrana 42 de hermetización aplicada a la superficie superior de la tira de ensayo de la manera que se ha descrito anteriormente, como puede ser el caso cuando se fabrica el dispositivo y se encuentra listo para su uso. La membrana 42 lleva un código de barras que identifica el tipo de tira de ensayo que se está utilizando, u otra información pertinente.

En la Figura 20, se han mostrado las horquillas 20 junto con una estación de procesamiento de amplificación del tipo descrito en la Patente U.S. núm. 5.786.182. La estación se ha mostrado mediante una vista extrema, parcialmente en sección, con dos tiras 10 de ensayo instaladas en la estación. Las horquillas han sido mostradas integrales con un miembro 132 transversal que a su vez está empernado con la parte superior de un alojamiento 134 de cubierta de vacío presente en la estación de procesamiento de amplificación. Las tiras 10 de ensayo están instaladas en el conjunto 136 de TEC/sumidero de calor que mantiene las dos cámaras del vaso de reacción de doble cámara en las tiras 10 de ensayo a la temperatura apropiada, como se describe con detalle en la Patente U.S. núm. 5.786.182. El alojamiento 134 de cubierta de vacío está sujeto a un mecanismo actuador mecánico que sube y baja el alojamiento de cubierta de vacío con relación a un miembro 238 de soporte horizontal. El alojamiento 134 de cubierta y el miembro 138 de soporte definen una envolvente de vacío o cámara 140. El alojamiento 134 de cubierta de vacío incluye además puertos (no representados) para sacar aire desde la envolvente 140 de vacío, e introducir aire de nuevo en la envolvente 140 de vacío. Cuando se baja el alojamiento 134 de cubierta de vacío sobre el miembro 138 de soporte, forma un sello hermético al aire con el miembro 138 de soporte (con la utilización de una estructura de junta adecuada en la zona 139), que permite que se practique vacío en la envolvente. La provisión de vacío en la envolvente 140 provoca que el aire sea arrastrado desde el vaso de reacción de doble cámara, a través de la abertura 28 del miembro 14 de cubierta, y de un filtro 142 permeable al aire situado en la misma (véase la Figura 19). A continuación, cuando se ha dejado de ejercer el vacío en la envolvente 140, con el alojamiento 134 permaneciendo en la posición inferior durante la liberación del vacío, el diferencial de presión entre las cámaras A y B provoca que la solución de fluido presente en la cámara A, migre a través del conducto de conexión, abierto por la acción de las horquillas 110, y hacia la cámara de bolita de enzima y la cámara B, de la manera que se ha descrito previamente.

Otros detalles sobre una estación de amplificación actualmente preferida que incorpora las formaciones de vacío y otras formaciones de la Figura 20, se encuentran descritos en la solicitud de Bryan Kluttz et al, depositada simultáneamente, citada previamente.

Mientras que la realización de válvula de bola citada anteriormente es una realización actualmente preferida, se podrá apreciar que otros numerosos mecanismos equivalentes y alternativos pueden ser incorporados en un dispositivo de ensayo a los efectos de permitir que el fluido migre o sea transferido desde la cámara A hasta la cámara B. Varios mecanismos diferentes se encuentran descritos en la Patente U.S. núm. 5.786.182. Incluso pueden existir otros mecanismos de válvula diferentes o pueden ser desarrollados por personas expertas en la materia. Los detalles particulares del mecanismo de válvula no son considerados particularmente importantes para la presente invención. Obviamente, si se utiliza un mecanismo de válvula diferente, entonces la estación de procesamiento de reacción de amplificación que procesa la tira de ensayo puede tener un tipo diferente de mecanismo de apertura de válvula además de las horquillas de la Figura 20. En consecuencia, los detalles de la estación que procesa el dispositivo de ensayo pueden tener características operativas diferentes para trabajar con mecanismos de válvula o de conducto de conexión particulares, que estén incorporados en el vaso de reacción de doble cámara.

La Figura 23 es una vista en perspectiva de una realización alternativa de la tira de ensayo, en la que la cámara A del vaso de reacción de doble cámara tiene una disposición de superficie exterior diseñada para estar en proximidad cercana, o en contacto, con un conjunto de sumidero de calor/TEC en una estación de procesamiento de reacción de amplificación con el fin de fomentar una rápida transferencia de calor entre la cámara A y el conjunto de sumidero de calor/TEC. En particular, la estructura de pared que forma la cámara A tiene lados 200 opuestos que proporcionan un área superficial extensa para contactar y transferir calor desde una superficie calentada en una estación de amplificación hacia el interior de la cámara A. De manera similar, la estructura 202 de pared que forma la cámara B tiene superficies 202 planares extensas en los lados opuestos de la misma, para transferir calor hacia el interior de la cámara B. Obsérvese que la Figura 23 muestra la tira de ensayo desde abajo, con anterioridad a la fijación de la tapa 86 de base (véanse las Figuras 8, 14 y 15) a las formaciones que conectan la cámara A con el conducto 50 de conexión dispuesto verticalmente.

