KR20010043331A

KR20010043331A - 종양 세포 및 추출물을 포함하는 조성물 및 이를 이용한방법

Info

Publication number: KR20010043331A
Application number: KR1020007012301A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 버드
Original assignee: 토마스 제퍼슨 유니버시티
Priority date: 1998-05-04
Filing date: 1999-05-04
Publication date: 2001-05-25
Also published as: WO1999056773A9; AU3786999A; US20030068337A1; ZA200006300B; AR016254A1; WO1999056773A3; DE69939111D1; ES2311303T3; PL347981A1; IL139442A0; BR9910187A; JP2002513772A; ATE401096T1; CN1309569A; US6458369B1; EP1082134B1; WO1999056773A2; EP1082134A2; CA2328507A1

Abstract

본 발명은 합텐으로 변형된 종양 세포 및 추출물을 포함하는 조성물, 및 그러한 치료를 필요로 하는 대상에게 전기 조성물을 치료에 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 종양 세포 및 추출물, 및 그의 조성물은 포유동물의 종양에 침윤, 포유동물의 염증 면역 반응 유도, 포유동물 종양에 대한 지연형 과민증 유도 및/또는 생체외에서 T 림프구를 자극할 수 있는 T 림프구를 유도할 수 있다. 또한, 본 발명은 다음 중 적어도 한 가지 이상을 유도하므로써, 종양으로 고통받는 포유동물 환자에게서 항-종양 반응을 유도하는데 유용한 효과적인 백신 계획에 관한 것이다: 종양 괴사, 종양 후퇴, 종양 염증, 활성화된 T 림프구에 의한 종양 침윤, 지연형 과민증 반응 및 환자 생존의 연장.

Description

종양 세포 및 추출물을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition Comprising Tumor Cells and Extracts and Method of Using Thereof}

＜110＞ Thomas Jefferson University

＜120＞ Composition Comprising Tumor Cells and Extracts and Method of Usi

ng Thereof

＜130＞ FP0031

＜150＞ US 60/084,081

＜151＞ 1998-05-04

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＜170＞ KOPATIN 1.5

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1960년대에는 종양 세포는 정상 세포에는 존재하지 않는 종양 특이 항원(tumor specific antigen, 이하 'TSA' 라 함)을 포함하며, 이러한 항원에 대한 면역 반응은 개체가 종양을 제거할 수 있게 할지도 모른다는 이론이 있었다. 이것은 후에 세포 표면에 새로운 면역 결정기(immunological determinant)를 도입함으로써 TSA에 대한 면역 반응을 증진시킬 수도 있다고 제안되었다(참조: Mitchison, Transplant. Proc., 2:92, 1970). 이러한 합텐(hapten), 단백질, 바이러스 외피 단백질, 이식항원(transplantation antigen) 또는 개구리(xenopus) 세포 항원 등의 "보조결정기(helper determinant)"를 종양 세포군에 도입시킬 수 있다. 그리고 나서 세포를 변형되지 않은(unmodified) 종양 세포의 증식에 관용적(tolerant)일 것으로 예측되는 개체에 주입시킬 수 있다. 임상적으로는, 보조결정기에 대해서 면역 반응을 일으켜, 수반하는 TSA에 대한 면역 반응이 증가하고, 그렇지 않으면 살아 남을, 종양세포가 파괴 된다. 미칫슨 등은 또한 다음과 같이 보조결정기의 여러 작용 형태를 제안한다: 1) 변형된 세포는 증식 속도가 둔화되는 의미의 감약화(attenuated)가 일어날 뿐이거나 면역 공격에 대한 감수성이 증가한다; 2) 보조결정기는 단지 공격 지점을 제공함으로써 변형된 세포가 면역 반응에 의해 사멸될 수 있도록 할 뿐 TSA로 향하게 하지는 않는다; 3)보조결정기는 항체에 대한 결합 등에 아주반트(adjuvant)로서 작용하거나 또는 종양세포가 체내에서 면역 반응이 일어나는 정확한 장소, 특히 림프절(lymph node)에 위치하도록 도와준다.

후지와라 등은(참조: Fujiwara et al., J. Immunol., 132:1571, 1984) 어떤 합텐화(haptenized)된 종양 세포, 즉, 합텐인 트리니트로페닐(trinitrophenyl, 이하 'TNP'라 함)과 접합된(conjugated) 종양 세포는 쥐에서 합텐-특이적 억제성 T 세포(suppressor T cell)가 존재하지 않는 상태에서 처음으로 합텐에 감작 되었다면(sensitized) 변형되지 않은 종양 세포에 대한 전신성 면역(systemic immunity)을 유도할 수 있다는 것을 보여 주었다. 위와 같이 처리된 쥐의 비장(spleen) 세포는 처리되지 않은 피이식(recipient) 동물에서 종양의 성장을 완전하게 특이적으로 방지하였다. 플러드 등은(참조: Flood et al., J. Immunol.. 138: 3573, 1987) TNP-접합된, 자외선에 의해 유도된 "퇴축성(regressor)" 종양으로 면역화된 쥐는, 그렇지 않으면 면역이 없는 쥐에서, TNP-접합된 "진행성(progressor)" 종양을 제거할 수 있다는 것을 보여 주었다. 더욱이 이러한 쥐들은 후에 접합되지 않은 진행성 종양에도 저항성을 나타냈다. 또 다른 실험 조건에서, 후지와라 등은(참조: Fujiwara et al., J. Immunol.,133:510, 1984) 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)로 전처리하고 트리니트로클로로벤젠(trinitrochlorobenzene, TNCB)에 의해 감작된 쥐의 종양 세포의 생체내 합텐화에 의해 대형(10mm) 종양이 치유될 수 있음을 증명하였다; 후에 이 동물들은 접합되지 않은 종양 세포에 특이적으로 저항성을 나타냈다.

후지와라 등의 실험 결과가 시사하는 바는 다음과 같은 여러 가지 이유에서 본 발명과는 다르다: A. 후지와라가 사용한 조성물은 쥐의 유도된 이식성 종양에서 유래된 세포이며-사람의 자연발생적 종양으로부터 유래된 것이 아니다; B. 후지와라의 조성물은 면역학적 예방(immunoprophylaxis)의 차원에서 사용되었고-본 발명은 면역학적 치료(immunotherapy)의 차원이다; C. 후지와라의 조성물은 국부적 치료에 투여되었고-본 발명의 조성물은 전신성 접종으로 투여된다; 및 D. 후지와라의 조성물은 종양을 퇴화시키지 않았으나-본 발명의 조성물은 종양의 퇴화 또는 적어도 처치를 받은 환자의 상당 부분의 생명이 연장되었다.

변형되지 않은 조직과 교차 반응하는 T 세포의 존재가 최근에 밝혀졌다. 웰치엔과 그의 동료들은 TNP-변형된 동계의(syngeneic) 림프구(lymphocyte)로 면역화된 쥐로부터 유래된 클래스 I MHC-제한된(restricted) T 세포 클론이 MHC-연합되고(associated) TNP-변형된 "자기(self)" 펩타이드에 반응하는 것을 밝혔다(참조: Ortmann, B. et al., J. Immunol. 148: 1445, 1992). 아울러, TNP-변형된 림프구로 쥐를 면역화 하였을 때 생체외에서 TNP-변형된 세포에 2차 증식과 세포상해 반응을 나타내는 비장(splenic) T 세포가 발달한다는 결과가 입증되었다(참조: Shearer, G.M., Eur.J. Immunol., 4: 527, 1974). DNP- 또는 TNP-변형된 자가세포(autologous cell)로 면역화된 림프구가 변형되지 않은 자가세포에 반응하는 능력은 다음과 같은 두가지 임상의 문제점과 관련되므로 상당히 중요하다: 1) 약물에 의해 유도되는 자가면역성(autoinmmune) 질병, 및 2) 암의 면역학적 치료. 첫 번째 것과 관련지어, 섭취된 약물은 합텐으로 작용하여 정상 세포 단백질과 면역원성 복합체(immunogenic complex)를 이룸으로써 T 세포가 인식(recognize)하게 된다(참조: Tsutsui, H. et al., J. Immunol., 149: 706, 1992). 따라서, 자가면역성 질병, 즉, 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)이 발병하여 약물을 중지한 뒤에도 지속될 수 있다. 이것은 결과적으로 변형되지 않은 조직과 교차 반응하는 T 림프구의 생성을 의미한다.

이들 실험의 공통점은 억제성(suppressor) 세포가 유도되지 않은 환경에서 합텐으로 감작화(sensitization) 되는 것이다. 사이클로포스파미드로 전처리 한 후 TNCB-감작된 쥐의 비장 세포는 방사선저항성(radioresistant)의 "증폭된 헬퍼(helper) 기능"을 나타낸다, 즉, 생체외에서 항-TNP 세포상해성(cytotoxicity)의 생성을 특이적으로 증가시킨다. 더욱이, 이들 증폭된 헬퍼들이 생체외에서 TNP-접합된 자가림프구에 노출되어 활성화되면, 종양 항원을 비롯해서 관련이 없는 항원에 대해서도 세포상해성을 증가 시킬 수 있다(참조: Fujiwara et al., 1984). 플러드 등은 (supra 1987) 이러한 증폭된 헬퍼의 활성이 Lyt-1+, Lyt-2-, L3T4+, I-J+의 표현형을 갖는 T 세포에 의해 매개됨을 보여 주었으며, 이러한 세포들은 역억제성(contrasuppressor) 세포로서 새로운 종류의 면역조절 T 세포라고 제안하였다.

흑색종(melanoma) 환자의 면역치료(immunotherapy)에서 일차(primary) 항원인 삿갓조개 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)으로 감작화 시키기 3일 전에 고용량(high dose, 1000mg/M²) 또는 저용량(low dose, 300mg/M²)의 사이클로포스파미드로 전처리 했을 때 항원에 대한 지연형 과민증(delayed type hypersensitivity) 획득이 증가하였다(참조: Berd et al., Cancer Res., 42: 4862, 1982; Cancer Res., 44:1275, 1984). 전이성(metastatic) 흑색종 환자에 대한 저용량의 사이클로포스파미드 전처리는 자가 흑색종 백신의 주입에 반응하여 자가 흑색종 세포에 대한 지연형 과민증의 발현을 가능하게 한다(참조: Berd et al. Cancer Res., 46:2572, 1986; Cancer Invest., 6:335, 1988). 사이클로포스파미드 투여는 말초 혈액 림프구의 비특이적 T 억제성 기능의 감소를 초래하는데(참조: Berd et al., Cancer Res., 44:5439, 1984; Cancer Res., 47:3317, 1987), 아마도 CD4+, CD45R+ 억제성 유도 T 세포(suppressor inducer T cell)의 결핍에 기인할 것이다(참조: Berd et al., Cancer Res., 48:1671, 1988). 이러한 면역치료 관리의 항종양 효과는 백신 투여를 개시하여 종양세포에 대한 지연형 과민증 발현이 될 때까지 상당 기간이 소요된다는 한계가 있다(참조: Berd et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 29:408, 1988). 그러므로, 이러한 백신의 면역원성을 더욱 강화시켜 치료 효과를 증대시킬 필요가 있다.

대부분의 종양 면역학자들은 T 림프구(종양 면역을 담당하는 백혈구)가 종양 덩어리에 침윤하는 것이 면역 체계에 의해 종양을 파괴하기 위한 전제 조건이라는 것에 동의한다. 결과적으로, NCI의 Dr. 스테판 로젠버그 박사에 의해 개척된 "TIL" 치료법으로 알려진 방법을 주목하게 된다. 로젠버그 박사와 그의 동료들은 사람의 전이암으로부터, 자연상태에서 존재하고 실험실에서 인터루킨2(interleukin2, 이하 'IL2'라 함)와 T 세포 성장 인자의 존재하에 배양하여 그 숫자가 상당히 증가하는, 몇 개의 T 림프구를 추출하였다(참조: Topalian et al., J. Clin. Oncol., 6:839, 1988). 그러나, 이러한 치료법은 종양 부위로 "귀소(home)" 하는 능력에 한계가 있으므로 별로 효과적이지 못하다.

고농도 IL2가 림프구를 비특이적 세포상해성 치사 세포(cytotoxic killer cell)가 되도록 유도하는 능력은 여러 연구에서 치료법으로써 연구되어 왔다(참조: Lotze et al., I. Biol. Response, 3:475, 1982; West et al., New England J. Med., 316: 898, 1987). 그러나, 고용량의 IL2 정맥 주사가 강한 독성을 나타내므로 이러한 접근 방법에는 한계가 있다. 훨씬 낮은 농도의 IL2가 항원에 의해 활성화된 T 세포의 증식을 유도함으로써 면역학적 아주반트로서 작용한다는 결과는 주목을 끌지 못했다(참조: Talmadge et al., cancer Res., 47: 5725, 1987, Meuer et al., Lancet, 1:15, 1989). 그러므로, IL2를 면역학적 아주반트로서 연구하고 사용을 시도해볼 필요가 있다.

사람의 흑색종은 T 림프구에 의해 인식되는 특이한 표면 항원이 발현되는 것으로 알려져 있다(참조: Old, L.J., Cancer Res., 41:361, 1981; Van der Brugen, P. et al., Science, 254:1643, 1991; Mukherji,B. et al., J. Immunol., 136:1888, 1986; Anichini, A. et al., J. Immunol., 142:3692, 1989). 그러나, 본 발명자에 의한 연구가 이루어지기 전에는 생체내에서 그러한 항원에 대해 T-세포가 매개하는 효과적인 반응을 유도하기가 어려웠으므로 면역치료법 연구에는 한계가 있었다.

사람의 종양관련 항원(tumor-associated antigen)에 대한 관용을 일으키는 것에 대한 설명을 하기 위해 다음과 같은 몇가지 모델이 제시되어 있다:

1) 초기의 항종양 반응을 감소시키는(down-regulate) 종양 항원-특이적 억제성 세포(tumor antigen-specific suppressor cell)(참조: Mukherji, et al. supra; Berendt, M.J. and North, R.J., I. Exp. Med., 151:69, 1980).

2) 사람의 종양 세포에 의한 T 헬퍼 세포 유도의 실패 또는 그러한 T 세포에 공동자극 신호(costimularory signal)의 제공 실패(참조: Fearon, E.R. et al., Cell, 60:397, 1990; Townsend, S.E. and Allison, J.P., Science, 259:368, 1993); 및,

3) 종양 세포 표면에 MHC 산물(major histocompatibility product)의 발현 감소에 의한 T 세포 인식의 저하(참조: Ruiter, D.J., Seminars in Cancer Biology, 2:35, 1991). 이들 중 어떠한 가설도 임상 시스템에서 확증되지 않았다.

종양 치료를 위한 면역치료법의 목표는 종양-특이적 면역성을 매개하는 증식성의 전신성 T 세포를 개발하는 것이다. 종양 특이적 면역성은 일차 종양 부위(primary tumor site)에 작용할 뿐만 아니라 멀리 떨어진 작은 전이성 포커스(metastatic foci)의 제거에도 작용한다. T 세포 면역성의 생성은 세포-세포 사이의 상호관계 및 여러 가지의 사이토카인(cytokine) 생성이 요구되는 고도로 조절되는 반응이다. 최근에 사람과 쥐의 시스템에서 수행된 연구에 의하면 T 세포 반응은 타입 I과 타입 II의 두가지 범주로 나뉜다. (참조: Mossman, et al., J. Immunol. 136:2348, 1986). 타입 I 반응은 지연형 과민증(delayed type hypersensitivity, 이하 'DTH'라 함)이 요구되며, 대식세포(macrophage)의 활성화 및 인터페론-감마(interferon-gamma, 이하 'IFN'라 함)와 연관되며, 사람의 나병(leprosy)(참조; Yamamura,M. et al., Science, 254:277, 1991) 및 쥐의 레슈마니아증(leishmaniasis)(참조: Scott, P. et al., Immunologicl Review, 112:161, 1989)과도 관련이 있는 것으로 나타났다. 타입 II 반응은 IL4 및 IL10의 생성과 연관되며, 일차적으로 항체 반응을 지원하고 진행성의 나병(참조; Yamamura,M. et al., 상동) 및 레슈마니아증(leishmaniasis)(참조: Yamamura,M. et al., 상동; Scott, P. et al. 상동)과도 관련이 있다. 타입 I 반응은 DTH의 발전과 더불어, MHC와 종양 연관 항원(tumor assocated antigen)의 발현 증가(upregulation)를 통한 종양 특이적 CTL의 생성을 향상시키고, 또한 이차적으로 국지화된 IFN 생성에 항원 제시(presentation)를 증가시킨다. 더욱 최근에, 타입 I과 II는 서로 교차 조절되는 것이 밝혀졌다: IFN 는 타입 II 반응을 저해하고, 반면 IL4와 IL10은 타입 I 반응을 저해한다(참조: Scott, J. Immunol., 147:3149, 1991; Fiorentino et al., J. Immunol., 146:3444, 1991). 레슈마니아 시스템에서, 상해 부위의 사이토카인 변환은 타입 II 반응을 타입 I 반응으로 전환할 수 있게 하며, 결과적으로, 진행성 감염으로부터 질병의 퇴치로 변화하게 한다(참조: Scott, 1991, 상동).

피사 등은(참조: Pisa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7708, 1992) 난소암 조직검사체로부터 IL10 mRNA를 검출하였으나 난소암 세포주(cell line)에서는 검출되지 않았다; 그들은 IL10의 출처가 종양-침윤성 림프구라고 결론지었다. 개스틀 등은(참조: Gastl et al., Int. J. Cancer, 55:96, 1991) 16/48 종양 세포주가 IL10을 배양 상등액으로 분비하는 것을 발견하였다; 흑색종 세포주는 3 내지 8 만이 양성이었다. 마지막으로, 첸 등은(참조: Chen et al., Int. J. Cancer, 56:755, 1994) 전이성 흑색종에서 유도된 세포주 6/9 이 IL10 mRNA를 발현한다고 보고하였다. 그러나, 본 발명이 전이성 흑색종 조직검사체로부터 IL10 mRNA를 발견한 첫 보고이다.

이러한 관찰을 사람 종양-숙주 관계에도 적용할 수 있는지, 즉, 종양에 침윤하는 T 세포에 의한 사이토카인의 생산 양식이 면역반응의 효과의 지표가 되는지 알 수는 없다. 전이성 흑색종 환자를 자가의 DNP-변형된(autologous, DNP-modified) 백신으로 치료한 결과 종양 부위에 염증 반응을 일으켰다(참조: Berd et al., 1991, 상동). 조직학적으로, 이러한 염증성 상해는 T 세포 침윤의 특성이며 때로는 종양 세포 파괴와 연관된다. 본 발명에서는 DNP-백신으로 치료한 환자의 종양이 타입 I 림프구를 포함하고 있는 반면, 백신 투여 전에 잘라낸 종양에는 포함되지 않음을 발견하였다.

사람의 암을 치료하기 위한 기존의 시도들은 성공적이지 못하거나, 부분적으로 성공하더라도 바람직하지 않은 부작용을 일으킨다. 여러 가지 면역학적 원리에 입각하여 시도된 암치료 또한 성공적이지 못하였다. 본 출원자가 어떤 환자에서는 합텐-접합된 흑색종 세포를 이용하여 흑색종을 성공적으로 치료하였으나, 암치료 기술에 있어서 항-종양 반응을 유도하는 또 다른 향상된 방법이 요구된다. 출원자는 합텐-변형된 종양 세포 또는 추출물을 이용하여 효과적인 백신 접종 프로토콜을 발견하였다.

[발명의 요약]

본 발명은 합텐-변형된 종양 세포와 종양 세포 추출물을 포함하는 조성물 및 암환자에게 본 발명의 조성물을 투여하여 항종양 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

한가지 측면에 따르면, 본 발명은 포유류의, 바람직하게는 사람의, 분리되어 합텐으로 변형된 종양 세포 또는 종양 세포 추출물에 관한 것이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 포유류의 합텐으로 변형된 종양 세포 또는 종양 세포 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 포유류의, 바람직하게는 사람의, 합텐으로 변형된 종양 세포 또는 종양 세포 추출물의 치료에 유효한 양을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 포유류에게, 바람직하게는 사람에게, 합텐으로 변형된 종양 세포 또는 종양 세포 추출물의 치료에 유효한 양을 포함하는 조성물을, 전기 종양 세포막과 같은 종류의 악성 종양을 앓고 있는 전기 포유류에 투여하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 주간(weekly) 백신 접종 계획에 따라 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 합텐-변형된(hapten-modified) 종양 세포 및 추출물, 그리고 종양 세포 및 추출물을 포함하는 조성물의 치료 효과적인 양을 그러한 치료를 필요로 하는 대상에 투여함으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암환자에게 항종양(antitumor) 반응을 유도하는데 사용되는 효과적인 백신접종(vaccination) 계획에 관한 것이다.

도 1은 DNP-변형된 자가 PBL 및 흑색종 세포에 대한 DTH 발전 속도를 나타낸 그래프이다. DNP-백신으로 치료받은 전이성 흑색종 환자의 피부를 DNP-변형된 PBL(LY) 또는 전이성 덩어리로부터 분리한 DNP-변형된 흑색종 세포(MEL)로 연속적으로 테스트하였다. 각 막대기는 각 시기별로 환자 그룹의 DTH 반응의 평균치를 나타낸다; 오차 막대기 = 평균 오차. 119일째에는 PBL에 대한 반응만 측정하였다. 시료 크기: 0, 14, 63일, N = 84; 119일, N = 57, 175일, N = 42; 231일, N = 35.

도 2는 DNP에 대한 항체 반응을 나타내는 그래프이다. 각각 다른 시기에 수득한 혈청에서 ELISA를 이용하여 DNP에 대한 항체(전체 면역글로불린)를 측정하였다. 항체역가는 다음과 같이 정의한다: (시료의 최대 OD) X (양성 대조군의 최대 OD의 반에 해당하는 OD를 나타내는 희석 배수의 역수).

도 3은 DNP-변형된 자가 림프구에 대한 PBL의 증식 반응을 나타내는 그래프이다. PBL은 DTH 반응이 최고치일 때 DNP-백신을 투여 받은 4명의 환자로부터 수득한 것이다. 세포는 DNP-변형된 자가 PBL(autol LY-DNP)과 대조구로서 자가 PBL(autol LY)에 대한 증식 능력을 테스트하였다. 배양물은 6일째에¹²⁵IUDR로 펄스(pulse) 표지 하였다.

도 4는 DNP-변형된 림프구에 대한 증식 반응 속도를 나타낸 그래프이다. PBL은 DNP 백신을 투여 받는 동안 환자 DM2에서 연속적으로 수득한 것이다. 시료는 동결조존하였으며 모든 시료는 동시에 DNP-변형된 자가 PBL(autol LY-DNP)에 대한 증식 반응을 테스트하였다. 배양물은 6일째에¹²⁵IUDR로 펄스(pulse) 표지 하였다.

도 5는 DNP-변형된 세포에 대한 증식 반응의 특이성을 나타낸 그래프이다. 두명의 환자로부터 수득한 PBL은 변형되지 않은(autol LY), DNP-변형된(autol LY-DNP), 또는 TNP-변형된(autol LY-TNP) 자가 PBL 및 변형되지 않은(MEL) 또는 DNP-변형된(MEL-DNP) 배양된 자가 흑색종 세포에 대한 증식 반응을 테스트하였다. 배양물은 6일째에¹²⁵IUDR로 펄스(pulse) 표지 하였다.

도 6은 증식된 T 세포의 특이성을 분석한 그래프이다. DM2 환자로부터 수득한 PBL은 IL2 존재 및 DNP-변형된 자가 B 림프아세포의 반복적 자극하에 증식시켰다. PBL은 변형되지 않은(autol LY), DNP-변형된(autol LY-DNP), 또는 TNP-변형된(autol LY-TNP) 자가 PBL 및 변형되지 않은(MEL) 또는 DNP-변형된(MEL-DNP) 배양된 자가 흑색종 세포; 그리고 동종이계 PBL(Allo LY)에 대한 증식 반응을 테스트하였다. 배양물은 6일째에¹²⁵IUDR로 펄스(pulse) 표지하였다.

도 7은 DNP-변형된 자가 세포에 대한 CD8+ 및 CD4+의 반응을 나타낸 그래프이다. 증식된 T 세포는 양성 패닝(positive panning)으로 CD8-풍부한 또는 CD4-풍부한 개체군으로 나누었다. T 세포는 변형되지 않은(autol LY), 또는 DNP-변형된(autol LY-DNP) 자가 PBL 및 변형되지 않은(MEL) 또는 DNP-변형된(MEL-DNP) 배양된 자가 흑색종 세포 대한 증식 반응을 테스트하였다. 배양물은 6일째에¹²⁵IUDR로 펄스(pulse) 표지 하였다.

도 8은 DNP에 반응하는 T 세포에 의한 사이토카인 생성을 나타낸 그래프이다. DNP에 반응하는 T 세포주(DNP-reactive T cell line, "부모(parent)") 및 한계희석법에 의해 접종(plate)하여 수득한 세가지 계대배양물(2F8, 1D7, 1C2)을 DNP-변형된 자가 B 림프아세포와 함께 18시간 배양하였다; 상등액은 모아서 감마 인터페론과 IL4를 분석하였다.

도 9는 항 MHC 클래스 I 단일클론 항체에 의한 T 세포 반응의 방해를 나타낸 그래프이다. 증식된 CD8+ T세포는 DNP-변형된 자가 림프아세포로 자극시켜 18시간 후에 감마 안터페론을 분석하였다. 자극 세포는 다음 중 한가지로 전처리(preincubate)하였다: 항체 없음(none), 비특이적 쥐 IgG(non-specific), 단일클론 항체 W6/32(class I), 또는 단일클론 항체 L243 (class II).

도 10은 T 세포 반응에 대한 MHC 제한(restriction)을 나타낸 그래프이다. 증식된 T 세포(HLA-A1, A2, B8, Bw6)는 DNP-변형된 자가 PBL 및 DNP-변형된 4명의 환자로부터 수득한 동종이계 PBL 에 대한 반응으로 세포 증식 능력을 테스트하였다. 동종이계 자극물 3개는 하나 또는 그 이상의 클래스 I 유전자좌와 일치하며 4번째 것은 완전히 일치하지 않았다(A24, A26, B44,B63). 배양물은 6일째에¹²⁵IUDR로 펄스(pulse) 표지 하였다.

도 11은 DNP에 반응하는 T 세포의 세포상해성(cytotoxicity)을 나타낸 그래프이다. 자가(autol) 또는 클래스 I-일치하지 않는 동종이계(allo)의 흑색종 세포를 6시간 크롬 유리 측정(⁵¹Cr assay)의 표적(target)세포로 사용하였다. 효과세포(effector cell)는 증식된 CD8+, DNP-반응성의 T 세포이다. 도 11a - 작동세포는 다양한 농도의 DNBS 또는 TNBS로 합텐화 시켰다. 효과세포:작동세포 비율은 20:1 이다. 도 11b - 2.5mg/ml의 DNBS 또는 TNBS로 합텐화시킨 작동세포는 일련의 효과세포:작동세포(E:T) 비율의 효과세포와 혼합하였다.

도 12 는 수술 후 DNP 백신 및 대조구로 합텐화 되지 않은 백신으로 치료 받은 환자가 수개월 동안 종양이 나타나지 않은 퍼센트를 나타낸 그래프이다.

도 13은 한 그룹에 10개 분획씩 5그룹으로 나눈 HPLC 분획을 나타낸 그래프이다. 그룹 2에서는 DNP-변형된 흑색종 세포(DNP-MEL) 또는 DNP-변형된 B 세포(DNP-LY)로부터 유래된 펩타이드가 자극인자이다.

도 14a 내지 14b DNP 백신으로 면역화된 환자의 염증성 피하 흑색종 결절에서 발현된 IFN 와 IL10 mRNA를 나타낸다. 도 14a는 RT-PCR로 분석한 사이토카인 mRNA를 나타낸 그래프이다(레인 1 = 크기 마커; 2 = 베타 액틴(actin); 3 = IFN ; 4 = IL4, 5 = IL10); 도 14b는 피하 병소(subcutaneous lesion)를 H＆E로 염색한 현미경 사진이다(400X).

도 15a 내지 15b는 면역화되지 않은 환자의 림프절 전이체의 IL10 mRNA(IFN 는 아님) 발현을 나타낸다. 도 15a는 RT-PCR로 분석한 사이토카인 mRNA를 나타낸 그래프이다(레인 1 = 크기 마커; 2 = 베타 액틴(actin); 3 = IFN ; 4 = IL4, 5 = IL10); 도 15b는 림프절 전이체(lymph node metastasis)를 H＆E로 염색한 현미경 사진이다(400X).

도 16은 사람 흑색종 전이체에 발현된 IL10 mRNA의 젤 사진이다. 사이토카인 mRNA는 RT-PCR로 분석하였다(레인 1 = 크기 마커; C = IL10 cDNA 대조구; 1-7 = 환자 시료).

도 17은 흑색종 세포에 발현된 IL10 mRNA의 젤 사진이다. 도 17은 대표적인 종양 조직검사체와 그로부터 유도된 세포주에서 발현된 IL10 mRNA를 RT-PCR로 분석하였다(레인 1 = 크기 마커; 2 = IL10 cDNA; 3 = 종양 조직검사체; 4 = 종양 세포주).

도 18A-18B는 염증을 일으키지 않은 흑색종 조직검사체의 파라핀 단편의 인 시츄 RT-PCR 현미경 사진이다(A=100X, B=400X).

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 암의 면역적 치료에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 종양 조성물과 암을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 주간 백신접종 계획(weekly vaccination schedule)에 의한 항종양 반응의 유도 방법에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위하여 항종양 반응이란 다음 중 적어도 한가지가 해당된다: 종양 괴사(tumor necrosis), 종양 퇴화(tumor regression), 종양 염증(tumor inflammation), 활성화 T 림프구(activated T lymphocyte)에 의한 종양 침윤(tumor infiltration), 지연형 과민 반응(delayed-type hypersensitivity reaction) 및 환자의 생명 연장. 본 발명의 종양 세포와 그의 추출물 및 그들의 조성물은 포유류 종양을 침윤하는 성질을 가진 T 림프구를 유도할 수 있고, 포유류 종양에 대하여 염증성 면역 반응을 유도할 수 있고, 포유류 종양에 대해서 지연형 민감 반응을 유도할 수 있고 및/또는 생체외에서 T 림프구를 자극할 수 있다.

본 발명에 따르는 치료의 결과로 유도된 항종양 반응은 전이성 종양 또는 정상성(stable) 질병을 부분적으로 또는 완전히 퇴화시키는 것이다. "완전한(complete)" 퇴화이란 적어도 한달 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월간, 100% 퇴화을 의미한다. "부분적(partial)" 퇴화이란 적어도 한달 동안, 더욱 바람직하게는 적어도 3개월간, 약 50% 이상의 퇴화을 의미한다. "정상성(stable)" 질병이란 백신 치료 후 상당한 종양의 성장이 발견되지 않는 상태를 의미한다. 본 발명에 따르는 치료 후에 나타나는 또 다른 항종양 반응은 생명의 연장이다.

전이성 및 원발성 종양(primary tumor), 그리고 경성 종양(solid tumor) 및 비경성(non-solid) 종양 등 어떤 악성 종양도 본 발명에 따라서 치료할 수 있다. 경성 종양은 암종(carcinoma)을 포함하며 비경성 종양은 혈액암(hematologic malignancies)을 포함한다. 암종은 선암(adenocarcinomas)과 상피암(epithelial carcinomas)을 포함하나 이에 한정 되지 않는다. 혈액암은 백혈병(leukemias), 림프종(lymphoma) 및 다발성 골수종(multiple myelomas)을 포함한다. 다음은 본 발명의 분리 변형된(isolated modified) 종양 세포막으로 치료할 수 있는 암의 예들이나 이에 한정되지 않는다: 진행된 난소암(advanced ovarian)을 포함하는 난소암, 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia)을 포함하나 이에 국한되지 않는 백혈병, 간으로 전이된 결장암(colon metastasized to liver)을 포함하는 결장암(colon), 직장암(rectal), 결장직장암(colorectal), 흑색종(melanoma), 유방암(breast). 폐암(lung), 신장암(kidney) 그리고 전립선암(prostate cancer) 등이 있다. 난소암은 선암 또는 상피암이다. 결장암 또는 전립선 암은 선암이다. 백혈병은 골수(myeloid bone marrow) 또는 림프절에서부터 유래된다. 백혈병은 발달의 초기 단계에서 분화가 멈추어 나타나는 급성(acute) 백혈병 및 성숙된 림프계(lymphoid) 및 골수(myeloid) 세포의 지나친 증식으로 인한 만성(chronic) 백혈병이 있다. I, II, III, 또는 IV 단계, 바람직하게는 III 과 IV 단계, 더욱 바람직하게는 IV 단계의 암이 본 발명에 따라서 치료될 수 있다. 어떤 동물, 바람직하게는 사람이, 본 발명에 따라서 치료될 수 있다.

본 발명의 조성물은 종양 세포 또는 종양 세포 추출물로 제조된다. 종양 세포는 모든 종류 암의 악성 또는 악성 전단계(pre-malignant)의 세포일 수 있다. 본 발명에 따르면, 악성 전단계란 암세포임을 시사하지만, 아직 암세포는 아닌 모든 비정상 세포를 의미한다; 궁극적으로는 경부암으로 발전되는 이형성화(dysplastic change)된 경부(cervical) 세포, 흑색종으로 발전되는 비정상 피부 세포인 이형성 모반(dysplastic nevi) 등이 있으나 이에 국한 되지 않는다. 종양 세포 또는 종양 세포 추출물은 치료할 암과 같은 종류로부터 유래된 것이 바람직하다. 예를 들어, 흑색종 세포 또는 세포 추출물은 흑색종 종류의 암을 치료하는데 쓰인다. 종양 세포 또는 종양 세포 추출물은 조직검사 표본(biopsy specimen) 이나 조직 배양(tissue culture)으로부터 분리한 자가(autologous) 또는 동종이계(allogenic)의 세포 및 이들의 추출액이지만 이에 한정되지 않는다. 한가지 바람직한 실시태양에 따르면, 자가 세포와 자가 세포 추출물을 사용한다. 그러나, 환자의 종양으로부터 분리한 자가 세포를 배양하여 생산한 종양 세포를 포함하는 어떤 종류의 비-동종이계 세포도 사용될 수 있다. 종양 세포는 치료 받는 환자의 종양 세포 또는 비-종양, 체세포와 유전학적으로 완전히(100%) 동일할 필요는 없다. 종양 세포와 환자 간의 MHC만 유전학적으로 동일하면 충분하다. 또한, 흑색종 세포의 특정한 항원과 환자의 종양 세포에 존재하는 항원 사이에 유전적 동일성이 있을 수 있다. 유전적 동일성은 당업계에 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 예를 들어, 환자의 특정한 MHC 분자 및/또는 환자 암세포의 특정 항원에 대하여 유전적으로 동일해지기 위해 유전적으로 변환된(예를 들어 DNA 재조합 기술을 이용하여) 종양 세포는 "비-동종이계(non-allogeneic)"의 의미에 포함되며 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 세포는 "MHC-동일(identical)" 또는 "MHC-적합(compatible)"으로 표시한다.

본 발명의 종양 세포 추출물은 합텐-변형된 암세포에서 분리된 펩타이드이거나 합텐-변형된 암세포에서 분리된 세포막일 수 있다. 추출물 역시 처음에는 종양 세포에서 분리하여 합텐-변형될 수 있다.

본 발명의 목적을 위해서, 펩타이드는 단백질을 포함하여 둘 또는 그 이상의 복합물(compounds)이다. 펩타이드는 바람직하게는 약 1,000 kD 내지 약 10,000 kD의 저분자량이며 더욱 바람직하게는 약 1,000 내지 5,000이고, 합텐화된 종양 세포에서 분리하며 T 림프구가 감마 인터페론을 생산하도록 자극한다. T 세포는 작용(effector)과 조절(regulatory) 두 종류의 면역 작용을 매개하며, 단백질(림포카인, lymphokine)을 분비하고, 다른 세포를 사멸시킨다(세포상해성, cytotoxicity). 작용 기능은 지연형 과민증, 동종 이계 이식편 거절 반응(allograft rejection), 종양에 대한 면역성(tumor immunity) 및 대숙주 이식편 반응(graft-versus-host reactivity) 등을 포함한다. 림포카인 생산과 세포상해성은 T 세포의 작용 기능으로 나타난다. T 세포의 조절 기능은 다른 T 세포에 의한 세포매개성 세포상해작용(cell-mediated cytotoxicity)을 증폭시키는 능력과 B 세포에 의한 면역 글로불린(immunoglobulin) 생산을 증폭시키는 능력으로 나타난다. 조절 기능 또한 림포카인의 생산을 필요로 한다. T 세포는 미토젠(mitogen), 항원, 렉틴(lectin) 등을 포함한 그러나 이에 한정되지 않는 유도 자극에 반응해서 감마 인터페론(IFN-)을 생산한다. 펩타이드는 약 8 내지 20개의 아미노산이 바람직하며, 또한 펩타이드는 합텐화되는 것이 바람직하다. 펩타이드는 세포의 표면, 내부, 또는 두 부분 모두에서 분리해도 된다. 추출물은 암세포의 종류에 따라(대 정상세포) 다르다. 본 발명의 펩타이드는 MHC, 세포 표면-연관 단백질(cell surface-associated protein), 암유전자(oncogene) 또는 돌연변이가 일어난 항-암유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 암세포막은 합텐화된 암세포로부터 분리한 세포막의 전부 또는 일부이다. 본 발명에 나타난 암세포막의 정의에 따르면, 암세포막은 분리한 후 합텐화하거나 또는 암세포를 합텐화시킨 후 막을 분리할 수 있다.

세포추출물은 T 세포를 자극할 수 있다. 본 발명의 목적을 위한 자극은 세포추출물에 반응하여 T 세포가 사이토카인을 생산할 뿐 아니라, 증식하는 것을 의미한다. 합텐-변형된 종양 세포에서 분리된 막과 단백질은 각각 독립적으로 T 세포를 자극할 수 있는 능력이 있다. T 세포의 증식은³H-티미딘,¹²⁵IUDR(iododeoxyuridine) 등에 의해, 그러나 이에 한정되지 않는, 변형된 핵산 및 살아있는 세포를 염색시키는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) 등의 염료를 섭취(uptake)시킴으로써 관찰할 수 있다. 또한, IFN , 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, 이하 'TNF'라 함), 및 IL-2 등의, 그러나 이에 한정되지 않는, 사이토카인을 생산한다. 사이토카인의 생산은 바람직하게는 15 picogram/ml 이상이며 더욱 바람직하게는 약 20 내지 약 30 picogram/ml이고 더더욱 바람직하게는 약 50 picogram/ml 이다.

바람직하게는, 종양 세포추출물은 특정 종류의 암에 유일한, 또는 매우 특이한 세포 물질을 포함한다. 본 발명의 종양 세포는 살아있는 세포일 수도 있다. 한가지 바람직한 실시태양에 의하면, 본 발명의 종양 세포와 세포추출물은 환자 몸속에 주입된 후 몸속에서 증식할 수는 없다. 세포가 증식하는 것을 방지하는 방법은 당업자에게는 잘 알려져 있다. 예를 들어, 종양 세포는 사용하기 전에 방사선 조사를 할 수 있다. 한가지 실시태양에 의하면, 종양 세포와 추출물은 주사 후 증식을 방지하기 위해 약 2500 cGy로 조사한다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 방법에 있어서 한가지만 사용하든지 또는 본 발명의 다른 성분을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 다른 성분과 복합적으로 사용할 수 있다. 따라서, 암세포와 암세포 추출물은 단독으로 또는 같이 투여(coadministration)할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 같이 투여함이란 같이 동시에 또는 차례대로 투여를 포함한다. 또한, 암세포막은 펩타이드와 같이 투여할 수 있다. 더욱이, 암세포와 암세포 추출물은 인터루킨2, 인터루킨4, 감마 인테페론, 인터루킨12, GM-CSF 등의 사이토카인을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 다른 성분과 같이 투여할 수 있다. 본 발명의 종양 세포와 추출물은 화학요법, 방사선 조사, 항체, 올리고누클레오타이드 서열, 역방향 올리고누클레오타이드 서열(antisense oligonucleotide sequence) 등을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 다른 암치료와 병행해서 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여하는 방법과 약학의 표준 관례에 따라 약학적으로 허용되는 담체(pharmaceutically-acceptable carier)와 혼합물로 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 몸무게 및 상태에 따라 결정할 수 있다. 담체에 대한 활성 성분의 비율은 일반적으로 조성물의 화학적 성질, 용해도, 안정성 등과 투여량에 의해 결정된다. 본 발명의 종양 세포와 추출물의 양은 암세포에 대한 조성물의 친화도, 암세포의 양, 조성물의 용해도 등의 요소에 따라 사용한다.

본 발명의 조성물은 면역적 아주반트 및/또는 약학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있다. 약의 전달에 사용되는 생리 식염수 등의 그러나 이에 한정되지 않는 어떠한 기존의 수용성 운반체도 본 발명에 따라서 담체로 사용할 수 있다. 또한, 어떤 기존의 아주반트도 본 발명의 운반을 위해서 사용될 수 있다. 아주반트는 본 발명의 종양 세포 제제에 반응하여 면역반응을 증강시키는 성질이 있다. 대표적인 아주반트로는 BCG, 또는 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria)의 나무껍질로부터 정제한 균질한 사포닌(saponin)을 포함하는 합성 부형제인 QS-21, 코리네 박테리움 파범(Corynebacterium parvum)(참조: McCune et al. Cancer, 43:1619, 1979), 일반적인 사포닌들, 무독화시킨 내독소(detoxified endotoxin) 및 인터루킨2, 인터루킨4, 감마 인테페론, 인터루킨12, 인터루킨15, GM-CSF 등의 사이토카인과 이들의 혼합물이 있다.

세포와 세포추출물을 조사해서 합텐화하는 경우, 세포를 먼저 합텐과 접합시킨 후 조사할 수 있다. 또는, 세포를 조사하고 나서 합텐에 접합시킬 수 있다. 어떤 경우든지, 추출물은 정제를 한 후에 조사 및/또는 합텐화한다. 추출물을 조사하여 합텐화하기 위하여, 어떤 방법이든 먼저 수행하고 다른 방법을 나중에 할 수 있다.

또는, 종양 세포 또는 종양 세포추출물을 항원제시 세포(antigen-presenting cell)에 첨가할 수 있다. 암세포 추출물은 다른 종류의 세포, 배양된 자가 대식세포(macrophage)와 배양된 수지상(dendritic) 세포로 구성된 그룹에서 선택한 항원제시세포와 함께 암치료에 사용될 수 있다. 대식세포란, 출처에 관계없이, 조직구(histiocyte)나 단핵세포(monocyte) 같이 다른 세포, 죽은 조직, 퇴화된 세포 등을 삼켜서 파괴하는 탐식작용을 하는 대형의 아메바성 단핵 세포를 의미하지만 이에 한정되지 않는다. 대식세포는 종양 항원을 포함하는 항원을 T 세포를 포함하는 세포에 제시하는 항원제시세포이다. 수지상 세포 또한 항원제시세포이며 대식세포와 가깝게 연관되어 있으나 수지상 세포는 대식세포 보다 더욱 효율적인 항원제시세포이다. 그들은 T 세포의 강력한 자극인자이며 혈액, 피부(수지상 세포는 랑겔한스(Langerhans) 세포로 불리운다), 림프계 조직 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 몸의 여러 기관이나 조직으로부터 분리할 수 있다.

예를 들어, 환자를 면역화하기 위하여 항원제시 세포의 펩타이드 또는 세포막을 사용할 수 있다. 환자의 혈액을 채취하여 그로부터 대식세포나 수지상 세포를 추출한다. 고농도의 펩타이드(약 1ng/ml 내지 약 1㎍/ml, 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 100ng/ml), 또는 세포막(약 10⁵내지 약 10⁷개 세포 등가물(cell equivalent, 이하 'c.e.'라 함), 세포수 상당량은 초기 세포수에 대한 것이며, 즉, 지정된 수의 세포로부터 얻은 세포추출물의 양)을 대식세포나 수지상 세포와 함께 overnight 또는 8시간 동안 항온 처리한다. 세포막과 함께 항온 처리하는 경우 세포막은 대식세포나 수지상 세포에 의해 잡아 먹힌다(phagocytized). 세포막을 섭취한 대식세포나 수지상 세포를 환자의 면역화에 사용하며(참조: Grabbe, S. et al., Immunology Today, 16:117, 1995), 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함 되어 있다.

본 발명의 백신 조성물은 예를 들어 일회 용량(dose)당 10⁴개 이상의 종양 세포 또는 세포 등가물의 종양 세포 추출물(즉, 분리한 세포막 또는 펩타이드)을 포함하며, 바람직하게는 적어도 10⁵cells/c.e.extract, 더욱 바람직하게는 적어도 10⁶cells/c.e.extract을 포함한다. 용량이란 한번 투여에 사용되는 백신 조성물의 양이다. 한가지 실시태양에 의하면, 백신 조성물은 용량 당 약 105 내지 약 2.5 x 10⁷cells/c.e.extract를 포함하며 더욱 바람직하게는 약 10⁶cells/c.e.이다. 한가지 바람직한 실시태양에 의하면, 백신 조성물은 최대 7.5 x 10⁶cells/c.e.extract를 포함한다. 본 발명의 종양 세포와 종양 세포막은 암세포에 대한 조성물의 친화도, 암세포의 양, 조성물의 용해도 등의 요소에 따라 사용한다. 용량은 또한 환자의 몸무게 및 상태에 따라 결정할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 피부내(intradermal), 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular) 및 피하(subcutaneous) 투여를 위한 일회 용량씩 포장할 수 있다. 또는, 일회 용량은 본 발명의 제제(즉, 종양 세포, 세포막, 펩타이드)를 포함하여 투여시 적절한 희석액으로 재구성 할 수 있다.

본 발명의 종양 세포, 종양 세포 추출물, 및 그들로 구성된 조성물은 피부내, 정맥내, 복강내, 근육내 및 피하에 접종(inoculation) 또는 주사(injection) 등의 적당한 방법으로 투여할 수 있다. 백신 치료 시 마다 여러 부위에 투여할 수 있다. 예를 들어, 백신 조성물은 투여 시 마다 인접한 두 군데 이상 또는 바람직하게는 세 군데에 피부내 주사로 투여할 수 있다. 본 발명의 한가지 실시태양에 의하면, 백신 조성물은 팔이나 다리의 상부에 투여한다.

본 발명의 백신 조성물을 투여하기 전에, 합텐을 피부에 투여해서 종양 세포와 세포막을 변형하기(modify) 위해 환자를 합텐으로 면역화할 수 있다. 예를 들어, 디니트로플루오르벤젠(dinitrofluorobenzene, 이하 'DNFB'라 함)를 사용 할 수 있다. 본 발명의 한가지 실시태양에 의하면, 환자는 백신 투여 전에 합텐으로 면역화하지 않는다. 그리고 나서(예를 들어, 약 2주 후에), 환자에게 종양 세포 또는 추출물조성물을 주사한다. 조성물(주사 등으로)은 모두 적어도 3회 바람직하게는 모두 적어도 6회에 걸쳐서 투여한다. 한가지 실시태양에 의하면, 총 투여 횟수(첫번 투여를 포함해서)는 8번이며 또 다른 실시태양에 의하면 10번이다. 백신 접종 스케쥴은 환자의 상태에 따라 의사가 결정할 수 있다. 백신은, 예를 들어, 매 4주 마다, 바람직하게는 매 2주 마다, 가장 바람직하게는 매주, 주사로 투여한다. 한가지 바람직한 실시태양에 의하면, 백신 치료는 매주 주사하여 모두 6회 실시하였다. 합텐화된 또는 합텐화 되지 않은 백신을 교대로 투여할 수 있다. 한가지 바람직한 실시태양에 의하면, 모든 백신은 합텐-변형된 종양 세포와 추출물을 포함한다. 추가자극(booster) 백신을 투여할 수 있다. 바람직하게는, 한번 또는 두 번 추가자극 백신을 투여한다. 예를 들어, 추가자극 백신은 초기 투여 후 약 6개월 또는 일년 후에 투여한다.

종양 세포에 대한 면역 반응을 증대시키기 위하여, 약물 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide, 이하 'CY'라 함)를 각 백신 투여 며칠 전(즉, 3일 전)에 투여할 수 있다. 한가지 바람직한 실시태양에 의하면, CY는 첫 번째 백신 주사 전에만 투여하다.

본 발명의 백신은 합텐화 되거나 또는 합텐화 되지 않는다. 합텐화 된, 또는 화학적으로 결합된(chemically-linked), 형태의 백신은 예를 들어, 디니트로페닐(dinitrophenyl, 이하 'DNP'라 함)로 합텐화된 종양 세포를 포함한다. 다른 합텐으로는 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl) ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzene sulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzene isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid), 디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 합텐의 혼합물을 사용할 수 있다. 종양 세포 추출물의 백신도 비슷한 방법으로 합텐화할 수 있다. 합텐화된 암세포 추출물의 경우, 추출물, 펩타이드, 암세포막은 합텐화 된 암세포로부터 분리한다. 본 발명은 또한 종양 세포 및/또는 세포 추출물의 합텐화하지 않은 백신도 생각할 수 있다.

본 발명의 한가지 실시태양에 의하면, 암이 있다고 생각되는 환자를 치료하는 방법은 약물학적으로 적정량의 사이클로포스파마이드 및 간암 세포 및 세포 추출물, 그리고 종양 세포 혼합물 및 종양 세포 추출물로 이루어진 그룹에서 선택한 조성물을 약물학적으로 적정량 투여하는 것을 포함한다. 조성물이 암세포 추출물인 경우, 추출물은 합텐화된 암세포로부터 분리한 펩타이드 또는 암세포막이다. 조성물은 면역학적 부형제 및/또는 약물학적으로 적절한 담체와 혼합할 수 있다. 합텐화 된 백신 투여 후, 선택 사항으로 합텐화하지 않은 백신을 약물학적으로 적정량 투여할 수 있다. 합텐화하지 않은 백신 또한 본 발명의 방법에 의해서 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, 본 발명의 조성물은 적어도 6주 동안 매주 투여하며 첫 번 투여 전에 약물학적으로 적정량의 사이클로포스파마이드를 투여한다. 바람직하게는, 조성물은 최대 7.5 x 10⁶세포 또는 세포 등가물 추출물을 포함한다. 환자는 백신 투여 전에 합텐으로 면역화할 필요가 없다.

본 발명의 백신 조성물은 종양 세포 및/또는 종양 세포 추출물을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 종양 세포는 다음과 같이 제조된다. 종양 덩어리(tumor mass)는 전문이 참조 문헌으로 본 명세서에 포함된 방법(Berd et al., 1986, 상동) 대로 처리한다. 세포는 기계적 분해와 콜라게나제 및 DNA 분해 효소를 이용한 효소 분해로 추출하여, 냉각 속도가 조절되는 동결기에서 동결시킨 후 필요할 때까지 액체질소에 보관한다. 환자의 피부에 테스트를 하거나 치료하는 날, 세포를 해동시킨 후, 세척하고 약 2500 R 으로 조사한다. 다시 세척한 후, 페놀레드를 제거한 행크스 식염액에 현탁한다. 처리된 세포와 DNP의 접합(conjugation)은 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된 방법(Miller and Claman, J. Immunol., 117:1519, 1976) 대로 수행하는데, 종양 세포와 DNFB를 무균 상태에서 30분 동안 항온처리한 후 멸균 생리적 식염수로 세척한다.

환자의 암세포는 세포막을 분리하여 세포막을 변형하거나 세포막을 분리하지 않고 변형하는 방법에 의해 합텐과 접합 시킨다.

암세포막은 환자의 변형되지 않은 암세포로부터 세포막을 분리하여 제조한다. 세포는 약 5배 부피의 1mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드(phenyl methyl sulfonyl fluoride, 이하 'PMSF'라 함)를 포함하는 30mM 중탄산염 나트륨에 현탁하여 유리 균질기(glass homogenizer)로 파쇄한다. 나머지 파쇄되지 않은 세포와 핵은 약 1000 g에서 원심분리하여 제거한다. 세포막은 100,000 g에서 90분간 원심분리하여 펠렛화 한다. 세포막은 약 8%의 자당에 재현탁하여 필요할 때까지 -80℃에서 동결시킨다. 세포막 현탁액(약 5,000,000 세포 등가물/ml)에 약 0.5 ml 의 1mg/ml DNFB를 30분간 첨가한다. 비슷한 방법으로, 트리니트로페닐과 N-요오드아세틸-N'-(5-설포닌 1-나프틸) 에틸렌 디아민도 사용할 수 있다. 여분의 DNP는 세포막을 0.15M PBS에서 약 3일간 투석하여 제거한다. 세포막은 펠렛화 한다.

다른 방법으로는, 환자의 암세포를 디니트로페닐같은 합텐으로 변형 시킨 후, 세포막을 분리하여, 암세포 추출물, 펩타이드 또는 세포막을 제조한다. 환자의 암세포는 조직검사시 채취하여 필요할 때까지 동결시킨다. 약 100mg의 DNFB(Sigma, U.S.A.)를 0.5 ml의 70% 에탄올에 용해시켰다. 약 99.5 ml의 PBS를 첨가하였다. DNFB의 농도는 약 152mg/0.1ml 이 되어야 한다. 용액은 37℃ 수조에서 하룻밤 동안 교반하였다. 용액의 보장 기간은 약 4주이다. 세포는 해동 시켜 펠렛을 행크스 식염액에 5X cells/ml 의 농도로 재현탁하였다. 약 0.1ml의 DNFB 용액을 1ml의 세포에 첨가하고 항온에서 약 30분간 방치하였다. 비슷한 방법으로, 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl) ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzene sulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzene isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic acid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid), 디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 합텐과, 이들의 혼합물을 합텐으로 사용할 수 있다. 세포는 행크스 식염액으로 2회 세척하였다. 세포는 약 5배 부피의 1mM PMSF를 포함하는 30mM 중탄삼염 나트륨에 현탁하여 유리 균질기(glass homogenizer)로 파쇄한다. 나머지 파쇄되지 않은 세포와 핵은 약 1000 g에서 원심분리하여 제거한다. 세포막은 100,000 g에서 90분간 원심분리하여 펠렛화 한다. 세포막은 약 8%의 자당에 재현탁하여 필요할 때까지 -80℃에서 동결시킨다.

DNP 변형된 세포로부터, 펩타이드를 추출하였는데 이들 중 일부는 세포의 변형화 결과로 DNP-변형화되었다. 당업자에게는 잘 알려진 방법으로 단백질 추출 후, 환자 치료에 효율적인 항원을 분리하기 위하여 항원 분석을 수행하였다. 세포 추출물을 분리하는 방법은 당 분야의 숙련된 자에게는 잘 알려져 있다. 간략하게, 암세포를 종양으로부터 분리하여 실험실에서 배양한다. 상술된 방법에 의하여 배양된 세포에 DNP를 첨가한다. 펩타이드는 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함하여 개시한 방법(참조: Rotzschke et al., Nature, 348:252, 1990)인 이미 확립된 방법에 의해서 분리한다. 세포는 약산(weak acid)으로 처리한다. 그리고 나서, 세포를 원심분리하고 상등액을 모은다. 작은 펩타이드를 포함하는 분획은 HPLC로 수득하여 농축시키고 동결시킨다. 분획들을 자가 B 림프아세포(autologous B lymphoblastoid)에 결합시켜, 흑색종-특이적 T 림프구를 자극시키는 능력을 테스트함으로써 분획의 면역 활성을 선별하였다.

세포는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, 이하 'TFA'라 함) 등의 약산(weak acid)으로 처리하지만 이에 한정되지 않는다. 그리고 나서, 세포를 원심분리하고 상등액을 모은다. 상등액에서 분자량이 5,000을 넘는 성분은 젤여과(G25 Sepharose, Pharmacia)하여 제거한다. 상등액의 나머지 부분은 역상(reversed phase) HPLC 컬럼(Superpac Pep S, Pharmacia-LKB)을 이용하여 0.1% TFA에서 아세토니트릴(acetonitrile)을 증가시키는 농도구배를 이용하여 분리한다; 유속 = 1ml/min, 분획 크기 = 1ml. 작은 펩타이드를 포함하는 분획은 기존의 방법(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 따라서 HPLC로 수득하여, 농축시키고 동결시킨다. 분획들을 자가 B 림프아세포(autologous B lymphoblastoid)에 결합시켜 종양(즉, 흑색종)-특이적 T 림프구를 자극시키는 능력을 테스트함으로써 분획의 면역 활성을 선별하였다.

엡스틴-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV, ATCC CRL-1612, B95-8 EBV에 의해 형질전환된 백혈구, cotton top marmoset, Saguinus oedipus)를 배양된 B 림프아세포에 첨가한다. B 림프아세포는 환자 자신의 림프구로부터 얻은 B 세포 종양으로 형질전환된다. 전이(metastasis)로부터 얻은 흑색종은 10% 소 태아 혈청(fetal calf serum) 또는 10% pooled 사람 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양한다. 부착되지 않은 세포는 RPMI 1640 배지로 씻어 낸다. 세포가 밀집증식(confluent)하였을 때, 0.1% EDTA를 첨가하여 세포를 떼어낸 후, 두 개의 플라스크에 나누어 넣는다. 밀집증식한 세포를 계속해서 나누는(split) 이러한 과정을 계속한다. T 세포에 의한 감마 인터페론 생산을 테스트하기 위하여, 환자의 혈액으로부터 림프구를 수득한다. DNP와 같은 합텐으로 변형된 환자 자신의 종양 세포를 림프구와 혼합하여 T 세포를 자극한다. 매 7일 마다 인터루킨-2를 첨가한다. T 세포는 상기 개시된 방법대로 나누어서(split) 증식시킨다. 그리고 나서, T 세포는 합텐으로 변형된 세포에 의해 다시 자극시킨다. 합텐으로 변형된 세포에 반응하는 T 세포가 풍부한 세포집단을 얻게된다.

사람의 암 백신은 여러 연구에서 개발되고 시험되었다. 그러한 백신들이 때로는 환자의 암에 대한 약한 면역성을 유도하기는 하지만, 거의 암을 퇴축(regress)시키지는 못한다. 전이성 종양에서 염증 반응으로의 발전이 놀랍게도 본 발명의 DNP-백신에서 발견되었다. 종양이 빨갛고, 따뜻하고, 부드럽게 되었다. 어떤 경우에는 육안 또는 현미경으로 보았을 때 궁극적으로 종양이 사라질 때까지 퇴축된다. 현미경으로 T 림프구가 종양 덩어리로 침윤하는 것이 관찰되었다. 그러므로, 염증 반응을 증가시키고 종양 안으로 들어가는 림프구의 숫자와 능력이 증가하는 이러한 접근방법은 당업계에서 눈에 띄는 발전이다.

백신의 효과는 다양한 생물학적 반응 변형인자를 첨가하여 향상시킬 수 있다. 이러한 인자들은 직접 또는 간접적으로 면역 반응을 자극한다. 본 발명의 생물학적 반응 변형인자는 인터루킨-12와 감마 인터페론을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 실시태양에 의하면, 백신 주사 후 매번 투여한다. 염증 반응을 일으키는 환자에게 IL2를 투여하면 T 세포가 종양 덩어리 안에서 증식하고 더욱 활성화 된다고 믿는다. T 세포의 증가된 숫자와 향상된 기능은 종양을 면역적으로 사멸시키게 한다. IL2의 용량은 상기한 용량 지침에 의하여 결정된다.

전이성 흑색종 환자는 다음과 같은 성분의 면역치료 요법을 이용하여 치료한다: 1) DNP 접합된 자가 종양 세포로 이루어진 백신; 및 2) 소량의 사이클로포스파미드 전처리. 종양 퇴화가 일어나는지 결정하고, 종양 염증 반응을 모니터하고, 자가 흑색종, DNFB(피부 감작화(sensitization)에는 DNP 형태), DNP 접합된 자가 림프구, 희석액(Hanks solution), 정제된 단백질 유도체(purified protein derivative, PPD) 및 상기(recall) 항원(candida, trichophyton, 및 mumps)에 대한 지연형 과민증을 측정하기 위하여 환자를 평가한다. 이러한 치료가 유익한 것으로(임상적 또는 면역학적으로) 생각되어지는 환자는 면역치료 요법을 계속한다. 이후의 백신은 사이클로포스파미드 없이 투여 할 수 있다. 비슷한 실험에서, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 결합된 인터루킨2는 효과가 없는 것으로 판명되었다.

또 다른 실시태양에 의하면, 합텐과 접합된 암세포의 화학적 추출물과 바실러스 칼메트 게린(Bacillus Calmette-Guerin, BCG )등의 면역 아주반트를 혼합한 백신을 사용하였다.

본 발명에 의하여, 사람 흑색종 전이체의 조직검사 시료에서 RT-PCR을 이용하여 사이토카인 mRNA의 발현을 측정하였다. IFN 의 mRNA는 DNP 백신 투여 후 염증을 일으킨 전이체에서 측정되었으나, 처치하지 않은 전이체에서는 거의 측정되지 않았고, 많은 수의 림프절 림프구를 포함하는 곳에서 조차도 거의 측정되지 않았다. 더구나, 타입 II 사이토카인, IL10,은 대부분의 흑색종 전이체에서 발견 되었고, 흑색종 세포 자신이 생산하는 것으로 나타났다.

자가의 DNP-변형된 백신으로 치료받은 전이성 흑색종 환자는 종양 부위에 염증 반응이 나타났다. 조직학적으로, 이러한 염증성 상해(lesion)는 때로는 종양 세포의 파괴와 관련이 있는 T 세포 침윤에 의한 것으로 나타난다. 본 발명에 의하여, 백신 치료 후 염증을 일으킨 8개의 피하 전이체의 조직검사 시료에서 IFN , IL4, TNF 및 IL10의 mRNA 발현을 측정하였다. 백신 투여 후, 염증을 일으킨 조직검사 시료는 IFN (5/8),IL4(4/8), 또는 둘다(3/8), 그리고 TNF(4/7)의 mRNA를 포함하는 것으로 나타났다. 반대로, 대조구(control)의 시료(처치전의 림프절 전이체 또는 염증을 일으키지 않은 피하 전이체)에서는 IFN mRNA는 1/17, TNF mRNA는 2/16 밖에 측정되지 않았다. 항염증(anti-inflammatory) 성질이 있는 사이토카인, IL10의 mRNA는 24/25 흑색종 전이체에서 측정되었고, 림프계 세포 함량에 무관하였다; 인 시츄 PCR에 의해서 흑색종 세포가 주요 출처임이 확인되었다. 이러한 발견은 암 면역치료법의 효과를 측정하는 새로운 요소를 제공한다.

본 발명은 새로이 채취한 전이성 흑색종의 조직검사 시료에서 종양 부위의 유익한(productive) 면역반응과 관계가 있는 사이토카인 mRNA의 측정에 목적이 있다. IFN 또는 IL4 mRNA의 발현은 DNP-변형된 자가 백신의 투여 후 나타나는 염증 반응을 일으키는 흑색종 전이체의 특징이다. 반대로, IL10 mRNA의 발현은 염증 반응과 무관하였고 거의 모든 흑색종의 조직검사 시료에서 발견되었다. 흑색종 조직검사 시료로부터 유래된 세포주(cell line)의 분석과 인 시츄 PCR분석은 IL10 mRNA의 주요 출처가 흑색종 세포 자신이며 다른 연관된 림프구가 아님을 증명하였다.

이 연구에서 가장 중요한 발견은 부정적인 것이다: IFN 또는 IL4 mRNA는 처치 받지 않은 환자의 흑색종 전이체 또는 많은 수의 림프절 림프구를 포함하는 흑색종 덩어리에서조차도 발견되지 않는다. 이러한 결과는 면역치료에 의해 변환된 T 세포 개체군에 비해 낮은 in situ 사이토카인 생산 바탕 활성도(background activity)를 제공한다. 게다가, 이것은 중요한 생물학적 요점을 낮게 평가한 것이다: 흑색종 림프절 전이체에서 추출한 T 세포는 아마도 원래부터 존재하던 림프절 림프구 개체군이지 흑색종 항원을 인식하고 침윤해 들어간 것은 아닐 것이다. 그들은 항원-활성화된 것이 아니므로, IFN 또는 IL4를 생산하도록 자극을 받은 것이 아니다.

반대로, DNP 백신 투여 후 수득한 조직검사 시료는 일반적으로 IFN mRNA를 발현한다. 그러나, DNP 백신에 의해 유도된 염증반응은 이 시료들의 일부분이 IL4를 포함하므로 타입 I의 특징이 아니다. PCR 방법 mRNA 분석의 민감도로 보아, 이러한 형태는 IFN 를 주로 생산하는 T 세포 침윤체의 가운데에서 IL4를 생산하는 T 세포의 작은 포커스(focus)에 의해 생산된 것일 수도 있다. 반대로, IFN 및 IL4 mRNA의 존재는 두가지 사이토카인을 모두 생산하는 THo 세포(참조: Lee et al. Eur. J. Immunol. 22:1455, 1992)로 불리는 T 세포의 존재를 의미할 수도 있다. 이러한 이슈의 해결은 인 시츄 PCR과 같이 mRNA 발현과 세포형태를 연관시켜 주는 분석을 필요로한다. 어떤 결과이든, 이러한 발견은 종양 내부의 사이토카인 생산이 면역치료를 받고 있는 환자의 평가에 주요한 요소임을 시사한다.

본 발명은 IL10 mRNA의 출처가 연관된 림프구가 아니라 흑색종 세포 자신임을 강력하게 시사한다. 24/25 조직검사 시료에서 강한 mRNA 밴드가 측정되었고, 이들의 발현은 연관된 림프구의 숫자 또는 DNP 백신에 의해 유도된 염증반응과는 무관하였다. 더욱이, 인 시츄 PCR에 의해 mRNA가 흑색종 세포 내부에 존재하는 것이 밝혀졌다. 조직검사물에서 유래된 세포주는 IL10 mRNA를 발현하며 ELISA법으로 측정했을 때 IL10을 생산하는 것이 밝혀졌다.

흑색종 세포 내부의 IL10 생산의 생리학적 중요성은 명백하지 않다. IL10은 T 세포의 증식과 IL2 생산을 저해하며(참조: Jinquan, T. et al., J. Immunol., 151:4545, 1993), 아마도 대식세포의 협조자극 기능을 감소시킴으로써 지연형 과민증을 저해하는(참조: Lee, 전개서) 항염증 사이토카인으로 알려져 있다. 그러므로, IL10은 흑색종에 침윤해 들어가 흑색종에 대한 반응성을 가진 T 세포의 활성화 및 증식을 억제할 것이다. 그러나, 최근에 IL10이 CD8+ T 세포의 화학적 유인제(chemoattractant)임이 밝혀졌다(참조: Jinquan, 전개서); DNP 백신에 의해 유도된 림프구 침윤체에서 CD8+ T 세포가 지배 개체군인 사실은 이러한 성질로 설명된다. 어떤 경우이든, 종양 부위에서 IL10 생산의 변환은 종양-숙주 관계에서 중요한 결과이다.

본 발명의 범위는 또한, 암이 있는 것으로 추정되는 환자에서, 조사되고 합텐-접합된 자가세포 조성물(autologous, irradiated hapten-conjugated cell composition)의 효과를 측정하기 위해, 종양에 의한 사이토카인 생산을 선별하는 방법 및 상기 합텐-접합된 자가세포 조성물을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 포함한다; 환자 조직 시료에서 핵산을 포함하는 시료의 수득; 사이토카인 특이적 핵산의 증폭 또는 상기 조직 시료에서 사이토카인 특이적 핵산에 특이적인 탐침(probe)의 혼성화에 의해 나타나는 시그날의 증폭; 증폭된 핵산 또는 증폭된 시그날의 존재가 암을 의미하며, 상기 환자의 조직 시료에서 증폭된 핵산 또는 증폭된 시그날이 상기 합텐-접합된 조성물의 효과를 의미하는 곳에서 증폭된 핵산 또는 증폭된 시그날의 측정.

예를 들어, 흑색종 종양(melanoma tumor) 또는 피하의 염증성 전이성 흑색종(subcutaneous inflamatory metastatic melanoma) 등의 악성 종양 또는 악성 전기(premalignant) 종양이 조직 시료가 될 수 있다. 또한, 조직 시료는 암이 있다고 추정되는 환자의 종양의 모든 부분, 침, 객담, 점액, 골수, 혈청, 혈액, 소변, 림프, 또는 눈물 등의 경성(solid) 또는 액성(liquid) 조직 시료가 될 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

핵산, DNA(cDNA 포함) 및 RNA(mRNA 포함) 등의 핵산은 환자의 조직 시료로부터 수득한다. 바람직하게는 RNA는 조직 시료로부터 수득한다. 총 RNA는 기존의 어떤 기술로도 추출 가능하며 방법은 참조 문헌에 포함되어 있다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

핵산은 추출 후 기존의 방법으로 증폭시켰다. 증폭 단계는 사이토카인 특이 서열의 일부분에 상보적인 적어도 한 개의 프라이머 서열 사용을 포함한다. 사이토카인 특이 서열은 본 발명의 목적을 위해서 IFN , TNF, IL-2, IL-12 및 IL-13를 암호화하는 서열의 전체 또는 일부를 포함(그러나 이에 한정되지 않는)하는 것으로 정의된다. 대체로, 프라이머 서열은 길이가 약 21 누클레오타이드 내지 33 누클레오타이드이며, 바람직하게는 약 21 누클레오타이드, 31 누클레오타이드, 32 누클레오타이드 및 약 33 누클레오타이드이다.

증폭 방법에 사용되는 프라이머 서열은 다음과 같은 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는다: -액틴(actin), 서열번호 1과 2; IFN , 서열번호 3과 4; IL4, 서열번호 5와 6; IL10, 서열번호 7과 8; 및 TNF, 서열번호 9와 10.

주형(template)을 사용하는 증폭 과정은 한쌍의 프라이머를 사용하는데, 그중 하나는 사이토카인 특이 단백질을 암호화하는 핵산서열에 상보적인 올리고누클레오타이드를 포함한다. 한쌍의 프라이머 중 한 개는 서열번호 1 내지 10 으로 구성되는 그룹에서 선택할 수 있다.

또는, 프라이머 쌍의 두개 올리고누클레오타이드 각각은 사이토카인을 암호화하는 염기서열에 특이적이다. 프라이머는 예를 들어 사이토카인 서열 내에서 각각 떨어진 부분에 상보적으로 디자인한다. 떨어진 부분이란 첫 번째 프라이머는 사이토카인 서열의 3' 부위에 상보적이고 두 번째 프라이머는 사이토카인 서열의 5' 부위에 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게, 프라이머는 별개의 떨어진 부위에 상보적이며 서로는 상보적이 아니다. 서열번호 1 내지 10의 프라이머는 단지 본 발명에서 사용된 프라이머의 예일 뿐이다.

증폭방법(예를 들어 중합효소연쇄반응 등)이 두 개의 프라이머를 포함하는 경우, 첫 번째 프라이머는 서열번호 1, 3, 5, 7 및 9에서 선택하고, 두 번째 프라이머는 서열번호 2, 4, 6, 8 및 10 으로 구성되는 그룹에서 선택할 수 있다. 서로를 향해서 핵산을 전사하며 사이토카인에 특이적인 어떤 프라이머 쌍도 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다.

바람직하게는 전체 RNA를 추출한다. 본 명세서에서, "증폭(amplification)"이라 함은 주형-의존형(template-dependent) 방법 및 벡터가 매개하는 증식을 의미하며, 특정한 핵산의 농도가 초기 농도에 비해서 증가하거나 측정할 수 있는 시그널의 농도가 증가하는 것을 의미한다. 주형-의존형 방법이라 함은 프라이머 분자의 주형-의존형 확장을 포함하는 방법을 의미한다. 주형-의존형 방법이라 함은 RNA 또는 DNA의 합성을 의미하며 새로 합성된 핵산 가닥의 서열은 염기쌍이 서로 상보적이 되는 잘 알려진 규칙을 따른다(참조: 예를 들어 Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif., 1987, 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함되었다.). 일반적으로, 벡터가 매개하는 방법이란 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 벡터에 도입하여, 벡터를 클론으로 증폭시키고(clonal amplification) 증폭된 핵산 단편을 회수하는 것이다. 이러한 방법의 예들은 코헨(Cohen) 등(미국특허 제 4,237,224호)과 마니아티스 등(참조: Maniatis, T. et al., Molecular Cloning(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)에 의해 제공되며, 각각은 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함되었다.

시료에 존재하는 표적서열(target sequence)을 증폭시키는데 여러가지 주형-의존형 방법이 있다. 가장 잘 알려진 증폭방법 중의 하나는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 'PCR'라 함)으로 미국특허 제 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호 및, 이니스 등(참조: Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego CA, 1990 )에 상세히 기술되었고, 각각은 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함되어 있다. 간략하게, PCR에서 두 개의 프라이머 서열은 표적서열의 반대되는 상보 가닥 위의 부위에 상보적으로 제조된다. 과량의 디옥시누클레오사이드 트리포스페이트(deoxynucleoside triphosphate)를 DNA 중합효소(즉, Taq polymerase)와 함께 반응 혼합액에 첨가한다. 만일 시료에 표적서열이 존재하면, 프라이머는 표적에 결합하여, 중합효소는 표적서열을 따라 염기를 더해가며 프라이머를 확장한다. 반응 혼합액의 온도를 올리거나 낮춤으로써, 확장된 프라이머는 표적으로부터 분리되어 반응 생성물을 형성하고, 과량의 프라이머는 표적과 반응 생성물에 결합하고 전과정을 반복한다. 바람직하게는, 역전사효소(reversetranscriptase) PCR 증폭 방법은 증폭된 mRNA의 양을 측정하기 위해 수행한다. 중합효소연쇄반응 방법은 당업계에 잘 알려진 방법이다.

다른 증폭 방법은 연결효소연쇄반응(ligase chain reaction, 이하 'LCR'이라 함)이며 EPA 제 320,308호에 개시되었고, 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함 되었다. LCR에서는, 두 개의 서로 상보적인 탐체쌍을 제조하고, 표적서열이 존재하면 각쌍은 표적의 반대쪽 상보 가닥에 결합하여 서로 인접하게된다. 연결효소 존재하에서 두 탐체쌍은 연결되어 하나의 단위체(unit)가 된다. PCR에서 처럼, 온도 순환에 의해서, 결합 연결된 단위체는 표적으로부터 분리되어, 과량으로 존재하는 탐침의 연결반응(ligation)의 "표적서열(target sequence)" 역할을 하게된다. 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된, 미국특허 제 4,883,750호는 탐체쌍이 표적서열에 결합하는 LCR과 비슷한 또 다른 증폭 방법을 기술하고 있다.

전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된, PCT 국제출원 제 PCT/US87/00880호 에 기술된, 큐베타 복제효소(Qbeta Replicase)는 본 발명의 또 다른 증폭 방법으로 사용되었다. 이 방법에서, 표적 서열과 상보 부위를 갖는 RNA의 복제서열(replicative sequence)을 RNA 중합효소 존재하에 시료에 첨가한다. 중합효소는 복제서열을 복제하고 이것을 측정한다.

제한효소 인식서열(restriction site)의 한 가닥에 누클레오티드 5'-[알파-티오] 트리포스페이트를 포함하는 표적 분자를 증폭하기 위하여 제한효소와 연결효소를 사용하는 등온 증폭방법(isothermal amplification method)(참조: Walker, G.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:392, 1992)도 본 발명의 핵산 증폭에 사용된다.

가닥치환증폭(strand displacement amplification, 이하 'SDA'라 함)도 핵산의 등온(isothermal) 증폭에 사용되는 방법으로 여러번의 가닥 치환과 합성, 즉 닉 번역(nick translation)이 일어난다. 복구연쇄반응(repair chain reaction, 이하 'RCR'라 함)이라 불리우는 비슷한 증폭 방법도 본 발명에서 사용되며, 증폭하고자 하는 표적 부위에 여러개의 탐침을 결합시켜(anneal) 4개의 염기 중 2개 만이 존재하는 상태에서 수선반응을 수행한다. 다른 두 개의 염기는 확인을 쉽게 하기 위하여 비오틴(biotin) 유도체를 첨가한다. SDA에서도 비슷한 방법이 사용된다.

사이토카인 특이 서열은 순환 탐침 반응(cyclic probe reaction, 이하 'CPR'라 함)을 사용하여 확인할 수 있다. CPR에서는 탐침이 3' 과 5'에 사이토카인 비특이 서열을 포함하며 중앙에 사이토카인 특이 서열을 포함하는 RNA로 시료에 존재하는 DNA와 혼성화(hybridization)된다. 혼성화되면 RNA 분해효소 H(RNase H)를 처리하여 특유의 산물로 확인된 탐침의 산물이 유리되어 시그널로 나타난다. 원래의 주형은 또 다른 순환(cycling) 탐침에 결합하여 반응이 반복된다. 그러므로, CPR은 탐침이 사이토카인 특이 서열에 혼성화되어 나타내는 시그널을 증폭시킨다.

영국특허출원 제 2,202,328호 및 PCT 국제출원 제 PCT/US89/01025호에 기술되어 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된, 또 다른 증폭 방법이 본 발명에 의해서 사용되었다. 전자(former)의 출원에서는, PCR과 비슷하게 주형과 효소 의존형 합성이 일어나며 "변형된(modified)" 프라이머가 사용된다. 프라이머는 캡쳐 잔기(capture moiety)(즉, 비오틴) 및/또는 검측 잔기(detector moiety)(즉, 효소)로 표식(labelling)하여 변형한다. 후자의 경우는, 과량의 표식된 탐체를 시료에 첨가한다. 탐체는 표적서열에 결합하여 효소에 의해 절단된다. 절단 후에, 표적서열은 원래대로 유리되어 다시 과량의 탐체와 결합한다. 표식된 탐체의 절단은 표적서열이 존재하는 시그널이다.

또 다른 핵산 증폭 방법은 전사에 의한 증폭 시스템(transcription-based amplification system, TAS)(참조: Kwoh D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86:1173, 1989; Gingeras T.R. et al., PCT 국제공개 제 WO 88/10315호, 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)으로, 핵산 서열 기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification, 이하 'NASBA'라 함) 및 3SR이 이에 포함된다. NASBA 에서는, 핵산을 표준 페놀/클로로포름 방법으로 추출하는데, 임상시료를 열처리 하고, 용해 완충용액으로(lysis buffer) 처리하여 DNA와 RNA는 미니스핀(minispin) 컬럼에서 분리하거나 RNA는 구아니디움 클로라이드(guanidinium chloride)를 이용하여 추출할 수도 있다. 이러한 증폭 방법은 전립선 특이 서열 프라이머의 결합을 포함한다. 중합반응 후에, DNA/RNA 하이브리드를 RNase H로 분해하고 이중가닥 DNA는 열처리한다. 어떤 경우든지, 단일 가닥 DNA에 두 번째 전립선 특이 서열 프라이머를 첨가하고 중합반응에 의해서 DNA를 완전한 이중가닥으로 만든다. 이중가닥 DNA 분자는 T7 및 SP6 등의 중합효소에 의해 여러번 전사된다. 등온 순환 반응에서, RNA는 역전사 되어 이중가닥 DNA가 되고, 이중가닥 DNA 분자는 T7 및 SP6 등의 중합효소에 의해 다시 전사된다. 결과적으로 생긴 산물은 중간에 절단되든 완전하든, 전립선 특이 서열임을 의미한다.

다비 등은 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된 유럽특허 출원 제 329,822호에 핵산 증폭 방법을 개시하였는데 이는 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA, 이하 'ssRNA'라 함), ssDNA 및 이중가닥 DNA (double-stranded DNA, 이하 'dsDNA'라 함)를 순환적으로 합성하는 방법으로 본 발명에 의해서 사용될 수 있다. 첫 번째 프라이머 올리고누클레오타이드는 첫 번째 주형 ssRNA에 결합하여, 역전사 효소(RNA-dependent DNA polymerase)에 의해 연장된다. 이때 생성된 DNA:RNA 이중가닥으로부터 RNA는 RNase H(DNA 또는 RNA와 이중가닥을 이루는 RNA에 특이적인 RNase)에 의해 제거된다. 결과물 ssDNA는 두 번째 프라이머의 두 번째 주형이 되며 주형서열과 상동 서열의 5'에 RNA 중합효소(T7 RNA polymerase 등의) 프로모터를 포함한다. 이 프라이머는 DNA 중합효소(E.coli DNA plymerase의 large "Klenow" fragment 등)에 의해 확장되어 dsDNA 분자가 되고, dsDNA 분자는 프라이머와 첨가된 프로모터 서열 사이에 원래 RNA 서열과 동일한 서열을 갖는다. 이 프로모터 서열은 적절한 RNA 중합효소에 의해 이용되어 DNA로부터 많은 RNA 를 만들어 낸다. 이 RNA는 다시 순환(cycle)에 들어가 매우 빠른 증폭을 하게 된다. 적절한 효소를 선택함으로써, 이 증폭 반응은 매 순환 마다 효소의 첨가 없이 등온(isothermally)에서 수행할 수 있다. 이 방법은 순환하는 성질이 있으므로, 출발 시의 서열은 DNA 또는 RNA 중 어느 것을 선택해도 된다.

밀러 등은 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된 PCT 출원 WO 89/06700에 핵산 서열 증폭 방법을 개시하였는데, 이는 프로모터/프라이머 서열을 표적 ssDNA에 혼성화 시켜 RNA를 전사하는 방법이다. 이 방법은 순환(cyclic)하지 않는다; 즉, 결과물 RNA로부터 새로운 주형이 생기지 않는다. 다른 증폭 방법은 프로만에 의해서 개시된 "경주(race)" 법(참조: Frohman, M.A., In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y., 1990) 및 "한 방향 PCR(one-sided PCR)"법(참조: Ohara, O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 86:5673, 1989)이 있다.

결과적으로 생성될 디-올리고누클레오티드(di-oligonucleotide)와 같은 서열을 가진 핵산의 존재하에 두 개 또는 그 이상의 올리고누클레오타이드를 연결시켜(ligate) "디-올리고누클레오티드(di-oligonucleotide)"를 만들어 디-올리고누클레오티드를 증폭 시키는 방법(참조: Wu, D.Y. et al., Genomics, 4:560, 1989)이 본 발명의 증폭 단계에서 사용될 수 있다. 증폭 후에, 증폭 산물이 있는지 없는지 확인한다. 증폭 산물은 맥삼 길버트법(Maxam and Gilbert method)(참조: Sambrook, 상동) 등의 기존의 어떤 방법으로도 서열을 결정할 수 있다. 서열이 결정된 증폭 산물은 백신 치료 전에 잘라낸 조직으로부터 수득한 결과와 비교한다. 백신 치료 전의 조직 시료는 사이토카인 서열, 특히 IFN , TNF, IL2, IL12 및 IL13의 서열이 없어야 한다. 핵산은 각각 다른 크기의 단편으로 절단할 수 있다. 예를 들어, DNA 단편은 아가로즈 젤에서 전기영동 등의(이에 한정되지 않음) 방법으로 분자량에 따라서 분리한다. 젤은 서던 하이브리디제이션(Southern hybridization)으로 분석한다. 간략하게, 젤의 DNA를 니트로셀룰로오스 또는 나일론막 등의(이에 한정되지 않음) 하이브리디제이션 기질(hybridization substrate) 또는 매트릭스(matrix)에 옮긴다. 표식된 탐침(labelled probe)을 선택된 하이브리디제이션 조건에서 매트릭스에 첨가하면 매트릭스상에 있는 상보적 DNA와 결합한다. 탐침은 안정된 이중가닥을 형성할 수 있는 길이라야 한다. 탐침은 길이의 범위가 약 200 내지 10,000 누클레오타이드의 범위이며, 바람직하게는 약 200 누클레오타이드이다. 비슷한 소수성(hydrophobicity) 또는 친수성(hydrophilicity) 등으로(이에 한정되지 않음) 인한 서열의 결합오류(mismatch)는 본 개시에서 대비한 당업자는 잘 알 것이다. 가시화(visualization) 또는 확인(detection)을 위한 여러 가지 표식(label)은 당업자에게는 잘 알려져 있으며, 예를 들어 형광 염색(fluorescent staining), 이티디움 브로마이드 염색(ethidium bromide staining), 아비딘/비오틴(avidin/biotin),³²P 표지와 같은 방사성 표식 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, PCR 생성물 같은 생성물은 아가로즈 젤에서 분리하여 이티디움 브로마이드 염색과 같은 방법으로 가시화 한다(참조: Sambrook, 상동). 메트릭스는 오토라디오그래피(autoradiography)에 의해 분석하여 탐침에 결합된 특정한 단편의 위치를 확인한다.

조사되고 합텐-접합된 자가 세포 조성물(autologous, irradiated, hapten-conjugated cell composition)의 효력을 선별할 진단 키트(diagnostic kit)는 한 개 또는 그 이상의 용기에 프라이머 한쌍( 상기 한쌍 중의 한 개의 프라이머는 사이토카인 특이 서열에 상보적이고, 상기 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 및 서열번호 10 으로 구성된 그룹에서 선택한다) 및 증폭된 DNA를 가시화 할 수 있는 수단을 포함을 포함한다; 상기 조성물의 효과를 분석하는데 사용되는 상기 키트.

실시예 1

본 발명의 방법에 따라, 64명의 환자에게 저투여량의 사이클로포스파마이드(CY)로 전처리하고, 흑색종 백신을 이용하여 전이성 흑색종을 치료한 후, 면역적 효과 및 항-종양 반응 측면에서 조사하였다. 0일째, 사이클로포스파마이드를 300mg/M²를 환자들에개 정맥주사로 투여하고, 3일 후 10X 10⁶내지 25X 10⁶의 자가유래의 동결보존된, 방사능(2500R) 처리된 종양세포를 BCG와 혼합하여 투여하였는데, 전기 종양 세포는 전이성 종양 덩어리를 효소처리(콜라게나제 및 DNA 가수분해 효소)하여, 수득하였다. 이러한 처리는 매 28일 마다 8회 동안 수행되었다.

전기 치료법의 독성은 투여 부위의 국부적인 염증반응, 사이클로포스파마이드 투여 후 발생한 약한 현기증 및 구토증으로 제한되었다. 측정될 수 있는 전이를 가진 40명의 환자가 평가되었다; 5명의 환자가 반응을 나타냈고, 4명이 완전한 반응, 1명이 부분적인 반응을 나타내었다. 반응의 평균 기간은 10달이었고(7-84 +1 달), 한 환자는 11년째까지 차도기 상태를 지속하였다. 종양 후퇴는 피부 및 결절성 전이에서만 일어난 것이 아니라, 폐 및 간 전이에서도 나타났다. 추가로 6명의 환자에게서 항-종양 반응이 관찰되었는데, 이는 이러한 백신 치료에 특이적인 것으로 보였고 즉, 면역치료 후 나타난 전이성 병변이 시작됨을 말한다. 3명의 환자에게서 이러한 "지연된(delayed)" 후퇴가 2개 이상의 종양에서 나타났다.

자가유래의 기계적으로 분리된 흑색종 세포에 대한 지연형 과민증(DTH)은 치료전에 단지 16%의 환자들에게서만 관찰될 수 있었으나, 치료후에는 49일째, 161일째 및 217일째에 각각 46%, 56%, 73%에서 관찰되었다. 면역치료 후 증가한 지연형 과민증은 비-의존적 t-테스트를 통하여 분석하였을 때, 유의적임을 알 수 있었다; 0일 대 49일, p＜0.001; 0일 대 161일, p＜0.001; 0일 대 217일, p= 0.021. 전체적으로, 43명의 환자 중 26명의 환자(61%)가 자가유래의 흑색종 세포에 대해 어느 한 시점에서 양성의 지연형 과민증 반응(≥5 mm)을 나타내었다. 또한, 환자들은 종양세포를 준비하는데 사용한 효소에 대해서도 강한 지연형 과민증을 나타내었다: 2회의 백신처리 후, 콜라게나제 및 DNA 가수분해 효소의 혼합액(각각 1mg/ml)으로 24명의 환자에 대하여 지연형 과민증을 조사하였을 때, 21명(88%)이 5mm이상의 반응을 나타내었다. 전기 백신에 대한 항-종양 반응은 다음의 3가지 관찰에 의해 알 수 있듯이, 기계적으로 분리된 자가유래의 흑색종 세포에 대한 지연형 과민증과 깊은 연관이 있었다; 1) 종양 후퇴를 보인 10명 중 8명의 환자에서 양성의 지연형 과민증이 나타났다; 2) 수술후의 아주반트 환자에게서, 자가유래의 흑색종 세포에 대한 지연형 과민증과 종양의 재발 시간 사이에 매우 유의적인 상관 관계가 있었다(r= 0.680, p＜0.001); 3) 원래 투여받은 백신("예전(old)"의 종양) 내의 자가유래의 흑색종 세포에 대해 지연형 과민증을 보인 9명의 환자에게서 지연형 과민증을 유도하지 않거나, 아주 적은 반응을 보이는 새로운 전이("새로운(new)" 종양)가 나타났다. 환자들은 백신 처리전에, 그들의 상태에 대해 비교되었다. 백신 연구전에 치료를 받은 환자들은 백신 연구를 시작하기 1 내지 2달전에 치료로부터 제외되었다. 따라서, 환자들은 백신연구 시작 무렵에는 모두 치료전의 상태이었다.

본 발명자들은 3가지의 경우에서, 조직 검사를 위해 후퇴하는 종양을 절개할 수 있었다; 그러한 종양의 특징은 림프구가 강하게 침윤되어 있다는 것이다. 대조적으로, 면역치료 전의 이러한 환자로부터 절개된 종양은 유의적인 림프구의 침윤이 없이, 자가유래의 악성 종양세포 덩어리로 구성되어 있다는 것이다. 이러한 연구는 사이클로포스파마이드의 사용이 종양 환자에서 흑색종-연관 항원에 대한 면역 반응의 발달을 허용함을 말해 주는 것이다.

실시예 2

전이성 흑색종을 가진 환자들을 1% 디니트로클로로벤젠(DCNB) 또는 디니트로플로로벤젠(DNFB)를 이용하여 팔의 상단에 국소적으로 DNP에 대해 감작시켰다. 2주 후, 전기 환자들에게 10X 10⁶내지 25X 10⁶의 DNP와 접합된 자가유래의 방사능 처리된 흑색종 세포를 BCG와 혼합하여 준비한 백신을 투여하였다. DNCB(또는 DNFB) 또는 백신 처리 3일 전에, 사이클로포스파마이드 300mg/M²를 정맥 주사의 방법으로 투여하였다. 4명의 평가 대상 환자중 3명의 환자가 2회의 백신 처리후(8주), 종양 덩어리에서 놀라울 정도의 염증 반응을 나타내었다. 환자 1은 홍반 및 다리와 하복부의 50개 이상의 큰(1 내지 3cm) 피부 전이에서 부어오름을 나타내었고, 궤양 형성 및 괴사 조직의 유출이 관찰되었으며, 일부는 후퇴하기 시작하였다. 생체조직검사를 하였을 때, CD4+ CD8+ T 림프구의 침윤을 관찰할 수 있었다. 환자 2는 홍반 및, 하복부 및 서혜부의 큰(8cm) 결절성의 덩어리에서 부어오름을 나타내었다. 이들 종양은 후퇴한 것은 아니었으나, 경도가 딱딱한 상태로부터 연화된 상태로 변하였다. 환자 3은 3개의 피하 전이 위의 피부에서 약간의 홍반을 나타내었다. 이들 세 환자들은 DNCB 및 DNP와 결합된 자가유래의 림프구 모두에 대해서 지연형 과민증을 나타내었다. 환자들은 백신 처리전의 상태에 대해서 비교되었다. 백신연구 전에 치료를 받은 환자들은 백신연구 시작 1 내지 2달전에 치료로부터 제외되었다. 따라서, 환자들은 백신연구 시작 무렵에는 모두 치료받지 않은 상태였다.

실시예 3

15명의 환자들(실시예 2의 환자 3명을 포함해서)을 새로운 형태의 면역 치료법, 즉 DNP와 결합된 종양 세포 백신을 사용하여 치료하였다. 팔 상단에 5-디니트로클로로벤젠을 국소적으로 적용하여 환자들을 DNP에 감작시켰다. 그리고 나서, 매 4주마다 300mg/M²의 사이클로포스파마이드를 투여하고, 3일 후 10X 10⁶내지 25X 10⁶의 DNP와 접합된 자가유래의 방사능 처리된 흑색종 세포를 BCG와 혼합하여 준비한 백신을 투여하였다. 환자들은 6 내지 8회의 치료를 받았다. 대부분의 환자들(92%)이 DNP에 결합된 자가유래의 림프구 또는 종양 세포에 대해서 지연형 과민증을 나타내었다(평균 DTH= 17mm). 전기 백신은 15명의 환자 중 11명의 환자에게서 홍반, 부어오름, 미열, 종양조직 부위의 연화 및, 한 경우에 있어서는 화농성의 유출과 같은 피하 및 결절성의 전이에서 강한 염증 반응을 유도할 수 있었다. 생체 조직 검사를 수행하였을 때, 림프구 침윤을 관찰할 수 있었고, 면역 병원성 및 세포 유동 계측 분석을 하였을 때, 주로 CD3+, CD4-, CD8+ HLA-DR+ T 세포와 같은 림프구임을 알 수 있었다. 이러한 조직의 흑색종 세포는 T 세포의 고착 분자(adhesion molecule) 역할을 하는 ICAM-1을 강하게 발현시켰다. 그러므로, DNP-백신은 이전에 시험된 면역 치료법에서는 볼 수 없었던 정도의 항흑색종 면역성을 유도함을 알 수 있었다. 환자들은 면역 치료전의 상태에 대해서 비교되었다. 백신 연구전에 치료를 받은 환자들은 백신 연구를 시작하기 1 내지 2달전에 치료에서 제외되었다. 따라서, 환자들은 백신 연구를 시작할 무렵에는 모두 치료를 받지 않은 상태에 있었다.

실시예 4

본 실시예는 외과적으로 절제한 전이를 가지고 전이성 질환의 임상적 증거가 없는 환자에게서 DNP-백신의 치료적 효과를 조사하였다. 47명의 환자를 합텐, 즉 DNFB에 감작시켰다. 그 후, DNP와 결합된 자가유래의 방사능 처리된 흑색종 세포를 피내 접종하였다. 추가 접종 백신은 매 28일마다 총 8회에 걸쳐서 투여되었다. 모든 환자들은 주기적으로 자가유래의 흑색종 세포, DNP 결합된 자가유래의 세포, 미생물 항원 각각에 대한 지연형 과민증에 대해 조사되었다. 생체외 연구는 전이성 종양으로부터 분리된, 및/또는 말초 혈액으로부터 분리된 동결보존된 림프구를 이용하여 수행되었다.

도 12의 그래프는 수술후 DNP-백신 또는 비합텐화되어 있는 대조군 백신으로 처리하여 종양이 사라진 환자의 백분률을 수술후 경과된 달수에 대하여 나타낸 것이다. 본 연구는 외과적으로 절제한 전이를 가지고 전이성 질환의 임상적 증거가 없는 환자에게서 DNP-백신의 치료적 효과를 조사한 것이다. 모든 환자들을 합텐, 즉 DNFB에 감작시켰다. 추가 접종 백신은 매 28일마다 총 8회에 걸쳐서 투여되었다. 모든 환자들은 주기적으로 자가유래의 흑색종 세포, DNP 결합된 자가유래의 세포, 미생물 항원 각각에 대한 지연형 과민증에 대해 조사되었다. 생체외 연구는 전이성 종양으로부터 분리된, 및/또는 말초 혈액으로부터 분리된 동결보존된 림프구를 이용하여 수행되었다.

흑색종의 DNP-백신 치료

요일

월

수

금

월

화

월

수

목

월

목

월

수

월

연구날짜

-21

-19

-17

-14

-13

0

2

3

28

31

49

51

56

사이클로포스파마이드

X

반복

DNP 백신

X

주기

DNFB SENS

X

For

DNFBCHALL

X

A

피부시험

X

Total

피부시험결과

X

OF

말초혈액림프구수득

X

8

혈청 수득

X

백신

상용검사

X

사이클로포스파마이드= 첫번째 2회의 백신전에만 정맥 거환 300mg/M²

백신= 5 X 10⁶내지 20 X 10⁶의 BCG와 혼합한 자가유래의 방사능 처리된 흑색종 세포.

DNFB SENS= 0.1ml의 아세톤-옥수수유에 200㎍을 녹여 팔에 적용

피부 시험= 자가유래의 흑색종 세포, 말초혈액 림프구(PBL), DNP에 결합된 PBL(PBL-DNP), 순수분리되 단백질 유도체(PPD)(결핵균에 대한 피부 시험), 미생물 항원.

* 0일째: PBL, PBL-DNP만 사용

피부 시험 결과 = 경화의 평균 직경

말초혈액 림프구 수득= 100cc 헤파린화된 혈액

상용검사= 전혈구 계산(CBC), 감별혈구 계산(diff), 혈소판 계산, SMA-12(상용검사의 패널), 혈액내 요소 질소(BUN)

DNP에 감작- 환자들은 다음과 같은 방법에 의하여 감작되었다; -17일째에 사이클로포스파마이드를 300 mg/M²로 급속한 정맥주입으로 투여하였다. 3일 후, -14일 및 -17일째에 환자들은 DNFB로 감작되었다: 1mg의 DNFB를 0.1ml의 아세톤-옥수수유에 녹여서 직경 2cm의 쇠고리 둘레만큼 국소적으로 적용하였다. 2주 후, 환자들에게 200pg DNFB 및 DNP가 결합된 자가유래의 PBL의 피내 접종에 의하여 DNP에 대한 지연형 과민증을 조사하였다. 멸균수에 사이클로포스파마이드를 녹이고, 적당한 양을 급속한 정맥 주입으로 투여하였다.

백신 준비- 종양 덩어리를 가공하였다. 콜라게나제 및 DNA 가수분해효소를이용한 효소적 해리 및 기계적 해리의 방법으로 세포를 분리하여, 냉각 속도를 조절할 수 있는 동결기에 의해 동결하여 사용할 때까지 액체 질소에서 보관하였다. 환자가 처리되는 당일, 세포는 해동되었고 세척되어 2500R로 방사선 처리되었다. 그 후, 세포를 다시 세척하고 페놀 레드 없이 행크스 부유액에 부유시켰다.

흑색종 세포를 DNP와 결합시켰다. 이는, 종양 세포를 멸균 조건 하에서, 디니트로벤젠과 30분 동안 배양하고, 식염수로 세척하므로써 수행된다.

백신은 5 내지 20 X10⁶의 살아있는 종양 세포를 0.2 ml의 행크스 식염액에 부유시켜서 준비된다. BCG가 첨가될 때에는, 0.1ml의 Tice BCG 10:1 희석액을 포함한다. 각각의 백신 접종은 림프결절 절단과 같은 방향의 팔, 다리를 제외하고, 팔의 상단이나 다리의 인접 부위에 3회 접종하므로써 이뤄진다.

연구절차 - 0일째, 환자들은 사이클로포스파마이드를 300 mg/M²로 급속한 정맥주입으로 투여되었다. 3일 후, +3일째에 환자들을 자가유래의 흑색종 세포로 피내 주사하였다. 추가 백신은 매 4주마다 총 8회 투여되었다. 사이클로포스파마이드는 첫 2회의 접종때만 사용되었다. 모든 백신은 DNP와 결합되었고, BCG와 혼합되었다. BCG는 오르가논 테크니카사(Organon Teknika Corporation, Durham, NC)로 부터 수득한 Tice 균주(파스퇴르 연구소 보유주의 아종)이다. 동결건조된 균주를 1ml의 멸균수에 부유시키고, 인산완충 식염수(pH 7.2)를 이용하여 10:1로 희석하였다. 그후, 0.1ml을 취하여 백신과 혼합하고, 접종하였다. 모든 백신은 같은 부위(팔의 상단 또는 다리)에 접종되었다.

면역적 평가 - 0.1ml의 시험 물질을 팔의 피내로 접종하여 피부 시험을 수행하였고, 경화의 평균 직경을 측정하므로써 48시간째에 지연형 과민증을 조사하였다. 양성의 반응을 사진 쵤영하였고, 다음의 물질을 시험하였다: 1) 1 X 10⁶의 방사선 처리된 자가유래의 흑색종 세포; 2) (DNP와 결합되어 있거나 결합되어 있지 않은) 3 X 10⁶의 자가유래의 말초혈액 림프구; 3) 행크스 식염액; 4) PPD-중간물 세기; 및, 5) 미생물 항원- 캔디다(Candida), 트리코피톤(trychophyton) 및 유행성이하선염(mumps). 또한, 팔의 상단에 200㎍의 DNFB를 적용하고, 48시간째에 경화부위의 원면적을 측정하므로써 DNFB에 대한 감수성을 조사하였다.

모든 환자들로부터 림프구 및 혈청을 분리하고 동결보존할 목적으로 혈액을 채취하였고, 매번 피부시험을 수행하였다(참조: 표 1, 혈액 채취 계획). 주기적으로, 1) 자가유래의 흑색종 세포에 대한 증식 및 세포독성 반응; 및, 2) DNP에 결합된 자가유래의 림프구에 대한 증식 반응을 조사하였다.

연구 기간

(1) 환자들에게 약 8개월에 걸쳐 8차례의 백신을 처리한 후, 치료를 중단하였다. 이러한 환자들은 수술후 최소한 5년 동안의 경과를 관찰하였다.

(2) 8회의 치료가 끝나기도 전에 국부적 재발 또는 거리상으로 떨어진 부위에서의 전이를 나타내는 환자들은 연구로 부터 제외되어 임상적으로 지료되었다(화학치료법 또는 수술).

대조군 그룹은 국소적 림프결절에 흑색종 전이를 가진 22명의 환자들로 구성되었다. 그들은 전이성 흑색종의 임상적 증거를 나타내지 않는 시기에 질환을 수술적으로 제거하고, 비합텐화되어 있는 흑색종 백신을 이용하여 치료되었다. 우선, 300mg/M²의 사이클로포스파마이드를 투여하였고, 3일 후 BCG와 혼합한 1X 10⁶내지 25 X10⁶의 방사능 처리된 자가유래의 흑색종 세포로 구성되는 백신을 피내로 접종하였다. 사이클로포스파마이드- 백신 처리는 매 28일 마다 반복되었고, 총 8회의 치료가 수행되었다. 환자들은 매 2 개월마다 임상적으로 검사되었다.

대조군 환자들의 약 20%만이 2년째에 종양이 완전히 사라졌다. 대조적으로, 본 발명의 DNP-백신을 처리한 환자들은 전기에서 언급하였듯이, 상당히 높은 종양이 사라진 생존 상태를 나타내었다.

합텐화된 백신을 받은 환자들은 모두 국소적 림프결절에 전이성 흑색종을 가지고 있었으나, 거리상으로 떨어진 부위에 전이는 없었다. 외과적 절제를 통해 임상적으로는 종양이 없는 상태로 만들어졌으나, 2년내에 전이성 흑색종을 유발할 가능성이 80 내지 85% 이었다.

대조군 그룹내의 환자들은 합텐화된 백신 그룹과 비교되기 위해서 임상적 상태가 비슷하였다. 그러므로, 대조군의 환자들은 국소적 림프결절에 전이성 흑색종을 가지고 있었으나, 거리상으로 떨어진 부위에는 전이성 흑색종이 없으며, 수술적으로 질환이 제거된 상태였다. 비합텐화된 백신으로 치료를 시작하였을 때, 대조군 그룹은 종양이 없는 상태이었으나, 전기에서 언급하였듯이, 80%가 거리상으로 떨어진 부위에 전이를 발생시켰다.

수술적으로 치료될 수 없는 전이를 가진 환자들은 치료될 확률이 없거나, 재절제할 수 있는 림프결절 전이를 가진 환자들보다 생존률이 낮기 상태이기 때문에 대조군 그룹에서 제외되었다. 더우기, 그러한 환자들은 질병이 없는 생존, 즉 본 발명의 백신에 의해서 극적으로 연장될 수 있는 매개 변수를 측정하기가 불가능하기 때문이다.

자료의 통계학적 분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다: 질병이 없는 생존 및 전체 생존사이의 카플란-메어(Kaplan-Meir) 플롯이 구축되었다. DNP-백신 환자와 대조군 환자사이의 차이는 만텔 로그-랭크 테스트(Mantel log-rank test)에 의하여 분석하였다. 이는 그러한 자료를 분석하는 표준적인 통계분석 방법이다. 그 차이는 p＜ .01로서 상당히 유의적이었다.

추가적으로 17명의 환자들을 본 발명의 프로토콜에 따라서 치료하였다( 전기에 설명된 이유에 의해서 대조군 그룹의 크기는 늘리지 않았다). 그 결과, 질병이 없는 생존과 전체 생존 사이의 유의적인 차이가 유지됨을 알 수 있었다.

실시예 5

자가유래의 디니트로페닐(DNPL이 결합된) 흑색종 백신은 전이성 종양에 T 세포의 침윤을 유도하였고, 외과적 절제에 의해 크기가 큰 전이를 제거한 환자들의 생존을 크게 연장시켰다. 이러한 효과는 흑색종-특이적인 T 세포에 기인하는 것으로 보인다. 전기 효과 발생은 DNP로 변형된 흑색종 세포에 특이성을 가지는 T 세포에 의존적인 것 같다.

임상적 프로토콜

모든 환자들은 전이성 흑색종을 가졌고, 본 발명의 참고 문헌에 통합되어 있는 버드 등(참조: Cancer Res., 1991, 51, 273)의 방법에 따라 자가유래의 DNP 결합된 백신을 이용한 면역 치료법이 수행되었다. 환자들로부터 동의가 구해졌다. 환자들은 버드 등(1986)의 방법에 따라, 사이클로포스파마이드를 300mg/M²로 전처리되었고, 3일 후 연속 2일 동안, 0.1ml의 아세톤-옥수수유에 녹인 DNFB를 국소적으로 적용하여 DNFB에 감작시켰다. 2주 후, 환자들은 사이클로포스파마이드를 다시 투여받았고, 3일 후 DNP 결합된 흑색종 백신을 투여받았다. DNP-백신은 매 28일 동안 반복되었다. 사이클로포스파마이드는 첫번째 2 주기동안 투여되었고, 백신은 BCG와 혼합된 1X 10⁶내지 25 X10⁶의 동결보존되었던 자가유래의 방사능 처리(2500R)된 DNP가 결합된 흑색종 세포로 구성되어 있다. 모든 종양 세포는 종양이 침윤된 림프구 조직의 잔여물인 림프구를 포함하고 있다. 혈청과 PBL은 다음의 시점에 채취되었다: 0일째(감각하기 전), 14일째(DNFB 감작 후 2주), 63일째(2회의 백신주입 후), 119일째(4회의 백신 주입후), 175일째(6회의 백신 주입 후), 및 231일째( 8회의 백신 주입후).

세포 시약

PBL은 피콜 메트리존산(Ficoll metrizoate)상에서 밀도구배 원심분리를 이용하여 분리하였다. PBL을 동결 배지(RPMI-1640(Mediatech, Washington DC)+ 11 인간 알부민 + 10% 디메틸술폭사이드)에 부유시키고, 냉각 속도를 조절할 수 있는 동결기에 동결시켜서 액체 질소에 보관하였다. PBL의 HLA형 분석은 토마스 제퍼슨 대학 병원 임상 실험실에서 수행되었다.

흑색종 세포는 본 발명의 참고 문헌에 통합되어 있는 버드(1986)등의 방법에 따라서 효소를 이용하여 분리하였고, 동결보존하였다. 세포주는 이러한 현탁액으로부터 유래되었고, 10% 소태아 혈청이 포함되어 있는 RPMI-1640에서 유지되었다. 본 연구의 환자에게 사용된 흑색종 세포주는 미국 기준 배양주 센터로부터 얻은 단클론성 항체(HB82= HLA-A2, HB122= HLA-A3, HB164 = HLA-A11, 24)를 이용한 세포 유동계측법을 통한 MHC 클래스 I 차이에 의해 구분되어질 수 있었다.

합텐 결합

PBL은 다음의 방법(참조: Miller, S.D. and H.N. claman, J. Immunol., 1976, 117, 1519; Geczy, A. F. and A. Baumagarten, Immunology, 1970, 19,189, 본 발명의 참고 문헌에 통합되어 있음)에 따라 각각 수용 상태의 DNFB 또는 DNBS와 30분 동안 배양시키므로써 DNP로 변형된다; 전기 두 가지 방법이 동등한 결과를 산출하였다. 특이성의 대조군으로서, 다음의 방법(참조: Fujiwara et al., J.Immunol., 1980, 124, 863 and Borerigter, G. H. and R. J. Scheper, J. Invest. Dermatol., 1987, 88, 3,본 발명의 참고 문헌에 통합되어 있음)에 따라 각각 TNBS, 또는 옥사졸론과 배양하므로써 세포를 TNP로 변형하였다. 합텐 결합은 흑색종 세포를 이용하여 반복되었다.

지연형 과민증(DTH)

동결보존된 PBL을 해동하여 세척하고 행크스 식염액에 재부유시켰다. 전기 세포는 3 그룹으로 나뉘어 졌다: 변형되지 않은, DNP에 결합되어 있는,및 TNP와 결합되어 있는 그룹. 세척 후, 1X 10⁶의 흑색종 세포 또는 3 X 10⁶의 PBL은 0.1ml의 행크스 식염액에 부유시켰고, 팔에 피내로 접종하였다. DTH는 경화의 평균 직경을 48시간째에 측정하므로써 결정되었다. DTH는 흑색종 세포에 대해서 반복되었다.

모든 환자들이 DNP-변형된 자가유래의 PBL에 대한 DTH를 발생시켰다(참조: 도 1). DNFB를 국소적으로 적용한 지 2주 후(14일째)에 DTH 반응이 민감하게 나타났고, 월별 백신 투여의 기간 동안, 안정적으로 유지되었다. DNP 결합된 자가유래의 흑색종 세포 부유액은 DNP-PBL보다 더 강한 지연형 과민증을 나타냈다(평균 SE:PBL = 13.3 mm ±1.3mm, 흑색종 세포 = 21.9mm ±3.6mm; p＜0.01). TNP에 결합된 자가유래의 PBL이 시험된 50명의 환자에게서 아무 반응을 유도하지 않았기 때문에, DTH는 DNP- 결합된 "자기자신" 에게서만 특이적이다.

항-DNP 항체

ELIZA는 마이크로리터 웰을 DNP가 결합된 PBL로 코팅하므로써 준비되었다. 이 방법은 면역전 환자의 혈청이 낮은 백그라운드 값을 가지기 때문에, DNP 결합된 알부민으로 플레이트를 코팅하기가 용이한 것으로 판명되었다. DNP가 결합된 PBL(0.1ml안에 5 X 10⁵)은 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가되었다. 세포를 플레이트에 고정시켰고, 5분 동안 100% 메탄올에 노출시켰다. 그 후, 플레이트를 인산 완충 심염액+ 0.05% Tween-20을 이용하여 5회 세척하였다. 시험 혈청을 연속적으로 희석하여 웰에 첨가하여, 37℃ 1시간 동안 습도실에서 배양하였다. 배양 후, 플레이트를 5회 세척하였고, HRP가 결합된 염소의 항-인간 면역글로불린(Cappel Laboratories, Malvern, PA)을 미리 결정된 최적의 농도로 첨가하였다. IgG 또는 IgM 항체를 검측하기 위해서, 퍼록시다제가 결합된 염소의 항-인간 IgG 또는 IgM을 각각 사용하였다. 37℃ 에서 1시간 동안 배양한 다음, 플레이트를 5회 세척하였고, 0.1ml의 기질(페닐렌디아민, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)이 각각 웰이 첨가된 다음, 50pl의 0.12 Oi 과산화수소를 첨가하였다. 플레이트의 측정값은 ELIZA 플레이트 리더로 측정하였다.

전기 분석 방법을 쥐의 항-DNP 단클론성 항체(클론SPE-7; Sigma ImmunoChemicals) 및 2 단계 시약으로서 퍼록시다제가 결합된 항-마우스 면역 글로불린을 이용하여 재확인하였다. 다음으로, 양성의 대조구는 다중의 DNP-백신을 투여 받은 환자의 혈청 시료로 구성된다. 각각의 혈청 시료에 대한 항-DNP 항체의 적정은 다음과 같이 정의된다: (시료의 OD 피크)X (양성 대조구의 피크의 반에 해당하는 OD의 희석비의 역수)(참조: Butler, J. E., Methods Enzymol., 1981, 73, 482).

항-DNP항체는 시험된 27명의 환자 중 24명에서 생성되었다(참조: 도 2). DTH와는 대조적으로, DNFB의 국소 적용으로 항체가 유도되지는 않았다(14일째). 19명의 환자에서, DNP가 결합된 흑색종 세포를 2회 피내로 주입한 다음의 적정비가 면역전 수준 보다 증가하였다(63일째); 5명의 환자에서 추가적으로 4회 내지 6회의 백신 접종 후, 유의성있는 적정비가 발견되었다. 모든 환자에서, IgG항체가 발견되었고; 단지 3명의 환자에서 항-DNP IgM이 관찰되었다. 항-DNP 항체는 TNP로 변형된 세포에는 결합하나, 관련이 없는 합텐, 옥사졸론에 결합하지 않음으로 인해 TNP와는 교차 반응함을 알 수 있었다.

T 세포주의 개발

PBL(1X 10⁶)을 림프구 배양 배지의 24 웰 둥근 바닥 플레이트내, 자가유래의 DNP와 결합된 B 림프구 종성 피진 세포(1X 10⁵)와 혼합하였다. 7일동안 배양 후, IL-2 100 U/ml(Cetus Oncology, Emeryville, CA)이 첨가되었다. 증식하는 T 세포는 IL-2가 들어 있는 배지에서 유지되었고, 직경이 22mm인 웰에 2 X 10⁶의 세포 농도로 존재하도록 세포를 나누었다. 매 14일 마다 DNP가 결합되어 있는 B 림프구 종성 피진 세포를 첨가하므로써 재자극하였다. 표현형은 단클론성 항체의 패널을 이용하여 세포 유동 계측법(Becton-Dickinson, San Jose, CA)을 통해 관찰될 수 있었다. CD8+ 및 CD4+ T 세포의 분리는 간접적인 패닝(panning)에 의해서 이뤄지는데, 항-CD8 또는 항-CD4의 단클론성 항체로 코팅된 T 세포는 본 명세서의 참고 문헌에 통합되어 있는 와이소키 등의 방법(참조: Wy socki, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2844)에 따라 표준적인 방법을 이용하여 항-면역글로불린이 코팅되어 있는 디쉬에 부착되게 된다; 고착된 세포는 분리되었고, DNP로 변형된 자극제와 IL-2로 확장하였다.

표현형적 측면에서 균일한 T 세포의 아집단은 2X 10⁵의 방사능 처리된 자가유래의 피더 세포(feeder cell), 200U/ml IL-2 및 피토헤마토글루티닌을 포함하는 림프구 배양 배지를 바닥이 둥근 마이크로리터 웰에서 희석하므로써 수득할 수 있다. 림프구가 성장하는 웰은 DNP로 변형된 B 림프구 종성 피진 세포에 반응하여 증식할 수 있는 능력으로 스크린되었다. 양성의 웰은 IL2에서 확장되었고, 매 14일 마다 자가유래의 DNP로 변형된 B 림프구 종성 피진 세포로 재자극하였다.

림프구 증식 반응 - PBL은 반응 세포로서 시험되었다. 전기 림프구는 림프구 배양 배지(RPMI-1640, 10% 인간의 AB+ 혈청, 인슐린-트란스페린-세레나이트 배지 보충물(Sigma Chemical Co.), 2mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산, 25mM HEPES 완충액, 페니실린 + 스트렙토마이신)에 부유시켰고, 96 웰 둥근바닥 마이크로 플레이트에 웰당 1X 10⁵의 세포를 분주하였다. 자극세포는 다음을 포함하고 있다: 1) 자가유래 또는 동종이계의 PBL, 2) 엡스테인-바(Ebstein-Barr) 바이러스로 트란스펙션한 자가유래 또는 동종이계의 B 림프구 종성 피진 세포, 3)자가 유래의 흑색종 세포; 이들은 모두 방사능(5000R)으로 불활성화되었다. 대부분의 실험에서, 반응세포:자극세포의 비율은 1:1이었다. 플레이트는 37℃ 이산화탄소 배양기에서 5일 동안 배양하였고, 웰을¹²¹I-표지된 IUDR(ICN Radiochemical, Costa Mesa, CA)로 6시간 동안 펼스를 준 후, 자동 수거 장치로 수거하여 감마 카운터로 측정하였다. 3개의 웰에 대한 평균값이 계산되었고, 배양된 T 세포는 본 발명의 방법에 따라, 림프구 증식 반응에 대해 시험되었다.

DNP로 변형된 자가유래의 세포에 대해 최대의 지연형 과민증 반응을 보이는 시간대에 4명의 환자로부터 수득하고 동결보존한 PBL을 해동하여 생체외 증식 반응에 대해서 시험하였다. 4명의 환자 모두로부터의 PBL은 DNP로 변형된 세포로 자극하였을 때, 증식하였다(참조: 도 3). 한 환자(DM2)로부터의 증식 반응의 발달 운동학이 도 4에 나타나 있다. DNFB만 적용하였을 경우(14일째)에는, 검측할 수 있는 수준의 순환성 반응세포를 생성시키는 못하였다. 반응성의 PBL은 DNP-백신을 2회 투여한 후(63일째), 관찰될 수 있었고, 백신치료의 8개월 내내 관찰될 수 있었다.

아무것도 결합되지 않은 PBL 또는 TNP로 변형된 PBL이 증식 반응을 유도하지 않았기 때문에, DNP로 변형된 세포에 대한 증식 반응은 특이적이었다(참조: 도 5). 백신 투입 후, PBL은 자가유래의 종양 조직으로부터 유래된, DNP로 변형된 흑색종 세포주로 자극하였을 때도 급속히 증식하였다. 동계이형의 세포주로 자극하였을 때, 예상한 바와 같이, PBL은 DNP 반응보다 3 내지 5배 증가된 혼합된 림프구 반응을 나타내었다.

이러한 환자들 중 1명(DM2)으로부터의 순환성의 T 림프구는 IL-2에서 배양하므로써 생체외에서 확장되었고, 자가유래의 DNP로 변형된 B 림프구 종성 피진 세포를 이용하여 반복적으로 자극되었다. 4주 동안의 확장 후, T 세포는 70% CD3+, CD8+ 및 30% CD3+, CD4+이었다. 전기 세포는 DNP로 변형된 자가유래의 B 림프구 종성 피진 세포 또는 DNP로 변형된 흑색종 세포로 자극하였을때 증식하였으나, DNP가 결합되지 않은 자가유래의 세포로 자극하였을 때에는 증식하지 않았다(참조: 도 6). 이러한 세포를 양성의 패닝(panning)을 통해 CD8 및 CD4가 풍부한 집단으로 분리하였고, 이를 세포 유동 계측법을 이용하여 분석하였을 때 98% 순수한 상태임을 확인할 수 있었다. 도 7 에서 보듯이, CD8 및 CD4가 풍부한 T 세포는 DNP로 변형된 자가유래의 B 림프구 종성 피진 세포에 대해 증식 반응을 나타냈다. 그러나, 오직 CD8+ T 세포만이 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포에 반응하였다. 이러한 결과는 흑색종 세포의 MHC 클래스 II의 낮은 발현 수준(＜5%)에 기인하는 것으로 보인다.

확장된 T세포를 DNP로 변형된 자가유래의 B 림프구 종성 피진 세포로 자극하였을 때, 시토카인을 형성하는 능력에 대해서 검사하였다. 도 8에서 보듯이, 전기 세포는 IL-4가 아닌 감마 인터페론을 생성하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두가 시토카인 반응에 관여하는지를 알아보기 위해서, 제한된 희석비로 T 세포를 도말하여 수득된 아세포주를 분석하였다. 각각의 배양은 CD4 및 CD8의 발현에 대해서 균일하였다. 이러한 아세포주 중 3가지(2가지의 CD4+, 한 가지의 CD8+)가 DNP로 변형된 B 림프구 종성 피진 세포에 대한 시토카인 반응에 대해 시험되었다. 세 가지 모든 세포가 IL-4는 생산하지 않는 반면, 감마 인터페론을 생성하였다(참조: 도 8).

시토카인 생산 - T 세포는 1 X 10⁵세포/웰의 농도로 둥근 바닥 마이크로리터 플레이트에 첨가되었다. 동수의 자극세포(DNP로 변형된 자가유래의 B 림프구 종성 피진 세포)가 첨가되었고, 18시간 동안 배양한 다음, 상등액이 수거되었다. 상업적으로 이용할 수 있는 ELIZA 키트를 이용하여 감마 인터페론(Endogen, Boston, MA; 및 IL-4(R ＆ D Systems, Minneapolis, MN; 민감도 = 3pg/ml)을 측정하였다.

전기 반응의 MHC-의존성을 조사하기 위하여, 자극 세포는 반응 세포를 첨가 하기 1시간 전에, MHC 클래스 I(W6/32) 또는 MHC 클래스 II(L243) 단클론성 항체와 전배양(preincubation)하였다. 비-특이적인 마우스 면역글로불린을 같은 농도로 사용하여 음성 대조구로서 사용하였다.

거대 집단을 패닝(panning)하여 얻은 DNP에 반응하는 CD8+ T 세포를 IL-2가 포함된 배지에서 DNP로 변형된 B 림프구 종성 피진 세포를 이용한 반복적인 자극을 통해 장기간(＞ 3개월) 유지할 수 있었다; 전기 세포는 안정적인 표현형(CD3+, CD 8+)을 유지하였다. 다음의 두 가지 증거가 그들의 반응이 MHC 클래스 I- 제한적임을 확인해 주었다: 1) 항-클래스 I항체와 자극세포를 전배양하였을 때는 감마 인터페론의 생산이 차단되었으나, 항-클래스 II 항체를 사용하였을 때에는 차단되지 않았다(참조: 도 9), 및, 2) T 세포는 HLA-A유전자좌의 하나 또는 두가지 모두에 부합되는 동계이형의 DNP로 변형된 자극 세포에는 반응할 수 있었으나, HLA-A에 부합되지 않는(mismatched) 자극세포에 대해서는 반응하지 않았다. 도 10 에서 볼 수 있듯이, T 세포는 DNP로 변형된 자가유래의 PBL(HLA-A1, A2, B8+, Bw6) 및 A1, A2 또는 둘 모두를 발현시키는 DNP로 변형된 동계이형의 PBL을 이용하여 자극하였을 때, 증식하였다; 그러나, A1 또는 A2 음성인 DNP로 변형된 동계이형의 자극세포에 대해서는 아무런 반응이 없었다.

세포독성 - 대상 흑색종은 2시간 동안⁵¹Cr(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)로 표지되었고, 2500개의 세포가 둥근 바닥 마이크로리터 웰에 첨가되었다. 그 후, 일련의 E:T 비율을 얻기 위해 효과 세포(effector cell)가 첨가되었다. 37℃에서 6시간 동안 배양한 후, 상등액을 취하여 감마 카운터를 이용하여 카운트하였다. 용균은 다음과 같이 정의되었다; [CPM_시험- CPM_자발적]/[CPM_전체- CPM_자발적]*100. CD8+ T 세포주의 세포독성은 자가유래의 흑색종 세포를 대상으로 이용한⁵¹Cr-배출 분석으로 시험되었다. 자발적인⁵¹Cr의 배출을 최소화하기 위해서, DNP 변형은 DNFB가 아닌, DNBS를 이용하여 수행되었다. T 세포는 DNP로 변형된 동종의 흑색종 세포를 용균시켰으나, 동계이형의(클래스 I이 일치되지 않는) 흑색종 세포를 용균시키지는 못하였다(참조: 도 11a, 11b). 사용된 DNBS의 농도에 의해 결정되듯이, 용균에 대한 감수성과 DNP 변형에 대한 정도 사이에는 직접적인 연관관계가 있었다. TNP로 변형된 자가유래 또는 동종이형의 대상 세포는 용균되지 않았다.

실시예 6

DNP가 결합된 흑색종 백신이 크지만, 재절제할 수 있는 림프 결절 전이를 가진 흑색종 환자에서 질병없는 상태의 생존(disease- free survival, 이하 'DFS'라 함) 및 전체 생존(total survival, 이하 'TS'라 함)를 연장시킬 수 있음을 보이기 위해, 임상적 자료를 수집하였다. 47명의 환자가 전이 덩어리의 재절제하는 임파종 재절제 수술을 받았다. 이러한 조직으로부터 종양세포를 효소적으로 분리하였고, 동결보관하였다. 백신은 DNP와 결합되어 있는 1 X 10⁶내지 20X 10⁶의 방사능(2500cGy) 처리된 흑색종 세포를 BCG와 혼합한 것이다. 백신은 피내 접종으로 매 28일 마다 총 8회에 걸쳐서 이뤄졌다. 사이클로포스파마이드는 처음 2회의 백신 투여 3일 전에만 300mg/M²의 양으로 정맥 투여되었다. 이러한 환자들의 DFS 및 TS를, 결절 재절제 수술을 받고 아무것도 결합되지 않은 백신으로 치료한 환자들과 비교하였다(참조: 실시예 4). 제 3기의 흑색종(한개의 림프 결절 부위에 만져질 수 있는 덩어리)을 가진 36명의 환자들 중, 22명이 평균 33 개월동안 질병이 없는 상태였다. 카플란-메이어(Kaplan-Meir)분석을 통해 3년의 DFS, 및 각각 59%, 71%의 TS를 나타냄을 알 수 있었다. 대조적으로, 아무것도 결합되지 않은 백신으로 치료된 제 3기의 환자들의 DF8 및 TS는 각각 22%, 27%이었다(p= 0.01, 로그-랭크 테스트). 제 4기의 11명의 환자(두개의 림프결절에서 만져질 수 있는 덩어리를 가지고 있음)들 중에서 5명이 41개월 동안 NED(질병의 증거가 없음)이었다. 제 3기 및 제 4기 환자들 모두에 있어서, 재발률이 가장 높은 시기는 첫 6개월동안이며, 이는 항-흑색종 면역이 확립되지 않은 시기이다. 이러한 실험 후에, 초기 재발을 막기 위한 급속한 면역을 실시하였고, 이는 전체적인 임상적 결과를 호전시켰다. 환자들은 백신 치료전의 상태에 대해서 비교되었다. 백신연구 전에 치료를 받은 환자들은 백신연구를 시작하기 2개월전에 연구로부터 제외되었다. 따라서, 모든 환자들은 백신연구 시작 무렵에는 모두 치료를 받지 않은 상태였다.

실시예 7

재료 및 방법

인간의 흑색종 조직과 세포주 - 백신 프로그램에 들어가기 전, 및 백신접종 이후에 환자들로부터 조직을 채취하였다. DNP-백신 투여에 대한 임상적 프로토콜은 버드 등(참조: Cancer Res. 1991 51:2731-2734)의 방법을 따라서 수행되었다. 수술후 종양 조직을 실험실로 옮겨와서, 종양 조직을 주변의 근막 연결조직으로부터 분리하였고, 2 내지 4 mm³크기의 종양 조직을 즉석에서 액체 질소에서 동결시켰다. 같은 시료로부터 흑색종 세포주를 효소적 해리(DNA 가수분해 효소 및 콜라게나제)를 통해 분리하여, 버드 등의 방법을 이용하여 증식시켰다(참조: Cancer Res. 1986 46:2572-2577).

RNA의 분리 및 RT-PCR을 이용한 증폭 - 동결된 전체 종양을 구아니듐 이소시아네이트(Guanium isothiocyanate)에서 추출하여 RNA를 분리하였고, 라티미 등(참조: Lattime, E.C., et al., J. Immunol. 1988 144:3422-3428)의 방법을 이용하여 CsCl구배로 분리하였다. 조직 RNA의 손실을 최소화하기 위해서, 15㎍의 대장균 리보솜 RNA(Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO)를 각각의 시료에 첨가하였다. 분리된 RNA는 DEPC가 처리된 증류수에 재용해되었고, 10㎍의 전체 RNA, 랜덤 프라이머(Gibco BRL, Gaithersburg, MD), DEPC가 처리된 물에 준비된 RT 완충액을 이용하여 cDNA합성이 수행되었다. 이는 65℃에서 10분 동안 배양되었고, 4℃에 정치되었다. 이를 위해, 10mM DTT(Gibco BRL), 0.5mM의 dATP, dCTP, dTTP, dGTP(Gibco BRL), 500U의 MMLV-LT(Gibco BRL)를 첨가하여 최종 부피가 50㎕가 되도록 조정하였다. 시료는 1시간 동안 37℃에서 배양되었고, 95℃에서 5분 동안 가열되었다.

PCR을 이용하여 증폭시키기 위해서, 5㎕의 cDNA를 각각 PCR반응 완충액, 0.2mM의 각각의 dATP, dCTP, dTTP, dGTP(Gibco BRL), 1.25U 앰플리탁 DNA 중합효소(Perkin Elmer), 각각의 프라이머 쌍에 최적으로 조정된 MgCl_2,0.5mM의 적당한 프라이머 쌍을 포함하여 최종 부피가 50㎕인 마이크로앰프 반응 튜브(Perkin Elmer, Norwalk, CT)에 첨가하였다. 본 연구에 사용된 프라이머 쌍은 베타-액틴, TNF-알파, 인터페론 감마(South San Francisco, CA) 및 IL10(Clontech, Palo Alto , CA)이다. p-액틴은 시료간의 mRNA의 상대적 발현 및, RT 및 PCR 반응을 비교하기 위한 표준으로서 사용되었다. PCR 시료는 진앰프 시스템 9600 써모사이클러(GeneAmp System 9600 thermocycler Perkin Elmer)를 이용하여 증폭되었다. 각각의 시료는 94℃에서 37초 동안 변성되었고, 55℃에서 45초 동안 프라이머가 어닐링(annealing)되었으며, 72℃에서 60초 동안 엑스텐션(extension)하면서 39 사이클로 증폭하였고, 72℃에서 10분 동안 엑스텐션하였다.

PCR 산물과 사이즈 마커(Novagen, Madison, WI)를 20% 한천 젤에서 분리시켰다. 전기 젤을 EtBr로 염색하였고, UV 조명 하에서 사진촬영을 하였다. PCR 산물을 전기영동하였을 때, 각각의 프라이머 쌍에 의해 예상되는 절편 크기의 밴드를 관찰할 수 있었다. 역전사되지 않은 RNA(Nonrevserse transcribed RNA)를 게놈 DNA의 오염에 대한 대조구로서 증폭하였다.

흑색종 조직으로부터 효소적으로 분리하여 동결 보존한 세포 부유액은 RNA 분석에 있어서 적합하지 않은 것으로 판명되었다. 이러한 시료는 시험된 모든 시토카인에 대한 mRNA를 보통적으로 발현시키는데, 이는 아마도 분리 과정상에서 활성화되었기 때문인것으로 생각된다.

조직학 및 인-시츄 RT-PCR - 대표적인 시료의 상용적인 H ＆ E 염색을 병리학과에서 수행하였다. 인-시츄 RT-PCR은 바가스라 등(참조: J. Immunol.. Meth. 1993 158:131-145)의 방법에 따라서 파라핀 섹션상에서 이뤄졌는데, 단백질 효소K를 이용하여 투과되었고, 역전사 효소가 처리되었으며, 동일한 프라이머를 사용하여 결과적으로 IL10 DNA를 증폭하였다.

백신치료 후 염증 반응이 있는 생검에서의 시토카인 mRNA - 전이성 흑색종의 특징이 림프구 침윤이 적다는 것이지만(참조: Elder et al., "The surgical pathology of cutaneous malignant melanoma." In: W. H. Clark, Jr., et al.(Eds), Human Malignant melanoma, PP, 100, New York: Grune and Stratton 1979), DNP 백신의 투여는 전이성 덩어리에서 T세포의 침윤을 유도해내었다(참조: Berd et al, 1991 supra). 백신 치료 후, 염증 반응을 유도한 4명의 환자로부터의 8개의 피하 전이를 백신 치료 전 절개한 3개의 피하 전이, 및 염증반응을 유도하지 못한 4개의 백신 치료후의 전이와 비교 연구하였다. 백신 치료후 염증 반응이 있는 생체조직은 인터페론 감마(5/8), 인터루킨4(4/8) 또는 둘 모두(3/8)에 대한 mRNA를 함유하고 있었다. 대조적으로, 7개의 대조구 시료에서는 인터페론 감마, 인터루킨 4 의 mRNA중 아무것도 포함하지 않았다. 전기 15개의 조직 중 하나만 제외하고 모두 IL10에 대한 mRNA를 포함하고 있었다. 도 14는 백신 치료후 T세포가 침윤된 대표적인 생검으로부터의 시토카인 mRNA의 발현을 그에 상응하는 조직 검사와 함께 보여주고 있다.

림프 결절 전이 - 흑색종 림프결절 전이의 생검 역시 연구되었다. 조직학적으로 이러한 부위는 종양이 침윤된 림프결절 림프구의 잔여로 생각되는 림프구(참조: 도 15b)가 풍부한 것으로 특징지워진다(참조: Cardi et al., Cancer Res. 1989 49:6562-6565). 조사된 10개의 림프 결절 생검 중 오직 한개 만이 인터페론 감마에 대한 mRNA를 발현시켰다; 이 시료와 또다른 시료 하나가 IL10에 대한 mRNA를 발현시켰다. 도 15는 대표적인 생검으로부터의 시토카인 mRNA의 발현을 그에 상응하는 조직 검사와 함께 보여주고 있다.

흑색종 전이와 세포주에 의한 IL10 생산 - 전기에서 나타낸 바와 같이, 25개의 전이성 흑색종 중 24개가 IL10 mRNA를 발현시켰다(참조: 도 16). IL10의 발현은 인터페론 감마 또는 IL4의 mRNA의 발현과 독립적이고, T세포 침윤과는 상호관련이 없기 때문에, 림프구 보다는 흑색종 세포가 IL10의 출처가 되었을 것이다. 이러한 가설을 증명하기 위해서, 두 가지 접근 방법이 시도되었다. 첫째는, 전기의 2개의 전이성 종양으로부터 세포주를 조사하였다. 도 17a에서 볼 수 있듯이, 세포주와 전기 세포주를 얻은 종양은 IL10의 mRNA를 발현시켰다. 72시간 동안 배양한 후, 배양의 상등액을 분석하였을 때, 두 가지 세포주가 IL10을 생산하였다(IL10의 농도: 각각 760pg/ml, 10pg/ml). 두번째는 흑색종 전이의 조직 섹션상의 IL10 mRNA의 발현을 인-시츄 RT-PCR의 방법을 이용하여 조사하였다. 도 17b에서 볼 수 있듯이, IL10 mRNA는 흑색종 세포와 관련이 있고, 비-종양의 요소와는 관련이 없음을 알 수 있었다.

TNF mRNA는 흑색종 전이에서 발현된다 - 인-시츄 하이브리디제이션을 이용한 인간의 대장암 생검에의서 TNF에 대한 mRNA(참조: Naylor, M.S., et al., Cancer Res. 1990 50:4436-4440)와 TNF에 대한 저항은 생체내 종양 성장과 관련이 있다(참조: Lattime, E. C. and Stutman,, O., J. Immunol. 1989 143:4317-4323). 23개의 흑색종 시료에서 6개에서 TNF mRNA가 관찰되었다. 이는 DNP-백신에 의해 유도된 염증반응과 연관이 있다: 7개의 백신 처리 후 T세포가 침윤된 생검 중 4개가 양성적이었는 반면, 16개의 백신 처리전 또는 백신을 처리하였지만 염증반응을 유도하지 않은 시료중 2개에서 검사 결과가 양성이었다.

실시예 8

본 발명은 암의 면역치료법을 위한 디니트로페닐로 변형된 종양 펩티드를 개시하고 있다.

엡그테인 바 바이러스(EBV)를 배양상의 B 림프구 종성 피진 세포에 첨가하였다. B 림프구 종성 피진 세포를 환자 자신의 림프구로부터 B 세포 종양으로 형질전환시켰다. 전이로부터의 흑색종은 10% 소 태아 혈청 또는 10% 인간 혈청이 들어있는 RPMI 1640에서 배양하였다. 비고착성의 세포는 RPMI 배지로 세척되었다. 세포가 바닥을 덮을 정도로 증식되었을 때, 0.1% EDTA로 바닥에서 떼어내어 2개의 플라스크로 통과되었다. 이러한 과정은 10 내지 30번 계속되었다. T 세포에 의한 감마 인터페론 생성을 시험하기 위해서, 환자의 혈액으로부터 림프구를 수득하였다. T 세포를 자극하기 위해서 약 백만 개의 림프구를 DNP로 변형된 자가 유래의 흑색종 세포와 혼합하였다. 매 7일 마다 100U/ml의 인터루킨 2를 첨가하였다. T 세포는 전기에 개시된 바와 같이, 계대접종에 의해 증식시켰다. 그 후, DNP로 변형된 자가 유래의 흑색종 세포로 재자극하였고, 그 결과 DNP로 변형된 자가 유래의 흑색종 세포에 반응하는 T 세포의 집단을 수득할 수 있었다. 자극은 T 세포에 의한 감마 인터페론의 양에 의해 결정되었다. 일반적으로, 15pg/ml 이상의 감마 인터페론의 생산이 고려되었다. 이러한 T 세포는 펩티드를 시험하는데 사용되었다.

4가지 형태의 세포로부터 작은 펩티드가 추출되었고, 이들은 모두 한 환자로부터 유래되었다: 1) B 림프구 종성 피진 세포, 2) DNP로 변형된 B 림프구 종성 피진 세포, 3) 배양한 흑색종 세포, 4) DNP로 변형된 흑색종 세포. 세포를 0.1% 트리플로로아세트산에 현탁, 초음파 분쇄후, 100,000 xg로 90분 동안 심분리하였다. 분자량이 10,000이상인 상등액내의 물질은 센트리콘 10 필터(Centricon 10 filter)에 의하여 제거되었다. 남아 있는 물질은 역상 HPLC 컬럼상에서 분리하였다. 각각의 분획이 수거되어 건조되고, 컬럼 배지에 재현탁하였고, 전기 펩티드를 결합하여 제시하는 자가유래의 B 림프구 종성 피진 세포에 첨가하였다. 펩티드-펄스된(peptide-pulsed) B 세포는 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포에 특이적으로 감작된 T 세포주를 자극할 수 있는 능력에 대해서 시험되었다.

처음에 50개의 HPLC 분획(각 시료당 10㎕)을 각 그룹당 10개의 분획을 포함하는 5 그룹으로 나누었다. 도 13에서 볼 수 있듯이, DNP로 변형된 흑색종 세포(DNP-MEL) 또는 DNP로 변형된 B 세포로부터 유래된 펩티드(DNP-LY)만이 자극을 할 수 있었고, #2만이 양성이었다.

#2의 각각의 분획은 각각의 분획을 이용하여 T세포 자극 시험을 수행하므로써 분석되었다;활성은 #17 및 #18에서만 관찰되었고, DNP-MEL은 DNP-LY보다 감마 인터페론을 두 배 정도 더 생산하였다.

이러한 결과는 저분자량의 펩티드를 포함하는 단일 HPLC 분획이 DNP로 변형된 흑색종 세포로 감작된 T 세포를 자극함을 보여주는 것이다.

실시예 9

본 실시예는 항-DNP 항체를 이용한 펩티드 자극 저해를 알아보는 것이다.

실험 방법은 한 가지만 제외하고는 실시예 8에서 기술된 것과 동일하다. B 림프구 종성 피진 세포에 펩티드를 첨가한 후 및, 반응하는 T 세포를 첨가하기 전에 각기 다른 시료에 다양한 농도(1- 100 ㎍/ml)의 항-DNP 항체를 첨가할 것이다. 항-DNP 항체는 ATCC, 하이브리도마 #CRL-1968, 또는 비슷한 항체로부터 얻어질 수 있다. DNP로 변형된 펩티드로 자극이 이뤄진다면, 전기 항체는 이를 저해할 것이다. 분획 17 및 18은 전기 항체에 의해 저해될 것으로 기대되었다.

실시예 10

실시예 10은 반응하는 T 세포가 CD4+ 또는 CD8+인지를 결정하기 위한 것이다.

본 실험은 한 가지만 제외하고는 실시예 8에서 기술된 것과 동일하다. 반응하는 T 세포는 펩티드-펄스된 B 림프구 종성 피진 세포에 첨가되기 전에 아그룹으로 나뉘었다. 이는 T 세포를 항-CD4 또는 항-CD8 항체(Immunotsch, Inc., Westbrook, Maine)로 코팅한 자성의 비드와 혼합하여 수행된다. 그 후, 비드와 비드에 결합한 세포는 자석을 이용하여 제거되었다. 결합하지 않은 세포는 조직 배양 배지를 이용하여 세척되었고, 카운트되었으며, 자극의 측정을 위해 마이크로리터 웰에 첨가되었다.

실시예 11

실시예 11은 암의 면역 치료법을 위한 디니트로페닐로 변형된 종양 세포막을 개시한다.

한 환자의 흑색종으로부터 본 명세서의 참고 문헌에 통합되어 있는 하이크 등(참조: Heike et al., J. Immunotherapy 1994 15:165-174)의 방법에 따라서 세포막을 준비하였다. 본 명세서의 참고 문헌에 통합되어 있는 밀러 및 클라만(참조: J. Immunology 1976 117:1519-1526)의 방법에 따라 흑색종 세포막을 DNP와 결합시켰다. 전기 세포는 1mM의 PMSF와 함께 5배 부피의 30mM의 중탄산염 나트륨 완충액에 현탁하여 유리 호모게나제를 이용하여 분쇄하였다. 남아있는 완전한 세포 및 핵은 1000g에서 원심분리하므로써 제거하였다. 그리고, 세포막을 100,000g에서 90분 동안 원심분리하였다. 전기 세포막을 8% 자당에 재부유시켜서, 사용할 때까지 -80℃에서 동결보관하였다. DNP와 결합시키기 위해서, 흑색종 세포도 비슷한 방법으로 준비하였다.

이러한 DNP로 변형된 흑색종 세포막은 DNP로 변형된 완전한 흑색종 세포로 감작된 T 세포를 자극할 수 있는 능력에 대해 시험되었다. 이는 웰당 100,000 T 림프구를 웰당 약 10,000 내지 100,000 세포 등가물에 해당하는 DNP로 변형된 세포막과 함께 배양하고 감마 인터페론의 생성(15pg이상)을 측정하므로써 수행되었다. 전기 과정은 T 림프구를 DNP로 변형된 흑색종 세포와 배양하므로써 반복되었다. 이러한 결과는 완전한 T 세포와 전기 세포로부터 유래된 세포막이 T 세포를 자극하는데 비슷하게 효과적임을 보여주는 것이다.

본 실험은 여러 번 반복(같은 시료를 이용하여)하여 비슷한 결과를 얻었는데, 이는 T 세포 반응을 유도하는데 있어서, DNP로 변형된 흑색종 세포막이 DNP로 변형된 완전한 흑색종 세포를 대체할 수 있음을 말해 주는 것이다.

실시예 12

실시예 12는 자가유래의 단구 또는 수상 세포의 첨가가 종양 막에 대한 T 세포 반응을 강화시킬 수 있는지를 조사하기 위한 것이다. 동종의 단구는 다음과 같은 방법으로 분리될 것이다. 말초혈액 림프구(PBL)은 본 명세서의 참고 문헌에 포함되어 있는 보이엄(참조: Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, 1968 Suppl 97:77-89)의 방법에 따라서 밀도 구배를 이용하여 분리하였다. 전기 세포를 조직 배양 배지(RPMI-1640 + 10% 인간 혈청)에 부유시킨 다음 단구가 플레이트의 바닥에 부착될 수 있도록 2시간 동안 플라스틱 마이크로리터 웰에 첨가하였다. 그후, 고착하지 않은 세포를 배양 배지로 세척할 것이다. 다양한 농도의 GM-CSF(graulocyte macrophage colony stimulating factor, Immunex로부터 상업적으로 구입할 수 있음, Seattle, WA)를 단구의 자극을 위해 첨가되었다. 약 2 내지 3주 후, 지금은 거식 세포로 간주되고 있는 단구를 0.1% EDTA로 플라스틱 웰로부터 떼어내고 새로운 마이크로리터 웰에 그 수를 증가시키면서(웰당 약 100 부터 10,000까지) 첨가하였다. DNP로 변형된 자가유래의 종양세포(세포 등가물로 정량화됨)로부터 준비된 종양 세포막을 그 수를 증가시키면서 고착되어 있는 거식 세포의 단층에 첨가하였다. 약 6 내지 24 시간 후에, DNP에 특이적인 자가유래의 T 세포가 첨가되었고, 추가로 24시간 동안 배양되었다. 그 후, 상등액을 취하여 감마 인터페론, IL-2, 종양 괴사 인자를 포함하나 이에 제한되지 않는 시토카인의 생성; 또는T싸이미딘(thymidine)에 의하거나, MTT와 같은 염료를 사용한 방법에 의한 T 세포의 증식 또는 자극, 에 대해서 조사하였다. 예를 들어, T 세포 증식을 시험하기 위해,¹²⁵IUDR이 첨가될 것이고, 세포를 자동 수거 장치를 이용하여 수거할 것이다. 대조군은 자극되지 않은 T 세포 및 거식 세포 부재하에 세포막으로 자극된 T 세포로 구성될 것이다. 자가유래의 수상 세포의 종양 세포막에 대한 반응을 증가시킬 수 있는 능력도 비슷한 방법으로 시험될 수 있을 것이다. 말초 혈액 단핵 세포로부터 수상세포를 분리하고, 본 명세서의 참고 문헌에 포함되어 있는 오도허티 등(참조: O'Doherty, U., et al., J. Exp. Med. 1993 178:10678-1078)의 방법에 따라서 조직 배양하였다.

실시예 13

실시예 13은 DNP로 변형된 흑색종 백신을 투여받은 환자들이 DNP로 변형된 자가유래의 흑색종 세포막에 대해서 지연형 과민증을 분명하게 나타낼 것인지를 알아보기 위한 것이다.

본 연구의 주체는 DNP로 변형된 흑색종 세포막 백신을 반복적으로 투여받은 환자들이 될 것이다. 세포막을 전기에서 기술한 바와 같이, DNP로 변형된 동종의 세포막으로부터 준비될 것이다. 세포막의 수를 증가시키면서(약 100 내지 10,000 세포 등가물), 세포막을 PBS에서 세척하고 PBS에 다시 현탁하여 팔에 피내로 접종하였다. 지연형 과민증은 48시간이 경과한 후, 경화의 직경으로서 측정되었다. 대조구는 자가유래의 결합되지 않은 흑색종 세포막 및 자가유래의 혈액 림프구로부터 준비된 세포막으로 구성될 것이다.

실시예 14

실시예 14는 거식 세포와 수상 세포가 동계이형의 흑색종 세포막을 가공하여, 그러한 거식 세포와 동계인 T 세포에 대해 면역원적인 방식으로 보유할 수 있을지의 여부를 조사하기 위한 것이다.

실험 과정은 자극 세포막을 DNP와 결합된 동계이형의 세포막으로 부터 준비된다는 것을 제외하고는 실시예 12에서 기술된 것과 동일하다. 가정은 환자 A의 거식 세포 또는 수상 세포가 환자 B 로부터 수득한 세포막을 생체외에서 가공할 수 있다는 것이다. 본 실험은 동계 이형의 면역에 대한 전략에 이르게 할 것이다. 단일 환자의 동계이형 흑색종 세포주로부터 준비된 DNP로 변형된 세포막, 또는 동계 이형의 세포주 집단은 생체외에서 환자의 거식세포 또는 수상세포에 의해서 가공될 것이다. 그러한 세포는 면역에 사용될 것이다.

실시예 15

합텐, 즉 디니트로페닐로 변형된 자가유래의 흑색종 세포막으로 구성되는 백신, 즉 DNP-백신은 림파종 절제후 임상적으로 제 3기 흑색종을 갖는 환자들의 재발 없는 전체적인 생존기간을 연장시켰다. 수술후 아주반트 환자에게 DNP-백신을 4가지 계획에 따라 투여하고, 동종의 변형되지 않은 흑색종 세포(autol-MEL)에 대한 지연형 과민증을 유도하는 측면에서 그 효율을 결정하고자 비교하였다: (1) 계획 A, 총 8회의 백신을 매 28일마다 투여하였다(백신은 모두 DNP로 변형된 것이었다.); (2) 계획 B, 총 12회의 백신을 매주 투여하였고, DNP로 변형된 백신과 변형되지 않은 백신을 교대로 투여하였다; (3) 계획 C, 총 12회의 백신을 매주 투여하였고, 백신은 모두 DNP로 변형된 것이었다; 및 계획 D, 총 6회의 백신이 매주 투여되었다( 모든 백신은 DNP로 변형된 것이었다.). D를 제외한 모든 계획에서, 환자들은 백신 전에 합텐에 대해 감작되었다. 4 가지 모든 백신에서 면역적 아주반트로서, BCG가 흑색종 세포와 혼합되었다. 계획 C의 환자들은 치료 기간 동안 일정 간격을 두고 3회 사이클로포스파마이드를 투여받았다. 계획 D의 환자들은 첫번째 백신전에만 사이클로포스파마이드를 투여받았다.

놀랍게도, 투여 계획 A 및 D는 보다 강화된 계획인 B 및 C보다 autol-MEL에 대해서 유의적으로 더 높은 지연형 과민증을 유도하였다(p= .001, Mann-Whiten U tests). 5mm 이하인 autol-MEL에 대해 DTH 반응을 발생시킨 환자들의 백분률은 다음과 같았다: 계획 A: 45%(총 44명의 환자들중 20명, 즉 20/44), 계획 B:11% (3/27), 계획 C:18% (4/22), 계획 D:59%(16/27) (p＜ .01, Chi square). 대조적으로, 4 가지 계획 모두가 PPD에 대한 비슷한 DTH를 유도하였다. 지금까지의 경과에 의하면, autol-MEL에 대한 DTH 반응 유도에 가장 효과적인 두 가지의 투여 계획(A 및 D)이 표준적인 예후의 변수를 조정한 이후에도 면역학적으로 덜 효과적인 다른 두 가지 계획(B 및 C)보다 더 재발이 없는 긴 생존기간을 유도하였다. 그러므로, 인간 종양 백신의 투여량과 계획은 임상적으로 의미가 있는 면역 반응을 유도하는 데 있어서 중요할 수도 있다.

본 발명에서 인용 또는 기술되어 있는 각각의 환자, 특허 출원, 논문등은 본명세서의 참고 문헌에 통합되어 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 특징을 가지고 있는 종양 세포 또는 종양 세포 추출물을 치료에 유효한 양으로 포함하는 조성물을 투여하고, 전기 투여를 매주 반복하는 단계를 포함하는 종양으로 고통받는 환자에서 항-종양 반응을 유도하는 방법:

(i) 합텐과 결합되어 있고;

(ii) 환자의 종양과 같은 형태의 종양이며;

(iii) 전기 환자와 동계이형이 아니고; 및,

(iv) 접종 후 환자의 몸에서 자랄 수 없는 종양세포 또는 종양 추출물.
제 1항에 있어서,

전기 조성물은 적어도 3회 투여되는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 조성물은 적어도 6회 투여되는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 조성물의 투여 전에 사이클로포스파마이드를 치료적으로 유효한

양을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 4항에 있어서,

사이클로포스파마이드는 전기 조성물을 첫번째 투여하기 전에만

투여되는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 4항에 있어서,

치료적으로 유효한 양의 사이클로포스파마이드는 약 300 mg/M²의

투여량인 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 종양 세포 또는 추출물은 흑색종, 허파, 대장, 유방, 신장,

전립선, 난소 및 백혈병 종양 세포 또는 추출물로 구성되는

그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 7항에 있어서,

전기 종양 세포 또는 추출물은 흑색종 종양 세포 또는 추출물인 것을

특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-

나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl)

ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzene

sulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluorescein

isothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzene

isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic

acid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid),

디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 조합으

로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 9항에 있어서,

전기 합텐은 디니트로페닐인 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 조성물은 아주반트와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 11항에 있어서,

아주반트는 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-Guerin), QS-21,

비독성화된 내독소 및 시토카인으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을

특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 조성물을 투여하기 전에 치료적으로 유효한 양의 합텐으로

환자를 감작시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 포유동물은 전기 조성물의 투여 전에 합텐으로 감작되지

않는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

전기 조성물은 1회 투여량당 최대 약 7.5 X 10⁶의 종양 세포

또는 세포 등가물을 포함하는 것을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
제 1항에 있어서,

항-종양 반응은 종양괴사, 종양퇴화, 종양 염증, 활성화된 T세포의

종양조직 침투, 질환의 안정화 및 환자 생존기간의 연장으로 구성된

그룹으로부터 선택되는 적어도 한 가지임을 특징으로 하는

항-종양 반응을 유도하는 방법.
다음의 특징을 가지고 있는 종양 세포 또는 종양 세포 추출물을 치료에 유효한 양으로 포함하는 조성물을 투여하고, 전기 치료적으로 유효한 양은 1회 투여량당 최대 약 7.5 X 10⁶의 종양 세포 또는 세포 등가물인 종양으로 고통받는 환자에서 항-종양 반응을 유도하는 조성물:

(i) 합텐과 결합되어 있고;

(ii) 환자의 종양과 같은 형태의 종양이며;

(iii) 전기 환자와 동계이형이 아니고; 및,

(iv) 접종 후 환자의 몸에서 자랄 수 없는 종양 세포 또는 종양 추출물.
제 18항에 있어서,

전기 세포 추출물은 흑색종, 허파, 대장, 유방, 신장, 전립선,

난소 및 백혈병 종양 세포 또는 추출물로 구성되는

그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

조성물.
제 18항에 있어서,

합텐은 디니트로페닐, 트리니트로페닐, N-요오드아세틸-N'(5-설포닉 1-

나프틸) 에틸렌 디아민(N-iodoacetyl-N'-(5-sulfonic 1-naphthyl)

ethylene diamine), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzene

sulfonic acid), 플로레신 이소티오시아네이트(fluorescein

isothiocyanate), 비산 벤젠 이소티오시아네이트(arsenic acid benzene

isothiocyanate), 트리니트로벤젠설포닌산(trinitrobenzenesulfonic

acid), 설파니린산(sulfanilic acid), 아제닐닌산(arsanilic acid),

디니트로벤젠-S-무스타드(dinitrobenzene-S-mustard) 및 이들의 조합으

로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는

조성물.
제 20항에 있어서,

전기 합텐은 디니트로페닐인 것을 특징으로 하는

조성물.
제 18항에 있어서,

아주반트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

조성물.
제 22항에 있어서,

아주반트는 바실러스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-Guerin), QS-21,

비독성화된 내독소 및 시토카인으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을

특징으로 하는

조성물.