ES2311303T3 - Uso de celulas tumorales sometidas a hapteno y extractos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Uso, en la fabricación de una composición para inducir una respuesta anti-tumor en un paciente mamífero que sufre un tumor, de una célula tumoral o extracto de célula tumoral que: (i) está conjugada con un hapteno; (ii) es del mismo tipo tumoral que el tumor del paciente; (iii) no es alogénica a dicho paciente, y (iv) es incapaz de crecer en el cuerpo del paciente tras la inyección como resultado de irradiación antes de su uso. Donde: a) dicha composición debe administrarse con un adyuvante de manera repetitiva en intervalos semanales; b) a un paciente mamífero que no ha sido sensibilizado para dicho hapteno antes de la administración de dicha composición; y c) únicamente antes de la primera administración de dicha composición, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida a dicho paciente.

Description

Uso de células tumorales sometidas a hapteno y extractos de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención está dirigida a composiciones que comprenden células tumorales modificadas con hapteno y extractos y métodos para tratar cáncer administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende una célula tumoral o un extracto de célula tumoral a un sujeto que precise dicho tratamiento. La invención también hace referencia a un programa de vacunación efectivo para inducir una respuesta anti-tumor en una paciente que sufre cáncer.

Contexto de la invención

En la década de los 60 apareció la teoría según la cual las células tumorales portan antígenos específicos (TSA) que no están presentes en células normales y que la respuesta inmune a estos antígenos puede permitir que un individuo rechace un tumor. Más tarde se sugirió que la respuesta inmune a TSA podía aumentar introduciendo nuevos determinantes inmunológicos en las células. Mitchison, Transplant, Proc., 1970, 2, 92. Dicho "determinante ayudante", que puede ser un hapteno, una proteína, un antígeno con capa viral, un antígeno de transplante, o un antígeno celular xenogénico, podía introducirse en una población de células tumorales. A continuación las células se inyectarían en un individuo del que se esperaría que fuera tolerante al crecimiento de células tumorales no modificadas. Clínicamente, se esperó que se diera una reacción inmunológica contra los determinantes ayudantes, y como consecuencia aumentase la reacción que acompaña a TSA, y las células tumorales que serían toleradas se destruyesen. Mitchison, supra, también sugiere varios modos de acción de los determinantes ayudantes incluyendo 1) que las células no modificadas simplemente se atenúan, en el sentido de que su ritmo de crecimiento se ralentiza o su susceptibilidad de ataque inmunológico aumenta; 2) que los determinantes ayudantes solamente proporcionan puntos de ataque y que por lo tanto permiten que una respuesta inmune no dirigida contra TSA mate las células modificadas; 3) que los determinantes ayudantes tienen una acción adyuvante como la de enlazarse con un anticuerpo o promover la localización de células en la parte correcta del cuerpo para su inmunización, en particular, en los nodos linfáticos.

Fujiwara et al., J. Immunol., 1984, 132, 1571 mostró que ciertas células tumorales sometidas a hapteno, es decir, células tumorales conjugadas con hapteno trinitrofenil (TNP), podían inducir inmunidad sistemática contra células tumorales no modificadas en un sistema murino, siempre y cuando los ratones se sensibilicen en primer lugar para el hapteno en ausencia de células T supresoras específicas de hapteno. Las células de bazo de los ratones tratados previnieron de manera completa y específica el crecimiento de tumores en animales recipientes no tratados. Flood et al., J. Immunol., 1987, 138, 3573 mostró que los ratones inmunizados con un tumor "que retrocede" conjugados con TNP, inducido por luz ultravioleta fueron capaces de rechazar un tumor que avanza conjugado con TNP que sino sería no inmunológico. Además, estos ratones a continuación fueron resistentes al desafío con el tumor no conjugado "que avanza". En otro sistema experimenta, Fujiwara et al., J. Immunol., 1984, 133, 510 demuestra que los ratones sensibilizados a trinitroclorobenzeno (TNCB) tras el pretratamiento con ciclofosfamida podían curarse de tumores grandes (10 mm) mediante sometimiento a hapteno in situ de células tumorales; a continuación, estos animales fueron específicamente resistentes a enfrentarse con las células tumorales no conjugadas.

Lo escrito por Fujiwara et al. difiere de la presente invención en varios factores incluyendo los siguientes: A. las células empleadas en la composición de Fujiwara se derivan de tumores murinos transplantables e inducidos - no de tumores humanos espontáneos; B. la composición de Fujiwara se emplea en inmunoprofilaxis - la presente invención emplea inmunoterapia; C. La composición de Fujiwara se administra como una terapia local - la composición de la presente invención se administra mediante inoculación sistémica; y D. La composición de Fujiwara no dio resultado en regresión tumoral - la composición de la presente invención da como resultado en la regresión y/o supervivencia prolongada para la menos una parte importante de los pacientes tratados.

Recientemente se ha demostrado la existencia de células T que reaccionan de manera cruzada con tejidos no modificados. Weltzien y sus colaboradores han demostrado que los clones celulares T de clase I restringidos a MHC generados a partir de ratones inmunizados con linfocitos singeneicos modificados con TNP respondieron a los péptidos asociados con MHC "automodificados" con TNP. Ortmann, B., et al, J. Immunol., 1992, 148, 1445. Además, se ha establecido que la inmunización de ratones con linfocitos modificados con TNP da como resultado el desarrollo de células T esplénicas que muestran respuestas proliferativas y citotóxicas secundarias para células modificadas con TNP in vitro. Shearer, G. M. Eur. J. Immunol., 1974, 4, 527. El potencial de linfocitos obtenidos mediante inmunización con células autólogas modificadas con DNP o TNP para responder a células autólogas no modificadas resulta de notable interés ya que puede ser relevante para dos problemas clínicos: 1) enfermedad autoinmune inducida por medicamento, y 2) inmunoterapia de cáncer. En relación con el primero, se ha sugerido que los medicamentos ingeridos actúan como haptenos, que se combinan con proteína de tejido normal formando complejos inmunogénicos que son reconocidos por células T. Tsutsui, H., et al., J. Immunol., 1992, 149, 706. A continuación la enfermedad autoinmune, es decir, lupus eritematoso sistémico, puede desarrollarse y continuar incluso después de la retirada de ausencia del medicamento ofensor. Esto podría implicar la generación final de linfocitos T que reaccionen de manera cruzada con tejidos no modificados.

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El denominador común de estos experimentos es la sensibilización con hapteno en un medio en el cual las células supresoras no son inducidas. Ratones pretratados con células del bazo de ciclofosfamida sensibles a TCB mostraron "función ayudante amplificada" radioresistente, es decir, aumentaron específicamente la generación in vitro de citotoxididad anti-TNP. Además, una vez que se habían activado estos ayudantes amplificados mediante la exposición in vitro a linfocitos autólogos conjugados con TNP, fueron capaces de incrementar la citotoxicidad también para antígenos no relacionados, incluyendo antígenos tumorales (Fujiwara et al., 1984). Flood et al., (1987), supra, mostró que esta actividad ayudante amplificada fue mediada por células T con el fenotipo Lyt^{-}1^{+}, Lyt^{-}2^{+}, L3T4^{+}, I^{-}J^{+} y sugiere que estas células fueron células contra-supresoras, una nueva clase de célula T inmunoreguladora.

La inmunoterapia de pacientes con melanoma había mostrado que la administración de ciclofosfamida, en dosis altas (1000 mg/M^{2}) o en dosis bajas (300 mg/M^{2}), tres días antes de la sensibilización con hemocianina de lapa californiana de antígeno primario aumenta de manera considerable la adquisición de hipersensibilidad de tipo tardío a ese antígeno (Berd et al., Cancer Res., 1982, 42, 4862; Cancer Res., 1984, 44, 1275). El pretratamiento con ciclofosfamida en dosis bajas permite a los pacientes con melanoma metastático que desarrollen hipersensibilidad de tipo tardío a células de melanoma autólogas en respuesta a la inyección con vacuna de melanoma antólogo (Berd et al., Cancer Res., 1986, 46, 2572; Cancer Invest., 1988, 6, 335). La administración de ciclofosfamida da como resultado la reducción de función supresora T no específica de linfocito sanguíneo periférico (Berd et al., Cancer Res., 1984, 44, 5439; Cancer Res., 1987, 47, 3317), posiblemente mediante la reducción de células T supresoras inductoras CD4+, CD5+ (Berd et al., Cancer Res., 1988, 48, 1671). Los efectos anti-tumor de este régimen de inmunoterapia parecen ser limitados por el intervalo excesivamente largo entre el inicio de la administración de la vacuna y el desarrollo de la hipersensibilidad de tipo tardío para las células tumorales (Berd et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 1988, 29, 408 (#1626)). Por lo tanto, aún existe una necesidad de aumentar la eficiencia terapéutica de dicha vacuna para hacerla más inmunogénica.

La mayoría de los inmunologistas tumorales actualmente están de acuerdo en que la infiltración de linfocitos T, células blancas responsables de la inmunidad tumoral, en la masa tumoral es un prerrequisito para la destrucción tumoral por el sistema inmune. Como consecuencia, se ha concentrado mucha atención en lo que se ha llegado a conocer como la terapia "TIL", de la que fue pionero el Doctor Stephen Rosenberg en NCI. El Dr. Rosenberg y otros han extraído de metástasis de cáncer humano los focos linfocitos T que se encuentran presentes de manera natural y expandieron en gran manera su número cultivándolos in vitro con Interleukina 2 (IL2), un factor de crecimiento para linfocitos T. Topalian et al., J. Clin. Oncol., 1988, 6, 839. Sin embargo, esta terapia no ha resultado muy efectiva debido a que las células T inyectadas están limitadas en su habilidad de "alojarse" en el punto del tumor.

La habilidad de las concentraciones altas de IL2 para provocar que los linfocitos se conviertan en células mortales no específicamente citotóxicas ha sido terapéuticamente explotada en numerosos estudios (Lotze et al., J. Biol. Response, 1982, 3, 475; West et al., New Engl. J. Med., 1987, 316, 898). Sin embargo, este enfoque tiene limitaciones debido a la toxicidad severa de dosis elevadas intravenosas de IL2. Se ha prestado menor atención a la observación de que muchas concentraciones más bajas de IL2 pueden actuar como un adyuvante inmunológico provocando la expansión de células T activadas por antígeno (Talmadge et al., Cancer Res., 1987, 47, 5725; Meuer et al., Lancet, 1989, 1, 15). Por consiguiente, aún existe la necesidad de entender e intentar explotar el uso de IL2 como un adyuvante inmunológico.