Claims (9)

1. Un dispositivo (10) de ensayo o de realización de reacción de amplificación de ácido nucleico, que comprende:

un alojamiento que posee un primer extremo y un segundo extremo, teniendo el citado alojamiento una porción del mismo que define una pluralidad de pocillos (13) entre dichos primer y segundo extremos;

comprendiendo además el citado alojamiento un vaso (12) de reacción de doble cámara para llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico en el mismo, comprendiendo el citado vaso de reacción de doble cámara una primera cámara (A) en la que se lleva a cabo una primera parte de una reacción de amplificación de ácido nucleico, una segunda cámara (B) en la que se lleva a cabo una segunda parte de una reacción de amplificación de ácido nucleico, y un conducto de conexión operable que une la citada primera cámara con la citada segunda cámara;

una membrana fijada a dicho alojamiento, estando la citada membrana aplicada a dicho alojamiento para cubrir las citadas primera y segunda cámaras y los citados pocillos tras la inserción de los reactivos en el citado dispositivo de ensayo, y

un miembro (14) de cubierta asegurado a dicho alojamiento y que se superpone a la citada membrana y a la citada primera cámara, siendo el citado miembro de cubierta móvil en relación con la citada primera cámara para permitir con ello que un usuario acceda a la citada membrana e introduzca una muestra en la citada primera cámara,

que se caracteriza porque el citado miembro de cubierta comprende un botón (41) accionado manualmente, que posee una superficie cortante, siendo el citado botón accionable para perforar la citada membrana.

2. Un dispositivo de ensayo según se reivindica en la reivindicación 1, en el que la citada membrana comprende una primera porción que cubre la citada primera cámara, y una segunda porción que cubre la citada segunda cámara, y una tercera porción que separa las citadas primera y segunda porciones, siendo el citado miembro de cubierta móvil en relación con la citada primera cámara para permitir que un usuario desgarre o perfore la citada tercera porción y retire con ello la citada primera porción de dicha membrana desde dicho dispositivo de ensayo.

3. Un dispositivo de ensayo según se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicho miembro de cubierta comprende además:

una primera porción, una bisagra y una segunda porción, cubriendo la citada primera porción a dicha primera cámara en una primera posición, siendo la citada primera porción móvil con relación a la citada primera cámara por medio de la citada bisagra hasta una posición elevada que permite a un usuario acceder a dicha primera cámara, encajando la citada segunda porción con el citado dispositivo de ensayo.

4. Un dispositivo de ensayo según se reivindica en la reivindicación 3, en el que la citada primera porción de dicho miembro de cubierta comprende además una abertura en dicha primera porción situada en relación de enfrentamiento con la citada primera cámara cuando dicha primera porción está en la citada primera posición, y encontrándose un filtro de malla absorbente situado en el interior de la citada abertura.

5. Un dispositivo de ensayo según se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicho miembro de cubierta comprende además una abertura que recibe en la misma un filtro poroso, siendo la citada cubierta susceptible de montaje en el citado alojamiento de tal modo que dicho filtro poroso está en relación de enfrentamiento con la citada primera cámara de dicho vaso de reacción de doble cámara.

6. Un dispositivo de ensayo según se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicho miembro de cubierta comprende además medios de acoplamiento resiliente para encajar liberablemente el citado miembro de cubierta con dicho alojamiento.

7. Un procedimiento de construcción de un aparato de ensayo de reacción de amplificación de ácido nucleico de dosis unitaria, que comprende:

formar un dispositivo (10) de ensayo que tiente (1) un vaso (12) de reacción desechable de doble cámara, que comprende una primera cámara (A), una segunda cámara (B), y un conducto de conexión que une la citada primera cámara con la citada segunda cámara, y (2) al menos un pocillo (13) de procesamiento intermedio;

añadir un primer reactivo a dicha primera cámara;

añadir un segundo reactivo a dicho dispositivo de ensayo, ya sea a la citada segunda cámara o ya sea a una cámara intermedia en comunicación de fluido con dicha segunda cámara;

fijar una membrana de hermetización a dicho dispositivo de ensayo de manera que cubra las citadas primera y segunda cámaras, y

fijar un miembro (14) de cubierta a dicho dispositivo de ensayo, siendo dicho miembro de cubierta móvil con relación a la citada primera cámara para permitir con ello el acceso a la película de sellado,

que se caracteriza porque dicho miembro de cubierta comprende un botón (41) accionado manualmente, que posee una superficie cortante, siendo el citado botón accionable para perforar la citada membrana.

8. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 7, que comprende además fijar una tapa de base a dicho dispositivo de ensayo, formando la citada tapa un canal entre dicha primera cámara y el citado conducto de conexión.

9. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 8, que comprende además añadir un desecante a dicho dispositivo de ensayo, en comunicación ya sea con el citado primer reactivo o ya sea con el citado segundo reactivo, o con ambos primer y segundo reactivos citados.