KR20010041018A - 합텐으로 변형된 종양 세포막, 및 합텐으로 변형된 종양세포막의 제조방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분리된 종양 세포막, 이들의 조성물, 세포막과 조성물을 제조하는 방법, 및 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 합텐으로 변형된 종양 세포로부터 제조된 조성물을 함유한다. 본 발명의 종양 세포막과 조성물은, 전기의 종양세포와 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 포유류에 투여될 때, 포유류의 종양에 침윤하는 T 림프구의 생성, 포유류의 종양에 대하여 염증 면역반응 형성, 및 포유류의 종양에 대하여 지연형-과민증 반응을 형성하는 특징을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 세포막과 조성물은 생체외에서 T 세포를 자극한다. 본 발명의 방법은 치료에 유효한 양의 종양 세포막을 투여하는 것을 포함하는 암 치료에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 합텐으로 변형된 종양 세포막과 세포막을 함유하고 있는 투여형태를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
정부연구비에 대한 참고사항
본 명세서에 기재된 발명은 연구비 번호 CA-39248로, 이는 국립보건원-국립암연구소(National Institutes of Health-National Cancer Institute)의 연구비 또는 재정의 지원하에 수행되었다. 그리하여 미국 정부는 본 발명의 권리를 가지고 있다.
종양세포는 정상 세포에는 존재하지 않는 특이한 항원(tumor specific antigen, 이하 'TSA'라 함)을 가지고 있고, 이러한 항원들에 의한 면역반응이 사람들로 하여금 종양을 극복할 수 있게 한다는 것이 1960년대에 이론화되었다. 그 후, TSA에 의한 면역반응은 세포에 새로운 면역결정기를 도입시켜 증가시킬 수 있다는 것이 제안되었다(참조: Mitchison, Transplant. Proc., 2, 92, 1970). 이러한 "보조 결정기(helper determinant)"로는, 합텐(hapten), 단백질, 바이러스 외피항원(viral coat antigen), 이식항원(transplantation antigen), 또는 이종세포 항원들이 있고, 이들은 종양세포 집단에 도입될 수 있었다. 그리고, 이러한 세포는 변형되지 않은 종양세포의 성장에 내성을 가질 것으로 기대되는 사람에게 투여되었다. 임상적으로, 이는 TSA에 의해 수반되는 면역작용이 증가하여, 그렇지 않았으면 내성을 가졌을 종양세포가 파괴되어 보조 결정기에 대한 면역반응이 일어날 것이라는 희망에서 였다. 또한, 미치슨은(Mitchison, supra) 보조 결정기의 작용방법에 대해, 1) 변형되지 않은 세포가 그들의 성장율이 저하된다든지 또는 면역반응에 대한 감수성이 증가된다든지 하는 측면에서, 단순히 약해지는 방법; 2) 보조 결정기가 단순히 면역반응 시작점을 제공하여 변형된 세포가 TSA를 목표로 하지 않는 다른 면역반응에 의해 죽게되는 방법; 3) 보조 결정기가 항체에 결합하거나 또는 면역을 위해 몸의 특정부분, 특히 림프노드에 세포의 집중화 현상을 촉진시키는 아주반트의 역할을 가지고 있는 경우를 포함하는 몇 가지를 제안하였다.
후지와라(Fujiwara)등은 예를 들어, 트리니트로페닐(trinitrophenyl, 이하 'TNP'라 함) 합텐이 접합되어 있는 종양세포와 같이 합텐를 가지고 있는 특정 종양 세포는, 합텐 특이적인 억제 T 세포가 없을 때 쥐가 합텐에 먼저 감작(sensitized)된다면, 쥐의 변형되지 않은 종양 세포에 대해 전신 면역을 유발할 수 있다고 제시하였다(참조: Fujiwara et al., J. Immunol., 132, 1572, 1984). 처리된 쥐로부터 분리한 비장 세포는 처리되지 않은 수용 동물에서 종양의 생장을 완전히 그리고 정확히 저해하였다. 플러드(Flood)등은 TNP가 접합되어 있고 자외선에 유도되는 "후퇴(regressor)종양"으로 면역된 쥐는, 그렇지 않았으면 면역작용이 일어나지 못했을 TNP가 접합된 "진보(progressor)" 종양에 저항할 수 있다는 것을 보여주었다(참조: Flood et al., J. Immunol., 138, 3573, 1987). 게다가, 이러한 쥐들은 TNP가 접합되지 않은 진보적 종양으로 대항했을 때도 저항성을 가졌다. 또 다른 실험에서, 후지와라(Fujiwara)등은 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide)로 전 처리한 후에, 트리니트로클로로벤젠(trinitrochloro benzene, 이하 'TNCB'라 함)으로 감작된 쥐는 종양세포의 인시츄(in situ) 합텐화에 의해 크기가 큰(10mm) 종양을 치유할 수 있다는 것을 증명하였다(참조: Fujjwara et al., J. Immunol., 133, 510, 1984); 결과적으로, 이러한 동물들은 TNP가 접합되지 않은 종양세포의 대항에 특이적으로 저항할 수 있었다.
후지와라(Fujiwara)등의 연구결과는 다음을 포함하는 몇 가지 이유에서 본 발명과는 다르다: A. 후지와라의 조성물에 사용된 세포는 자연 발생적인 사람의 종양이 아니라, 이식 가능한 쥐의 종양에서 유도된 것이었다; B. 후지와라의 조성물은 면역예방(immunopropylaxis)에 사용되고, 본 발명의 조성물은 면역치료 (immunotherapy)에 사용된다; C. 후지와라의 조성물은 국부적인 치료를 위해 투여되고, 본 발명의 조성물은 전신접종으로 투여된다; D. 후지와라의 조성물은 종양 후퇴를 야기하지 않지만, 본 발명의 조성물은 적어도 처리된 환자의 상당수에 있어 후퇴 및/또는 생존기간을 연장시키는 효과를 가져온다; 및 E. 후지와라는 종양세포를 투여하였는데, 본 발명은 종양 세포막을 투여하였다.
합텐으로 변형되지 않은 조직과 교차반응하는 T 세포의 존재가 최근에 증명되었다. 웰차이엔(Weltzien)과 그의 동료들은 TNP로 변형된 동계(syngeneic)의 림프구로 면역된 쥐에서 유래된 클래스 I MHC-제한적인 T 세포의 클론들이 MHC와 연관되어 있고, 이를 통하여 TNP로 변형된 "자신(self)"의 펩타이드에 반응한다는 것을 보여주었다(참조: Ortmann, B., et al., J. Immunol., 148, 1445, 1992). 게다가, TNP로 변형된 림프구로 면역된 쥐는 생체외에서 TNP로 변형된 세포에 2차적인 세포증식과 세포 독성반응을 나타내는 비장의 T 세포를 발달시킬수 있다는 사실이 확립되었다(참조: Shearer, G.M., Eur. J. Immunol., 4, 527, 1974). DNP 또는 TNP로 변형된 자가유래 세포로 면역하여 생성되는 림프구의 변형되지 않은 자가유래의(autologous) 세포에 반응할 수 있는 가능성은 상당히 흥미가 있는데, 이는 다음 두 가지의 임상적인 문제와 관련되어 있기 때문이다: 1) 약에 의해 유도된 자가면역 질환, 및 2) 암의 면역치료. 전자에 관해서는, 소화된 약이 합텐으로 작용하여, 정상적인 조직 단백질과 결합하여 T 세포에 의해 인지되는 면역원적인 복합체를 형성한다고 제안되었다(참조: Tsutsui, H., et al., J. Immunol., 149, 706, 1992). 결과적으로, 전신 성홍반성낭창(systemic lupus erythematosus)과 같은 자가면역 질환이 발병하여, 약의 효능이 감퇴되거나 사라진 후에도 계속된다. 이는 결과적으로 변형되지 않은 조직과 교차반응하는 T 림프구를 생성한다는 것을 의미한다.
이러한 실험들의 공통분모(common denominator)는 억제세포가 유도되지 않은 환경에서 합텐으로 감작하는 것이다. 사이클로포스파마이드로 전처리되고, TNCB로 감작된 쥐에서 얻어진 비장세포는 예를 들어, 생체외에서 항-TNP 세포독성(anti-TNP cytotoxicity)의 생성을 특이적으로 증가시킴을 뜻하는 방사저항적 (radioresistant)인 "증폭된 보조 기능(amplified helper function)"을 나타낸다. 게다가, 이러한 증폭된 보조제들은 생체외에서 TNP로 접합된 동종의 림프구에 노출되어 일단 활성화되면, 종양항원을 포함하여 관계되어 있지 않은 항원의 세포독성을 증가시킬수 있다(참조: Fujiwara et al., 1984). 플러드 등(1987, supra)은 이러한 증폭된 보조제의 활성은 Lyt-1+, Lyt-2-, L3T4+, I-J+의 표현형을 가진 T 세포에 의해서 매개되며, 이러한 세포들을 역저해세포(contrasuppressor cell)라는 새로운 종류의 면역조절 T 세포라고 제안하였다. 흑색종(melanoma) 환자의 면역치료는 일차적인 항원인 키호올 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)으로 감작하기 3일 전에, 사이클로포스파마이드를 과량(1000mg/M2) 또는 소량(300mg/M2)으로 투여하면 그 항원에 대한 지연형 과민증(delayed type hypersensitivity)의 취득을 현저하게 증가시킨다는 것을 보여주었다(참조: Berd et al., Cancer Res., 42, 4862, 1982; Cancer Res., 44, 1275, 1984). 소량의 사이클로포스파마이드 전처리는 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자에게 자가유래의 흑색종 백신의 주사에 반응하여 자가유래의 흑색종 세포에 대하여 지연형 과민증을 보이는 것을 가능케 하였다(참조: Berd et al., Cancer Res., 46, 2572, 1986; Cancer Invest., 6, 335, 1988). 사이클로포스파마이드의 투여는, 아마도 CD4+, CD45R+억제유도 T 세포(suppressor inducer T cell)를 제거하여(참조: Berd et al., Cancer Res., 48, 1671, 1988), 말초혈액림프구의 비 특이적 T 세포 억제기능을 감소(참조: Berd et al., Cancer Res., 44, 5439, 1984; Cancer Res., 47, 3317, 1987)시키는 결과를 가져온다. 이러한 면역치료 요법의 항 종양 효과는 백신의 접종개시와 종양세포에 대한 지연형 과민증반응의 발달 사이에 과도하게 오랜 시간 차이가 있기 때문에 제한된다(참조: Berd et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 29, 408(#1626), 1988). 그리하여, 백신을 좀 더 면역원성을 지니게 만들어 이러한 백신의 치료효율을 높혀야 할 필요성이 증가되었다.
오늘날 대부분의 종양 면역학자들은 T 림프구와 종양면역을 담당하고 있는 백혈구을 종양 덩어리에 침투시키는 것이 면역체계에 의한 종양파괴의 전제조건이라는 의견에 동의한다. 결과적으로, 국립암연구소(National Cancer Institute, NCI)의 스테판 로젠버그박사에 의해 선도되었던 "TIL"치료로 알려진 것에 대하여 상당한 관심이 집중되었다. 로젠버그 박사와 그 밖의 다른 사람들은 사람의 전이암으로부터 자연적으로 존재하고 있는 소량의 T 림프구를 추출하였고, 이들을 생체외에서 T 림프구의 생장인자인 인터루킨 2(interleukin 2, 이하 'IL-2'라 함)를 첨가시켜 배양하여, 그 수를 상당히 증가시켰다(참조: Topalian et al., J. Clin. Oncol., 6, 839, 1988). 그러나, 이러한 치료법은 주사된 T 세포가 종양이 발생된 장소에만 머물러 있도록 능력이 제한되기 때문에 효율적이지 못하다.
림프구를 비특이적 세포독성 킬러세포로 유도하는 고농도의 IL-2의 능력은 다수의 연구에 있어서 치료적으로 유용하게 사용되었다(참조: Lotze et al., J. Biol. Response, 3, 475, 1982; West et al., New Engl. J. Med., 316, 898, 1987). 그러나, 이러한 접근법은 정맥내 고농도의 IL-2에 의한 심한 독성 때문에 제한이 따른다. 상당한 저농도의 IL-2는 항원에 의해 활성화된(antigen-activated) T 세포의 증폭을 야기시키는 면역적인 아주반트(adjuvant)의 역할을 할 수 있다는 관찰은 주의를 끌지 못했다(참조: Talmadge et al., Cancer Res., 47, 5725, 1987; Meuer et al., Lancet, 1, 15, 1989). 그리하여, 면역적인 아주반트로서 IL-2을 이용하고자 하는데 대한 이해와 노력이 필요하다.
사람의 흑색종은 T 림프구에 의해 인지될 수 있는 특이한 표면항원을 발현한다고 믿어지고 있다(참조: Old, L. J., Cancer Res., 41, 361, 1981; Van der Bruggen, P., et al., Science, 254, 1643, 1991; Mukherji, B., et al., J. Immunol., 136, 1888, 1986; 및 Anichini, A., et al., J. Immunol., 142, 3692, 1989). 그러나, 본 발명자들에 의하여 행하여진 발명 이전의 면역치료적인 접근법은 생체내에서 그러한 항원에 대한 효과적인 T 세포매개 반응을 유도하는데 어려움이 있어 제한되었다.
사람의 종양과 관련된 항원에 대한 내성(tolerance)으로 보이는 것을 설명해주는 몇 가지 제안된 모델이 있는 바, 이들은 다음을 포함한다:
1) 초기의 항-종양 반응을 하향 조절하는 종양 항원-특이적 억제세포(참조: Mukherji, et al., supra; Berendt, M. J. and R. J. North., J. Exp. Med., 151, 69, 1980)
2) 사람 종양세포가 T 헬퍼 세포를 유도해 내거나 또는 전기의 T 세포에 상호자극 (costimulatory)을 제공하지 못함(참조: Fearon, E. R., et al., Cell, 60, 397, 1990; Townsend, S. E. and J. P. Allison, Science, 259, 368, 1993); 및
3) 종양세포 표면에 주요조직적합유전자복합체(major histocompatibility products)의 발현이 감소되어 T 세포에 의해 인지되는 정도가 제한됨(참조: Ruiter, D. J., Seminars in Cancer Biology, 2, 35, 1991). 그러나, 이러한 가설들의 어떠한 것도 임상계통에서 확인되지 않았다.
이러한 설명들이 사실인지 또는 아닌지에 상관없이, 다양한 악성종양을 좀 더 효율적으로 치료하기 위한 필요성이 끊임없이 대두되고 있다.
급성 백혈병(acute myelogenous leukemia, 이하 'AML'이라 함)의 경우, AML을 위한 치료법은 한 두 단계의 초기 유도기와 경화(consolidation), 화학요법 (chemotherapy)으로 알려진 몇 가지의 후기-완화(remission)단계로 나누어진다. 초기의 화학치료 유도는, 이용하는 프로토콜에 따라 환자의 55 내지 88%에서 완전한 반응을 유도한다. 그러나, 이러한 환자들의 대다수가 재발되고, 장기간(5년 +) 생존한 AML환자들은 그 비율이 20 내지 30%이다. 첫 번째 완화기 동안 이를 치료하기 위한 방법으로 고농도의 화학치료제 첨가와 골수이식(bone marrow transplantation)은 결과적으로 약간의 호전을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 이질적인 골수이식을 받은 환자는 5년의 생존기간에서 5 내지 10% 증가된 기간을 갖게 된다. 그러나, 골수이식을 위한 엄밀한 의미의 적격성 판단은(예를 들어, 나이, HLA-matched donor의 존재여부) 치료될 수 있는 환자의 수를 엄격하게 제한한다. 일단 AML환자가 재발되면, 제 2의 완화를 이룰 수 있는 가능성이 단지 30%이고, 이러한 환자들의 극히 소수만이 오랜 기간동안 병이 없는(disease-free) 상태를 유지한다. 재발을 치료하는 방식은 비록, 단일 약품의 고농도 처리와 골수이식이 사용되지만(참조: Keating et al), 1차 완화를 이루기 위해 사용되었던 것과 비슷한 방법(유도 치료를 따르는 몇단계의 경화, 화학요법)을 포함한다.
골수이식을 이용한 실험은 면역적인 거부가 이 질병을 통제하는데 주요한 역할을 한다는 것을 제시하였다. 대숙주이식편질병(Graft-versus-host disease, 이하 'GVHD'라 함)과 재발은 골수이식을 받은 환자들을 죽게 만드는 두가지 주요한 원인이다. 가벼운 GVHD가 발생하면 재발의 위험은 줄어든다(참조: Horowitz et al). 그리하여, 이식된 림프구는 면역적으로 숙주의 백혈병 세포를 거부(graft-versus-leukemia reaction, 대백혈병이식편반응, 이하 'GVL'이라 함)할 수 있을 것이라고 가정되었다. 이러한 GVL반응은 비록, 면역원적인 사람의 백혈병 항원이 아직까지는 발견되지 않았지만(흑색종의 경우도 마찬가지임), 특별한 백혈병 세포 항원에 대한 T 세포의 반응으로 매개될 것이다. 사람의 AML세포는 각각 CD8-및 CD4-에 의해 매개되는 T 세포반응을 유도하는데 필수적인 클래스 I 및 클래스 II 주요조직적합유전자복합체(MHC) 항원을 강하게 발현한다고 알려져 있다(참조: Ashman et al; Andreasen et al). 그러나, 백혈병 세포를 목표로 하는 T 세포의 반응 유도는 성공적이지 못했다.
몇 가지 면역적 접근법이 AML을 치료하기 위해 사용되고 있다(참조: Foon et al; Caron and Scheinberg). 이러한 접근법은 바실러스 칼메트 게린(Bacillus Calmette Guerin, 이하 'BCG'라 함), 인터루킨-2, 레바미솔(levamisole), 결핵결절 바실러스(tubercle bacillus)의 메탄올-추출 잔여물과 같은 비특이적인 것과, 단일항체 및 백신(수확한 백혈병 세포, 무세포추출액 및 배양된 세포)과 같은 특이적인 것으로 나누어진다. 이러한 연구의 대부분은, 면역치료가 잔여 질병을 통제하는데 성공적이었던, 완화단계에 있는 환자에게 행하여졌다.
1960년대 말 및 1970년대 초에, 영국의 세인트 바스로무스 병원(St. Barthlomew's Hospital)의 알 포웰스(R. Powles)의 연구그룹은 화학요법으로 완화를 유도한 후에, AML환자에게 백신을 처리하는 일련의 연구를 수행하였다(참조: Powles, 1974; Powles et al, 1977). 그들은 아주반트로 BCG를 사용하고 동종의 AML세포를 사용하였다. 몇 번의 시도가 행하여졌는데, 이들 모두 시료수(N=10 내지 15)가 작았다. 화학치료만 했을 때에 비해 화학치료 및 면역치료를 혼합하여 사용하면 생존율이 다소 연장되었으나, 재발이 없는 생존(relapse-free survival)은 연장되지 않았다. 심각한 독성은 발견되지 않았다; 자가면역(예를 들어, 정상적이 골수에 대한 독성)이 보여지지 않았다. 뒤돌아 보면, 이러한 시도들과 관련된 수많은 기술적 문제들이 있었다: 1) 자가유래 보다는 동종의 백혈병 세포가 사용되었다; 2) 백신으로 사용된 백혈병 세포의 양이 너무 많았다 (109세포/양); 3) BCG양이 너무 많았고, BCG투여가 백혈병 세포 백신투여의 시간 및 장소와 분리되었다; 4) 환자가 세포독성 약을 투여받고 있는 동안(유지 또는 경화 화학요법, maintenance or consolidation chemotherapy) 백신이 투여되었다.
상기 기재된 치료들의 제한적인 성공에 대한 면역화학적 근거에 대해서는 아직 더 고찰하여야 하지만, 몇 가지 가설들이 검사되고 있다. 김 및 장(1992)은 특별한 항원결정기(epitope)에 대한 T 세포 반응의 결여는 T 세포들의 종류가 없어서가 아니라, 특별한 항원결정기를 만들어 내는데 어려움이 있기 때문이라고 제안하였다. 마틴 등은(1993) 자신의 펩타이드에 대한 낮은 친화성 때문에, 흉선 선별(thymic selection)되지 못한 자가반응(autoreactive) T 세포의 존재를 가정하여 그들의 실험결과를 설명하였다.
사람의 암을 치료하기 위해 행해지는 통상적인 시도들은 성공적이지 못하였다. 전기에서 예시된 바와 같이, 조성물의 투여는 지연형 과민증, T 세포 침윤 (infiltration), 및 염증 면역 반응과 같은 세포매개 면역반응을 유도하는데 실패하였다.
따라서, 암을 치료하는데 있어 면역적 효과가 있다고 제안된 다양한 이론들에 근거한 수많은 시도들에도 불구하고, 포유류에 투여됐을 때, 종양으로 침윤할 수 있는 T 림프구를 형성하고, 종양에 대하여 염증 면역반응을 일으키며, 종양에 대하여 지연형 과민증 반응을 일으킬 수 있는 조성물에 대한 필요성이 대두되었다. 놀라웁게도, 본 발명자들은 동계의 또는 동종의 종양세포로부터 분리된 세포막이 이러한 바람직한 특성을 가지고 있다는 사실을 발견하게 되었다.
발명의 요약
본 발명은 분리된 종양 세포막, 그러한 세포막을 함유하고 있는 조성물, 종양 세포막 및 전기의 세포막을 함유하고 있는 조성물을 분리하고 제조하는 방법, 및 생체외 및 암 치료를 위한 전기 발명품의 사용용도로 구성되어 있다. 합텐으로 변형되어 있는 종양세포막은, 바람직하게는 동계(syngeneic)의 또는 동종 (allogeneic)인 종양세포 원형질막이다. 동계의 종양 세포막은 자가유래 (autologous)일 수 있다. 치료될 수 있는 암으로는 암종(carcinoma) 및 백혈병(예를 들어, 급성 백혈병), 림프종(lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 난소암(ovarian), 결장암(colon), 직장암(rectal), 결장직장암(colorectal), 흑색종, 유방암, 폐암, 신장암, 및 전립선암으로 이루어진 비고체종양(non-solid tumor)을 포함한다.
한편으로, 본 발명은 합텐으로 변형된, 분리된 포유류, 바람직하게는 사람 의 종양세포막에 관한 것이다. 합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl) ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌 산(trinitrobenzene sulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzene isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌 산(trinitrobenzenesulfonic acid), 설파니린 산(sulfanilic acid), 아제닐닌 산(arsanilic acid), 포스포릴콜린(phosphorylcholine), 디니트로벤젠-S-무스타드 (dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택되어진다.
또 다른 관점에서 보면, 본 발명은 합텐으로 변형된 포유류의 종양세포막 단독, 또는 합텐으로 변형된 포유류의 종양세포와의 혼합을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
그외 또 다른 관점에서 보면, 본 발명은 종양세포막과 같은 종류의 악성종양으로 고통받고 있는 포유동물에 투여하기 위해 치료적으로 유용한 양의 포유류, 바람직하게는 사람의 종양세포막을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 관점은, 조성물은 예를 들어, BCG, QS-21, 비독성화된 내독소(detoxified endotoxin) 및 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마 인터페론(IFN-γ), 인터루킨-12, 인터루킨-15 및 GM-CSF와 같은 사이토카인과 같은 아주반트를 함유한다.
본 발명의 세포막과 조성물은, (세포막을 분리해 낸 종양세포와 같은 형의 악성종양으로 고통받고 있는 포유류, 바람직하게는 사람에 투여될 때), 다음과 같은 특징들을 적어도 하나는 가지고 있어야 한다: i) 처리될 포유류의 종양에 침윤할 수 있은 T 세포 형성, ii) 포유류의 종양에 대하여 염증 면역반응 형성, iii) 포유류의 종양에 대하여 지연형-과민증 반응 형성. 본 발명의 세포막과 조성물은 또한 생체외에서 T 세포를 자극시킬 수 있는 특징을 가지고 있어야 한다.
또 다른 관점에서 보면, 본 발명은 종양세포막과 같은 종류의 악성종양으로 고통받고 있는 포유류, 바람직하게는 사람에게 합텐으로 변형된 사람의 종양세포막을 치료에 유효한 양을 포함하고 있는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료에 관한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전기의 포유류, 바람직하게는 사람의 종양에 침윤할 수 있는 특징을 가지고 있는 T 림프구를 형성하는 방법과, 선택적으로는, 전기 포유류의 종양에 침윤하는 T 림프구를 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전기 포유류의 종양에 염증 면역반응을 일으킬 수 있는 방법 및, 선택적으로는, 전기의 염증 면역반응을 측정하는 방법, 또는 전기 포유류의 종양에 대하여 지연형-과민증을 형성하는 방법 및, 선택적으로는, 전기 지연형-과민증 반응을 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생체외에서 T 세포를 자극시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 합텐으로 변형된 종양 세포막을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 인용문헌은 참고문헌에 첨부되어 있으나, 불일치할 경우에는, 본 명세서의 개시내용을 우선으로 한다.
본 발명은 분리된 변형된, 및 변형되지 않은 종양세포막, 그러한 세포막을 함유하는 새로운 조성물, 세포막과 세포막을 함유하는 조성물을 분리하고 제조하는 방법, 및 본 발명의 세포막과 조성물을 사용하는 방법이 명시되어 있다.
본 발명의 세포막과 조성물은 포유류, 바람직하게는 사람의, 전이성 및 1차 암, 고형(solid) 및 직장암, 결장직장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 신장암, 및 전립선암과 같은 비고형(non-solid) 암을 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 분리된 세포막, 조성물 및 치료방법이 제 1, 2, 3 또는 4기의 암, 바람직하게는 제 3기 및 4기, 좀 더 바람직하게는 제 3기의 암을 치료하는데 사용된다. 진행되고 있는 전이성 암을 가지고 있는 포유류, 특히 사람은 본 발명의 세포막, 조성물 및 치료방법으로 처리될 수 있다. 일 실시태양으로, 본 발명은 예를 들어, 고양이, 개, 말 및 소와 같이 사육되는 동물에게 사용된다.
본 발명의 세포막과 조성물은 또한 포유류 종양에 침윤할 수 있는 특징을 가지고 있는 T 세포의 형성, 포유류 종양에 대하여 염증 면역반응 형성, 포유류 종양에 대하여 지연형-과민증 반응형성 및/또는 생체외에서 T 림프구를 자극하는데 사용된다.
분리된 종양세포의 용도와 관련하여, 본 명세서의 어떠한 내용도 다른 종양세포막의 사용 또는 종양세포와 종양 세포막을 혼합하여 사용하는 경우에 동일하게 적용될 수 있음이 숙지되어야 한다.
종양 세포막 및 이들의 조성물
본 발명의 분리된, 변형된 종양세포막은 포유류, 바람직하게는 사람의 종양 세포로부터 제조된다. 본 발명의 일 실시태양에서, 종양 세포막은 고양이, 개, 말 또는 소의 종양으로보터 분리된다.
본 발명의 목적을 위하여, 종양세포의 정의안에는 전체가 완전한 및 분쇄된 세포를 포함된다. 세포막의 분리를 위한 종양세포는 살아 있는, 약독화된 (attenuated), 또는 죽은 세포다. 본 발명은 실험 대상자에 실질적으로 생장이 일어나지 않도록 투여한 후에, 얻어진 생장과 분열이 일어나지 않는 종양세포를 사용하였다. 그러한 세포들은 환자에게 단독으로 또는 분리된 종양 세포막과 혼합하여 투여할 때 바람직하다. "생장이 없는 상태의 세포"(cells in a state of no growth)라는 것은 생체내에서 분열되지 않는 살아 있는, 약독화된 또는 죽어 있는, 전체가 완전한 또는 분쇄된(또는 전체지만 분쇄되어 있는) 세포를 의미한다. 생장이 없는 상태의 세포부유물을 만드는 통상적인 방법은 당업자들에게 알려져 있고 본 발명에 있어 유용하다. 예를 들어, 세포가 생장 및 분열하지 못하도록, 세포를 사용하기 전에 방사선을 조사한다. 종양세포는 예를 들어, 2500 R로 방사선 조사하여, 투여한 후에 세포가 생장하지 못하도록 할 수 있다. 또 다른 방법으로, 종양 세포막은 생체내에서 생장 및 분열할 수 있는 종양세포로부터 분리한다. 그런 경우, 바람직하게는, 종양세포막 준비는 생체내에서 분열할 수 있는 종양세포로 오염되지 않아야 한다.
종양세포막은 치료하고자 하는 암과 같은 종류의 종양 세포로부터 분리된다. 예를 들어, 난소암을 치료하기 위해 사용되는 세포막은 난소암 세포로부터 분리된다. 바람직하게는, 종양세포는 치료되어야 할 사람과 동일한 실험대상자로부터 유래된다. 종양 세포는 바람직하게는 동계(syngeneic)이다(예를 들어, 자가유래의). 그러나 또한 실험 대상자에 대해 동종(allogeneic)일 수도 있다. "동계"라고 정의할 때는, 종양세포는 처리될 환자의 종양세포 또는 비종양 체세포와 유전학적으로 완전히(100%) 동일할 필요가 없다. 일반적으로, 종양세포(세포막이 분리될)와 환자 사이에 MHC분자의 유전학적 동일성이면 충분하다. 게다가, 세포막을 분리한 종양세포의 특별한 항원과 환자의 종양세포에 존재하는 항원 사이에는 유전적인 동일성이 있을지도 모른다. 유전적 동일성은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정된다. 또한, 동계의 종양세포는 유전적으로 변형(예를 들어, 재조합 DNA 기술)되어 예를 들어, 환자의 특이한 MHC분자 및/또는 환자의 암 세포의 특이한 항원과 유전적으로 동일해진 세포를 의미한다. 예를 들어, 동종(allogeneic) 세포처럼, 유전적으로는 다르나 동일종의 동물로부터 얻어진 종양세포을 본 발명의 종양 세포막을 제조하는데 사용할 수 있다. 종양세포는 생검 표본으로부터 분리한 세포일 수도 있고 또는 조직 배양으로부터 분리한 것일 수도 있는데, 이에 제한되지는 않는다.
종양 세포막은 외막(outer membrane), 핵막(nuclear membrane), 미토콘드리아막(mitochondria membrane), 액포막(vacuole membrane), 소포체막(endoplasmic reticular membrane), 골지 복합체막(Golgi complex membrane), 라이소좀 막(lysosome membrane)과 같은 모든 세포막을 포함한다. 본 발명의 일 실시태양에서는 세포막의 50% 이상이 종양세포 원형질막이다. 바람직하게는, 세포막의 60%이상이 종양세포 원형질막으로 구성되어야 하고, 좀 더 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이다.
바람직하게는, 분리된 세포막은 대체로 핵과 세포가 없다. 예를 들어, 세포막 물질로 2x108세포 등가물를 사용할 때, 세포 및/또는 핵이 100개 이하로 들어 있으면 세포막 제조는 대체로 핵 또는 세포가 없는 상태이다. 세포 등가물(cell equivalent, 이하 'c.e.'라 함)은 제시한 세포수로부터 분리된 세포막의 양이다. 대체로 세포 및/또는 핵이 없이 분리된 종양 세포막은 림프구 및/또는 림프구 막을 함유하고 있다.
바람직하게는, 분리된 종양 세포막은 예를 들어, 종양세포 원형질막과 같은 세포 외막이다. 본 발명에 의한 세포막 제조물은 전체 외막 또는 이들의 분획 (fraction)을 함유하고 있다. 세포 외막의 분획을 함유하고 있는 본 발명의 분리된 세포막은, 적어도 그 외막의 MHC 분획 및 /또는 열 충격 단백질 분획을 함유하고 있다. 세포막 파편의 크기는 중요하지 않다.
동종의 종양 세포막은 본 발명의 방법에서 동계(예를 들어, 자가 유래의)의 항원제시 세포와 함께 사용된다. 이러한 접근법은 환자 자신의 종양 이외에 다른 출처로부터 유래된 종양 세포막으로 환자를 면역시킬 수 있도록 한다. 동계의 항원제시 세포는, 동종의 세포막을 처리하여 환자의 세포매개 면역 체계가 그것들에 반응을 하게 한다.
종양 세포뿐만 아니라 분리된 종양 세포막은 예를 들어, 합텐으로 변형된다. 이러한 변형된 종양 세포막(및 종양 세포)은 적어도 다음과 같은 특징을 하나는 가지고 있다: (i) 처리될 포유류의 종양에 침윤하는 T 림프구 생성, (ii) 포유류의 종양에 대한 염증 면역반응의 형성, 및 (iii) 포유류의 종양에 대하여 지연형-과민증 반응 형성. 변형된 종양 세포막과 세포는 또한 생체외에서 T 세포를 자극할 수 있는 특징을 가지고 있다.
본 명세서에 제시된 종양 세포막(변형된 또는 변형되지 않은)은 예를 들어, 희석제에 부유된 세포막, 세포막 침전물(pellet), 또는 동결된 또는 동결건조된 세포막과 같은 방법으로 보관되거나 투여되는 어떠한 형태도 다 포함한다.
본 발명의 세포막은 본 발명의 방법에 의해 단독으로 또는 본 발명의 다른 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 화합물을 포함하여 혼합하여 사용된다. 따라서, 종양세포 및 종양 세포막은 단독으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는, 동시투여는 같이 투여하는 것 및 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 게다가, 종양세포와 종양 세포막은 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마 인터페론, 인터페론-12, 인터페론-15 및 GM-CSF와 같은 사이토카인과 같은 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않은 다른 화합물을 포함하여 동시 투여될 수 있다. 본 발명의 종양세포 및 종양 세포막은 화학치료, 방사선 조사, 항체, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 암 치료방법과 연결하여 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 암치료를 하는데 단독으로도 유용하게 사용할 수 있어 다른 부가적인 치료가 필요치 않다는 장점을 가지고 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명에 의하여(변형된 또는 변형되지 않은) 분리된 종양 세포막과 약제학적으로 허용되는 담체나 행크스액, 식염수, 인산완충 식염수, 자당 용액, 및 물을 포함하나 이에 제한되지 않는 희석제를 포함한다. 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 담체는 투여하고자 하는 경로 및 일반적인 약제학적 관행을 고려하여 선택되어진다. 유효성분의 담체에 대한 비례비는 일반적으로 고려된 사용량 뿐만 아니라, 조성물의 화학적 특성, 용해도 및 안정성에 의존하고, 당업계에 알려진 일반적인 방법을 사용하여 최적화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 분리된 종양 세포막의 효과적인 양을 포함하는 백신 조성물이다. 이러한 개시를 위해서, "효과적인 양"(effective amount)은 원하는 결과를 이룰 수 있는데 필요한 양이다. 예를 들어, 암을 치료하는 방법에 있어서, "효과적인 양"이란 적어도 다음과 같은 특징을 발생시킬 수 있는 분리된 변형되어진 종양 세포막의 양을 의미한다: (i) 종양으로 침투할 수 있는 T 림프구 형성, (ii) 종양에 대하여 염증반응 유도, (iii) 종양에 대하여 지연형-과민증 반응 유도, 및 (iv) 종양 후퇴. 비슷하게, 생체외에서 T 세포를 자극시키기 위한 방법에서는, "효과적인 양"은 T 세포를 자극할 수 있는 세포막의 양이다.
백신 조성물은 예를 들어, 도스(dose)당 적어도 104c.e.의 분리된 세포막을, 바람직하게는 적어도 105c.e., 및 가장 바람직하게는 적어도 106c.e을 함유한다. 투여량은 1회 투여를 위해 투여되는 백신 조성물의 양이다. 일 실시태양에서, 백신 조성물은 1회 투여당 105내지 2.5x107c.e.의 세포막을 함유하고, 보다 바랍직하게는 약 5x106c.e.를 포함한다. 본 발명의 종양세포와 종양 세포막의 사용량은 일반적으로 암 세포에 대한 조성물의 친화도, 존재하는 암 세포양 및 조성물의 수용성과 같은 요소에 의존한다. 투여량은 환자의 체중 및 임상적 상태를 고려하여 결정된다.
본 발명의 백신 조성물은 피내, 정맥내, 복강내, 근육내, 및 피하투여에 적당한 투여량으로 포장되어진다. 또 다른 방법으로, 투여형태는 투여시, 예를 들어, 희석제에 재구성될 수 있는 분리된 종양 세포막을 포함할 수도 있다.
합텐
본 발명의 종양세포와 종양 세포막은 변형되거나, 변형되지 않은 종양세포, 또는 변형된 종양세포, 변형되지 않은 종양세포 및 종양 세포막을 혼합하여 사용한다. 본 발명의 목적을 위해서, 변형된 것은 합텐으로 변형된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 단독으로는 면역반응을 유도하지 못하는(그러나, 다른 분자에 연결되거나 또는 부착되었을 때 그 분자에 대하여 면역반응을 향상시킬 수 있는) 어떠한 작은 분자들도 합텐으로 작용할 수 있다. 일반적으로, 합텐으로 사용되는 분자는 분자량이 1000MW 보다는 작아야 한다.
당업계에는 다음과 같은 다양한 종류의 합텐이 알려져 있다: TNP(참조: Kempkes et al., J. Immunol., 147:2467, 1991); 포스포릴콜린(phosphorylcholine, 참조: Jang et al., Eur. J. Immunol., 21:1303, 1991); 니켈(참조: Pistoor et al., J. Invest. Dermatol., 105:92, 1995); 비산염(arsenate, 참조: Nalefski and Rao, J. Immunol., 150:3806, 1993)
일반적으로, 본 발명의 용도에 적당한 합텐은 친수성 아미노산(예를 들어 라이신, lysine)에 결합할 수 있는 특징을 가지고 있다. 합텐은 라이신의 ε-아미노 그룹 또는 카르복시 그룹을 통해 세포에 연결된다. 부가적으로, 타이로신 및 히스티딘과 같은 소수성 아미노산에 디아자커플링(diaza coupling)으로 연결된 합텐 또한 사용된다. 본 발명의 용도에 적당한 합텐의 예는 다음과 같다: 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl) ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌 산 (trinitrobenzene sulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzene isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 포스포릴콜린(phosphorylcholine), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid), 디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 혼합물. 일단 본 발명의 개시 내용을 숙지하면, 당업자들은 본 발명의 용도를 위한 합텐을 선택할 수 있다. 예를 들어, 지연형 과민증을 사용해서 합텐은 일반적으로 검사된다.
아주반트(adjuvant)
바람직한 일 실시태양에서, 종양세포와 종양 세포막은 면역적인 아주반트와 함께 투여된다. 아주반트는 합텐으로 변형된 종양세포 및 세포막에 대한 면역반응을 증가시킬 수 있는 특징을 가지고 있다. 아주반트의 대표적인 예로는, 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-Guerin), BCG, 또는 합성적인 아주반트, 퀼라자 사모나리아(Quillaja saponaria)의 나무껍질로부터 정제된 사포닌을 포함하는 QS-21, 코리네박테리아 파범(Corynebacterium parvum. 참조: McCune et al., Cancer, 43:1619, 1979), 일반적인 사포닌, 비독성화된 내독소 및 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마 인터페론, 인터페론-12, 인터페론-15, GM-CSF 및 이들의 혼합물과 같은 사이토카인이 있다.
아주반트는 최적화될 수 있는바, 당업자들은 사용할 최적의 아주반트를 결정하기 위해 일반적인 실험을 사용할 수도 있다.
본 발명의 종양 세포막을 제조하는 방법
본 발명에 사용할 종양세포는 다음과 같이 제조된다. 종양은 버드 등과 (1986), 사또 등(1997), 미국 특허 제 5,290,551호, 및 미국 출원 제 08/203,004호, 제 08/479,016호, 제 08/899,905호, 제 08/942,794호, 또는 PCT출원 PCT/US96/09511에 기재된 방법에 의해 처리되는데, 이들의 전체는 본 명세서에 첨부된 참고문헌에 기재되어 있다. 간단히, 세포는 콜라겐 가수분해 효소 및 DNA 가수분해 효소를 사용한 효소적 분해, 믹서기를 이용하는 기계적 분해, 쪽집게를 사용하거나 막자사발과 막자를 이용하며, 칼날을 사용하여 작은 조각으로 자르거나, 또는 이와 유사한 방법에 의해 분해하여 추출된다. 액체종양에 대해서는, 혈액 또는 골수 시료를 채취하여 밀도구배 원심분리에 의해 종양 세포를 분리한다.
종양 세포막은 종양세포를 예를 들어, 저농도 충격(hypotonic shock), 기계적 해리 및 효소적 분해에 의해 파쇄하고, 다양한 세포 구성물을 원심분리로 분리하여 준비된다. 간단하게, 다음과 같은 단계가 이용된다: 종양세포의 분쇄, 분쇄된 종양 세포로부터 핵이 제거된 종양세포를 얻기 위해 핵 제거, 세포와 핵이 제거된 충분히 순수한 세포막 수득, 합텐으로 변형된 종양 세포막을 얻기 위해 합텐을 종양 세포막에 처리한다. 세포막 분리는 하케 등의 방법에 따라서 수행된다.
본 발명의 일 실시태양에서, 완전한 세포와 핵은 현미경 관찰시, 핵과 세포가 없어질 때까지 연속적인 원심분리를 하여 제거된다. 예를 들어, 분쇄된 세포는 , 대략 500 내지 2000g의 낮은 속도로 5분간 원심분리한다. 분리과정은 2x108세포 등가물에 해당되는 세포막에 대하여 약 100개 미만의 세포 및/또는 핵이 남아 있도록 수행된다. 세포막을 함유한 핵이 제거된 상등액은 예를 들어, 100,000g 에서 약 90분 원심분리하여 침전한다. 침전물은 전체 세포막을 함유한다. 세포막은 예를 들어, 약 8%의 자당, 5mM Tris, pH 7.6에 재부유시키고 사용할 때까지 -80℃에서 동결한다. 어떠한 희석제도, 바람직하게는 안정제로 작용하는 희석제가 사용될 수 있다. 세포막 조제(대략 6x107c.e.의 세포막)의 질을 위해 정기적으로 배양한다. 세포 콜로니는 발생하지 않고 세포 또는 핵이 광학 현미경으로 관찰되지 않아야 한다.
준비된 세포 또는 세포막을 DNP 또는 다른 합텐으로 변형하는 것은 예를 들어 참조에 기재되어 있는 밀러와 클래만의 방법(참조: Miller and Claman, J. Immunol., 117, 1519, 1976)과 같은 알려진 방법으로 수행하는데, 이는 무균 조건에서 합텐을 종양세포 또는 세포막과 30분간 배양하고, 멸균한 식염수로 세척하는 것을 포함한다. 합텐-변형화는 단클론 항-합텐 항체를 이용한 유동세포계측법 (flow cytometry)을 사용하여 확인한다.
분해된 세포 또는 분리된 세포막은 본 상태로 사용되거나 또는, 필요할 때까지 냉각 속도를 조절할 수 있는 동결기 또는 액체 질소에 동결하여 저장한다. 세포 및 세포막은 용해되자마자 사용할 수 있다. 바람직하게는, 세포 또는 세포막은 환자에게 투여되기 직전에 용해한다. 예를 들어, 환자에게 피부 검사를 하거나 또는 처리하는 당일, 세포 또는 세포막을 용해한다. 선택적으로, 세포 또는 세포막은 세척하고, 선택적으로는 2500R로 방사선 조사한다. 이들을 다시 세척하고 페놀레드가 없는 행크스액에 부유시킨다.
동종(allogeneic)의 종양 세포막은 전기에 기술한 바와 같이 준비한다. 그러나, 환자에게 투여하기 전에, 이들을 자가 항원제시 세포(syngeneic antigen presenting cell)와 함께 배양한다. 자가의 항원제시 세포는 동종의 세포막을 처리하여 환자의 세포매개 면역체계가 그 세포막에 반응하게 한다. 이러한 접근은 환자 자신의 종양이외에 다른 출처로부터 유래된 종양 세포막으로 환자를 면역할 수 있게 한다. 동종의 종양 세포막은 수시간 내지 수일의 다양한 시간동안 항원 제시 세포와 배양한다. 그 다음에 세포막이 표지된 항원제시 세포를 세척하여 환자에게 주사한다.
항원제시 세포는 그라베 등(1995) 및 시에나 등(1995)의 방법을 포함하는 다양한 방법으로 준비된다. 간단히, 혈액은 면역될 환자로부터 예를 들어, 정맥 천자(venipuncture)로 획득한다. 다른 방법으로는 골수를 얻는다. 다른 방법으로는 백혈구분리반출법(leukapheresis)에 의해 백혈구를 얻는다. 이러한 출처의 어떤 것으로부터, 단핵 백혈구는 구배 원심분리를 하여 얻어진다. 백혈구는 항원 CD34에 대한 단클론 항체에 의한 양성선택에 의해 더 정제된다.
분리된 백혈구는 조직배양 배지(예를 들어, 소의 태아 혈청(fetal calf serum), 모아진 사람 혈청(pooled human serum), 또는 자가 혈청과 같은 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지)에 배양하고 확장한다. 다른 방법으로는, 혈청이 없는 배지가 사용된다. 항원제시 세포의 생장을 자극하기 위해, 사이토카인이 배양 배지에 첨가된다. 사이토카인은 과립구 거식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, 이하 'GM-CSF'라 함), 인터루킨-4, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, 이하 'TNF'라 함), 인터루킨-3, FLT3 리간드 및 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, 이하 'G-CSF'라 함)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
분리하여 배양해서 증식된 항원제시 세포는 예를 들어, 수상세포(dendritic cell), 단구(monocyte), 거식세포, 및 랑게르한스 세포로 특징되어진다.
종양 세포막 및 조성물을 사용하는 방법
암치료하는 방법
본 발명은 암으로 진단되었거나 또는 암으로 예견되받고 있는 포유류, 바람직하게는 사람을 약제학적으로 허용되는 양의 합텐으로 변형된 종양 세포막, 합텐으로 변형된 종양세포, 또는 이들의 혼합물의 투여에 의한 치료방법에 관한 것이다. 세포막 및/또는 세포는 면역적인 아주반트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합한다. 소량의 사이클로포스파마이드 또는 소량의 다른 화학치료제가 약제학적으로 허용되는 양으로 조성물을 투여하기 전에 투여될 수 있다. 합텐화된 조성물을 투여한 후, 선택적으로 비합텐화된 종양세포 또는 종양 세포막을 약제학적으로 허용되는 양으로 투여할 수 있다. 비합텐화된 조성물은 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다.
전이성 및 1차 암 및, 고체 및 비고체 암을 포함한 어떠한 악성 종양도 본 발명에 따라서 처리된다. 고체성 종양은 암종(carcinoma)을 포함하고, 비고체 종양은 혈액학적 종양을 포함한다. 암종은 선암(adenocarcinoma) 및 상피성 암(epithelial carcinoma)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 혈액학적 종양은 백혈병, 림프종(lymphoma), 및 다발성 골수종을 포함한다. 다음은 본 발명의 방법에 의해 분리되어 변형된 종양 세포막으로 처리될 수 있는 제한되지 않는 암의 예를 나타낸 것이다: 진행된 난소암을 포함한 난소암, 급성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지 않는 백혈병, 간, 직장, 결장직장, 흑색종, 유방암, 폐암, 신장암, 및 전립선암으로 전이된 결장암을 포함한 결장암. 난소암은 선암 또는 상피성 암이고,결장 및 전립선암은 선암이다. 백혈병은 척수성 골수 또는 림프관에서 유래된다. 백혈병은 발달 초기 단계에서 성숙이 정지되는 특징을 나타내는 급성, 및 성숙한 림프구 또는 골수성 세포가 과량 증가된 특징을 나타내는 만성이 있다. I, II, III, 또는 IV기의, 바람직하게는 III, IV기, 좀 더 바람직하게는 III기의 암은 본 발명에 따라서 치료된다.
진행되는 형태의 전기의 전이성 암을 가지고 있는 포유류, 특히 사람은 본 발명의 세포막, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는, 가축에 처리하였다.
본 발명의 백신 조성물을 투여하기 전에, 환자는 종양세포와 세포막을 변형시키는데 사용된 합텐을 피부에 접종하여 면역시킨다. 예를 들어, 전기 합텐으로 디니트로플로로벤젠(dinitrofluorobenzene)이 사용된다. 그후(예를 들어, 약 2주 후에), 환자는 종양 세포막 조성물로 주사된다. 조성물은 전체적으로 적어도 3번, 바람직하게는 적어도 6번 재주사를 투여된다. 일 실시태양에서, 전체 투여되는 횟수(초기 투여를 포함하여)는 8번이고, 또 다른 실시태양에서는 10번이다. 접종 계획은 담당의사가 각각의 환자상태를 고려하여 계획한다. 백신 접종은 예를 들어 2주 마다, 바람직하게는 매주마다 이루어진다. 추가백신도 접종될 수 있다. 바람직하게는, 단일 또는 2개의 추가백신이 투여된다. 전기백신은 예를 들어, 최초 투여 후 약 6개월 또는 1년후에 투여한다.
환자에 대한 면역반응은 약으로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide, CY)는 매번 백신을 투여하기 전에 투여된다.
본 발명은 통상적인 암 치료 방법인 수술에도 사용된다. 난소암 같은 고체 종양의 경우에, 종양은 최적으로 또는 부분적 최적으로 제거된다. 최적의 제거는 종양을 제거하여 처리받을 환자에 있어서 오직 작은 종양 덩어리가 남아 있는 것을 일컫는다. 부분적으로 최적인 제거는 종양을 제거하였어도 환자에게 크기가 큰 덩어리가 남아있는 상태를 언급한다. 비고체 종양의 경우에는, 적당한 혈액 또는 골수 시료를 수집하고, 본 명세서에 첨부된 참고문헌에 제시된 어떠한 방법을 이용하여 암 세포를 분리한다. 제거된 종양 또는 수집된 종양세포는 전기의 기술한 종양 세포막을 제조하는 데 사용된다.
종양 세포막은 예를 들어, 피내(intradermal), 정맥내, 복강내, 근육내, 및 피하 주사와 같은 접종 및 주사를 포함한 적당한 경로를 통해 투여된다. 각각의 백신 처리에 대한 많은 투여경로가 있다. 예를 들어, 백신 조성물을 피내 주사로 적어도 2번, 바람직하게는 3번을 인접한 부위에 투여한다. 본 발명의 일 실시태양에서는, 백신 조성물은 팔의 또는 다리의 상단에 투여된다.
백신의 효율성은 다양한 생물학적인 반응 조절인자를 투여하여 향상시킬 수 있다. 이러한 제제는 직접적으로 또는 간접적으로 면역반응을 자극함으로써 작용한다. 본 발명의 생물학적인 반응 조절인자는 IL-12,IL-15 및 감마 인터페론을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일실시태양에서, IL-12는 각각의 백신 접종 후에 투여되었다. 염증반응을 나타내는 환자에게 IL-12를 투여하면, 종양집단에 있는 T 림프구를 증식시키고 더욱 더 활성을 갖게 한다. T 세포수와 기능적인 능력의 증가는 종양의 면역적인 파괴 및 후퇴에 이르게 한다.
사람의 암 백신은 수많은 연구자들에 의해 개발되고 실험되었다. 비록 이러한 백신들이 때때로 환자의 암에 대해서 약한 면역을 유도하지만, 이들이 종양 후퇴를 야기시키거나 생존율을 증가시키지는 못한다. 본 발명의 백신이 놀랄만한 염증 반응을 보인다는 증거가 발견되었고, 현미경상으로 T 세포의 침윤도 관찰되었다. 따라서, 염증반응 및 림프구의 수적증가와 같은 이러한 접근은 이 분야에 있어서는 상당히 진보적인 것이다. 그리하여, 본 발명은 또한 적어도 다음과 같은 특징을 하나는 가지는 T 세포를 생성할 수 있는 방법을 제공한다: (i) 처리될 포유류의 종양에 침윤하는 T 림프구의 생성, (ii) 포유류의 종양에 대하여 염증면역 반응 야기, 및 (iii) 투여될 때 포유류의 종양에 대하여 지연형 과민증 반응 야기.
T 세포를 자극하는 방법
분리한 종양 세포막은 생체외에서 T 세포를 자극하는 데 사용된다. 이러한 분석방법은 예를 들어, 특정한 종양 세포막을 사용하는 치료법이 성공적인지를 평가하는데 사용될 수 있다. 이 분석방법에 사용되는 T 세포는 사람의 경우에 기술된 방법에 따라서 얻어질 수 있는데, 이는 또한 포유류의 따른 어떠한 종류에도 적용될 수 있다.
T 세포는 어떤 종류의 암으로 진단되어진 환자에게 합텐으로 변형된 종양세포, 종양 세포막, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 약제학적으로 허용되는 양으로 투여하므로써 생성된다. 조성물은 선택적으로 면역적인 아주반트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고 있다. 소량의 사이클로포스파마이드 또는 멜팔란(melphalan)을 포함하나 이에 제한되지 않은 또 다른 소량의 화학치료제를 약제학적으로 허용되는 양으로 즉, 약 5 내지 10mg/M2을 선택적으로 첫 번째 종양세포 조성물을 투여하기 전에 투여한다. 합텐화된 조성물을 투여한 후, 선택적으로 비합텐화된 세포막, 종양세포 또는 이들의 혼합물을 함유하는 비합텐화된 백신 조성물을 약제학적으로 허용되는 양으로 투여할 수 있다. 비합텐화된 조성물은 본 발명의 방법에 따라서 투여된다.
말초혈관 림프구(peripheral blood lymphocyte, 이하 'PBL'라 함)은 합텐으로 변형된 자가 유래의 세포 또는 세포막을 투여한 후에 강한 지연형 과민증(DTH)을 보이는 환자로부터 얻어진다. DTH반응의 크기는 바람직하게는 지름이 10mm이고, 가장 바람직하게는 10mm 보다 더 크다. 합텐으로 변형된 암 세포를 이용하여 반복적으로 자극하여 PBL로부터 T 세포주가 확립되었다. T 세포는 단일 부유세포 , 여과, 단구 제거 및 특정한 T 세포 수용체(T cell receptor, 이하 'TCR'라 함) 종류를 발현하는 소그룹(subset)을 T 세포 수용체-아형(TCR-subtype)-특이적 항체, IL-2의 존재 및/또는 초항원(superantigen)의 존재하에 그 수를 증가시켜 분리하는 것과 같이 당업계에 널리 알려진 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 사용하고자 하는 T 세포는 이미 그 T 세포가 풍부하여 존재하는 종양의 침윤액으로보터 얻을 수 있기 때문에 생체내에서 그 수가 증가될 수 있다.
변형된 종양세포와 종양 세포막 각각은 T 세포를 자극할 수 있는 특징을 가지고 있다. 본 발명의 목적을 위한 "자극(stimulation)"은 생체외에서 T 세포에 의한 사이토카인의 생성뿐만 아니라, T 세포의 증식을 유도함을 의미한다. 종양 세포막과 종양세포 각각은 독립적으로 T 세포를 자극하는 능력을 가지고 있다. T 세포의 증식은3H thymidine,125IUDR(iododeoxyuridine)를 포함하나 이에 제한되지 않는 변형된 뉴클레오타이드; 및, 살아 있는 세포를 염색하는 3-(4,5-디메틸티아졸 -2-일)-2,5-디페닐테트라졸리윰브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)와 같은 염색제의 T 세포에 의한 섭취를 측정하므로써 측정할 수 있다. 게다가, 인터페론 감마, 종양 괴사인자, 및 인터루킨-2를 포함하나 이에 제한되지 않은 사이토카인의 생성은 T 세포 증식을 나타내는데 유용한다. 사이토카인의 생성은 당업계에 잘 알려진 검사방법을 이용하여 측정할 수 있다. 사이토카인 생성은 보통으로 존재하는 수준을 능가해야 하는데, 일반적으로는 25pg/ml 이상이어야 하고, 바람직하게는 100pg/ml이상이어야 한다.
T 세포는 작동자(effector) 및 조절자(regulator)로서 단백질을 분비하고(림포카인), 다른 세포를 죽이는(세포독성) 2 종류의 면역기능을 매개하는 림프구이다. 작동 기능은 지연형 과민증, 동종이식편거절반응(allograft rejection), 종양 면역, 및 대숙주이식편반응(graft-versus-host reactivity)과 같은 반응을 포함한다. 림포카인 생성과 세포독성은 T 세포의 작동기능에 의해 나타나는 것이다. T 세포의 조절기능은 다른 T 세포에 의한 세포-매개 세포독성을 증대하는 능력과 B 세포에 의한 임뮤노글로불린 생산을 증가시킬 수 있는 능력에 의해 나타난다. 조절기능은 또한 림포카인의 생성을 요구한다. T 세포는 마이토젠, 항원, 또는 렉틴을 포함하나 이에 제한되지 않은 자극에 반응하여 감마 인터페론을 생산한다.
본 발명의 일ㅍ실시태양에서, T 세포주는 다음과 같이 변형된다. PBL (1x106)을 자가유래의 DNP가 접합된 B 림프블라스트 세포(1x105)와 함께 배양 배지가 첨가된 24웰 플랫 플레이트에 혼합한다. 배양 7일 후에, 100U/ml의 IL-2 (Cetus Oncology, Emeryville, CA)을 첨가한다. 확장된 T 세포는 IL-2가 첨가된 배지에서 증식시키고, 필요시 22mm 지름을 가진 웰에 약 2x106세포의 농도로 유지하기 위해 세포를 떼어내어 나누어 준다. 매 14일에, 배양 세포를 자가유래의 DNP가 접합된 B 림포아세포를 첨가하여 재자극시킨다. 표현형은 단일클론 항체 패널을 사용하는 세포 형광측정법(Becton-Dickinson, San Jose, CA)으로 결정한다. CD8+및 CD4+T 세포의 분리는 항-CD8 또는 항-CD4 단일클론 항체로 코팅된 T 세포를 와이소키(Wysocki)의 방법에 따라 일반적인 기술을 사용하는 항-항체로 코팅된 배양 접시에 부착시키는 간접적인 방법으로 수행한다(참조: Wysocki, L. J. and V. L. Sato, Pro. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 2844, 1978); 부착된 세포는 분리하여 흑색종 세포 및 베타 림포아세포; 및 IL-2를 포함하나, 이에 제한되지 않은 DNP로 변형된 촉진제로 증식시킨다.
예를 들어, 2x105의 방사선 조사된 동종의 피더(feeder) 세포, 200U/ml IL-2, 및 피토헤마글루티닌을 함유하는 림프구 배양 배지를 둥근 바닥을 가진 마이크로타이터 웰에 제한적인 희석으로 배양하여 표현형적으로 균일한 T 세포의 소집단이 얻어진다. 림프구 콜로니가 자라는 웰을 DNP로 접합된 B 림포아세포에 반응하여 증식할 수 있는 능력에 대해서 선별된다. 양성적인 웰은 IL-2를 넣어 확장하고, 매 14일에 자가유래의 DNP로 접합된 B 림포아세포로 재자극한다.
말초혈액 림프구(PBL)은 반응 세포로서 검사된다. 이들을 림프구 배양 배지 (RPMI1640, 10% 사람의 AB 혈청, 인슐린-트랜스페린-셀레나이트 배지 보조제(Sigma Chemical Co.), 2mM L-글루타민(L-glutamine), 1% 비필수 아미노산, 25mM 허피스 완충 용액, 페니실린+스트렙토마이신)에 부유시키고 바닥이 둥근 96웰 플레이트에 1x105세포/웰로 첨가한다. 1) 자가유래 또는 동종의 PBL, 2) 엡스타인-바 바이러스로 트랜스펙션하여 만들어지는 자가유래 또는 동종의 B 림포아 세포주, 3) 자가유래의 배양된 흑색종 세포를 방사선 조사(5000R)에 의해 불활성화된 것을 포함하는 자극제 세포가 또한 첨가된다. 대부분의 실험에서, 반응제: 자극제 비율은 바람직하게는 1:1이다. 플레이트를 37℃, CO2배양기에서 5일 배양한다; 그리고 나서 웰을125I-labeled IUDR(ICN Radiochemical, Costa Mesa, CA)로 6시간 처리하여, 자동화된 수확 기계로 수확하여 감마 카운터로 카운트한다. 3개 웰의 평균값을 계산한다. 배양된 T 세포는 또한 전기의 방법에 따라 림포증식 반응을 검사한다.
DNP로 변형된 자가유래 세포에 대하여 최고의 DTH활성을 나타낼 때, 환자로부터 수득하여 냉동보존한 PBL을 용해시켜 생체외 증식 반응을 검사하였다. DNFB을 단독으로 적용하였을 때는, 감지될 만한 숫자의 혈액내 반응 세포를 얻을 수 없었다. 반응력이 있는 PBL은 DNP-백신을 2번 주사후에(63일) 검측될 것으로 기대되고, 이전에 DNP로 변형된 흑색종 세포에 노출된 경험에 근거하여, 백신을 처리하는 기간내내 계속 검측될 것이다.
사이토카인 생성을 검사하기 위하여, T 세포는 바닥이 둥근 마이크로타이터 배양접시에 약 1x105세포/웰로 첨가된다. 동수의 자극세포(DNP로 변형된 자가유래의 B 림프아세포)를 첨가하고, 18시간 배양 후에 상등액을 수집한다. 상업적으로 구입가능한 ELISA 키트(Endogen, Boston, MA; 감도=5pg/ml)를 사용하여 감마 인터페론의 양을 측정한다.
반응의 MHC-의존성을 결정하기 위하여, 반응 세포를 첨가하기 전에, 자극세포를 MHC 클래스 1(W6/32) 또는 MHC 클래스 II(L243)에 대한 단일클론 항체를 10㎍/ml의 농도로 한시간 동안 전 배양(pre-incubation)한다. 음성 대조군으로는, 동일 농도의 비특이적 생쥐의 임뮤노글로불린으로 검사한다.
대량의 개체군을 선별하여 얻어진 DNP-활성적인 CD8+T 세포는 DNP로 변형된 자가유래의 B 림포아세포의 반복적인 자극에 의해 IL-2가 첨가된 배지에서 장기간 (＞ 3달) 유지될 수 있다; 이들은 CD3+, CD8+의 안정적인 표현형을 유지하였다. 이들의 반응이 MHC 클래스 I에 제한적이라는 2가지 증거가 있다: 1) 감마 인터페론 생성이 자극 세포를 항-클래스 I 항체와의 전 배양에 의해서는 저해되나, 항-클래스 II 항체와의 전 배양에 의해서는 저해되지 않는다, 2) T 세포는 단일 또는 2개의 HLA-A 대립인자의 위치에서 동일한 동종의 DNP로 변형된 자극 세포에 반응을 보이나, 그렇지 못한 자극 세포에는 반응을 보이지 못한다.
T 세포에 의한 감마 인터페론 생성을 검사하기 위하여, 환자 혈액으로부터 림프구를 얻었다. T 세포를 자극하기 위하여, 약 1,000,000개의 림프구를 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포막과 혼합하였다. 매 7일 째, 100U/ml의 IL-2를 첨가하고, 계대배양하여 T 세포를 증식시킨다. 그리고, T 세포는 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포막으로 재자극된다. 이를 통해, DNP변형된 자가유래의 흑색종 세포에 반응을 보이는 풍부한 T 세포 개체군을 얻는다. 자극정도는 T 세포에 의한 감마 인터페론 생성량으로 결정한다. 일반적으로, 15pg/ml 이상의 감마인터페론 생성이 유의적으로 간주된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게서 자명할 것이다.
실시예 1: 분리된 흑색종 세포막에 의한 T 세포의 생체외 자극
T 세포주의 확립
본 발명의 방법에 따라, DNP-백신을 투여한 후에 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포에 대하여 강한 지연형 과민증(delayed type hypersensitivity, 이하 'DTH'라 함)을 발생하는 환자로부터 말초 혈액 림프구(Peripheral blood lymphocyte, 이하 'PBL'이라 함)을 수득한다. PBL을 밀도구배 원심분리에 의해 혈액으로부터 분리하여, 2.5% 사람의 알부민과 DMSO가 첨가된 RPMI1640과 같은 동결 배지에 부유하고, 냉각속도 조절이 가능한 동결기에 동결시켜, 사용할 때까지 액체 질소에 보관한다(참조: Sato et al., 1995).
T 세포주는 이러한 PBL을 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포로 반복적인 자극을 하여 확립하고, 재조합 IL-2를 넣어 유지한다(참조: Sato et al., 1995).
흑색종 세포(Melanoma cell)
흑색종 세포는 동일한 환자로부터 수술에 의해 제거된 전이성 암으로부터 전기에 기술한 바와 같이 효소적으로 추출하였다(참조: Sato et al., 1997), 전기의 방법으로 동결보존하였다. 자가유래의 흑색종 세포주는 흑색종 세포 부유물로부터 확립되었다. 간단히, 흑색종 세포는 전이성 암으로부터 효소적으로 해리하여 조직 배양 배지(우태아 혈청 또는 사람 혈청 첨가된 RPMI1640)에 부유하고 조직 배양 접시에 첨가하였다. 몇 일 후에, 비부착 종양세포는 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다. 몇 주 후에, 부착된 흑색종 세포는 빠르게 증식하기 시작하였다. 세포가 배양 접시에 꽉 차면, 세포를 EDTA로 떼어내서 나누어 새로운 조직 배양 접시에 첨가한다.
흑색종 세포주 세포를 밀러와 클레만의 방법으로 DNP로 변형시켰다. 이는 무균 조건하에, 디니트로플로로벤젠(dinitrofluorobenzene, DNFB, Sigma Chemical Co.)으로 종양 세포와 30분동안 배양하였고, 행크스 용액으로 과도의 DNFB를 세척하는 것을 수반한다. DNP-변형은 쥐의 단일클론 항-DNP항체(SPE-7; Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO)를 사용하여 유동 세포계측법을 통해 확인하였다 (100%의 세포가 DNP로 변형되었음을 보여 주었다).
다른 방법으로, 세포주를 확립하는 번거로운 단계없이 냉동보관된 흑색종 세포를 전기에 기술한 바와 같이 DNP로 변형하였다.
세포막 추출
하케 등의 방법에 의해, DNP로 변형된 흑색종 세포(DNP-Mel)로부터 세포막을 추출하였다. 간단히, DNP로 변형된 세포를 30mM 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate) 완충용액, 1mM 페닐메틸셀포닐플로라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, PMSF)를 5배 부피비로 넣어 저농도 충격을 주고, 다운스 호모지나이저 (Dounce homogenizer, 10 내지 20 스트로크)로 분쇄시킨다. 남아 있는 완전한 세포와 핵은, 상등액에서 핵과 세포가 없어질 때까지 1000g에서 5분간 연속적인 (consecutive) 원심분리를 하여 제거한다. 그리고 나서, 세포막을 100,000g에서 90분간 원심분리하여 침전시킨다. 침전된 전체 세포막을 8% 자당, 5mM Tris, pH 7.6의 완충용액으로 107세포등가물 단위(cell equivalent unit, 예를 들어 107세포로부터 추출된 세포막)로 부유시켜 사용할 때까지 -80℃에 동결한다.
또 다른 방법으로, 세포막을 전기에 기술한 바와 동일한 방법으로 변형되지 않은 흑색종 세포로부터 분리하였다. 세포막을 알부민이 첨가되지 않은 행크스 용액에 다양한 세포등가 농도(105내지 109세포 등가/ml)로 부유시킨다. 다음에 전기에서 기술한 바와 같이 DNFB를 첨가하였다. 그리고, 세포막을 100,000g에서 90분간 원심분리하여 침전시키고 식염수로 2번 세척하였다.
세포막 제제에 대한 사이토카인 생성
DNP로 변형된 흑색종 세포막에 의해 유도된 T 세포반응은 인터페론 감마 생성량으로 측정되었다. 환자의 PBL로부터 수득된 T 세포를 100㎕ 배양 배지(10% 사람의 AB 혈청, 2mM L-글루타민, 100mg/ml, 100U/ml의 스트렙토마이신/페니실린, 10mM 허피스, 1% 비필수 아미노산이 첨가된 RPMI1640배지)가 첨가된 바닥이 둥근 96웰 배양 접시에 105세포/웰로 배양하였다. 다양한 양의(약 105내지 108세포등가물) 세포막을 각각의 웰에 첨가하고 배양배지를 더 첨가하여 각각의 웰의 전체 부피를 250㎕로 하였다.
18시간 배양 후에, 인터페론 감마의 분석을 위해 상등액을 수집하였다. 상등액의 인터페론 감마의 농도는 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(Endogen, Boston, MA; 감도=5pg/ml)를 사용하여 측정하였다.
T 세포에 의한(750pg/ml) 인터페론 감마의 유의적인 생성량은 자가유래의 DNP-Mel 세포막으로 배양한 후에 검출된다. T 세포에 의한 인터페론 감마의 생성량은 동시 배양하는 DNP-Mel 세포막의 양과 관계있다. 변형되지 않은 Mel 세포막에 대해서는 유의적인 반응이 유도되지 않았다. 양성적인 패닝(positive panning) 기술에 의하여 CD4+CD8+T 세포를 풍부하게 하여, 2종류의 T 세포 아세포주 (subline)를 개발하였다. 각각의 아세포주는 DNP-Mel 세포막에 반응하여 인퍼페론 감마를 생성하였다. DNP-Mel 세포막에 대한 CD4+T 아세포주의 반응은 MHC 클래스 II에 대한 항체로 저해되고, CD8+T 아세포주에 대한 반응은 MHC 클래스 I에 대한 항체로 저해되었다(각각, 73% 및 80%의 저해).
이러한 결과는, 합텐으로 변형된 종양 세포막이 종양치료를 필요로하는 환자에게 백신으로서 성공적으로 사용될 수 있음을 보여주었다.
실시예 2: 변형된 종양 세포막으로 제 3기에 있는 난소암 치료
환자들은 초기에 표준적인 의료 관행에 따라서 치료하였다(외과적 수술로 제거후 화학 치료). 화학치료 완성 후, 디니트로페닐(DNP) 합텐으로 변형된 난소암 세포막을 함유하는 백신으로 6주 과정의 치료를 수행할 수 있었다. 첫번째 주사하기 전에 소량의 사이클로포스파마이드를 투여하였다. 전기 치료과정을 완료한 후, 환자들은 DNP로 변형된, 및 변형되지 않은 암종 세포막에 대한 지연형 과민증 반응에 대해서 검사되었다. 생체외 연구는 전이성 종양 및/또는 말초혈액으로부터 분리되어 추출되고 동결된 림프구를 이용하여 행하여졌다.
예를 들어, 외과적 수술을 받은 환자 또는 화학 치료에 의해 종양감소를 나타내는 환자들이 치료를 위해 선택되어졌다. 각각의 환자로부터 제거된 종양 덩어리는 적어도 100x106의 살아 있는 종양 세포를 얻기에 충분하다. 각각의 환자는 카보플라틴(carboplatin) 및 탁솔(taxol)과 같은 화학치료를 받고, 바람직하게는 화학 치료 후에 임상적으로 종양이 제거된다(즉, 정상적인 신체 검사 및 CT연구 및 혈청 수치인 CA-125가 ＜35IU/L을 나타냄).
다음에 기초하여 환자들은 본 발명의 치료에서 제외된다: 백신 제조와 피부테스트를 위한 종양 세포가 양적으로 부족한 경우(＜100x106세포), 80보다 작은 카노브스키 수행 상태(Karnovsky performance status), 지난 6개월 이내의 주요한 방사선 치료, 전신성 코티코스테로이드를 현재 투여하고 있는 경우, 적혈구용적 (hematocrit)＜30% 또는 백혈구＜3000, 나이＜18, 활동적인 자가면역질환, 활동적 상태의 심각한 감염, 또다른 활동적인 악성종양, B형 간염 바이러스(순환성 항원) 또는 HIV(순환성 항체)에 대한 감염의 증거가 있는 경우, 또는 동의 의사를 제공하지 못함.
환자들은 종양의 외과적 절제 및 전이부의 절제를 행하고 있다. 최적의 또는 부분적으로 최적의 절제를 행한 환자들이 적합하다. 종양 조직은 실험실에 옮겨져서 세포막을 얻기 위해 처리된다. 세포막은 동결되어 액체 질소에 저장된다.
동계 및 동종의 종양 세포막이 제조되어 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용된다.
외과적 수술 후 6 주 이내에 시작하여, 환자들은 다음과 같은 투여 계획에 따라 카보플라틴 또는 시스플라틴+탁솔과 같은 화학치료를 시작한다: 카보플라틴 AUC 7.5 또는 시스플라틴 75mg/M2-매 3주마다, 탁솔 175mg/M2, 3시간 이상, 정맥내 주사-매 3주 마다. 6번의 화학치료가 이뤄지고, 또 다른 화학치료가 이뤄질 수 있다.
대략적으로, 화학치료 완료 4주 후에, 환자들은 가슴-복부-골반에 대한 컴퓨터 단층촬영(computer tomography, CT)을 포함하는 전이성 평가를 받는다. 암종이 재발했다는 증거가 없는 환자들만이 백신치료에 적합하다. CT결과가 재발에 대한 음성이라면, CA125의 혈청 수준이 증가된 환자가 적합하다. 종양 세포막 치료는 마지막 화학치료후 적어도 4주후, 그러나 12주를 넘지 않도록 시작한다.
7일 째, 환자는 다음과 같은 것으로 피부테스트를 받는다: 1) DNP로 변형된 자가유래의 난소암 세포 또는 세포막, 2) 희석제(0.1% 사람 알부민이 첨가된 행크스액(Hank's balanced salt solution)), 및 3) PPD 중간체. DTH반응은 5일째되는 날 측정될 수 있다. 0일 째, 환자는 빠른 정맥내 주입으로 사이클로포스파마이드 300mg/M2을 받는다. 3일 후에, 환자들은 종양 세포막 조성물로 피내 접종되고 이를 6주 동안 주마다 반복한다. 백신은 BCG와 혼합된 DNP로 변형된 난소암 세포막으로 구성된다. 백신은 팔 상단에 주사된다. 만약 어떠한 이유로 인하여 왼쪽 보조 리프관 절개가 행하여졌다면, 오른쪽 팔을 사용한다.
6번째 백신을 접종하고 2.5주 후에, 환자들은 CBC, SMA-12, CA125 및 가슴 엑스레이로 구성되는 임상적인 평가를 받는다. 환자들은 다음과 같은 물질로 DTH반응을 검사받는다: DNP로 변형된, 및 변형되지 않은 자가유래의 암종세포; DNP로 변형된, 및 변형되지 않은 자가유래의 말초혈액 림프구; 희석제; 및 PPD 중간체. 또한, 환자들은 DNFB에 대한 접촉 민감성(contact sensitivity)을 검사받는다.
재발이 없은 환자들은 6개월때(백신 치료시작으로부터 측정하여) 7번째(추가) 백신을 투여 받는다. 각각의 환자에 대하여 6개월 때의 추가 접종을 위하여 적어도 1 바이얼(vial)의 동결보존된 종양 세포막을 남겨둔다. 만약에 이용가능한 세포수가 6주째 백신 + 6개월째 추가접종을 위해 부족하다면, 주간 접종의 초기 단계를 5단계로 줄인다. 만약에 세포수가 충분하다면, 또다른 추가 접종이 1년 후에 이뤄진다. 1년째 추가 접종하기 전에, 환자들은 그들의 이전의 면역수준이 유지되도 있는지를 알아보기 위하여 자가유래 종양세포 또는 세포막으로 피부 테스트를 받을 수도 있다.
실시예 3: 변형된 종양 세포막을 이용한 흑색종 암의 치료
종양 덩어리는 전기에 기술한 바와 같이 처리된다. 간단히, 세포는 콜라겐 분해효소 및 DNA분해효소에 의한 효소적 분해 및 기계적 분해에 의하여 추출된다. 세포막은 본 명세서에 기술한 바와 같이 분리하고, 냉각속도를 조절할 수 있는 동결기에 동결하여, 필요할 때까지 액체 질소에 보관한다. 환자를 치료하는 당일, 세포막을 용해시켜, 세척하고, 페놀 레드가 첨가되지 않은 행크스액에 부유시킨다. DNP에 의한 변형은 밀레와 클레만(1976)의 방법으로 수행한다. 이는 멸균 조건에서 DNFB와 종양 세포를 30분간 배양하고, 멸균 식염수를 세척하는 것을 수반한다.
백신 조성물은 최소한 2.5x106c.e.의, 최고 7.5x106c.e.의 트립판블루-배제 (trypan-blue excluding)의 흑색종 세포막을 함유하고, 0.2ml의 행크스액에 부유시킨다. 각각의 백신 치료는 인접한 부위에 3번 주사하는 것으로 이루어진다.
동결 건조된 재료는 1ml의 멸균수 또는 인산염 완충용액(pH 7.2)으로 재구성한다. 적당한 희석은 멸균된 식염수 완충용액으로 만든다. 그리고 0.1ml은 덜어내어 주사하기 전에 백신과 혼합한다. 첫번째 및 두번째 백신은 1:10으로 희석된 Tice BCG(" Tice-1") 0.1ml로 혼합한다. BCG는 오가논 테크니카 회사(Organon Teknika Corporation, Durham, NC)로부터 수득된 Tice 균주이다(substrain of the Pasteur Institute stain). 3번째 및 4번 째 백신은 1:100으로 희석된 Tice BCG ("Tice-3") 0.1ml과 혼합한다. 5번째와 6번째 및 추가 백신은 1:1000으로 희석된 Tice BCG("Tice-5") 0.1ml과 혼합한다. 이상적인 백신 반응은 단지 작은(＜ 5mm) 중앙 궤양을 가지는 염증 구진(papule)이다.
피부테스트는 실험할 물질 0.1ml을 팔에 피내 주사하여 수행하고, DTH는 48시간째에 경화물의 평균 지름을 측정하여 평가한다. 다음과 같은 물질이 검사된다: 1) DNP로 변형된, 및 변형되지 않은 1x106자가유래의 흑색종 세포막; 효소적 해리(TCE) 및 기계적 해리(TCM)된 종양 세포가 사용될 수 있다; 2) DNP로 변형된 및 변형되지 않은 3x106자가유래의 말초혈액 림프구; 3) 행크스액; 및 4) PPD중간체의 강도. 또한 DNFB에 대한 접촉 민감도는 200ug의 DNFB를 위쪽 팔의 복부쪽의 피부에 투여하고, 48시간째 경화물 원의 면적을 조사하여 검사한다. DTH테스트의 완전한 계(full battery)는 백신을 투여하는 6주의 과정후에 실행된다. 치료 전 DTH테스트는 DNP로 변형된 흑색종 세포막, PPD, 및 희석제에 제한된다. 이러한 전략은 1) DNP로 변형된 림프구에 환자를 감작시키는 것 및 2) 변형되지 않은 종양 세포의 주사에 의해 환자로 하여금 내성을 갖게 하는 것을 피하기 위해 고안되었다.
피부 테스트를 수행할 때마다 모든 환자들로부터 림프구와 혈청을 분리하여 동결 보관하기 위한 혈액을 수집하였다. 정기적으로, 이들은 증식, 사이토카인 분비, 및 세포독성에 의해 측정되는 자가유래의 암 세포에 대한 반응에 대해 검사된다.
환자들은 백신치료가 시작되기 전에 전이성 질병이 있는지를 검사받는다. 첫 번째 8주간의 백신치료가 끝난 뒤, 평가는 3달에 한번씩 이뤄진다. 측정은 2년째와 3년째는 4달에 한번, 그 다음에는 6달에 한번씩 계속된다. 신체검사와 일반적인 혈액검사(CBC, SMA-12, 및 CA 125)가 각각의 평가와 같이 수행된다. 가슴-복부-골반에 대한 CT검사는 백신을 투여하기 전인 6개월 및 12개월째(추가 백신 전에) 수행되고, 그 후에는 임상적으로 지시되는 바와 같이 수행된다. 재발이 없는 환자와 전체 생존자를 진단하며, 모든 환자는 적어도 5년 또는 죽을 때까지 계속 검진된다.
환자들은 2 내지 3개월후에 병을 고치는 액체성의 민감한 농포(pustule)로 이루어지고, 천연두 백신과 같은 흔적을 남기는 BCG에 대한 국소적인 반응을 나타낼 것으로 기대된다. 환자들이 BCG에 대하여 민감성을 나타냄에 따라, 이러한 반응의 강도는 증가된다. 합텐화된 백신을 받은 환자에게서 과민증, 다른 알레지 반응, 및 자가면역은 발견되지 않았다.
백신부위에 대한 반응은 다음과 같이 평가된다: 0 - 무증상; 1 - 가려움 또는 불쾌감, 그러나 팔의 움직임 또는 정상적인 활동의 방해는 없음: 2 - 팔의 움직임의 방해에 따른 불쾌감, 그러나 정상적인 활동의 변형이 필요하지는 않다; 3 - 팔의 움직임의 주요한 간섭에 따른 불쾌감 및 정상적인 활동의 변경이 필요; 및 4 - 대부분의 정상적인 활동을 하지 못하는 정도의 불쾌감.
사이클로포스파마이드는 멸균수로 재구성되어 적당량이 빠른 정맥내 주사로 투여된다. 전형적으로, 환자의 1/3이 구역질을 경험하고 약 10%가 소량의 사이클로포스파마이드 투여 후에 구토를 할 수 있다. 이러한 양에서 백혈구 감소, 탈모증, 및 방광염은 발생하지 않았다. 사이클로포스파마이드가 마지막 백신 접종과 연관하여 단 한번만 투여되기 때문에, 이러한 방법은 구역질과 구토의 발생을 낮추는 것으로 기대된다.
환자들은 다음의 백신 접종으로 관찰된다. 기대되지 않은 증상 또는 징후를 경험하는 환자들은 의사에게 연락하여 즉시 검사받는다. 불쾌감을 야기하는 열은 아세트아미노펜(acetaminophen)으로 치료한다. 소량의 사이클로포스파마이드에 의해 야기되는 구역질은 프로클로페라진(prochlorperazine, Campazine)을 경구투여하여 치료한다. 전술한 바와 같이, 만약에 심한 국소반응(＞ 5mm 궤양)이 백신부위에 발생하면, 후에 사용되는 BCG의 양은 줄어든다.
1년간의 평가로 재발이 없는 환자는 백신의 마지막 추가접종을 받는다. 그리고 이들의 상태는 더 이상의 치료가 따르지 않는 채 계속 검사된다. 전이를 보이는 환자는 연구를 그만두고 임상적으로 지시되는 바와 같이 치료된다(일반적으로 외과적 수술 또는 화학치료).
또한, DNP-백신이 이러한 환자들의 재발병이 없는, 및/또는 전체 생존률을 연장하는 지를 결정하기 위한 효능연구가 수행되었다. 생존율의 매개변수 (카플란 -메이어 방법)가 측정될 수 있다.
토마스 제퍼슨 대학, 국립보건 연구소 및 식품의약청은 모두 공지된 동의에 관해서 계속 보고를 받을 것이다.
합텐으로 변형된 흑색종 세포를 이용한 흑색종에 대한 DNP로 변형된 자가유래의 백신에 대한 본 발명자의 이전 연구는 다음과 같은 결과를 보여주었다: 100%의 환자가(N=60) DNP로 변형된 종양세포의 처리에 의하여 양성의 DTH 반응(5mm 지름의 경화)을 나타내었고, 85%가 커다란 양성의 반응(10mm 지름의 경화)을 나타내었다. 비슷한 성공이 DNP로 변형된 자가유래의 암종 세포막 백신의 경우에서도 기대된다. 즉, 환자들은 DNP로 변형된, 및 변형되지 않은 자가유래의 암종 세포막에 대하여 DTH반응을 나타낼 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들이고 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (52)
- 합텐으로 변형된 사람의 종양 세포막을 포함하는 조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막은 암종(carcinoma)세포 및 비고체(non-solid) 종양세포로구성된 그룹으로부터 선택되는 종양 세포로부터 분리되는 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 신장암, 및 전립선 암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 종양에서 유래된 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 3항에 있어서,백혈병은 급성 백혈병인 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막은 동계(syngeneic)의 종양 세포막 및 동종(allogeneic)의종양 세포막으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 5항에 있어서,동계의 종양 세포막은 자가 유래(autologous)인 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 1항에 있어서,합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl)ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluoresceinisothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzeneisothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonicacid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid),디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 1항에 있어서,아주반트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 8항에 있어서,아주반트는 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-Guerin), QS-21,비독성화된 내독소 및 사이토카인으로 구성된 그룹에서 선택되는것을 특징으로 하는제 1항의 조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 환자에 투여될 때, 전기 환자의 종양에 침윤하는 T 세포를 생성할 수 있는 특징을가지는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 환자에 투여될 때, 전기 환자의 종양에 대하여 염증 면역반응을 야기시킬 수 있는특징을 가지는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 환자에 투여될 때,전기 환자의 종양에 대하여 지연형 과민증 반응을 야기시킬 수있는 특징을 가지는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막은 동종(allogenic)이며, 추가로 항원 제시 세포(antigenpresenting cell)을 포함하는 것을 특징으로 하는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막은 동종(allogenic)이고 항원제시 세포는 동계(syngeneic)인것을 특징으로 하는조성물.
- 제 1항에 있어서,종양 세포막은 동종(allogenic)이고 항원제시 세포는 자가유래(autologous)인 것을 특징으로 하는조성물.
- 종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 사람에게 합텐으로 변형된 사람의 종양 세포막을 치료에 유효한 양으로 포함하는 조성물로 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,사람 종양에 침윤하는 T 세포를 생성하고, 전기의 사람 종양에 침윤한T 세포를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,사람 종양에 대하여 염증 면역반응을 일으키고, 전기의 염증면역반응을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,사람 종양에 대하여 지연형 과민증 반응을 일으키고, 전기의 지연형과민증 반응을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,악성 종양은 암종 및 비고체 종양으로 구성된 그룹으로부터 선택되는것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,악성종양은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장암, 직장암,결장직장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 신장암, 및 전립선 암으로 구성된그룹으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 21항에 있어서,백혈병은 급성 백혈병인 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,종양 세포막은 동계의 세포막 및 동종의 세포막으로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 23항에 있어서,동계의 종양 세포막은 자가 유래인 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl)ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluoresceinisothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzeneisothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonicacid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid),디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,조성물은 추가적으로 아주반트를 포함하는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 26항에 있어서,아주반트는 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmetter-Guerin), QS-21,비독성화된 내독소 및 사이토카인으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,종양 세포막은 동종(allogenic)이고, 전기 조성물은 추가로 항원 제시세포(antigen presenting cell)을 포함하는 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,종양 세포막은 동종(allogenic)이고 항원제시 세포는 동계(syngeneic)인 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 제 16항에 있어서,종양 세포막은 동종(allogenic)이고 항원제시 세포는 자가유래(autologous)인 것을 특징으로 하는암 치료방법.
- 전기의 종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 포유류에게 합텐으로 변형된 포유류 종양 세포막을 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 포유류 종양세포에 침윤하는 T 세포를 형성하는 방법.
- 제 31항에 있어서,포유류는 사람; 또는, 개, 고양이, 소 및 말로부터 선택되는 동물인 것을 특징으로 하는방법.
- 종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 포유류에게 합텐으로 변형된 포유류 종양 세포막을 치료적으로 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 포유류 종양세포에 염증 면역반응를 야기시키는 방법.
- 제 33항에 있어서,포유류는 사람; 또는, 개, 고양이, 소 및 말로부터 선택되는 동물인 것을 특징으로 하는방법.
- 종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양으로 고통받고 있는 포유류에게 합텐으로 변형된 포유류 종양 세포막을 치료에 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 지연형 과민증 반응을 야기시키는 방법.
- 제 35항에 있어서,포유류는 사람; 또는, 개, 고양이, 소 및 말로부터 선택되는 동물인 것을 특징으로 하는방법.
- 종양 세포를 분쇄시켜 분쇄된 종양세포를 수득하는 단계; 전기의 분쇄된 종양 세포로부터 핵이 제거된 종양세포를 수득하는 단계; 전기의 핵이 제거된 종양 세포로부터 실질적으로 세포가 제거된 종양 세포막을 수득하는 단계; 및, 합텐으로 변형된 종양 세포막을 얻기 위해 전기의 종양 세포막에 합텐을 처리하는 단계를 포함하는 합텐으로 변형된 종양 세포막의 제조 방법.
- 제 37항에 있어서,분쇄(lysing)는 저농도 충격, 기계적 분해 및 효소적 분해로 구성된그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는제조 방법.
- 제 37항에 있어서,합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl)ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluoresceinisothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzeneisothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonicacid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid),디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는제조 방법.
- 합텐으로 변형된 포유류 종양 세포막.
- 제 40항에 있어서,포유류는 사람; 또는, 개, 고양이, 소 및 말로부터 선택되는 동물인 것을 특징으로 하는종양 세포막.
- 제 41항에 있어서,포유류는 사람인 것을 특징으로 하는종양 세포막.
- 제 42항에 있어서,전기의 세포막은 암종 세포 및 비고체 종양 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는종양 세포막.
- 제 42항에 있어서,전기의 세포막은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 콩팥암, 및 전립선 암으로구성된 그룹으로부터 선택어지는 종양으로부터 유래된 것을 특징으로하는종양 세포막.
- 제 44항에 있어서,백혈병은 급성 백혈병인 것을 특징으로 하는종양 세포막.
- 제 40항에 있어서,동계(syngeneic)의 종양 세포막 및 동종(allogenic)의 종양 세포막으로구성된 그룹으로부터 선택되어지는 것을 특징으로종양 세포막.
- 제 46항에 있어서,동계(syngeneic)의 종양 세포막은 자가유래(autologous)인 것을 특징으로 하는종양 세포막.
- 제 40항에 있어서,합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl)ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluoresceinisothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acidbenzene isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid), 디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는종양 세포막.
- 제 40항에 있어서,다음의 특징을 적어도 한 가지 이상을 갖는종양 세포막:(i) 포유류의 종양에 침윤하는 T 림프구 형성,(ii) 포유류의 종양에 대하여 염증 면역 반응을 야기,(iii) 포유류 종양에 대하여 지연형 과민증 반응을 야기; 및(iv) 생체외에서 T 세포 자극.
- 제 40항에 있어서,전기의 세포막은 세포외막(outer cell membrane)인 것을 특징으로하는종양 세포막.
- 제 40항에 있어서,전기의 세포막은 MHC 분자, 열 충격 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는 세포막 분획을 포함하는종양 세포막.
- 제 40항의 세포막을 포함하는 조성물.
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