Se cree que los melanomas humanos expresan antígenos de superficie única reconocible por linfocitos T. Old, L. J., Cancer Res., 1981, 41, 361; Van der Bruggen, P., et al., Science, 1991, 254, 1643; Mukherji, B., et al., J. Immunol., 1986, 136, 1888; y Anichini, A., et al., J. Immunol., 1989, 142, 3692. En cambio, las visiones inmunoterapéuticas previas al trabajo realizado por la presente invención se han quedado limitadas por la dificultad para provocar una respuesta efectiva mediada por célula T para los antígenos in vivo.

Existen varios modelos propuestos para explicar lo que parece ser tolerancia para los antígenos asociados a tumores humanos. Estos modelos incluyen:

1)

Células supresoras específicas de antígeno tumorales que reduce las incipientes respuestas anti-tumor. Mukherji, et al., supra; Berendt, M. J. y R. J. North., J. Exp. Med., 1980, 151, 69.

2)

Fallo de células tumorales humanas para obtener células ayudantes T o para proporcionar señales coestimuladoras con aquellas células T. Fearon, E. R., et al., Cell, 1990, 60, 397; Townsend, S. E. y J. P. Allison, Science, 1993, 259, 368;

y

3)

Expresión de superficie reducida de productos principales de histocompatibilidad sobre células tumorales que limita su reconocimiento por parte de células T. Ruiter, D. J., Seminars in Cancer Biology, 1991, 2, 35. Ninguna de estas hipótesis ha sido corroborada en un sistema clínico.

El fin de la inmunoterapia activa para tumores es el desarrollo de una inmunidad específica para tumor mediada por una célula T sistémica productiva. La inmunidad específica para tumor actuaría tanto en el punto del tumor primario así como en los pequeños puntos metastáticos claros en lugares distantes. La generación de inmunidad a célula T ha demostrado ser una respuesta elevadamente regulada que requiere la interacción célula-célula y la producción de un número de citoquinas. Últimamente, estudios sobre un número de sistemas humanos y sistemas de ratas han demostrado que las respuestas a las células T pueden separarse en dos categorías denominadas Tipo I y II (Mossman, et al., J. Immunol. 1986 136:2348). Las respuestas del Tipo I son necesarias para el desarrollo de hipersensibilidad de tipo tardío (DTH), están asociadas con la activación de microbase y la producción de interferón-gamma (IFN\gamma), y han demostrado estar asociadas con la resolución de lepra humana (Yamamura, M., et al., Science 1991 254:277-279)y leishmaniasis murina (Scott, P., et al., Immunological Review 1989 112:161-182). Las respuestas del Tipo II están asociadas con la producción de IL4 e IL10, principalmente respuestas al soporte de anticuerpos, y están asociadas con las formas progresivas de lepra (Yamamura, M., et al., supra) y leishmaniasis (Yamamura et al., supra; y Scott, P., et al., supra). Además del desarrollo de DHT, se espera que las respuestas del Tipo I aumenten la generación de CTL específico de tumor por medio de la incrementación de MHC y antígenos asociados al tumor así como la presentación incrementada de antígeno secundaria a la producción localizada de IFN\gamma. Más recientemente, las respuestas del Tipo I y Tipo II han demostrado regular de manera cruzada: IFN\gamma inhibe las repuestas de Tipo II, mientras que IL4 e IL10 inhiben las del Tipo I (Scott, J. Immunol. 1991 147: 3149-3155; y Florentino et al., J. Immunol. 1991 146: 3444-3451). En el sistema de leishmania, la modulación de citoquinas en el punto de la lesión permite la conversión de una respuesta de Tipo II a una respuesta de Tipo I, y, como consecuencia, un cambió de infección progresiva a erradicación de la enfermedad (Scott, 1991, supra).

Pisa et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1992 89: 7708-7712 detectó mARN IL10 en biopsias de carcinoma en ovarios, pero no en líneas celulares de carcinoma en ovarios; concluyeron que la fuente de IL10 era los linfocitos que infiltraban el tumor. Gastl et al., Int. J. Cancer 1991 55: 96-101 descubrió que las líneas celulares tumorales 16/48 liberaban IL10 en el sobrenadante del cultivo; solamente 3-8 líneas celulares de melanoma fueron positivas. Finalmente, Chen et al., Int. J. Cancer, 1994 56: 755-760 recientemente ha afirmado que 6/9 líneas celulares derivadas de melanomas metastáticos expresaron mARN de IL10. Sin embargo, la presente información es el primer documento conocido par los inventores de mARN para IL10 en biopsias de melanoma metastático.

Aún no se conoce si estas observaciones son aplicable a la relación tumor humano-huésped, es decir, si el patrón de producción de citoquinas por parte de células T infiltradotas de tumores es un indicador de la eficacia de la respuesta inmune. Los pacientes con melanoma metastático tratado con una vacuna antóloga, modificada con DNP desarrollan respuestas anti-inflamatorias en puntos tumorales, Berd et al., 1991, supra y Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting (Marzo 1998), vol. 39, p. 356. Histológicamente, estas lesiones inflamadas se caracterizan por la infiltración de célula T que en ocasiones se asocia con la destrucción de células tumorales. La presente invención considera que los tumores de pacientes tratados con vacunas DNP contienen linfocitos T de Tipo I, que no son detectables en tumores extirpados antes de la administración de la vacuna.

Los intentos convencionales para tratar cáncer humano no han tenido éxito o han tenido muy poco éxito y a menudo han provocado efectos secundarios no deseable. Los intentos para tratar cáncer en base a varias teorías inmunológicas tampoco han tenido éxito. A pesar de que el Solicitante ha tratado con éxito el melanoma en ciertos pacientes empleando células de melanoma conjugadas con hapteno, aún existe en el campo de tratamiento de cáncer la necesidad de métodos adicionales y mejorados para inducir o provocar una respuesta anti-tumor. El Solicitante ha descubierto ahora un protocolo efectivo de vacunas empleando células tumorales modificadas con hapteno o extractos de las mismas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de composiciones que contienen células tumorales modificadas con hapteno y extractos para provocar una respuesta anti-tumor en un paciente que sufre cáncer mediante la administración de las composiciones de la invención tal y como se define en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la cinética del desarrollo de DHT a PBL análogo modificado con DNP y células de melanoma. Los pacientes con melanoma metastático tratados con vacunas DNP fueron testados en serie con PBL (LY) modificado con DNP o con células de melanoma modificadas con DNP desasociadas de una masa metastática (MEL). Cada barra indica la respuesta DTH media para el grupo de paciente en cada punto del tiempo; barras de error = error estándar. Para el día 119, solamente se midieron las respuestas para PBL. Tamaños de muestra: días 0, 14, 63, N = 84; día 119, N = 57; día 175, N = 42; día 231, N = 35.

La Figura 2 muestra la respuesta del anticuerpo a DNP. El suero obtenido de varios puntos en el tiempo fue testado para anticuerpo (inmunoglobulina total) para DNP empleando ELISA. El título se define: (pico OD de la muestra) X (recíproco de la dilución que dio un OD igual a la mitad del pico OD del control positivo).

La Figura 3 es un gráfico de la respuesta proliferativa de PBL a linfocitos autólogos modificados con DNP. Se obtuvo PBL de cuatro pacientes que recibían vacunas DNP en el unto de sus respuestas DHP. Las células fueron testadas en busca de habilidad para proliferar a PBL autólogo modificado con DNP (auto) LY-DNP) con PBL autólogo no modificado (autol LY) como un control. Los cultivos fueron pulsados con ^{125}IUDR el día 6.

La Figura 4 muestra la cinética de la respuesta proliferativa para linfocitos modificados con DNP. PBL fue recogido en serie de paciente DM2 mientras recibía la vacuna DNP. Se crioconservaron y a continuación todas las muestras fueron testadas de manera simultánea para respuesta proliferativa con PBL autólogo modificado con DNP (auto) LY-DNP). Los cultivos fueron pulsados con ^{125}IUDR el día 6.

La Figura 5 muestra la especificidad de la respuesta proliferativa con las células modificadas con DNP. PBL de dos pacientes fue testado para respuesta proliferativa con PBL autólogo, bien sin modificar (autol LY), modificado con DNP (autol LY-DNP), o modificado con TNP (auto) LY-TNP), y con células cultivadas autólogas de melanoma, bien sin modificar (MEL) o modificadas con DNP (MEL-DNP). Los cultivos fueron pulsados con ^{125}IUDR el día 6.

La Figura 6 es un análisis de especificidad de células T expandidas. PBL de paciente DM2 fueron expandidos en IL2 y de manera repetitiva se estimularon con células linfoblastoides B modificadas con DNP autólogo. Fueron testadas para respuestas proliferativa con PBL autólogo, bien sin modificado (autol LY), modificado con DNP (autol LY-DNP), o modificado con TNP (auto) LY-TNP); células cultivadas autólogas de melanoma, bien sin modificar (MEL) o modificadas con DNP (MEL-DNP); y PBL alogénico (Alto LY). Los cultivos fueron pulsados con ^{125}IUDR el día 6.

La Figura 7 muestra respuestas de CD8 + CD4 + Células T a células autólogas modificadas con DNP. Las células T expandidas se separaron en poblaciones enriquecidas con CD8 o enriquecidas con CD4 mediante criba positiva. A continuación se testaron para respuestas proliferativa con PBL autólogo, bien sin modificar (auto) LY), modificado con DNP (auto) LY-DNP), o con células cultivadas autólogas de melanoma, bien sin modificar (MEL) o modificadas con DNP (MEL-DNP). Los cultivos fueron pulsados con ^{125}IUDR el día 6.

La Figura 8 muestra la producción de citoquina por medio de las células T reactivas con DNP. La línea celular T reactiva con DNP ("Padre"), y tres subcultivos (2F8, 1 D7, 1 C2), obtenidos tras la colocación en placas en dilución limitativa, se incubaron con células linfoblastoides B modificadas con DNP autólogo durante 18 horas; se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para interferón gamma (IFN) e IL4.

La Figura 9 muestra el bloqueo de la célula T por parte del anticuerpo monoclonal de clase I anti-MHC. Las células expandidas CDB + T se estimularon con células linfoblastoides B modificadas con DNP autólogo y los cultivos se analizaron para interferón gamma tras 8 horas. Las células estimuladoras fueron preincubadas y con uno de los siguientes: ningún anticuerpo (ninguno), IgG de ratón no específico (no específico), anticuerpo W6/32 monoclonal (clase I), o anticuerpo L234 monoclonal (clase II).

La Figura 10 muestra restricción MHC de respuesta celular T. Las células expandidas CD8 + T (HLA-A1, A2, B8, Bw6) fueron testadas para habilidad para proliferar en respuesta a PBL autólogo modificado con DNP y para PBL alogénico modificado con DNP de otros cuatro pacientes. Tres de los estimuladores alogénicos coincidieron en uno o más puntos de clase I tal y como se ha mostrado, y el cuarto no coincidió en absoluto (A24, A26, B44, B63). Los cultivos fueron pulsados con ^{125}IUDR el día 6.

La Figura 11 muestra gráficos de citotoxicidad de células T reactivas con DNP. Las células de melanoma, bien autólogas (auto), o alogénicas sin coincidir con la clase I (alo), se emplearon como objetivos en un ensayo ''Cr de 6 horas. Las células efectoras fueron células T reactivas con DNP y expandidas CD8+. La Figura 11A - células objetivo fueron sometidas a hapteno con varias concentraciones de DNBS o TNBS. El efector: el radio de célula objetivo fue 20:1. La Figura 11B - células objetivo fueron sometidas a hapteno con 2.5 mg/ml DNBS o TNBS y se mezclaron con células efectoras en una serie de radios efectora:objetivo (E:T).

La Figura 12 muestra un gráfico de porcentaje de pacientes libres de tumor en los meses tras la operación tratados con vacuna DNP y con vacuna control sin hapteno.

La Figura 13 muestra las fracciones HPLC que se introdujeron en cinco grupos de diez fracciones cada uno. Los péptidos derivados de células de melanoma modificadas con dinitrofenil (DNP-MEL) o células B modificadas con dinitrofenil (DNP-LY) fueron estimuladores en el pozo 2.

Las Figuras 14A-14B muestran un nódulo de melanoma subcutáneo inflamado de pacientes inmunizados con vacuna DNP que expresa mARN para IFN\gamma e IL10. La Figura 14A muestra mARN para citoquinas determinado por RR-PCR (ruta 1 = marcador de tamaño; 2 = beta-actina; 3 = IFN\gamma, 4 = IL4; 5 = IL10); La Figura 14B es una sección tintada H&E de la lesión subcutánea (400X).

La Figura 15A muestra una metástasis del nódulo linfático de un paciente inmunizado que expresa mARN para IL10 pero no para IFN\gamma. La Figura 15-A muestra mARN para citoquinas determinado por RR-PCR (ruta 1 = marcador de tamaño; 2 = beta-actina; 3 = IFN\gamma, 4 = IL4; 5 = IL10), La Figura 15-B es una sección tintada H&E de la metástasis de nódulo linfático (400X).

La Figura 16 es un gel de IL10 mARN expresado en metástasis de melanoma humano. El mARN para citoquinas determinado por RR-PCR (ruta 1 = marcador de tamaño; C = IL10 cADN control; 1-7 = muestras de los pacientes).

La Figura 17 es un gel de IL10 mARN expresado por las células de melanoma. La Figura 17 muestra la expresión de IL10 mARN por RTPCR de biopsia tumoral representativa y línea celular derivada (ruta 1 = marcador de tamaño; 2 = IL10 cADN; 3 = biopsia tumoral; 4 = línea tumoral).

Las Figuras 18A-18B es un RT-PCR in situ de una sección de parafina de una biopsia de melanoma no inflamado (A=100X, B=400X).

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a la inmunoterapia para cáncer tal y como se define en las reivindicaciones. La invención además hace referencia a un método para provocar una respuesta anti-tumor de acuerdo con un programa semanal de vacunación. Por motivos de la invención la respuesta anti-tumor es al menos una de las siguientes: necrosis tumoral, regresión tumoral, inflamación tumoral, infiltración tumoral por parte de linfocitos T activados, respuesta de hipersensibilidad de tipo tardío, y prolongación de la supervivencia del paciente. Las células tumorales y los extractos y composiciones de las mismas son capaces de obtener linfocitos T que tiene la propiedad de infiltrar un tumor de un mamífero, obtener una respuesta inmune anti-inflamatoria a un tumor de un mamífero, obtener una respuesta de hipersensibilidad de tipo tardío a un tumor de un mamífero y/o estimular linfocitos T in vitro.

Una respuesta anti-tumor que resulta del tratamiento puede ser una regresión parcial o completa del tumor metastático o de una enfermedad estable. Una regresión "completa" indica aproximadamente el 100% de regresión o retroceso durante un periodo de al menos un mes, más preferiblemente durante un periodo de al menos tres meses. Una regresión "parcial" indica una regresión de más del 50% durante un periodo de al menos un mes, más preferiblemente durante un periodo de al menos tres meses. Una enfermedad "estable" indica una condición en la que no existe un crecimiento considerable del tumor tras el tratamiento con vacuna. Otra respuesta anti-tumor que puede observarse tras el tratamiento de la invención es la prolongación de la supervivencia.

Cualquier tumor maligno puede tratarse incluyendo cánceres metastáticos y primarios y tumores sólidos y no sólidos. Los tumores sólidos incluyen carcinomas, y los tumores no sólidos incluyen tumores malignos hematológicos. Los carcinomas incluyen y no están limitados a adenocarcinomas y carcinomas epiteliales. Los tumores malignos hematológicos incluyen leucemias, linfomas, y múltiples mielomas. Los siguientes son ejemplos no limitativos de cánceres tratables con membranas celulares tumorales aisladas y modificadas de acuerdo con los métodos de la presente invención: cáncer ovárico, incluyendo ovárico avanzado, leucemia, incluyendo y sin limitarse a la leucemia mielógena aguda, cáncer de colon, incluyendo colon metastatizado hasta el hígado, de recto, de colon y recto, melanoma, de pecho, pulmón, riñón y de próstata. Los cánceres ováricos pueden ser adenocarcinomas o carcinomas epiteliales. Los cánceres de colon y próstata son adenocarcinomas. Las leucemias pueden originarse en la médula ósea mieloide o en los nódulos linfáticos. Las leucemias pueden ser agudas, presentadas por una detención de maduración en una fase primitiva del desarrollo, y crónicas, presentadas por un devengo excesivo de células linfoides o mieloides maduras. El cáncer de fase I, II, III y IV puede tratarse de acuerdo con la presente invención, preferentemente las fases III y IV, y más preferentemente la fase III. Cualquier mamífero, preferentemente un humano, puede tratarse.

Las composiciones se preparan a partir de una célula tumoral o de un extracto de célula tumoral. Una célula tumoral puede ser una célula maligna o pre-maligna de cualquier tipo de cáncer. Pre-maligno hace referencia a cualquier célula anormal sugerente de ser una célula cancerígena, que aún no es una célula cancerígena; como, aunque sin limitarse, los cambios displásticos en células del cuello del útero que finalmente dan lugar a cáncer cervical o de cuello de útero, y nevus displástico que son células cutáneas anormales que dan lugar a melanoma. Las células tumorales y los extractos preferentemente se originan del tipo de cáncer que va a tratarse. Por ejemplo, una célula de melanoma o un extracto de la célula se emplean para tratar cáncer del tipo melanoma. Las células tumorales y los extractos de las mismas pueden ser, aunque no se limitan a, células autólogas y alogénicas desasociadas de especímenes de biopsia o cultivos de tejido, así como células madre y extractos de estas fuentes. Preferentemente, las células y extractos son autólogos. Sin embargo, puede usarse cualquier célula no alogénica, incluyendo las células tumorales producidas en cultivo de células autólogas aisladas del tumor del paciente. Las células tumorales no necesitan ser completamente (100%) idénticas genéticamente con la célula tumoral o la célula somática no tumoral del paciente tratado. La identidad genética de las moléculas MHC entre la célula tumoral y el paciente es generalmente suficiente. Además, puede existir identidad genética entre un antígeno particular en la célula del melanoma y un antígeno presente en las células tumorales del paciente. La identidad genética puede determinarse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Una célula tumoral que se ha alterado genéticamente (empleando por ejemplo tecnología del ADN recombinante) para convertirse en genéticamente idéntica con respecto a, por ejemplo, las moléculas MHC particulares del paciente y/o el antígeno particular en las células cancerígenas del paciente se encuentra dentro del significado de "no-alogénica" y dentro del alcance de la presente invención. Tales células pueden también referirse como "MHC-idénticas" o "MHC-compatibles".

Los extractos de células tumorales puede ser un péptido aislado de una célula cancerígena modificada con hapteno o una membrana celular aislada de una célula cancerígena modificada con hapteno. Los extractos también pueden aislarse en primer lugar de las células tumorales y a continuación modificarse con hapteno.

Los péptidos son compuestos de dos o más aminoácidos que incluyen proteínas. Los péptidos preferiblemente tendrán bajo peso molecular, de aproximadamente 1,000 kD a aproximadamente 10,000 kD, más preferiblemente entre aproximadamente 1,000 y 5,000 kD, que se aíslan de células tumorales sometidas a hapteno y que estimulan linfocitos celulares T para producir interferón gamma. Las células T son linfocitos que median dos tipos de funciones inmunológicas, efectora y reguladora, segregan proteínas (linfoquinas), y matan otras células (citotoxicidad). Las funciones efectoras incluyen reactividad como la hipersensibilidad tardía, rechazo a aloinjerto, inmunidad al tumor, y reactividad injerto- versus-huésped. La producción de linfoquina y la citotoxicidad se demuestran mediante las funciones efectoras de las células T. Las funciones reguladoras de las células T están representadas por su habilidad para amplificar la citotoxicidad mediada por la célula por parte de otras células T y la producción de inmunoglobulina por parte de las células T. Las funciones reguladoras también requieren la producción e linfoquinas. Las células T producen interferón gamma (IFN\gamma) en respuesta a un estímulo provocador que incluye aunque no se limita a mitógenos, antígenos y lectinas. Los péptidos pueden estar formados preferiblemente entre 8 y 20 aminoácidos, además el péptido se ha sometido a hapteno. Los péptidos pueden aislarse de la superficie celular, del interior celular, o de una combinación de estas dos localizaciones. El extracto puede ser particular al tipo de célula cancerígena (contra la célula normal). El péptido incluye pero no está limitado a un péptido que se enlaza con el principal complejo de histocompatibilidad, una proteína asociada a la superficie celular, una proteína codificada por los oncogenes cancerígenos o por anti-oncogenes mutados.

La membrana celular cancerígena pude ser una o parte de una membrana de una membrana aislada de una célula cancerígena sometida a hapteno. De acuerdo con la definición de membrana celular cancerígena, una membrana celular cancerígena puede aislarse y a continuación someterse a hapteno, y de manera alternativa, una célula cancerígena puede someterse a hapteno y a continuación la membrana puede aislarse del mismo.

Los extractos celulares son capaces de estimular células T. La estimulación para fines de la presente invención hace referencia a la proliferación de células T así como a la producción de citoquinas por parte de células T, en respuesta al extracto celular. Las membranas y proteínas aisladas de células y proteínas tumorales modificadas con hapteno tienen independientemente la habilidad para estimular células T. La proliferación de células T puede observarse por la respuesta de células T de los ácidos nucleicos modificados, como, aunque sin limitarse, 3H timidina, ^{125}IUDR (iododeoxiuridina); y tintes como 2-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) que tinta o mancha células vivas. Además, se producen citoquinas como, aunque sin limitarse a, IFN\gamma, factor de necrosis tumoral (TNF), e IL2. La producción de citoquinas se encuentra preferentemente en una cantidad superior a 15 picogramos/ml, más presentemente entre aproximadamente 20 y 30 picogramos/ml, e incluso más preferentemente aproximadamente 50 picogramos/ml.

Preferentemente, el extracto de células tumorales comprende materiales celulares que son únicos, o sustancialmente específicos para un tipo particular de cáncer. Las células tumorales pueden ser células vivas, pero son incapaces de crecer en el cuerpo de un paciente tras la inyección. Los métodos para prevenir que las células crezcan son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las células tumorales pueden irradiarse antes de su uso. En una realización, las células o extractos tumorales se irradian a aproximadamente 2500 cGy para prevenir que las células crezcan tras la inyección.

Las composiciones pueden emplearse solas o en combinación con otros compuestos. Por consiguiente, las células cancerígenas y los extractos de células cancerígenas pueden emplearse solas y se pueden coadministrar. La coadministración incluye la administración simultáneamente o de manera consecutiva. Además, la membrana de la célula tumoral puede coadministrarse con el péptido. Adicionalmente, las células cancerígenas y/o extractos pueden coadministrarse con otros compuestos que incluyen pero no limitan a las citoquinas tales como Interleukina-2, Interleukina-4, interferón gamma, Interleukina-12, GM-CSF. Las células tumorales y extractos también pueden emplearse junto con otros tratamientos de cáncer incluyendo aunque sin limitar la quimioterapia, radiación, anticuerpos, secuencias de oligonucleótidos, y secuencias de oligonucleótidos antisentido.

Las composiciones pueden administrarse en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable, seleccionado en base a la ruta deseada de administración y a la práctica farmacéutica estándar. Las dosis pueden establecerse en base al peso y a la condición clínica del paciente. El radio proporcional de ingrediente activo para el portador depende naturalmente de la naturaleza química, solubilidad, y estabilidad de las composiciones, así como de la dosis considerada. Las cantidades de células y extractos tumorales de uso dependen de factores tales como la afinidad del compuesto con células cancerígenas, la cantidad de células cancerígenas presentes y la solubilidad de la
composición.

La composición puede mezclarse con un adyuvante inmunológico y/o un portador farmacéuticamente aceptable. Puede emplearse cualquier vehículo acuoso conocido útil en el envío de fármacos como por ejemplo aunque sin limitación, salina, como un portador. De manera adicional, cualquier adyuvante conocido para aquellos expertos en la técnica puede resultar útil en el envío. El adyuvante tiene la propiedad de incrementar una respuesta inmune a las preparaciones con células tumorales de la presente invención. Ejemplos representativos de adyuvantes son BCG, o el adyuvante sintético, QS.21 que está formado por saponina homogénea purificada de la corteza de Quillaja saponaria, Corynebacterium parvum (McCune et al., Cancer 1979 43:1619), saponinas en general, endotoxina detoxificada y citoquinas tales como interleukina-2, interleukina-4, interferón gamma (IFN\gamma), interleukina-12, interleukina-15, GM-CSF y combinaciones de las mismas.

Las células pueden conjugarse con un hapteno y a continuación irradiarse. De manera alternativa, las células pueden irradiarse y a continuación conjugarse con un hapteno. En cualquiera de los casos, los extractos posteriormente se purifican y a continuación también pueden irradiarse y/o someterse a hapteno. Para irradiar o someter a hapteno los extractos, cualquier método puede ejecutarse en primer lugar seguido del otro método.

Las células tumorales o los extractos de células tumorales pueden añadirse a la célula que presenta antígeno. El extracto de célula cancerígena puede emplearse para tratar cáncer junto con otro tipo de célula, una célula que presente antígeno, seleccionada de un grupo consistente en macrófagos cultivados autólogos y células dendríticas cultivadas autólogas. Los macrófagos son cualquier célula grande mononuclear ameboide, sin tener en cuenta el origen, y sin limitarse a los histiocitos y monocitos, que realizan fagocitosis, es decir, atacan y destruyen otras células, tejido muerto, células degeneradas y similares. Los macrófagos son células que presentan antígenos incluyendo antígenos tumorales, a células incluyendo células T. Las células dendríticas son también células que presentan antígenos y parecen estar muy relacionadas con los macrófagos a pesar de que las células dendríticas son antígenos más eficientes presentando células que los macrófagos. Son estimuladores potentes de células T y pueden aislarse de una variedad de órganos y tejidos corporales que incluyen sin limitación la sangre, piel (donde las células dendríticas se refieren a las células de Langerhans), tejidos linfoides.

Las células que presentan antígeno con péptido o membrana unidos a las mismas, por ejemplo, pueden emplearse para inmunizar al paciente. Se obtiene sangre del paciente y los macrófagos y células dendríticas se extraen de la misma. Se incuban elevadas concentraciones del péptido (aproximadamente de 1 ng/ml a aproximadamente 1 \mug/ml, preferiblemente entre aproximadamente 10 ng/ml y 100 ng/ml), o membrana (aproximadamente de 10^{5} a aproximadamente 10^{7} equivalentes celulares (c.e.), estando los equivalentes celulares en relación con el número de células iniciales, es decir, la cantidad de extracto celular obtenido del numero indicado de células) con las células durante la noche o durante aproximadamente 8 hora. En el caso de incubarse con membranas, las membranas se someten a fagocitosis por parte de los macrófagos o células dendríticas. Los macrófagos o células dendríticas que han sometido a fagocitosis a las membranas se emplean para inmunizar al paciente, Grabbe, S., et al., Immunology Today 1995 16:117-121.

La composición de la vacuna puede contener, por ejemplo, al menos 10^{4} de células tumorales o c.e de extracto de célula tumoral (es decir, membrana aislada o péptido) por dosis, preferiblemente al menos 10^{5} células/extracto c.e, y más preferiblemente al menos 10^{6} células/extracto c.e. Una dosis es la cantidad de la composición de vacuna que se administra en una única administración. En una realización, la composición de la vacuna contiene desde aproximadamente 10^{5} a aproximadamente 2.5 x 10^{7} células/extracto c.e. por dosis, más preferiblemente aproximadamente 5 x 10^{6} células/extracto c.e. En una realización preferente, la composición de la vacuna contiene un máximo de 7.5 x 10^{6} células/extracto c.e. La cantidad de las células tumorales y las membranas de las células tumorales de la invención para uso depende generalmente de factores tales como la afinidad del compuesto con células cancerígenas, la cantidad de células cancerígenas presentes y la solubilidad de la composición. Las dosis se establecen en base al peso y a la condición clínica del paciente.

La composición de la vacuna puede estar envasada en una forma de dosis adecuada para administración intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, y subcutánea. De manera alternativa, las forma de dosis puede contener la preparación (por ejemplo, células tumorales, membranas, péptidos) para ser reconstituida en el momento de la administración, por ejemplo, un diluyente adecuado.

Las células tumorales, extractos de células tumorales y composiciones de las mismas pueden administrarse por cualquier ruta adecuada, incluyendo inoculación e inyección, por ejemplo, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, y subcutánea. Existen múltiples puntos de administración para cada tratamiento con vacuna. Por ejemplo, la composición de la vacuna puede administrarse mediante inyección intradérmica en al menos dos, y preferiblemente tres, puntos contiguos por administración. En una realización de la invención, la composición de la vacuna se administra en la parte superior de los brazos o en las piernas.

El paciente no está inmunizado para un hapteno antes de la administración de la vacuna. La composición para el tumor puede administrarse (como por ejemplo por inyección) durante un total de al menos tres y preferiblemente al menos seis tratamientos. En una realización, el número total de administraciones (incluyendo la administración inicial) puede ser ocho, y en otra realización puede ser diez. El programa de vacunación puede diseñarse con la ayuda del doctor para ajustarse a las condiciones del sujeto en particular. Las inyecciones de la vacuna se administran cada semana. En una realización preferente, la vacuna se inyecta cada semana durante un total de seis tratamientos. Todas las vacunas contienen células modificadas con hapteno o extractos de las mismas. Puede administrarse una vacuna de recuerdo. Preferentemente, se administran una o dos vacunas de recuerdo. La vacuna de recuerdo puede administrarse, por ejemplo, aproximadamente después de seis meses o después de un año de la administración inicial.

La ciclofosfamida (CY) se administra varios días (por ejemplo, 3 días) solamente antes de la inyección de la primera vacuna.

La vacuna se somete a hapteno o se enlaza químicamente y la forma de la vacuna puede incluir una célula tumoral sometida a hapteno con dinitrofenil (DNP) por ejemplo. Otros haptenos incluyen pero no se limitan a trinitrofenil, N-iodoacetil-N'-(5-sulfónico 1-naftil)etileno diamina, ácido trinirobencenosulfónico, isotiocianato fluoresceína, ácido arsénico benceno isotiocianato, ácido trinirobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceno-S-mostaza. Las combinaciones de hapteno también pueden emplearse. Una vacuna de extractos de células tumorales puede someterse a hapteno de manera similar. En el caso de extractos de célula cancerígena sometidos a hapteno, los extractos, un péptido y una membrana de célula cancerígena, se aíslan de las células cancerígenas sometidas a
hapteno.

En otra realización de la invención, la composición se administra cada semana durante un periodo de al menos seis semanas, y la primera administración está precedida por una cantidad farmacéuticamente aceptable de ciclofosfamida. Preferentemente, la composición puede contener un máximo de aproximadamente 7.5 x 10^{6} células o extracto c.e. El paciente no está inmunizado con hapteno antes de la administración de la vacuna.

La composición de la vacuna puede contener células tumorales y/o extractos de células tumorales. Las células tumorales pueden prepararse del siguiente modo. Las masas tumorales se procesan tal y como lo describió Berd et al. (1986), supra, incorporado aquí como referencia en su integridad. Las células se extraen mediante disociación con colagenasa y ADNasa mediante disociación mecánica, se congelan en un congelador con temperatura controlada, y se almacenan en nitrógeno líquido hasta que sean necesarias. El día en el que el paciente va a ser sometido a un examen de piel o a tratarse, las células se deshielan, se lavan y se irradian a aproximadamente 2500 R. Se lavan de nuevo y se suspenden en solución salina balanceada de Hank sin fenol rojo. La conjugación de las células preparadas con DNP se lleva a cabo con el método de Millar y Claman, J. Immunol., 1976, 117, 1519, lo que implica una incubación de 30 minutos de células tumorales con DNFB bajo condiciones estériles, seguido de un lavado con salina estéril.

Las células cancerígenas de un paciente pueden conjugarse con un hapteno aislando las membranas y modificando las membranas o conjugando las células con un hapteno sin aislar en primer lugar las membranas.

Una membrana de célula cancerígena puede prepararse aislando membranas de una preparación no modificada de células cancerígenas de un paciente. Las células se suspenden en aproximadamente cinco volúmenes de aproximadamente 30 mM búfer de bicarbonato de sodio con aproximadamente 1 mM fluoruro de fenil metil sulfonil y se interrumpe con un homogenizador de cristal. Las células intactas residuales y los núcleos se retiran por centrifugación a aproximadamente 1000 g. Las membranas se transforman en bolas mediante centrifugación a 100,000 g durante 90 minutos. Las membranas se vuelven a suspender en aproximadamente 8% sacarosas y se congelan a aproximadamente -80ºC hasta que sea necesario. A la suspensión de membranas (aproximadamente 5, 000,000 equivalentes celulares/ml) se añaden aproximadamente 0.5 ml de 1 mg/ml dinitrofluorobenceno (DNFB) durante aproximadamente 30 minutos. De manera similar, se pueden emplear otros haptenos como, aunque sin limitarse a, trinitrofenil y N-yodoacetil-N, (S sulfónico 1-naftil)etileno diamina. El exceso de DNFB se retira dializando las membranas contra aproximadamente 0.15 M PBS durante aproximadamente tres días. Las membranas se transforman en bolas.

De modo alternativo, el extracto de célula cancerígena, el péptido o membrana, puede prepararse modificando las células cancerígenas de un paciente con un hapteno como dinitrofenil y a continuación preparando las membranas del mismo. Las células cancerígenas de un paciente se obtienen durante la biopsia y se congelan hasta que sean necesarias. Se disuelven aproximadamente 100 mg de DNFB (Sigma Chemical Col, St. Louis, MO) en aproximadamente 0.5 ml de 70% etanol. Se añade aproximadamente 99.5 ml de PBS. La concentración de PBS debería ser aproximadamente 152 mg/0.1 ml. La solución se agita durante la noche en un baño de agua a 37ºC. La vida útil de la solución es de aproximadamente 4 semanas. Las células se deshielan y la bola se vuelve a suspender en 5X células/ml en solución salina balanceada de Hank. Se añadió aproximadamente 0.1 ml de solución DNFB a cada ml de células y se incubaron durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. De manera similar, pueden emplearse otros haptenos como, aunque sin limitarse a, trinitrofenil, N-iodoacetil-N'-(5-sulfónico 1-naftil)etileno diamina, ácido trinirobencenosulfónico, isotiocianato fluoresceína, ácido arsénico benceno isotiocianato, ácido trinirobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceno-S-mostaza y combinaciones de los mismos. A continuación, las células se lavaron dos veces con solución salina balanceada de Hank. Las células se suspendieron en aproximadamente cinco volúmenes de aproximadamente 30 mM de búfer de bicarbonato de sodio con aproximadamente 1 mM fluoruro de fenil metil sulfonil y se interrumpe con un homogenizador de cristal. Las células intactas residuales y los núcleos se retiran por centrifugación a aproximadamente 1000 g. Las membranas se transforman en bolas mediante centrifugación a 100,000 g durante 90 minutos. Las membranas se vuelven a suspender en aproximadamente 8% sacarosas y se congelan a aproximadamente -80ºC hasta que sea necesario.

A partir de las células modificadas con DNP, se puede extraer el péptido, algunos de los cuales son DNP modificados como resultado de modificar las células. Las técnicas de extracción de proteínas, conocidas por aquellos expertos en la técnica, pueden estar seguidas de ensayos con antígeno para aislar antígenos efectivos en el tratamiento del paciente. Los métodos para aislar extractos celulares son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En resumen, las células cancerígenas se aíslan de un tumor y se cultivan in vitro. Se añade dinitrofenil a las células cultivadas de acuerdo con el método establecido anteriormente. Los péptidos se aíslan de las células de acuerdo con una técnica establecida por Rotzschke et al., Nature, 1990, 348, 252. Las células se tratan con un ácido débil. A continuación, se centrifugan y se salvan los sobrenadantes. Las fracciones que contienen pequeños obtenidos se obtienen mediante HPLC, se concentran y se congelan. Las fracciones se analizan para actividad inmunológica permitiendo que se enlacen con células linfoblastoides B autólogas que a continuación se analizan para comprobar su habilidad para estimular linfocitos T específicos de melanoma.

Las células se tratan con un ácido débil, como, aunque sin limitación, ácido trifluoroacético (MA). A continuación las células se centrifugan y el sobrenadante se salva. Los compuestos que tienen un peso molecular superior a 5,000 se retiraron del sobrenadante mediante filtración con gel (G25 Sepharose, Pharmacia). El resto del sobrenadante se separa en una columna para HPLC en fase inversa (Superpac Pep S, Pharmacia LKB) en 0.1% ácido trifluoroacético (TFA) empleando un gradiente de incrementación para concentración de acetonitrilo; velocidad de flujo = 1 ml/min, tamaño de fracción = 1 ml. Las fracciones que contienen pequeños péptidos se obtienen mediante HPLC de acuerdo con el método de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), se concentran y se congelan. Las fracciones se analizan para actividad inmunológica permitiendo que se enlacen con células linfoblastoides B autólogas que a continuación se analizan para comprobar su habilidad para estimular linfocitos T específicos (por ejemplo, para melanoma).

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Se añade virus de Epstein-Barr (EBV, ATCC CRL-1612, B95-8 EBV leucocitos transformados, tamarino cabeza de algodón, Sanguinus oedipus) a las células linfoblastoides B en el cultivo. Las células linfoblastoides B se transforman en un tumor celular B a partir de los propios linfocitos del paciente. El melanoma de una metástasis se cultiva en RPMI 1640 + 10% de suero de ternero fetal o 10% de suero humano en un pozo. Las células no adheridas se lavan con medio RPMI. Cuando las células son confluentes, se separan con 0.1% EDTA y se separan en dos frascos. Este proceso continua cuando las células confluentes se separan continuamente. Se obtienen linfocitos de las sangre del paciente para comprobar la producción de interferón gamma por parte de células T. Las propias células tumorales del paciente, que han sido modificadas con hapteno, como DNP, se mezclan con los linfocitos para estimular a las células T. Cada siete días se añade interleukina-2. Las células T se expanden dividiéndose tal y como se ha establecido anteriormente. Las células T se vuelven a estimular a continuación por parte de las células modificadas con hapteno. Como resultado se obtiene una población enriquecida de células T que son las responsables de las células modificadas con hapteno.

Las vacunas para cánceres humanos han sido desarrolladas y testadas por un número de trabajadores. A pesar de que en ocasiones pueden provocar inmunidad débil al cáncer del paciente, rara vez provocan regresión del cáncer. El descubrimiento de desarrollo de respuestas antiinflamatorias en tumores metastáticos supuso una sorpresa con la vacuna DNP. El tumor se enrojece, se calienta y se ablanda. En última instancia, en algunos casos, el tumor retrocede hasta tal extremo que desaparece tanto para el ojo humano como para el microscopio. Microscópicamente, se observa la infiltración de linfocitos T en la masa tumoral. Por lo tanto, esta técnica, que aumenta la respuesta antiinflamatoria y el número y capacidad de linfocitos que penetran en el tumor, es un avance significante en el campo.

La eficacia de la vacuna puede mejorarse añadiendo varios modificadores a la respuesta biológica. Estos agentes trabajan estimulando directamente o indirectamente la respuesta inmune. Los modificadores de respuesta biológica incluyen, aunque no se limitan a, interleukina-12 e interferón gamma. En esta realización, se administrará IL12 tras cada inyección de vacuna. Se piensa que la administración de IL12 a pacientes con respuestas antiinflamatorias provocará que los linfocitos T en el interior de la masa tumoral se proliferen y se transformen en más activos. El incremento del número de células T y la capacidad funcional da lugar a la destrucción inmunológica de los tumores. Las dosis de IL12 se prepararán de acuerdo con las indicaciones de dosis establecidas anteriormente.

Los pacientes con melanoma metastático fueron tratados usando un régimen de inmunoterapia con los siguientes componentes: 1) vacuna consistente en células tumorales autólogas conjugadas con DNP; y 2) pretratamiento con dosis baja de ciclofosfamida. Los pacientes fueron evaluados para determinar si se había dado un retroceso del tumor, para controlar las respuestas antiinflamatorias al tumor, y para medir la hipersensibilidad de tipo tardío para células autólogas de melanoma, DNFB (la forma de DNP empleada para sensibilización de piel), linfocitos autólogos conjugados con DNP, diluyente (solución de Hank), derivado de proteína purificada (PPD), y retirar antígenos (cándida, tricofitón y paperas). Los pacientes a los que son considera que derivan beneficios (clínicos o inmunológicos) de la terapia continúan en el régimen de la inmunoterapia. Se administran posteriores vacunas sin ciclofosfamida. En un experimento similar, se descubrió que interleukina 2 unida con glicol de polietileno no resultó efectivo.

La vacuna se mezcla con un adyuvante inmunológico, como Bacillus Calmette-Guerin, BCG.

Las biopsias de metástasis de melanoma humano se examinaron en busca de expresión de citoquina mARN usando RT-PCR. MARN para IFN\gamma se encuentra en vacuna post-DNP, metástasis inflamadas, pero sólo rara vez en metástasis en pre-tratamiento, incluso aquellas que contienen grandes números de linfocitos de nudos linfáticos residuales. Además, la citoquina Tipo II, IL10, se encuentra en casi todas las metástasis de melanoma y parece producirse por las propias células de melanoma.

Los pacientes con melanoma metastático tratados con una vacuna antóloga modificada con DNP desarrollan respuestas antiinflamatorias en los puntos del tumor. Histológicamente, estas lesiones inflamadas se caracterizan por la filtración de célula T que en ocasiones se asocia con la destrucción de células tumorales. Se testaron especímenes de biopsia de 8 metástasis subcutáneas que habían desarrollado inflamación tras el tratamiento con vacuna para la expresión de mARN, IFN\gamma, IL4, TNF, e IL10. Tras la vacuna, las biopsias inflamadas contenían mARN para IFN\gamma (5/8), IL4 (3/8), y para TNF (4/7). Sin embargo, IFN\gamma mARN sólo fue detectado en 1/17 y TNF mARN en 2/16 de los especímenes de control (pre-tratamiento de metástasis de nódulo linfático o metástasis subcutánea no inflamada). MARN para IL10, una citoquina con propiedades antiinflamatorias, fue detectada en 24/25 metástasis de melanoma y fue independiente del contenido linfoide; PCR in situ confirmó que las células de melanoma eran la principal fuente. Estos descubrimientos proporcionan un nuevo parámetro con el cual medir los efectos de la inmunoterapia de cáncer.

Las biopsias de melanoma metastático recién obtenidas para la presencia de citoquina mARN que corresponde con una respuesta inmune productiva en el punto del tumor son analizadas. La expresión de IFN\gamma o IL4 mARN es característica de metástasis de melanoma que han desarrollado una respuesta antiinflamatoria tras la administración de vacuna antóloga modificada con DNP. Por otro lado, la expresión de IL10 mARN es independiente de una respuesta antiinflamatoria y se observa en casi todos los especímenes de biopsias de melanoma. El examen de líneas celulares derivadas de biopsias de melanoma así como el análisis PCR in situ demostraron que la fuente de IL10 es el conjunto de las propias células de melanoma más que los linfocitos asociados.

Quizás el descubrimiento más importante de este trabajo es el negativo: generalmente no se encuentra mARN para IFN\gamma e IL4 en metástasis de melanoma de pacientes no tratados, ni en masas metastáticos que contienen un elevado número de linfocitos correspondientes al nódulo linfático. Esto da lugar a una baja actividad de fondo de la producción de citoquina in situ contra la cual compiten los tejidos de melanoma cuya población de células T ha sido alterada mediante inmunoterapia. Además, pone de relieve un importante factor biológico: las células T extraídas de metástasis de nódulo de melanoma probablemente representan los residuos de la población original de nódulo linfático más que los linfocitos que han sido realmente infiltrados el tumor como resultado de su reconocimiento de antígenos de melanoma. Debido a que no se han activado por antígenos, no han recibido ningún estímulo para producir IFN\gamma o IL4.

Sin embargo, los especímenes de biopsia obtenidos tras la administración de vacuna DNP normalmente expresaron mARN o IFN\gamma. En cambio, las respuestas inflamatorias provocadas por la vacuna DNP no pueden caracterizarse como Tipo I ya que algunas de estas muestras también contenían IL4. Dada la sensibilidad del análisis de mARN basado en PCR, dicho patrón podía producirse por un pequeño foco de células T productoras de IL4 en medio de una célula T infiltrada que predominantemente produce IFN\gamma. Por otro lado, la presencia de mARN para IFN\gamma e IL4 podía significar la presencia de células T que producen ambas citoquinas, llamadas células TH_{o} (Lee et al., Eur. J. Immunol. 1992 22:1455-1459). La resolución de este asunto requerirá análisis que permitan la correlación de expresión mARN con morfología, como PCR in situ. Sean cuales sean los resultados, estos descubrimientos sugieren que la producción de citoquina intra-tumor podría ser un parámetro importante para medir en los pacientes que están realizando inmunoterapia.

Los resultados sugieren con firmeza que la fuente de IL10 mARN es el conjunto de las propias células de melanoma, más que los linfocitos asociados. Se detectaron fuertes bandas de IL10 mARN en 24/25 biopsias, y su expresión fue independiente del número de linfocitos asociados o la presencia de inflamación inducida por la vacuna DNP. Además, PCR in situ claramente mostró IL10 mARN en el interior de las células de melanoma. Las líneas celulares derivadas del material de biopsia expresaron IL10 mARN y produjeron IL10 tal y como ELISA midió.

La relevancia fisiológica de producción de IL10 en tejidos de melanoma no está clara. IL10 es conocido por ser una citoquina antiinflamatoria con la habilidad de inhibir la proliferación de células T y la producción de IL2 (Jinquan, T., et al., J. Immunol. 1993 151:4545-4551) y la hipersensibilidad de tipo tardío (Lee, supra), probablemente reduciendo la función coestimuladora del macrófago. Por lo tanto, IL10 podía suprimir la activación y proliferación de células T reactivas con melanoma que ha infiltrado el punto del tumor. Sin embargo, recientemente IL10 ha demostrado ser quimioatrayente para células CD8 + T (Jinquan, supra); esta propiedad podría representar el predominio de células CD8 + en infiltrados de linfoide provocados por vacuna DNP. En cualquier caso, la modulación de producción IL10 en el punto del tumor puede tener consecuencias importantes para la relación tumor- huésped.

Se describe un método para analizar la producción de citoquina por parte de un tumor para determinar la eficacia de una composición celular conjugada con un hapteno irradiado y autólogo en un paciente sospechoso de tener cáncer, consistiendo dicho método en la administración de dicha composición conjugada con hapteno a dicho paciente; obtención de una muestra que consiste en ácidos nucleicos de una muestra de tejido del paciente; amplificación de los ácidos nucleicos específicos para una citoquina o amplificación de una señal generada mediante hibridización de una sonda específica para un ácido nucleico específico de la citoquina en dicha muestra de tejido; y la detección de presencia de los ácidos nucleicos amplificados o señal amplificada en los que la presencia de ácidos nucleicos amplificados o señal amplificada indica cáncer, en los que la presencia de ácidos nucleicos amplificados o señal amplificada de dicha muestra de tejido del paciente indica eficacia de dicha composición conjugada con hapteno.

La muestra de tejido puede ser un tumor maligno o pre-maligno, por ejemplo un tumor de melanoma, o por ejemplo un melanoma metastático inflamatorio subcutáneo. Además, una muestra de tejido puede ser una muestra de tejido sólido o líquido como, aunque sin limitación a todo o parte de un tumor, saliva, esputo, mocos, médula ósea, suero, sangre, orina, linfa o una lágrima de un paciente sospechoso de tener cáncer.

Los ácidos nucleicos, como ADN (incluyendo cADN) y ARN (incluyendo mARN) se obtienen a partir de muestra de tejidos del paciente. Preferentemente ARN se obtiene a partir de una muestra de un tejido. El ARN total se extrae mediante cualquier método conocido en la técnica como el descrito en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989), aquí incluido como referencia en su totalidad.

La extracción de ácido nucleico es seguida de la amplificación del mismo mediante cualquier técnica conocida en la técnica. El paso de amplificación incluye el uso de al menos una secuencia iniciadora que es complementaria con una parte de una secuencia específica para la citoquina. Las secuencias específicas para citoquina se definen para incluir (y no están limitadas a) todas o parte de las secuencias que codifican IFN\gamma, TNF, IL-2, IL-12, e IL-13. Generalmente, la secuencia iniciadora tiene aproximadamente entre 21 y 33 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 21 nucleótidos, aproximadamente 31 nucleótidos, 32 nucleótidos, y aproximadamente 33 nucleótidos de longitud.

Las secuencias iniciadoras útiles en los métodos de amplificación incluyen y no se limitan a actina \beta, SEQ ID NOS: 1 y 2; IFN\gamma, SEQ ID NOS: 3 y 4; IL4, SEQ ID NOS: 5 y 6; IL10, SEQ ID NOS: 7 y 8; y TNF, SEQ ID NOS: 9 y 10.

Mientras un proceso dependiente de muestra emplea un par de iniciadores, un iniciador del par puede consistir en oligonucleótidos que son complementarios con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas específicas de citoquina. Un iniciador del par puede seleccionarse del grupo consistente en SEQ ID NOS: 1 a 10.

De manera alternativa, cada uno de los dos oligonucleótidos en la pareja iniciadora puede ser específico a una secuencia de ácido nucleico codificadora de una citoquina. Los iniciadores pueden diseñarse para ser complementarios con regiones separadas de una secuencia de citoquina, por ejemplo. Por regiones separadas se entiende que un primer iniciador es complementario con una región 31 de una secuencia de citoquina y un segundo iniciador es complementario con una región 5' de una secuencia de citoquina. Preferiblemente, los iniciadores son complementarios para distinguir, separar regiones y no son complementarios entre sí. Los iniciadores de SEQ ID NOS: 1-10 son meramente ejemplares de los iniciadores que son útiles en la presente invención.

Cuando un método de amplificación incluye el uso de dos iniciadores, como la reacción en cadena de la polimerasa, el primer iniciador puede seleccionarse del grupo consistente en SECUENCIA ID NOS: 1, 3, 5, 7 y 9, y el segundo iniciador puede seleccionarse del grupo consistente en SECUENCIAS ID NOS: 2, 4, 6, 8 y 10. Cualquier pareja de iniciadores que transcribe ácidos nucleicos entre sí y que son específicos para citoquinas pueden emplearse de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Preferentemente se lleva a cabo la extracción total de ARN. Como aquí se emplea, el término "amplificación" se refiere a procesos dependientes de una plantilla y a propagación mediada por un vector que da como resultado un aumento en la concentración de una molécula de ácido nucleico en relación con su concentración inicial, o un aumento en la concentración de señal detectable. Como aquí se emplea, el término proceso dependiente de una plantilla pretende referirse a un proceso que incluye la extensión dependiente de una plantilla de una molécula de iniciador. El término proceso dependiente de una plantilla hace referencia a la síntesis de ácido nucleico de una molécula de ARN o ADN donde la secuencia de la cadena recién sintetizada de ácido nucleico se dicta por las normas bien conocidas de emparejamiento de base complementario (ver, por ejemplo, Watson, J. D., et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4ª Ed., W. A. Benjamín, Incl, Menlo Park, Calif. (1987). Normalmente, las metodologías mediadas por vector incluyen la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clonal del vector, y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. Ejemplos de tales metodologías se encuentran en Cohen et al. (U.S. Pat. No. 4,237,224), Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Se dispone de un número de procesos dependientes de plantilla para amplificar las secuencias objetivo de interés presentes en una muestra. Uno de los mejores métodos conocidos de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se describe con detalle en las Patentes U. S 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159, y en Innis et al., PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego CA, 1990. En resumen, en PCR, se preparan dos secuencias de iniciadores que son complementarias con regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia objetivo. Se añade un exceso de deoxinucleósido a una mezcla de reacción unto con polimerasa de ADN (por ejemplo, polimerasa Taq). Si la secuencia objetivo está presente en la muestra, los iniciadores se enlazarán con el objetivo y la polimerasa provocará que los iniciadores se extiendan a lo largo de la secuencia objetivo añadiendo nucleótidos. Aumentando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de la reacción, los iniciadores extendidos se disociarán del objetivo para formar productos de reacción, los iniciadores en exceso se enlazarán con el objetivo y con los productos de reacción y el proceso se repite. Preferiblemente, se puede llevar a cabo un procedimiento de amplificación PCR de transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de mARN amplificado. Las metodologías de reacción en cadena de la polimerasa son bien conocidas en la técnica.

Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa (referida como LCR), descrita en EPA No. 320,308. En LCR, se preparan dos parejas de sondas complementarias, y en la presencia de la secuencia objetivo, cada pareja se enlazará con las cadenas complementarias opuestas del objetivo con las que lindan. En la presencia de una ligasa, dos parejas de sonda se unirán para formar el objetivo y servir a continuación como "secuencias objetivo" para el ligamiento de exceso de parejas de sonda. La Patente U.S 4,883,750 describe un método alternativo de amplificación similar a LCR para enlazar parejas de sonda con una secuencia objetivo.

Replicasa Q-beta, descrito en la Solicitud PCT No. WO 87/06270 puede también emplearse como otro método de amplificación en la presente invención. En este método, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria con la de un objetivo se añade a una muestra en la presencia de una polimerasa de ARN. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede a continuación detectarse.

Un método de amplificación isotérmico, en el que las endonucleasas y ligasas de restricción se emplean para conseguir la amplificación de moléculas objetivo que contienen nucleótido 5'-[alfa-tio]trifosfatos en una cadena de un punto de restricción (Walker, G. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 1992, 89:392-396, también puede ser útil en la amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención.

La Amplificación por Desplazamiento de Cadena (SDA) es otro método para llevar a cabo amplificación isotérmica de ácidos nucleicos que implica múltiples vueltas de desplazamiento y síntesis de cadena, es decir, translación nick. Un método similar, denominado Reacción en Cadena de Reparación (RCR) es otro método de amplificación que puede ser útil en la presente invención y que consiste en templar varias sondas a través de una región dirigida a la amplificación, seguida de una reacción de reparación en la que solamente dos de las cuatro bases están presentes. Las otras dos bases pueden añadirse como derivados biotinilados para una sencilla detección. En SDA se emplea una técnica similar.

Las secuencias específicas de citoquina pueden también detectarse empleando reacción de sonda cíclica (CPR). En CPR, una sonda que tiene 31 y 51 secuencias de ADN específico para no-citoquina y la secuencia media de ARN específico de citoquina se hibridiza para ADN que está presente en una muestra. Tras la hibridización, la reacción se trata con ARNsaH, y los productos de la sonda identificados como productos distintivos que generan una señal son liberados tras la digestión. La plantilla original se templa en otra sonda cíclica y la reacción se repite. Por lo tanto, CPr implica la amplificación de una señal generada por hibridización de una sonda con un ácido nucleico específico de citoquina.

Incluso pueden emplearse otros métodos de amplificación descritos en la Solicitud GB No. 2 202 328, y en la Solicitud PCT No. WO 89/09284. En la primera solicitud, los iniciadores "modificados" se emplean una síntesis similar a PCR dependiente de enzima y de la plantilla. Los iniciadores pueden modificarse mediante etiquetas con una molécula de captura (por ejemplo, biotina) y/o molécula detectora (por ejemplo, enzima). En la segunda solicitud, se añade un exceso de sondas etiquetadas a una muestra. En la presencia de la secuencia objetivo, la sonda se enlaza y se parte catalíticamente. Tas la partición, la secuencia objetivo se libera intacta para enlazarse con la sonda de exceso. La partición de la sonda etiquetada señaliza la presencia de la secuencia objetivo.

Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico incluyen sistemas de amplificación basados en la trascripción (TAS) (Kwoh D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci (U.S.A) 1989, 86:1173, Gingeras T. R., et al., Solicitud PCT WO 88/10315, que incluye la amplificación en base a la secuencia de ácido nucleico (NASBA) Y 3SR. En NASBA, los ácidos nucleicos pueden prepararse para amplificación mediante extracción estándar fenol/cloroformo, desnaturalización con calor de una muestra clínica, tratamiento con búfer tisis y columnas minispin para aislamiento de ADN o ARN o extracción con cloruro de guanidina de ARN. Estas técnicas de amplificación incluyen el proceso de templar un iniciador o cebador que tiene secuencias específicas de próstata. Tras la polimerización, los híbridos ADN/ADN se digieren con Rnasa H mientras las moléculas ADN de doble trenzado se vuelven a desnaturalizar con calor. En cualquier caso, El ADN de trenzado sencillo se convierte completamente en doble trenzado mediante la adición de un segundo iniciador específico de próstata, y a continuación se realiza la polimerización. Las moléculas de ADN de doble trenzado a continuación se trascriben de manera multiplicativa por medio de una polimerasa como T7 o SP6. En una reacción cíclica isotérmica, las ARNs se trascriben de manera inversa a ADN de doble trenzado, y se vuelven a transcribir con una polimerasa como T7 o SP6. Los productos resultantes, ya sean truncados o completos, indican las secuencias específicas para el cáncer de próstata.

Davey, C., et al., Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 329,822, describe un proceso para amplificación de ácido nucleico que incluye sintetizar cíclicamente ARN de trenzado sencillo ("ssARN"), ssADN, y ADN de doble trenzado (dsADN), que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. El ssARN es una primera plantilla para un primer oligonucleótido de iniciador, que se alarga mediante transcriptasa inversa (polimerasa ADN dependiente de ARN). A continuación, se retira el ARN del dúplex resultante ADN:ARN mediante la acción de ribonucleasa H (Rnasa H, una Rnasa específica para ARN en un dúplex bien con ADN o con ADN). El ssADN resultante es una segunda plantilla para un segundo iniciador, que también incluye las secuencias de un promotor de polimerasa ARN (ejemplificado por la polimerasa T7 ARN) 5' con su homología y con su plantilla. A continuación, este iniciador se extiende mediante polimerasa ADN (ejemplificado por el fragmento grande "Klenow" de E. Coli polimerasa ADN I), que da como resultado una molécula ADN de doble trenzado ("dsADN"), que posee una secuencia idéntica a la del ARN original entre los iniciadores y que posee de manera adicional, en un extremo, una secuencia promotora. Esta secuencia promotora puede emplearse por parte de la polimerasa apropiada de ARN para hacer muchas copias ARN del ADN. Estas copias pueden volver a entrar en el ciclo que da lugar a una amplificación muy rápida. Sin la elección apropiada de enzimas, esta amplificación puede realizarse de manera isotérmica sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia inicial puede elegirse para que tenga la forma de bien ADN o ARN.

Millar H. I., et al., Solicitud PCT WO 89/06700 describe un programa de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridización de una secuencia promotora/iniciadora para un ADN objetivo de trenzado sencillo ("ssADN") seguido de la trascripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este programa no es cíclico; es decir, no se reproducen nuevas platillas de las trascripciones de ARN resultantes. Otros métodos de amplificación incluyen la "carrera" descrita por Frohman, M. A., en: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications 1990, Academia Press, N. Y.) y PCR11 de "un lado" (Ohara, O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 1989, 86:5673-5677).

Los métodos basados en el ligamento de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del resultante "di-oligonucleótido", amplificando de este modo el di-oligonucleótido (Wu, D., Y., et al., Genomics 1989, 4:560, también pueden emplearse en el paso de amplificación.

Tras la amplificación, puede detectarse la presencia o ausencia del producto de amplificación. El producto amplificado puede secuenciarse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero no limitando, el método de Maxam y Gilbert, ver Sambrook, supra. El producto amplificado secuenciado puede a continuación compararse con los resultados obtenidos con el tejido extirpado antes del tratamiento con vacuna. Las muestras de tejido obtenidas antes del tratamiento con vacuna deberían estar libres de secuencias de citoquina, en particular IFN\gamma, TFN, IL2, IL12 e IL13. Los ácidos nucleicos pueden fragmentarse en varios tamaños de fragmentos discretos. Por ejemplo, los fragmentos de ADN pueden separarse de acuerdo con el peso molecular mediante métodos tales como, pero sin limitación, electroforesis a través de matriz de gel de agarosa. Posteriormente, los geles se analizan mediante hibridización Southern. En resumen, el ADN en el gel se transfiere a un sustrato de hibridización o matriz como, aunque sin limitación, una capa de nitrocelulosa y una membrana de nylon. Se aplica una sonda etiquetada a la matriz bajo condiciones seleccionadas de hibridización para hibridizarse con ADN complementario localizado en la matriz. La sonda puede tener una longitud capaz de formar un dúplex estable. La sonda puede tener un rango de tamaño que oscila entre 200 y 10,000 nucleótidos en longitud, preferiblemente aproximadamente 200 nucleótidos en longitud. Los desequilibrios tales como, sin limitación, las secuencias con similar hidrofobicidad e hidrofilicidad, serán conocidas para aquellos expertos en la técnica una vez que tengan la presente descripción. Se conocen varias etiquetas para visualización o detección por parte de aquellos expertos en la técnica, como por ejemplo, pero sin limitación, tinte fluorescente, tinte con bromuro de etidio, por ejemplo, etiquetaje radioactivo avidin/biotina como etiquetaje ^{32}P y similares. Preferentemente, el producto, como el producto PCR, puede extenderse sobre un gel de agarosa y visualizarse usando un tinte como bromuro de etidio. Ver Sambrook et al., supra. A continuación, la matriz puede analizarse mediante autoradiografía para localizar fragmentos particulares que se hibridizan con la sonda.

Un kit de diagnóstico para analizar la eficacia de una composición celular conjugada con hapteno autólogo e irradiado que contiene en uno o más envases un par de iniciadores, donde uno de los iniciadores dentro de dicho par es complementario con una secuencia específico de citoquina, donde dicho primer iniciador se selecciona del grupo consistente en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, y medios para visualizar ADN amplificado; dicho kit es útil para determinar la eficacia de dicha composición.

La invención además se muestra por medio del siguiente ejemplo 15. Los ejemplos 1-8 y 11 y los ejemplos proféticos 9-10 y 12-14 representan ilustraciones del contexto de la presente invención.

Ejemplo 1

Sesenta y cuatro pacientes fueron tratados con melanoma metastático empleando la vacuna de melanoma, preparada de acuerdo con los métodos establecidos anteriormente, precedidos por una baja dosis de ciclofosfamida (CY) y controlada para comprobar efectos inmunológicos y actividad anti-tumor. El día 0, se suministró a los pacientes ciclofosfamida 300 Mg/M^{2} por ruta intravenosa. Tres días más tarde, se les inyectó intradérmicamente la vacuna consistente en 10 X 10^{6} a 25 X 10^{6} células tumorales irradiadas (2500 R) autólogas y criopreservadas mezcladas con BCG; las células tumorales se obtuvieron por disociación de masas enzimáticamente metastáticos (colagenasa y ADNsa). Este tratamiento secuencial se repitió cada 28 días durante 8 tratamientos.

La toxicidad de la terapia se limitó a una respuesta a una respuesta antiinflamatoria local en el punto de la inyección y náuseas y vómitos leves tras la administración de ciclofosfamida. Hubo 40 pacientes evaluables con metástasis mensurable: 5 tuvieron respuesta - 4 completa y 1 parcial. La duración media de la respuesta fue 10 meses (7-84 + meses). Un paciente continúa hasta estar en remisión hasta los 11 años. La regresión se dio no sólo en la piel y en las metástasis nodales, sino también en metástasis del pulmón e hígado. En 6 pacientes adicionales, se observó una respuesta anti-tumor que pareció peculiar con este tipo de vacuna, es decir, comenzó la regresión de lesiones metastáticos que apareció tras la inmunoterapia. En 3 pacientes esta regresión "tardía" se dio en dos o más
tumores.

La hipersensibilidad de tipo tardío (DTH) para células de melanoma autólogas desasociadas mecánicamente se detectó en solamente 16% de pacientes antes del tratamiento, en comparación con el 46%, 56% y 73% de pacientes los días 49, 161 y 217, respectivamente. Los aumentos en hipersensibilidad de tipo tardío tras la inmunoterapia fueron estadísticamente significantes por un t-test no independiente; día 0 vs. Día 49, p < 0.001; día 8 vs. Día 161, p < 0.001; día 0 vs. Día 217, p = 0.021. En total, 26/43 pacientes (61%) mostraron una respuesta de hipersensibilidad de tipo tardío positiva (\leq 5 mm) a células autólogas de melanoma en algún punto en el tiempo. Los pacientes también desarrollaron fuerte hipersensibilidad de tipo tardío a las enzimas empleadas para preparar las suspensiones de célula tumoral: de 24 pacientes testados para hipersensibilidad de tipo tardío con una mezcla de colagenasa y ADNasa (cada uno a 1 Mg/ml) tras dos tratamientos con vacuna, 21 (88%) tuvieron respuestas < 5 mm. Las respuestas anti-tumor a la vacuna estuvieron fuertemente relacionadas con hipersensibilidad de tipo tardío a células autólogas de melanoma mecánicamente desasociadas, tal y como se indica por las tres observaciones: 1) 8/10 pacientes que mostraron regresión al tumor tuvieron hipersensibilidad positiva de tipo tardío; 2) en pacientes adyuvantes post-quirúrgico, existió una correlación muy significativa entre la intensidad de hipersensibilidad de tipo tardío con células autólogas de melanoma y el tiempo de recurrencia del tumor (r=0.680, p < 0.001); 3) nueve pacientes que desarrollaron hipersensibilidad de tipo tardío a células autólogas de melanoma en su vacuna original (tumor "viejo") desarrollaron nuevas metástasis (tumor "nuevo") que no provocó hipersensibilidad de tipo tardío provocó una respuesta mucho menor. Los pacientes fueron comparados con su condición previa al tratamiento con vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio de la vacuna fueron retirados uno o dos meses antes del inicio del estudio de la vacuna. Por consiguiente, los pacientes no fueron tratados al comenzar el estudio de la vacuna.

En tres casos fuimos capaces de extirpar tumores regresivos para examen histológico; dichos tumores se caracterizaron por una intensa infiltración de linfocitos. Sin embargo, los tumores extirpados de estos pacientes antes de la inmunoterapia consistieron en masas homogéneas de células malignas sin infiltración significante de linfocitos.

Este estudio muestra que el uso de ciclofosfamida permite el desarrollo de una respuesta inmune a antígenos asociados con melanoma en pacientes que sufren cáncer.

Ejemplo 2

Pacientes con melanoma metastático fueron sensibilizados con DNP mediante aplicación tópica en la parte superior del brazo con 1% dinitroclorobenceno (DNCB) o dinitrofluorobenceno (DNFB). Dos semanas más tarde se les inyectó una vacuna consistente en 10 x 10^{6} para 25 x 10^{6} células autólogas de melanoma irradiadas conjugadas con DNP y mezcladas con BCG. Se suministró ciclofosfamida 300 mg/M^{2} por vía intravenosa 3 días antes de DNCB (o DNFB) o la vacuna. De 4 pacientes evaluables, 3 han desarrollado una respuesta inflamatoria llamativa en masas tumorales tras 2 tratamientos con vacuna (8 semanas). El Paciente #1 desarrolló eritema e hinchazón en el < 50 metástasis dérmicas grandes (1-3 cm) en su pierna y abdomen inferior, seguido de ulceración y drenaje de material necrótico, y algunos están comenzando a experimentar un retroceso. La biopsia mostró infiltración con CD4+ CD8 + linfocitos T. El Paciente #2 desarrolló eritema e hinchazón en la piel del abdomen inferior y masas nodales grandes (8 cm) en la parte anterior de la ingle. Estas masas aún no han experimentado un retroceso, pero han cambiado en consistencia de duras como rocas a fluctuantes. El Paciente # mostró eritema moderado en la piel que cubre 3 metástasis subcutáneas. Los tres pacientes han desarrollado hipersensibilidad de tipo tardío con linfocitos autólogos conjugados tanto con DNCB como con DNP. Los pacientes fueron comparados con su condición antes del tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio de la vacuna fueron retirados del tratamiento uno o dos meses antes del inicio del estudio de la vacuna. Por consiguiente, los pacientes no fueron tratados al comenzar el estudio de la vacuna.

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Ejemplo 3

Quince pacientes (incluyendo 3 pacientes del Ejemplo 2) fueron tratados con melanoma metastático usando una forma nueva de inmunoterapia, es decir, vacuna de células tumorales conjugada con DNP. Los pacientes fueron sensibilizados con DNP mediante aplicación tópica en la parte superior del brazo con 5-dinitroclorobenceno. A continuación, cada 4 semanas recibieron ciclofosfamida 300 mg/M^{2} tras haber transcurrido 3 días de la inyección de 10 x 10^{6} para 25 x 10^{6} células autólogas de melanoma irradiadas conjugadas con DNP. Los pacientes recibieron 6-8 tratamientos. La mayor parte de los pacientes (92%) mostraron hipersensibilidad de tipo tardío (DTH) para linfocitos autólogos o células tumorales (promedio DHT = 17 mm). La vacuna provocó una sorprendente respuesta inflamatoria en metástasis subcutánea y nodal en 11/15 pacientes, consistente en eritema, hinchazón, calor, y molestia alrededor de las masas tumorales, y, en un caso, drenaje purulento. Las biopsias mostraron infiltración con linfocitos, que, mediante análisis inmunopatológicos y citométricos de flujo, fueron principalmente células CD3+, CD4-, CD8+, HLA-DR+ células T. Las células de melanoma en estos tejidos expresaron de manera clara ICAM-1, que sirve como una molécula de adhesión para células T. Por lo tanto, la vacuna DNP parece provocar un grado de inmunidad anti-melanoma no vista en inmunoterapia previamente testada. Los pacientes fueron comparados con su condición previa al tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio de la vacuna fueron retirados del tratamiento uno o dos meses antes del inicio del estudio de la vacuna. Por consiguiente, los pacientes fueron no tratados al comenzar el estudio de la vacuna.

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Ejemplo 4

Este ejemplo examinó los efectos terapéuticos de la vacuna DNP en pacientes con metástasis retiradas quirúrgicamente y evidencia clínica de enfermedad metastática. Cuarenta y siete pacientes fueron sensibilizados al hapteno, DNFB (dinitrofluorobenceno). A continuación, fueron tratados con inyección intradérmica de células autólogas de melanoma irradiado, conjugadas con DNP. Las inyecciones adicionales de vacuna fueron administradas cada 28 días durante un total de ocho tratamientos. Todos los pacientes fueron periódicamente testados para Hipersensibilidad de Tipo Tardío, DHT, respuestas a células autólogas de melanoma, linfocitos autólogos conjugados con DNP, y antígenos microbiales. Los estudios in vitro se llevaron a cabo con linfocitos criopreservados extraídos de tumores metastáticos y/o separados de sangre periférica.

El gráfico de la figura 12 compara el porcentaje de pacientes sin tumor en los meses posteriores a la cirugía tratada con vacuna DNP y vacuna de control no sometida a hapteno. El estudio examinó los efectos terapéuticos de vacuna DNP en pacientes con metástasis retiradas quirúrgicamente y sin evidencia clínica de enfermedad metastática. Todos los pacientes fueron sensibilizados con hapteno, DNPF (dinitrofluorobenceno). A continuación, fueron tratados con inyección intradérmica de células autólogas de melanoma irradiado, conjugadas con DNP. Las inyecciones adicionales de vacuna fueron administradas cada 28 días durante un total de ocho tratamientos. Todos los pacientes fueron periódicamente testados para Hipersensibilidad de Tipo Tardío, DHT, respuestas a células autólogas de melanoma, linfocitos autólogos conjugados con DNP, y antígenos microbiales. Los estudios in vitro se llevaron a cabo con linfocitos criopreservados extraídos de tumores metastáticos y/o separados de sangre periférica.

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Terapia de vacuna DNP de melanoma

1

Sensibilización a DNP - Los pacientes fueron inicialmente sensibilizados a DNP del siguiente modo: El día -17, se administró ciclosfosfamida, 300 Mg/M^{2} como una rápida infusión intravenosa. Tres días más tarde, los días -14 y -15, los pacientes fueron sensibilizados con DNFB (dinitrofluorobenceno): 1 mg DNFB disuelto en aceite acetona-maíz y tópicamente aplicado en un volumen de 0.1 ml dentro de las limitaciones de un aro de acero de 2 cm de diámetro. Dos semanas más tarde, los pacientes fueron testados para reactividad a DNP mediante aplicación tópica de 200 pg DNFB e inyección intradérmica de PBL autólogo conjugado con DNP. La ciclofosfamida se reconstituyó en agua estéril y se administró la dosis adecuada mediante rápida infusión intravenosa.

Preparación de la Vacuna - Las masas tumorales fueron procesadas. Las células se extrajeron mediante disociación enzimática con colagenasas y ADNasa y mediante disociación mecánica, se congelaron en un congelador de velocidad controlada, y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta ser necesarias. El día en el que el paciente fue tratado, las células se descongelaron, lavaron e irradiaron a 2500 R. A continuación se volvieron a lavar y se suspendieron en solución salina balanceada de Hank sin fenol rojo.

Se llevó a cabo la conjugación de células de melanoma con DNP. Esto implicó una incubación de 30 minutos de células tumorales con dinitrofluorobenceno (DNFB) bajo condiciones estériles, seguido de un lavado con salina estéril.

La vacuna consistió en 5-20 x 10^{6} células tumorales vivas suspendidas en 0.2 ml de solución de Hank. Cuando se añadió BCG, consistió en 0.1 ml de una dilución 1:10 de BCG Tice. Cada tratamiento con vacuna consistió en tres inyecciones en puntos contiguos sobre la parte superior de los brazos y piernas, excluyendo las extremidades ipsilaterales con una disección del nódulo linfático.

Procedimiento de Estudio - El día 0, los pacientes recibieron ciclosfosfamida, 300 Mg/M^{2} como una rápida infusión intravenosa. Tres días más tarde, el día +3, se les inyectó intradérmicamente la vacuna antóloga de melanoma. Las inyecciones adicionales de vacuna fueron administradas cada cuatro semanas durante un total de ocho tratamientos. La ciclofosfamida se administró solamente antes de las primeras dos inyecciones. Todas las vacunas se conjugaron con DNP y se mezclaron con Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BCG es de la variante Tice (subvariante de la variante del Instituto Pasteur) que se obtiene de Organon Teknika Corporation, