DE60031100T2

DE60031100T2 - Hapten modifizierte tumorzellen und verfahren zur herstellung und deren verwendung

Info

Publication number: DE60031100T2
Application number: DE60031100T
Authority: DE
Inventors: David Wyncote BERD
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1999-03-16
Filing date: 2000-03-15
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2020-03-16
Also published as: EP1723963A2; EP1162996B1; DE60031100D1; EP1723963A3; AR022937A1; AU4010600A; EP1162996A2; ATE341338T1; AU757980B2; WO2000057911A2; CA2367922A1; WO2000057911A3; ES2273680T3; US6403104B1

Description

DAS GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Säugetierzellen, die an ein Hapten gebunden sind, sowie Verfahren zur deren Herstellung und Verwendung. Die Bindung eines Haptens an Säugetierzellen ist eine alternative Vorgehensweise, um Zellen an der Proliferation zu hindern und kann anstelle einer konventionellen Bestrahlungsbehandlung eingesetzt werden. Zusammensetzungen, die haptenmodifizierte Tumorzellen und Tumorzellextrakte aufweisen und Verfahren zur Behandlung von Krebs durch Gabe einer therapeutisch wirksamen Dosis von haptenmodifizierten Tumorzellen oder Tumorzellextrakten an Personen, die eine solche Behandlung benötigen, sind ebenfalls Aufgabe der Erfindung. Die Erfindung sieht ebenso einen wirksamen Impfplan vor, der bei Patienten, die an Krebs leiden, eine Antitumorantwort hervorruft.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verhinderung des Wachstums von Säugetierzellen
Bei verschiedenen in vitro und in vivo Verfahren mit Säugetierzellen ist es notwendig, die Säugetierzellen am Wachstum und an der Teilung zu hemmen, das heißt an der Proliferation. Auf herkömmliche Weise wird für diesen Zweck eine Bestrahlung der Säugetierzellen eingesetzt. Zum Beispiel werden Säugetiertumorzellen vor einer Gabe als Impfstoff an Melanompatienten bestrahlt (Berd et al., Cancer Res., 1986; 46: 2572-77). In ähnlicher Weise beschreibt McCune et al. (Cancer, 1981; 47:1984-87) die Bestrahlung von Nierenkarzinomzellen für Therapiezwecke. Im Stand der Technik besteht jedoch ein Bedarf für Vorgehensweisen, um die Zellproliferation ohne Bestrahlung der Zellen zu verhindern.
Hapten-gebundene Tumorzell-Impfstoffe
Es wurde gezeigt, dass ein autologer Impfstoff aus ganzen Zellen, welcher mit dem Hapten Dinitrophenol (DNP) modifiziert ist, Entzündungsreaktionen in metastasenbildenden Körperregionen von Melanompatienten auslöst. Die postoperative adjuvante Therapie mit DNP-modifizierten Impfstoffen ergab im Vergleich mit einer alleinigen Operation merklich höhere Überlebensraten. Für den Impfstoff werden unversehrte oder lebensfähige Zellen bevorzugt.
Das US-Patent Nr. 5,290,551 von David Berd offenbart und beansprucht Impfstoff-Zusammensetzungen, die haptenisierte Melanomzellen aufweisen. Melanompatienten, die mit diesen Zellen behandelt wurden, entwickelten eine starke Immunantwort. Die Antwort konnte als DTH-Antwort (Delayed-Type Hypersensitivity) auf haptenisierte und nicht haptenisierte Tumorzellen nachgewiesen werden. Wichtiger ist, dass die Immunantwort erhöhte Überlebensraten der Melanompatienten bewirkte.
Haptenisierte Tumorzell-Impfstoffe wurden auch für andere Krebsarten beschrieben, einschließlich Lungenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Pankreaskrebs, Eierstockkrebs und Leukämie (siehe US-Patentanmeldung Nr. 08/203,004, eingereicht am 28. Februar, 1994; Internationale Patentanmeldung Nr. PCT/US96/09511; US-Patentanmeldung Nr. 08/899,905, eingereicht am 24. Juli 1997).
Obwohl die oben genannten Untersuchungen erfolgreiche immuntherapeutische Verfahren mit haptengebundenen Tumorzellen beschreiben, verbleibt für die Krebsbehandlung ein Bedarf an zusätzlichen und verbesserten Verfahren, um eine Antitumorantwort hervorzurufen und ein Bedarf an verbesserten haptenmodifizierten Tumorzellen. Überraschenderweise hat der Anmelder nunmehr ein vereinfachtes Verfahren zur Herstellung haptenmodifizierter Tumorzellen entwickelt, welches die Notwendigkeit einer Strahlenbehandlung vermeidet und dabei verfahrensmäßige und finanzielle Vorteile für die Herstellung haptenmodifizierter Tumorzell-Impfstoffe bietet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen von Säugetierzellen in einem im wesentlichen nichtproliferativen Zustand, die haptenmodifizierte Tumorzellen zum Hervorrufen einer Antitumorantwort bei einem Patienten enthalten, der unter Krebs leidet, wobei durch die Hapten-Bindung die Tumorzellen nicht fähig sind, im Körper des Patienten zu wachsen und wobei die genannten Tumorzellen nicht gesondert behandelt wurden, um sie im Körper des Patienten am Wachsen zu hindern.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, um eine Säugetierzellen in vitro in einen im Wesentlichen nicht proliferativen Zustand zu versetzen, wobei die Zelle nicht bestrahlt wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die eine haptenmodifizierte Säugetier-Tumorzelle in einem im Wesentlichen nicht proliferativen Zustand umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung einen Impfstoff vor, der eine therapeutisch wirksame Menge einer haptenmodifizierten Säugetier-, vorzugsweise menschlichen, Tumorzelle umfasst, die sich in einem im Wesentlichen nicht proliferativen Zustand befindet.
Die vorliegende Anmeldung offenbart ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, das die Verabreichung einer Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Dosis einer haptenmodifizierten menschlichen Tumorzelle an ein Säugetier, vorzugsweise einen Menschen, umfasst, welche keiner Bestrahlung ausgesetzt wurde und wobei das genannte Säugetier an einem bösartigen Tumor desselben Typs leidet, wie die genannte Tumorzellmembran.
Die vorliegende Anmeldung offenbart weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, bei dem wöchentliche Impfungen mit den hier beschriebenen, nicht proliferativen haptenmodifizierten Tumorzell-Zusammensetzungen durchgeführt werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Säugetierzellen, die an ein Hapten gebunden sind, sowie Verfahren zur deren Herstellung und Verwendung. Die Bindung eines Haptens an Säugetierzellen ist eine alternative Vorgehensweise, um Zellen am Wachstum zu hindern, das heißt an einer Vervielfachung und kann anstelle einer konventionellen Bestrahlungsbehandlung eingesetzt werden. Dementsprechend betrifft die Erfindung im Allgemeinen Säugetierzellen, zum Beispiel menschliche Zellen, die sich im Wesentlichen in einem nicht proliferativen Zustand befinden und ein Verfahren, um diese Zellen in diesem Zustand an ein Hapten zu binden. Außerdem können die in den folgenden PCT-Anmeldungen beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren mit Vorteil entsprechend der vorliegenden Erfindung abgeändert werden:
PCT/US96/09511 (WO 96/40173), PCT/US97/1574 1 (WO 98/14206), PCT/US98/20888, PCT/US98/16660, PCT/US99/27442, PCT/US99/07725 (WO99/52546) und PCT/US99/31297.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine Krebs-Immuntherapie. Die Anmeldung umfasst eine Tumorzusammensetzung und Verfahren zur Behandlung von Krebs. Die Anmeldung betrifft weiterhin ein Verfahren, um eine Antitumorantwort aufgrund wöchentlicher Impfungen mit nicht proliferativen haptengebundenen Tumorzell-Zusammensetzungen hervorzurufen, welche durch das vereinfachte erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Antitumorantwort durch mindestens eine der folgenden Erscheinungen gekennzeichnet: Tumornekrose, Tumorrückbildung, Tumorentzündung, Tumorinfiltration durch aktivierte T-Lymphozyten, DTH-Antwort und Verlängerung der Lebensdauer des Patienten. Die erfindungsgemäßen Tumorzellen und Extrakte und die Zusammensetzungen davon können T-Lymphozyten herauslocken, die die Eigenschaft haben, den Säugetiertumor zu infiltrieren, eine entzündliche Immunantwort gegen den Säugetiertumor hervorzurufen, eine DTH-Antwort gegen den Säugetiertumor zu erzeugen und/oder T-Lymphozyten in vitro zu stimulieren.
Eine sich aus der erfindungsgemäßen Behandlung ergebende Antitumorantwort kann eine teilweise oder vollständige Rückbildung des metastasierenden Tumors oder eine stabile Erkrankung zur Folge haben. Eine „vollständige" Rückbildung bezeichnet eine etwa 100%ige Regression innerhalb eines Zeitraums von mindestens einem Monat, vorzugsweise innerhalb eines Zeitraums von mindestens drei Monaten. Eine „teilweise" Rückbildung bezeichnet eine etwa über 50%ige Regression innerhalb eines Zeitraums von mindestens einem Monat, vorzugsweise innerhalb eines Zeitraums von mindestens drei Monaten. Eine „stabile" Erkrankung bezeichnet einen Zustand, bei dem es nach der Impfbehandlung kein signifikantes Tumorwachstum mehr gibt. Eine andere beobachtbare Antitumorantwort nach der erfindungsgemäßen Behandlung ist eine Verlängerung der Überlebenszeit.
Durch die vorliegende Erfindung kann jeder bösartige Tumor behandelt werden, einschließlich metastasierender und primärer Krebserkrankungen und fester und nichtfester Tumore. Feste Tumore umfassen Karzinome und nichtfeste Tumore umfassen bösartige Bluterkrankungen. Karzinome umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, Adenokarzinome und epitheliale Karzinome. Bösartige Bluterkrankungen umfassen Leukämie, Lymphome und multiple Lymphome. Die nachfolgenden, nicht beschränkend aufgeführten Krebsarten, sind mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung durch isolierte, modifizierte Tumorzellmembranen behandelbar: Eierstockkrebs, einschließlich fortgeschrittenem Eierstockkrebs, Leukämie, einschließlich und nicht darauf beschränkt, akute myelogene Leukämie, Darmkrebs, einschließlich Darmkrebs, der zu Leber-, Rektum-, Kolorektum-, Melanom-, Brust-, Lungen-, Nieren- und Prostatakrebs metastasiert ist. Der Eierstockkrebs kann ein Adenokarzinom oder ein epitheliales Karzinom sein. Leukämien können vom Knochenmark oder Lymphknoten stammen. Die Leukämie kann akut sein, was durch eine Reifehemmung in einem frühen Stadium der Entwicklung gekennzeichnet ist, und chronisch, was durch übermäßige Zunahme von lymphoiden oder myeloiden Zellen gekennzeichnet ist. Krebs der Stufen I, II, III oder IV können durch die vorliegende Erfindung behandelt werden, vorzugsweise die Stufen III und IV, am meisten bevorzugt die Stufe III. Mit der vorliegenden Erfindung kann jedes Säugetier, vorzugsweise ein Mensch, behandelt werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden aus Tumorzellen oder einem Tumorzellextrakt hergestellt. Eine Tumorzelle kann eine bösartige Zelle oder Vorstufe einer bösartigen Zelle jeden Krebstyps sein. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Vorstufe einer bösartigen Zelle jede entartete Zelle, die sich als Krebszelle entwickeln kann, aber noch keine Krebszelle ist; so wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, dysplastische Veränderungen in Zervixzellen, die schließlich zu Zervixkrebs führen und dysplastische Nävi, welche entartete Hautzellen sind und zum Melanom führen.
Die Tumorzellen und Extrakte stammen vorzugsweise von jenem Krebstyp, der behandelt werden soll. Zum Beispiel wird eine Melanomzelle oder Zellextrakt verwendet, um ein Melanom zu behandeln. Die Tumorzellen und Extrakte können, aber sind nicht darauf beschränkt, autologe und allogene Zellen sein, die Biopsieproben oder Zellkulturen entnommen wurden, genauso wie Stammzellen und Extrakte davon. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen und Extrakte autolog. Es können jedoch auch alle nicht-allogenen Zellen, einschließlich in einer Kultur hergestellter, autologer Tumorzellen, die vom Tumor des Patienten isoliert wurden, verwendet werden. Tumorzellen müssen nicht vollständig (das heißt zu 100%) genetisch identisch mit der Tumorzelle oder der Nicht-Tumorkörperzelle des behandelten Patienten sein. Eine genetische Übereinstimmung zwischen den MHC-Molekülen der Tumorzelle und des Patienten ist im Allgemeinen ausreichend.
Zusätzlich kann es eine genetische Identität zwischen einem bestimmten Antigen auf der Melanomzelle und einem Antigen auf der Tumorzelle des Patienten geben. Die genetische Identität kann durch Verfahren nach dem Stand der Technik bestimmt werden. Für die vorliegende Erfindung fällt eine Tumorzelle, die (unter Verwendung von z.B. rekombinanter DNA-Technologie) genetisch verändert wurde, damit sie zum Beispiel mit bestimmten MHC-Molekülen des Patienten und/oder einem bestimmten Antigen auf den Krebszellen des Patienten genetisch identisch ist, unter den Begriff „nicht allogen" und unter die erfindungsgemäße Aufgabenstellung. Solche Zellen werden auch als „MHC-identisch" oder „MHC-kompatibel" bezeichnet.
T-Zellen sind Lymphozyten, die zwei Arten von immunologischen Funktionen vermitteln, effektorische und regulatorische, Proteine absondern (Lymphokine) und die andere Zellen abtöten (Zytotoxizität). Die Effektorfunktionen umfassen Reaktionen wie die verzögerte Hypersensitivität, die Abstoßung von Allotransplantaten, Tumorimmunität und die Graft-versus-Host-Reaktion. Die Lymphokin-Produktion und Zytotoxizität zeigen sich durch T-Zell-Effektorfunktionen. Die regulatorischen Funktionen von T-Zellen zeigen sich durch ihre Fähigkeit, die zellvermittelte Zytotoxizität durch andere T-Zellen und die Produktion von Immunglobulinen durch B-Zellen zu verstärken. Die regulatorischen Funktionen erfordern außerdem die Produktion von Lymphokinen. T-Zellen produzieren Gamma-Interferon als Antwort auf einen anregenden Reiz, der ein Mitogen, Antigen oder Lektin ist, aber nicht darauf beschränkt ist.
Die Proliferation von T-Zellen kann durch die Aufnahme von modifizierten Nukleinsäuren durch T-Zellen beobachtet werden, welche ³H-Thymidin, ¹²⁵IUDR (Iododesoxyuridin) und Zellen anfärbende Farbstoffe wie 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) sind. Zusätzlich durch Produktion von Cytokinen wie IFNγ, Tumornekrose Faktor (TNF) und IL-2, aber nicht auf diese beschränkt. Die Produktionsmenge von Cytokinen liegt vorzugsweise in einem Bereich größer als 15 pikogramm/ml, besonders bevorzugt bei etwa 20 bis etwa 30 pikogramm/ml und ganz besonders bevorzugt bei etwa 50 pikogramm/ml.
Die erfindungsgemäßen Tumorzellen können lebende Zellen sein. Gemäß der Erfindung sind die Tumorzellen als alleinige Folge der Haptenisierung, zum Beispiel mit DNP, nicht in der Lage, im Körper des Patienten nach der Injektion zu wachsen. Anders ausgedrückt sind die Zellen „im Wesentlichen in keiner Wachstumsphase".
Andere Verfahren zur Verhinderung des Zellwachstums sind nach dem Stand der Technik bekannt, zum Beispiel können Tumorzellen vor dem Gebrauch bestrahlt werden. In einer Ausführungsform werden die Tumorzellen oder Extrakte bei etwa 2500 cGy bestrahlt, damit die Zellen nach der Injektion nicht wachsen. Ein überraschender Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die erfindungsgemäßen Zellen nicht bestrahlt oder auf andere Weise gesondert behandelt werden, um ihr Wachstum im menschlichen Körper zu verhindern, weil die Haptenisierung alleine das Wachstum der Tumorzellen nach der Injektion verhindert, wie in Beispiel 1 dargestellt ist. Im Sinne der Erfindung bedeutet der Begriff „gesondert behandeln, um Tumorzellen (oder Säugetierzellen im Allgemeinen) am Wachstum im Körper des Patienten zu hindern", dass das einzige Mittel, um die Zellen unfähig zu machen, im Körper des Menschen zu wachsen, die Hapten-Bindung ist, und dass zu diesem Zwecke keine anderen Verfahren (wie zum Beispiel Bestrahlung) zusätzlich zur Haptenisierung verwendet werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Säugetierzelle an ein Hapten gebunden, um sie in eine im Wesentlichen Nicht-Wachstumsphase zu versetzen. Vorzugsweise werden diese Zellen nicht gesondert behandelt (das heißt zusätzlich zur Haptenisierung) um sie unfähig zu machen, zu wachsen. Solche Säugetierzellen können zum Beispiel für alle dem Fachmann bekannten Verfahren, Behandlungen oder Assays verwendet werden; für die herkömmlicherweise bestrahlte Zellen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in dem Verfahren der Erfindung einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindungen angewandt werden, einschließlich und nicht darauf beschränkt mit anderen Zusammensetzungen der Erfindung. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst die gemeinsame Gabe eine gleichzeitige Gabe oder nacheinander. Die Krebszellen können zusammen mit anderen Verbindungen gegeben werden, einschließlich und nicht darauf beschränkt, Cytokine, wie Interleukin-2, Interleukin-4, Gamma-Interferon, Interleukin-12 und GM-CSF. Die erfindungsgemäßen Tumorzellen können außerdem in Verbindung mit anderen Krebsbehandlungen angewandt werden, einschließlich und nicht darauf beschränkt, Chemotherapie, Bestrahlung, Antikörper, Oligonukleotidsequenzen und Antisense-Oligonukleotidsequenzen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger verabreicht werden, der in Abhängigkeit der gewünschten Art der Gabe und der pharmazeutischen Übung ausgewählt wird. Die Dosierung kann in Abhängigkeit vom Gewicht und der klinischen Verfassung des Patienten festgelegt werden. Das proportionale Verhältnis von wirksamer Substanz und Träger hängt auf natürliche Weise von der chemischen Natur, Löslichkeit und Stabilität der Zusammensetzungen ab, genauso wie die Dosierung berücksichtigt werden muss. Die Mengen der verwendeten erfindungsgemäßen Tumorzellen und Extrakte hängen von Faktoren wie der Affinität der Verbindungen für Krebszellen, der Menge der vorhandenen Krebszellen und der Löslichkeit der Zusammensetzung ab. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann mit einem immunologischen Hilfsstoff und/oder einem pharmazeutisch geeigneten Träger kombiniert werden. Jeder bekannte wasserhaltige Träger für die Abgabe von Arzneimittelstoffen, wie etwa Salzlösung, kann, ohne darauf beschränkt zu sein, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung als Träger verwendet werden. Zusätzlich kann jeder dem Fachmann für die Abgabe bekannte Hilfsstoff für die Erfindung verwendet werden. Der Hilfsstoff hat die Eigenschaft, die Immunantwort auf die erfindungsgemäßen Tumorzell-Zubereitungen zu verstärken. Typische Beispiele für Hilfsstoffe sind BCG oder der synthetische Hilfsstoff QS-21, der ein homogenes Saponin aufweist, das aus der Rinde von Quillaja saponaria aufgereinigt wurde, Corynebacterium pamum (McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619), Saponine im Allgemeinen, entgiftetes Endotoxin und Cytokine wie Interleukin-2, Interleukin-4, Gamma-Interferon (IFN-γ), Interleukin-12, Interleukin-15, GM-CSF und alle Kombinationen davon.
Die Tumorzellen können alternativ zu Antigen-präsentierenden Zellen gegeben werden. Die Tumorzelle kann zusammen mit einer anderen Zellart zur Behandlung von Krebs verwendet werden, einer Antigen-präsentierenden Zelle, die aus der Gruppe autologer, kultivierter Makrophagen und autologer, kultivierter dendritischen Zellen ausgewählt ist. Makrophagen sind alle großen, mononuklearen, amöbenartigen Zellen, unabhängig von ihrer Herkunft, wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Histiozyten und Monozyten, die phagozytieren, das heißt andere Zellen, totes Gewebe und degenerierte Zellen fressen und töten. Makrophagen sind Antigen-präsentierende Zellen, die Zellen, einschließlich T-Zellen, Antigene präsentieren, einschließlich Tumorantigene. Dendritische Zellen sind ebenso Antigen-präsentierende Zellen und sind mit den Makrophagen scheinbar eng verwandt, allerdings präsentieren dendritische Zellen Antigene weitaus effizienter als Makrophagen. Sie sind potente Stimulatoren der T-Zellen und können aus vielen Körperorganen und Geweben isoliert werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, aus Blut, Haut (wo dendritische Zellen als Langerhanssche Zellen bezeichnet werden) und Lymphgewebe.
Die an Peptid oder Membran gebundenen Antigen-präsentierenden Zellen können zum Beispiel verwendet werden, um Patienten zu immunisieren. Aus dem Blut von Patienten werden die Makrophagen oder dendritischen Zellen extrahiert. Hohe Konzentrationen des Peptids (etwa 1 ng/ml bis etwa 1 μg/ml, vorzugsweise etwa 10 ng/ml bis etwa 100 ng/ml) oder der Membran (etwa 10⁵ bis etwa 10⁷ Zelläquivalente (c.e.), Zelläquivalente beziehen sich auf die Anzahl der Startzellen, das heißt die Menge des erhaltenen Zellextrakts aus der angegebenen Anzahl der Zellen) werden über Nacht für etwa 8 Stunden mit den Zellen inkubiert. Bei der Inkubation mit Membranen werden die Membranen von Makrophagen oder dendritischen Zellen phagozytiert. Die Makrophagen oder dendritischen Zellen, die die Membranen phagozytiert haben, werden dann verwendet, um die Patienten zu immunisieren (Grabbe, S., et al., Immunology Today 1995; 16:117-121).
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung des Impfstoffes kann zum Beispiel mindestens 10⁴ Tumorzellen pro Dosis enthalten, vorzugsweise mindestens 10⁵ Zellen und besonders vorzugsweise 10⁶ Zellen. Eine Dosis ist die Impfstoffmenge, die bei einer Einzelgabe verabreicht wird. In einer Ausführungsform enthält die Impfstoffzusammensetzung etwa 10⁵ bis etwa 2,5 × 10⁷ extrahierte Zellen pro Dosis, besonders vorzugsweise etwa 5 × 10⁶ Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Impfstoffzusammensetzung höchstens 7,5 × 10⁶ extrahierte Zellen. Die Menge der verwendeten erfindungsgemäßen Tumorzellen hängt von Faktoren wie der Affinität der Verbindung für Tumorzellen, der Menge der Tumorzellen und der Löslichkeit der Zusammensetzung ab. Die Dosierungen können in Abhängigkeit vom Gewicht und der klinischen Verfassung des Patienten festgelegt werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung des Impfstoffes kann in einer Dosierform abgepackt werden, die für intradermale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre und subkutane Gabe geeignet ist. Alternativ kann die Dosierform die erfindungsgemäßen Zubereitungen (zum Beispiel Tumorzellen) so enthalten, dass sie zum Zeitpunkt der Verabreichung, z.B. mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, hergestellt werden.
Die Tumorzellen und die daraus bestehenden Zusammensetzungen können auf jede geeignete Weise verabreicht werden, einschließlich Impfung und Injektion, zum Beispiel intradermal, intravenös, intraperitoneal, intramuskulär und subkutan. Es gibt verschiedene Orte für die Verabreichung jeder einzelnen Impfbehandlung. Zum Beispiel kann die Impfzusammensetzung mittels intradermaler Injektion mindestens an zwei und vorzugsweise drei Stellen pro Gabe verabreicht werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Impfzusammensetzung in die Oberarme oder Beine gegeben.
Vor der Verabreichung der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzung kann der Patient für das Hapten, das für die Modifizierung der Tumorzellen und Membranen verwendet wird, immunisiert werden, indem es auf die Haut aufgetragen wird. Beispielsweise kann Dinitrofluorobenzen (DNFB) verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Patient vor der Verabreichung des Impfstoffes nicht für das Hapten immunisiert. Danach (zum Beispiel etwa zwei Wochen später) wird dem Patienten eine Tumorzell- oder Extraktzusammensetzung injiziert. Die Zusammensetzung kann für insgesamt drei und vorzugsweise mindestens sechs Behandlungen verabreicht werden (zum Beispiel durch Reinjektion). In einer Ausführungsform beträgt die Gesamtzahl der Gaben (einschließlich der Anfangsgabe) acht und in einer anderen Ausführungsform zehn. Der Impfplan kann durch den behandelnden Arzt aufgestellt werden, um die individuelle Verfassung des Patienten zu berücksichtigen. Die Injektionen des Impfstoffes können zum Beispiel alle 4 Wochen, vorzugsweise alle 2 Wochen und am meisten bevorzugt jede Woche gegeben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Impfstoff jede Woche bei einer Gesamtzahl von sechs Behandlungen injiziert. Haptenisierter und nicht haptenisierter Impfstoff können sich abwechseln. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der gesamte Impfstoff mit Hapten modifizierte Tumorzellen. Es kann ein Booster-Impfstoff gegeben werden. Vorzugsweise werden ein oder zwei Booster-Impfstoffe verabreicht. Der Booster-Impfstoff kann zum Beispiel nach etwa sechs Monaten oder etwa einem Jahr nach der Anfangsgabe verabreicht werden.
Zur Verstärkung der Immunantwort auf die Tumorzellen kann mehrere Tagen (zum Beispiel drei Tage) vor jeder Gabe des Impfstoffes der Wirkstoff Cyclophosphamid (CY) verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird CY nur einmal vor der ersten Injektion des Impfstoffes gegeben.
Die haptenisierte oder chemisch gebundene Form des Impfstoffes kann zum Beispiel eine mit Dinitrophenol (DNP) haptenisierte Tumorzelle aufweisen. Andere Haptene umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, Trinitrophenol, Iodoacetyl-N'-(5-Sulfon-1-Naphthyl)-Ethylen-Diamin, Trinitrobenzensulfonsäure, Fluorescein-Isothiocyanat, Arsensäure-Benzen-Isothiocyanat, Trinitrobenzensulfonsäure, Sulfanilsäure, Arsanilsäure, Dinitrobenzen-S-Senföl. Kombinationen der Haptene können ebenso verwendet werden.
Haptene umfassen im Allgemeinen eine reaktive Gruppe für die Bindung an einen Substituenten an einer Aminosäurenseitenkette eines Proteins oder Polypeptids (zum Beispiel eine freie Carboxylsäuregruppe wie bei der Asparaginsäure oder Glutaminsäure; die γ-Aminogruppe des Lysins; der Schwefelrest von Cystein; die Hydroxylgruppe von Serin oder Tyrosin; der Imidazolrest von Histidin; oder die Arylgruppe von Tryptophan, Tyrosin oder Phenylalanin). Die Bezeichnung „reaktive Gruppe" bedeutet hierbei eine funktionelle Gruppe des Haptens, die mit einer funktionellen Gruppe eines Peptids oder Proteins reagiert. Die Bezeichnung „funktionelle Gruppe" entspricht der üblichen Bedeutung in der organischen Chemie. Die reaktiven Gruppen des Haptens werden hier die „reaktive Hapten-Gruppe" genannt. Für Haptene sind verschiedene reaktive Gruppen bekannt, die mit den Substituenten an den Seitenketten der Peptid- und Protein-Aminosäuren reagieren. Bevorzugte Beispiele solcher reaktiver Gruppen zur Bindung an spezifische Polypeptid-Substituenten sind Carboxylsäure- und Sulfonsäure-Derivate (einschließlich Säurechloride, Anhydride und reaktive Carboxylester wie N-Hydroxysuccinimidester), Imidoester, Diazonium-Salze, Isocyanate, Isothiocyanate, Halonitrobenzol, α-Halocarbonylverbindungen, Maleimide, Schwefel-Senföle, Stickstoff-Senföle und Aziridine.
Reaktive Hapten-Gruppen, die eine kovalente Bindung mit primären Aminen an Aminosäureseitenketten eingehen, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Säurechloride, Anhydride, reaktive Ester, α,β-ungesättigte Ketone, Imidoester und Halonitrobenzole. Verschiedene reaktive Ester, die mit nukleophilen Gruppen, wie beispielsweise primären Aminen, reagieren können, sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Pierce (Rockford, Illinois).
Carboxylsäuren können durch Carbodiimide, wie zum Beispiel EDC, aktiviert werden, was die Wechselwirkung mit verschiedenen Nukleophilen, einschließlich primären und sekundären Aminen, erlaubt. Die Alkylierung von Carboxylsäuren zur Bildung stabiler Ester erreicht man durch Wechselwirkung mit Schwefel- oder Stickstoff-Senfölen oder Haptenen, die entweder einen Alkyl- oder Arylaziridinrest enthalten.
Die Wechselwirkung von aromatischen Resten an verschiedenen Aminosäuren kann durch Photoaktivierung einer Aryl-Diazonium-Verbindung in Anwesenheit des Proteins oder Peptids erfolgen. Auf diese Weise kann die Modifizierung der Arylseitenketten von Histidin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, insbesondere Histidin und Tryptophan, durch Verwendung einer derartigen reaktiven Eigenschaft erreicht werden.
Funktionelle Gruppen, die mit Sulfhydrylgruppen reagieren. Es gibt mehrere reaktive Gruppen, die zum Modifizieren von Sulfhydrylgruppen, die sich an den Seitenketten von Aminosäuren befinden, verwendet werden können. Haptene mit einem α,β-ungesättigten Keton oder einem Esterrest, wie Maleimid, haben eine reaktive Eigenschaft, die sowohl mit Sulfhydryl als auch mit Aminogruppen wechselwirken kann. Zusätzlich kann eine reaktive Disulfidgruppe, wie eine 2-Ppyridyldithiogruppe oder eine 5,5'-Dithio-bis-(2-Nitrobenzolsäure)-Gruppe genauso gut reagieren. Einige Beispiele für Reagenzien mit reaktiven Disulfidbindungen umfassen N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyl-Dithio)-Propionat (Carlsson, et al., Biochem J., 173:723-737, 1978), Natrium-S-4-Succinimidyloxycarbonyl-alpha-Methylbenzylthiosulfat und 4-Succinimidyloxycarbonyl-alpha-Methyl-(2-Pyridyldithio)-Toluen. Einige Beispiele für Reagenzien mit reaktiven Gruppen mit einer Doppelbindung, die mit einer Thiolgruppe reagieren, umfassen Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)-Cyclohexahe-1-Carboxylat und Succinimidyl-m-Maleimidobenzoat.
Andere funktionelle Moleküle umfassen Succinimidyl-3-(Maleimid)-Propionat, Sulfosuccinimidyl-4-(p-Maleimid-Phenol)-Butyrat, Sulfosuccinimidyl-4-(N-Maleimidmethyl-Cyclohexane)-1-Carboxylat, Maleimidbenzoyl-N-Hydroxy-Succinimidester. Viele der oben genannten Reagenzien und ihre Sulfonate können von Pierce bezogen werden.
Die Haptene umfassen ebenso eine Erkennungsgruppe, die mit einem Antikörper wechselwirkt. Die Erkennungsgruppe ist irreversibel mit der reaktiven Gruppe des Haptens verbunden. Deshalb kann die Erkennungsgruppe des Haptens an den Antikörper binden, wenn die reaktive Gruppe des Haptens mit der funktionellen Gruppe des Zielmoleküls verbunden ist. Durch Auswahl einer geeigneten reaktiven Gruppe des Haptens wird die Erkennung der Hapten-Erkennungsgruppe durch den Antikörper und seine Bindung daran unabhängig von der funktionellen Gruppe, durch die das Hapten gebunden ist. Wenn dies der Fall ist, dann sind die Haptene funktionell gleichwertig und man kann sagen, dass sie die Bindungsmerkmale des Antikörpers teilen. Dies trifft sogar zu, obwohl die Haptene sich chemisch unterscheiden, um die Bindung an verschiedene funktionelle Gruppen zu ermöglichen.
Beispiele für verschiedene Hapten-Erkennungsgruppen umfassen, ohne dadurch beschränkt zu sein, Dinitiophenol, Trinitrophenol, Fluorescein, andere Aromaten, Phosphoylcholin, Peptide, Endprodukte einer fortgeschrittenen Glykolisierung (AGE), Kohlenhydrate usw.
In einer besonderen Ausführungsform kann die gleiche Hapten-Erkennungsgruppe an verschiedene Aminosäuren durch verschiedene reaktive Gruppen des Haptens gekoppelt sein. Zum Beispiel bilden die Reagenzien Dinitrobenzensulfonsäure, Dinitrophenoldiazonium und Dinitrobenzen-S-Senföl alle das Dinitrophenol-Hapten, das jeweils an Aminogruppen, aromatische Gruppen und Carboxylsäure-Gruppen gebunden ist. Ebenso kann ein Arsensäure-Hapten durch reaktives Arsensäure-Benzen-Isothiocyanat an Aminogruppen oder durch Azobenzenarsenat an aromatische Gruppen gekoppelt sein.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Verdacht auf Krebs kann die Gabe einer pharmazeutisch geeigneten Dosis an Cyclophosphamid umfassen, sowie eine pharmazeutisch geeignete Dosis einer Zusammensetzung, die vitale Tumorzellen aufweist, oder Tumorzellen, die im Wesentlichen in einem nicht metabolischen Zustand sind oder eine Mischung davon. Die Zusammensetzung kann mit einem immunologischen Hilfsstoff und/oder einem pharmazeutisch geeigneten Träger gemischt werden. Nach dem haptenisierten Impfstoff kann wahlweise eine pharmazeutisch geeignete Dosis eines nicht haptenisierten Impfstoffes verabreicht werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird jede Woche in einem Zeitraum von mindestens drei Wochen gegeben, vorzugsweise mindestens sechs Wochen, und der ersten Gabe geht eine pharmazeutisch geeignete Dosis Cyclophosphamid voraus. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung eine Höchstmenge von etwa 7,5 × 10⁶ Zellen enthalten. Der Patient muss vor der Verabreichung des Impfstoffes nicht mit einem Hapten immunisiert werden.
Die Tumorzellen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, können wie folgt hergestellt werden. Die Tumormasse wird nach Berd et al. (1986), siehe oben, verarbeitet. Die Zellen werden durch enzymatische Auflösung mit Kollagenase und mit DNAse durch mechanische Auflösung extrahiert, in einem Gefrierschrank mit einstellbarer Geschwindigkeit gefroren, und bis zum Gebrauch in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. An dem Tag, wo die Haut eines Patienten getestet oder behandelt wird, werden die Zellen aufgetaut und gewaschen. Sie werden noch einmal gewaschen und dann in Hanks-Salzlösung ohne Phenolrot resuspendiert. Die Bindung der präparierten Zellen mit DNP wird vorzugsweise nach dem Verfahren von Miller und Claman (J. Immunol., 1976; 117, 1519) durchgeführt.
Das folgende Verfahren kann für die Haptenisierung der Tumorzellen durchgeführt werden. Etwa 100 mg DNFB (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wird in etwa 0,5 ml 70% Ethanol gelöst. Etwa 99,5 ml PBS wird hinzugegeben. Die DNFB Konzentration sollte bei etwa 152 mg/0,1 ml liegen. Die Lösung wird über Nacht in einem 37°C warmen Wasserbad gerührt. Die Haltbarkeit der Lösung beträgt etwa vier Wochen. Die Zellen werden aufgetaut und das Pellet in 5 × 10⁶ Zellen/ml Hanks-Salzlösung resuspendiert. Etwa 0,1 ml DNFB-Lösung wird zu jedem ml Zellen hinzugegeben und für etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. In gleicher Weise werden andere Haptene, wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Trinitrophenol, N-Iodoacetyl-N'-(5-Sulfon-1-Naphthyl)-Ethylen-Diamin, Trinitrobenzensulfonsäure, Fluorescein-Isothiocyanat, Arsensäure-Benzen-Isothiocyanat, Trinitrobenzensulfonsäure, Sulfanilsäure, Arsanilsäure, Dinitrobenzen-S-Senföl und Kombinationen davon verwendet. Die Zellen werden dann zweimal in Hanks-Lösung gewaschen. Die Zellen werden dann in etwa fünf Volumeneinheiten eines etwa 30 mM Natriumbicarbonatpuffers mit etwa 1 mM Phenolmethylsulfonylfluorid resuspendiert und mit einem Glass-Homogenisator aufgebrochen. Die restlichen intakten Zellen und Zellkerne werden durch Zentrifugation bei etwa 1000 g entfernt. Die Membranen werden durch Zentrifugation bei 100.000 g bei 90 Minuten pelletiert. Die Membranen werden in etwa 8% Sucrose resuspendiert und bei etwa –80°C eingefroren, bis sie gebraucht werden.
Zahlreiche menschliche Krebsimpfstoffe sind entwickelt und untersucht worden. Obwohl diese herkömmlichen Impfstoffe manchmal eine schwache Immunität für den Krebs eines Patienten hervorrufen, wird selten eine Rückbildung des Tumors beobachtet. Die Entwicklung von entzündlichen Antworten bei metastasierenden Tumoren wurde überraschenderweise mit dem erfindungsgemäßen DNP-Impfstoff gefunden. Die Tumore wurden gerötet, warm und weich. In einigen Fällen bildete sich der Tumor bis auf eine Größe zurück, dass er für das bloße Auge und mikroskopisch verschwand. Mikroskopisch wurde eine Infiltration von T-Lymphozyten in die Tumormasse beobachtet. Deshalb ist diese Vorgehensweise, bei der die entzündliche Antwort und die Anzahl und Wirksamkeit der Lymphozyten, die in den Tumor eindringen, erhöht wird, ein signifikanter Vorteil im Stand der Technik.
Die Wirksamkeit des Impfstoffes kann durch Zugabe verschiedener biologischer Stoffe, die die Antwort beeinflussen, verbessert werden. Die Wirkstoffe stimulieren direkt oder indirekt die Immunantwort. Erfindungsgemäße biologische Modifikatoren der Immunantwort umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, Interleukin-12 und Gamma-Interferon. Die in dieser Ausführungsform wird IL12 nach jeder Impfstoffinjektion gegeben. Es wird angenommen, dass bei Verabreichung von IL12 an Patienten die entzündlichen Antworten die T-Lymphozyten veranlassen, innerhalb der Tumormasse zu proliferieren und aktiver zu werden. Die erhöhte Anzahl an T-Lymphozyten und ihre höhere Aktivität führen zur immunologischen Zerstörung des Tumors. Die Dosierungen für IL 12 stimmen mit den Dosierschemata überein, die oben beschrieben wurden.
Patienten mit metastasierenden Melanomen können mit einer Immuntherapie mit folgenden Komponenten behandelt werden: 1) ein Impfstoff, der aus autologen Tumorzellen besteht, die an DNP gebunden sind; und 2) eine Vorbehandlung mit niedrig dosiertem Cyclophosphamid. Die Patienten werden untersucht, um festzustellen, ob eine Tumorrückbildung auftritt, um die entzündliche Antwort des Tumors zu überwachen und um die DTH-Antwort auf die autologen Melanomzellen, DNFB (die Form von DNP, die für Hautsensibilisierung verwendet wird), die DNP-konjugierten autologen Lymphozyten, Verdünnungsmittel (Hanks-Lösung), gereinigtes Proteinderivat (PPD) und Erinnerungsantigene (Kandida, Trichophyton und Mumps) zu messen. Bei Patienten, die (klinisch oder immunologisch) von der Therapie profitieren, wird die Immuntherapie fortgesetzt. Die folgenden Impfungen können ohne Cyclophosphamid durchgeführt werden. In einem ähnlichen Experiment ergab sich, dass an Polyäthylenglykol gebundenes Interleukin 2 nicht wirksam ist.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Impfstoff verwendet, der an ein Hapten gebundene Krebszellen enthält, die mit einem immunologischen Hilfsmittel gemischt sind, zum Beispiel mit Bacillus Calmette-Guerin, BCG.
Von menschlichen Melanom-Metastasen werden Biopsien mit RT-PCR auf die Expression von Zytokin-mRNA untersucht. mRNA für IFNγ wird in durch DNP-Impfstoff entzündeten Metastasen gefunden, aber nur selten in unbehandelten Metastasen, sogar bei jenen nicht, die viele restliche Lymphknotenlymphozyten enthalten. Darüber hinaus werden Typ II Zytokine, IL10, in fast allen Melanom-Metastasen gefunden und scheinen durch die Melanomzellen selbst produziert zu werden.
Patienten mit metastasierenden Melanomen, die mit einem autologen, DNP-modifizierten Impfstoff behandelt wurden, entwickeln entzündliche Antworten an den Tumorstellen. Histologisch sind diese entzündlichen Läsionen durch T-Zellen-Infiltration gekennzeichnet, die manchmal mit der Zerstörung der Tumorzellen einhergeht. Bei der vorliegenden Erfindung wurden 8 Biopsieproben von subkutanen Metastasen, die nach einer Impfbehandlung eine Entzündung entwickelt hatten, auf eine Expression von mRNA für IFNγ, IL4, TNF und IL10 getestet. Nach einer Impfung entzündete Biopsien enthielten mRNA für IFNγ (5/8), IL4 (4/8) oder beide (3/8) und für TNF (4/7). Demgegenüber wurde IFNγ mRNA nur in 1/17 und TNF mRNA nur in 2/16 Kontrollproben ermittelt (Lymphknotenmetastasen oder nicht entzündete subkutane Metastasen). mRNA für IL10, einem Zytokin mit anti-entzündlichen Eigenschaften, wurde in den 24/25 Melanom-Metastasen nachgewiesen und war unabhängig vom lymphoiden Inhalt; durch in-situ PCR wurde bestätigt, dass Melanomzellen die Hauptquelle waren. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen Parameter, mit dem die Wirkungen einer Krebs-Immuntherapie gemessen werden können.
Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf frische Biopsien metastasierter Melanome, die hinsichtlich der Anwesenheit von Zytokin-RNA analysiert werden, welche bei einer erwünschten Immunantwort am Tumorort auftritt. Die Expression von IFNγ oder IL4-RNA wird durch Melanom-Metastasen charakterisiert, die nach der Gabe von DNP-modifiziertem autologem Impfstoff eine entzündliche Antwort zeigen. Auf der anderen Seite ist die Expression von IL10-RNA unabhängig von einer entzündlichen Antwort und wird in nahezu allen Biopsieproben von Melanomen gefunden. Die Untersuchung von Zelllinien, die von Melanombiopsien stammen, sowie die in-situ PCR-Analyse zeigte, dass die Melanomzellen selbst die Quelle von IL10 sind, und nicht die zugehörigen Lymphozyten.
Die vorliegende Anmeldung umfasst ein Verfahren zur Untersuchung der Zytokin-Produktion durch einen Tumor, um die Wirksamkeit einer Zusammensetzung aus autologen, bestrahlten, mit Hapten-gebundenen Zellen bei einem Patienten mit Verdacht auf Krebs zu bestimmen, wobei genanntes Verfahren die Verabreichung der genannten Zusammensetzung aus autologen, bestrahlten, mit Hapten-gebundenen Zellen umfasst; die Entnahme einer Probe, die Nukleinsäuren von einer Gewebeprobe des Patienten enthält; die Amplifizierung derjenigen Nukleinsäuren, die spezifisch für ein Cytokin sind, oder die Amplifizierung eines Signalstoffes, der durch Hybridisierung einer Sonde erzeugt wird, die für eine cytokinspezifische Nukleinsäure in besagter Gewebeprobe spezifisch ist; und der Nachweis der amplifizierten Nukleinsäuren oder des amplifizierten Signalstoffes, wobei das Vorhandensein der amplifizierten Nukleinsäuren oder des amplifizierten Signalstoffes Krebs anzeigt, und wobei das Vorhandensein der amplifizierten Nukleinsäuren oder des amplifizierten Signalstoffes von besagter Gewebeprobe des Patienten die Wirksamkeit von genannter Hapten-gebundener Zusammensetzung anzeigt.
Die Gewebeprobe kann von einem bösartigen oder einer Vorstufe eines bösartigen Tumors stammen, zum Beispiel ein Melanomtumor, oder zum Beispiel ein subkutanes, entzündetes, metastasierendes Melanom. Weiterhin kann eine Gewebeprobe fest oder flüssig sein und zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, ein gesamter Tumor oder ein Teil eines Tumors, Speichel, Sputum, Schleim, Knochenmark, Serum, Blut, Urin, Lymph- oder Tränenflüssigkeit von einem Patienten mit Verdacht auf Krebs sein.
Nukleinsäuren wie DNA (einschließlich cDNA) und RNA (einschließlich mRNA) werden der Gewebeprobe des Patienten entnommen. Vorzugsweise wird RNA von einer Gewebeprobe verwendet. Die gesamte RNA wird nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren extrahiert, wie es bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989), beschrieben ist.
Nach der Extraktion der Nukleinsäure erfolgt eine Amplifikation nach dem Stand der Technik. Der Amplifikationsschritt umfasst die Verwendung mindestens einer Primersequenz, die mit einem Teil der zytokinspezifischen Sequenz komplementär ist. Zytokinspezifische Sequenzen für die vorliegende Erfindung umfassen (und sind nicht darauf beschränkt) gesamte Sequenzen oder Teile davon, die IFNγ, TNF, IL-2, IL-12 und IL-13 kodieren. Im Allgemeinen ist die Sequenz des Primers etwa 21 Nukleotiden bis etwa 33 Nukleotide lang, vorzugsweise etwa 21 Nukleotide, etwa 31 Nukleotide, 32 Nukleotide und etwa 33 Nukleotide lang.
Primersequenzen für die Amplifikationsverfahren umfassen, aber sind nicht darauf beschränkt, Sequenzen mit den Sequenzkennzahlen SEQ ID Nr. 1 und 2; IFNγ, SEQ ID Nr. 3 und 4; IL4, SEQ ID Nr. 5 und 6; IL10, SEQ ID Nr. 7 und 8; und TNF, SEQ ID Nr. 9 und 10.
Wo in einem vom Ausgangsmaterial abhängigen Amplifikationsprozess ein Primerpaar benötigt wird, umfasst ein Primer des Paares Oligonukleotide, die mit Nukleinsäuresequenzen komplementär sind, die zytokinspezifische Proteine kodieren. Dieser eine Primer des Paares kann aus der Gruppe, die aus den Sequenzkennzahlen SEQ ID Nr. 1 bis 10 besteht, ausgewählt werden.
Alternativ kann jedes der beiden Oligonukleotide in dem Primerpaar spezifisch für eine Nukleinsäuresequenz sein, die ein Zytokin kodiert. Die Primer können so hergestellt werden, dass sie zum Beispiel für unterschiedliche Regionen einer Zytokinsequenz komplementär sind. Mit unterschiedlichen Regionen ist gemeint, dass ein erster Primer mit einer 3'-Region einer Zytokinsequenz komplementär ist und ein zweiter Primer mit einer 5'-Region einer Zytokinsequenz komplementär ist. Vorzugsweise sind die Primer mit unterschiedlichen, getrennten Regionen komplementär, und sind nicht miteinander komplementär. Die Primer mit den Sequenzkennzahlen SEQ ID Nr. 1 bis 10 sind lediglich Beispiele für Primer, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können.
Wenn bei einem Amplifikationsverfahren zwei Primer verwendet werden, so wie bei der Polymerase-Kettenreaktion, dann kann der erste Primer aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Sequenzen mit den Sequenzkennzahlen SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 7, und 9 besteht und der zweite Primer kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Sequenzkennzahlen SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8 und 10 besteht. Alle Primerpaare, die Nukleinsäuren zueinander transkribieren und die für Zytokine spezifisch sind, können in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Vorzugsweise wird eine gesamte Extraktion der RNA durchgeführt. Der hier benutzte Begriff „Amplifikation" bezieht sich auf vorlagenabhängige Prozesse und vektorvermittelte Vermehrung, die zu einer Erhöhung der Konzentration eines spezifischen Nukleinsäuremoleküls im Verhältnis zu seiner Anfangskonzentration oder zur Konzentrationserhöhung eines nachweisbaren Signalstoffes führen. Der hier benutzte Begriff „vorlagenabhängiger Prozess" bezieht sich auf einen Prozess, der sich auf eine vorlagenabhängige Erweiterung eines Primermoleküls bezieht. Der Begriff „vorlagenabhängiger Prozess" bezieht sich auf die Nukleinsäuresynthese eines RNA- oder DNA-Moleküls, bei der die Sequenz eines neu synthetisierten Stranges der Nukleinsäure durch die bekannten Regeln der komplementären Basenpaarung bestimmt werden (siehe hierzu zum Beispiel Watson, J. D. et al., in: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)). Typischerweise verwenden vektorvermittelte Verfahren die Einführung eines Nukleinsäurefragments in einen DNA- oder RNA-Vektor, die Amplifikation des Vektors und die Rückgewinnung des amplifizierten Nukleinsäurefragments. Beispiele für solche Methoden finden sich bei Cohen et al. (US Patent Nr. 4,237,224), Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Die gewünschten Zielsequenzen in einer Probe können mit einer Vielzahl von vorlagenabhängigen Prozessen amplifiziert werden. Eines der bekanntesten Verfahren zur Amplifikation ist die Polymerraserkettenreaktion (PCR), die im Detail in den US-Patenten 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 sowie bei Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego CA, 1990, beschrieben ist. Kurz gesagt werden bei der PCR zwei Primersequenzen hergestellt, die mit Regionen der gegenüberliegenden, komplementären Stränge der Zielsequenz komplementär sind. Zusammen mit einer DNA-Polymerase (zum Beispiel Taq-Polymerase) wird ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten zu einem Reaktionsmedium hinzugegeben. Wenn die Zielsequenz in der Probe vorhanden ist, binden die Primer an das Ziel und die Polymerase bewirkt, dass die Primer durch das Anfügen von Nukleotiden entlang der Zielsequenz verlängert werden. Durch Erhöhen oder Erniedrigen der Temperatur des Reaktionsmediums dissoziieren die verlängerten Primer von der Zielsequenz und bilden Reaktionsprodukte, die überschüssigen Primer binden an das Zielmolekül und an die Reaktionsprodukte und der Vorgang wiederholt sich. Vorzugsweise wird eine reverse Transkriptase PCR durchgeführt, um die Menge an amplifizierter mRNA zu bestimmen. Polymerase-Kettenreaktionsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein anderes Verfahren zur Amplifikation ist die Ligase-Kettenreaktion (als LCR bezeichnet), die im Europäischen Patent Nr. 320,308 offenbart ist. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, und wenn eine Zielsequenz vorhanden ist, bindet jedes Paar an den gegenüberliegenden komplementären Strang des Zielmoleküls, so dass sie anliegen. Ist eine Ligase vorhanden, dann verbinden sich die beiden Sondenpaare und bilden eine Einheit. Durch zyklische Temperaturveränderungen, wie bei der PCR, dissoziieren die gebundenen Einheiten vom Zielmolekül und dienen dann als „Zielsequenzen" für die Bindung der überschüssigen Sondenpaare. Das US Patent 4,883,750 beschreibt eine alternative Amplifikationsmethode, bei der, ähnlich wie bei der LCR, Sondenpaare an eine Zielsequenz gebunden werden.
Ebenso kann die in der PCT-Anmeldung PCT/US87/00880 beschriebene Qbeta Replikase als weiteres Amplifikationsverfahren für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die eine Region aufweist, welche mit derjenigen einer Zielsequenz komplementär ist, zu einer Probe in Anwesenheit einer RNA-Polymerase gegeben. Die Polymerase kopiert dann die replikative Sequenz, die anschließend nachgewiesen werden kann.
Ein Amplifikationsverfahren bei gleich bleibender Temperatur, bei dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen benutzt werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erzielen, die Nukleotid-5'-[alpha-Thio]-Triphosphate in einem Strang der Restriktionsstelle enthalten (Wanderer, G.T., et al., Proc. National. Acad, Sci. USA 1992, 89:392-396), kann ebenso bei der Amplifikation von Nukleinsäuren für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ist ein weiteres Verfahren, um eine Amplifikation von Nukleinsäuren bei gleich bleibender Temperatur durchzuführen, wobei mehrfache Zyklen einer Strangverdrängung und Synthese erfolgen, d.h. eine „Nick"-Translation. Ein ähnliches Verfahren wird Kettenreparaturreaktion (RCR) genannt und ist ein anderes Verfahren zur Amplifikation, das für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann und die Anlagerung von mehreren Sonden an eine zu amplifizierende Region betrifft, gefolgt von einer Reparaturreaktion, bei der nur zwei der vier Basen vorhanden sind. Die anderen zwei Basen können als Biotinderivate zum einfachen Nachweis hinzugegeben werden. Ein ähnlicher Ansatz wird bei der SDA verfolgt.
Mit dem CPR-Verfahren (Cyclic Probe Reaction) können ebenfalls zytokinspezifische Sequenzen nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Sonde, die 31 und 51 Sequenzen einer nicht-zytokinspezifischen DNA und eine mittlere zytokinspezifische RNA-Sequenz aufweist, mit DNA in der Probe hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNase H behandelt, und die Produkte der Sonde, die unterschiedliche Produkte sind, erzeugen ein Signalmolekül, das nach dem Abbau freigesetzt wird. Die ursprüngliche Vorlage wird an eine andere Zyklussonde gebunden und die Reaktion wiederholt sich. Das heißt, dass bei der CPR ein Signalmolekül amplifiziert wird, das durch Hybridisierung einer Sonde mit einer zytokinspezifischen Nukleinsäure erzeugt wird.
Es können außerdem noch weitere Amplifikationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die in der GB Anmeldung Nr. 2 202 328 und in der PCT Anmeldung PCT/US89/01025 beschrieben sind. In der erstgenannten Anmeldung werden „modifizierte" Primer für eine PCR-ähnliche vorlagen- und enzymabhängige Synthese verwendet. Die Primer können durch Markierung mit einem Einfangrest (z.B. Biotin) und/oder einem Detektorrest (z.B. ein Enzym) modifiziert werden. Im letzteren Fall werden markierte Sonden im Überschuss zu der Probe gegeben. In Anwesenheit der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch abgespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz unversehrt freigesetzt und durch die überschüssige Sonde gebunden. Die Abspaltung der markierten Sonde zeigt die Anwesenheit der Zielsequenz an.
Andere Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren umfassen transkriptionsbasierte Systeme (TAS) (Kwoh D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:1173, Gingeras T.R., et al., PCT Veröffentlichung WO 88/10315) einschließlich der nukleinsäurebasierten Amplifikation (NASBA) und 3SR. Bei der NASBA können die Nukleinsäuren für die Amplifikation durch eine Standard-Phenol/Chloroformextraktion präpariert werden, durch Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, Behandlung mit Lyse-Puffer und Minispin-Säulen zur Isolierung der DNA oder RNA oder durch Guanidiniumchloridextraktion der RNA. Bei diesen Amplifikationstechniken wird ein Primer angelagert, der prostataspezifische Sequenzen hat. Nach der Polymerisierung werden die DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle wiederum hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird die Einzelstrang-DNA durch Zugabe eines zweiten prostataspezifischen Primers in eine vollständig doppelsträngige DNA überführt, gefolgt von einer Polymerisierung. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann mehrfach durch eine Polymerase, wie etwa T7 oder SP6, transkribiert. In einer zyklischen Reaktion wird die RNA bei gleich bleibender Temperatur in eine doppelsträngige DNA revers transkribiert und noch einmal mit einer Polymerase, wie T7 oder SP6, transkribiert. Die so erhaltenen vollständigen oder trunkierten Produkte sind spezifische Sequenzen für Prostatakrebs.
Die Europäische Patentveröffentlichung Nr. 329822 offenbart ein Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, bei dem Einzelstrang-RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngige DNA (dsDNA) zyklisch synthetisiert wird, was im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA bildet die Vorlage für ein erstes Primer-Oligonukleotid, das durch Reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann von dem gebildeten RNA:DNA-Doppelstrang durch Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in einem Doppelstrang mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die erhaltene ssDNA ist eine zweite Vorlage für einen zweiten Primer, der ebenso die Sequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors (beispielsweise T7 RNA-Polymerase) zu seiner Homologie zu seiner Vorlage umfasst. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase (beispielsweise das große „Klenow"-Fragment von E. Coli DNA Polymerase) verlängert und ergibt ein doppelsträngiges DNA („dsDNA") Molekül mit einer Sequenz, die mit der ursprünglichen RNA zwischen den Primern identisch ist und an einem Ende zusätzlich eine Promotorsequenz hat. Diese Promotorsequenz kann von der geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um zahlreiche RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann wieder in den Zyklus eintreten und führen zu einer sehr schnellen Amplifikation. Durch geschickte Wahl der Enzyme kann die Amplifikation bei gleich bleibender Temperatur ohne Zugabe von Enzymen für jeden Zyklus durchgeführt werden. Wegen der zyklischen Natur des Verfahrens kann als Startsequenz sowohl DNA als auch RNA gewählt werden.
Miller, H.I. et al., PCT Anmeldung WO 89/06700, offenbart ein Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, das auf der Hybridisierung einer Promotor/Primersequenz mit einer einzelsträngigen Ziel-DNA („ssRNA") beruht, gefolgt von einer Transkription vieler RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Verfahren ist nicht zyklisch, das heißt neue Vorlagen werden nicht durch die erhaltenen RNA-Transkripte produziert. Andere Amplifikationsverfahren sind „Race", offenbart von Frohman, M.A. in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications 7990, Academic Press, N.Y.) und "one-sided PCR11 (Ohara, O., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 8656733677).
Ebenso können für den Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung Verfahren verwendet werden, die auf der Bindung von zwei (oder mehr) Oligonukleotiden in Gegenwart von Nukleinsäuren beruhen, die die Sequenz der entstandenen „Di-Oligonukleotide" (Wu, D.Y. et al., Genomics 1989; 4560) haben, wodurch die Di-Oligonukleotide amplifiziert werden.
Nach der Amplifikation kann die Anwesenheit oder Abwesenheit des amplifizierten Produkts nachgewiesen werden. Das amplifizierte Produkt kann durch jedes Verfahren nach dem Stand der Technik sequenziert werden, einschließlich, und nicht darauf beschränkt, entsprechend der Methode von Maxam und Gilbert, siehe Sambrook, wie oben beschrieben. Das sequenzierte, amplifizierte Produkt kann dann mit Ergebnissen verglichen werden, die mit Gewebe vor der Impfbehandlung erhalten wurden. Gewebeproben, die vor der Impfbehandlung entnommen wurden, sollten keine Zytokinsequenzen enthalten, insbesondere IFNγ, TNF, IL2, IL12 und IL13. Die Nukleinsäuren können in einzelne Fragmente mit unterschiedlichen Größen fragmentiert werden. Zum Beispiel können DNA-Fragmente entsprechend ihrem Molekulargewicht durch Verfahren wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Elektrophorese durch eine Agarose-Gelmatrix getrennt werden. Die Gele werden dann mittels Southern-Hybridisierung analysiert. Kurz gesagt, wird die DNA im Gel in ein Hybridisierungssubstrat oder eine Matrix eingebracht, wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, ein Nitrozelluloseblatt und eine Nylonmembran. Eine markierte Sonde wird dann unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen auf die Matrix gegeben, so dass sie mit komplementärer DNA hybridisiert, die sich auf der Matrix befindet. Die Sonde kann eine Länge haben, dass sie in der Lage ist, einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Die Sonde kann eine Länge in einem Größenbereich von etwa 200 bis etwa 10.000 Nukleotide haben. Fehlstellen, wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Sequenzen mit ähnlicher Hydrophobizität und Hydrophilität sind dem Fachmann durch die vorliegende Offenbarung bekannt. Dem Fachmann sind zahlreiche Markierstoffe zum Sichtbarmachen oder zum Nachweis bekannt, wie zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, Fluoreszenzfärbung, Ethidiumbromidfärbung, Avidin/Biotin, radioaktive Markierung, wie ³²P-Markierung. Vorzugsweise kann das Produkt, wie zum Beispiel das PCR-Produkt, über ein Agarose-Gel laufen und mit einer Anfärbung wie Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden. Siehe hierzu Sambrook et al. wie oben beschrieben. Die Matrix kann dann durch Autoradiographie analysiert werden, um bestimmte Fragmente zu finden, die mit der Sonde hybridisieren.
Ein diagnostisches Kit zum Testen der Wirksamkeit einer autologen, bestrahlten, Hapten-gebundenen Zellzusammensetzung, umfassend einen oder mehrere Behälter, ein Primerpaar, wobei einer der Primer des genannten Paares zu einer zytokinspezifischen Sequenz komplementär ist, wobei genannter Primer aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Sequenzkennzahlen mit den Nummern SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9 besteht, und ein Mittel zum Sichtbarmachen amplifizierter DNA; wobei besagtes Kit für die Bestimmung der Wirksamkeit der genannten Zusammensetzung geeignet ist.
Die Erfindung wird weiterhin anhand des folgenden, tatsächlichen Beispiels dargestellt, das nur zur Veranschaulichung, aber nicht zur Beschränkung der vorliegenden Erfindung auf die besondere Ausführungsform dient.
BEISPIEL 1-Hemmung der Impfstoff-Tumorzellproliferation durch Hapten-Bindung
Tumorzellen wurden aus Biopsieproben von dreizehn Melanom- und neun Eierstockkrebspatienten entnommen. Die Zellen wurden aus der Tumormasse wie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben, isoliert und bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Die Tumorzellen wurden enzymatisch dissoziiert. Eine Zelllinie, die aus Melanomzellen von einem Patienten hergestellt wurde, wurde in dieser Studie auch verwendet. Tumorzellen von jedem Patienten wurden in vier Gruppen eingeteilt: (i) Kontrolltumorzellen; (ii) bestrahlte Tumorzellen; (iii) Haptengebundene Tumorzellen und (iv) bestrahlte, Hapten-gebundene Tumorzellen. Die Zellen der Gruppen (ii) und (iv) wurden bei 2500 cGy bestrahlt. Die Zellen wurden an ein Hapten gebunden, wie in der vorliegenden Beschreibung beschrieben. Die Zellen wurden bei 37°C in Gewebekulturmedium (RPMI-1640 mit entweder fetalem Kälberserum oder gesammeltem menschlichen Serum) in Mikrotiter-Wells für 2-14 Tage wachsen gelassen. Die Wells wurden dann mit ¹²⁵IUDR für vier Stunden gepulst, die Pellets wurden mit einem automatischen Zellharvester gesammelt und die ¹²⁵I-Aufnahme wurde mit einem Gammazähler gemessen. Die Zählimpulse pro Minute für jeden Well entsprechen dem Proliferationsvermögen der Zellen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde das Zellwachstum an unterschiedlichen Tagen gemessen, um sicherzustellen, dass sich die Zellen nicht von den antiproliferativen Wirkungen der Bestrahlung oder des DNP oder von beidem erholten.
TABELLE 1 – HEMMUNG DER IMPFSTOFFZELLPROLIFERATION DURCH BESTRAHLUNG (RT) UND/ODER HAPTENISIERUNG (DNP)

¹Kein Rx – keine Bestrahlung
²RT – Bestrahlung (2500 cGy)
³DNP – Haptenisierung
⁴RT+DNP – Haptenisierung und Bestrahlung (2500 cGy)
⁵Zählimpulse pro Minute (CPM)

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Haptenisierung alleine die Proliferation von Tumorzellen hemmt. Legt man den ¹²⁵IUDR-Assay zu Grunde, dann ist zur Verhinderung der Proliferation tatsächlich eine alleinige Haptenisierung wirksamer als eine Bestrahlung. Dementsprechend kann der erfindungsgemäße Tumorzellimpfstoff hergestellt werden, indem der Bestrahlungsschritt oder irgend ein anderer Schritt zur Verhinderung des Wachstums im Körper des Patienten nach der Injektion weggelassen wird, da die Haptenisierung für das Ergebnis alleine ausreichend ist.

Claims

Zusammensetzung zur Induktion einer Anti-Tumor-Antwort bei einem an einem Tumor leidenden menschlichen Patienten, bestehend aus einer therapeutisch wirksamen Menge von Tumorzellen, welche: (i) an ein Hapten gebunden sind; (ii) von demselben Tumortyp sind wie der Patiententumor, und (iii) für den genannten Patienten nicht allogen sind; wobei durch die Hapten-Bindung die Tumorzellen nicht fähig sind, im Körper des Patienten zu wachsen, und wobei die genannten Tumorzellen nicht gesondert behandelt wurden, um zu erreichen, dass sie nicht fähig sind, im Körper des Patienten zu wachsen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die genannten Tumorzellen vor der Verabreichung nicht bestrahlt wurden.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 bestehend aus einer Höchstzahl von etwa 7,5 × 10⁶ Tumorzellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die genannten Tumorzellen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Melanom-, Lungen-, Darm-, Brust-, Nieren-, Prostata-, Eierstock- und Leukämietumorzellen besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das genannte Hapten aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dinitrophenol, Trinitrophenol, Iodoacetyl-N'-(5-Sulfon-1-Naphthyl)-Ethylen-Diamin, Arsensäure-Benzen-Isothiocyanat, Trinitrobenzensulfonsäure, Sulfanilsäure, Arsanilsäure, Dinitrobenzen-S-Senföl und aus Kombinationen davon besteht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das genannte Hapten Dinitrophenyl ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit einem zusätzlichen Hilfsstoff.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der genannte Hilfsstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Bacillus Calmette-Guerin, QS-21, enttoxifiziertem Endotoxin und einem Cytokin besteht.
Verwendung von einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 für die Herstellung eines Medikamentes zur Induktion einer Anti-Tumor-Antwort bei einem an einem Tumor leidenden Säugetier.
Verfahren zur Herstellung einer zum Wachstum nicht fähigen menschlichen Tumorzelle mit einem Verfahrensschritt zur Bindung der menschlichen Tumorzelle an ein Hapten, wobei durch die Hapten-Bindung die Tumorzellen nicht in der Lage sind zu wachsen, und wobei die genannte menschliche Tumorzelle nicht gesondert behandelt wurde, um zu erreichen, dass sie nicht fähig ist, zu wachsen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die menschliche Tumorzelle nicht bestrahlt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die genannte Tumorzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Melanom-, Lungen-, Darm-, Brust-, Nieren-, Prostata-, Eierstock- und Leukämietumorzelle besteht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die genannte Tumorzelle eine menschliche Melanomzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das genannte Hapten aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Dinitrophenol, Trinitrophenol, Iodoacetyl-N'-(5-Sulfon-1-Naphthyl)-Ethylen-Diamin, Arsensäure-Benzen-Isothiocyanat, Trinitrobenzensulfonsäure, Sulfanilsäure, Arsanilsäure, Dinitrobenzen-S-Senföl und aus Kombinationen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das genannte Hapten Dinitrophenyl ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das genannte Hapten Sulfanilsäure ist.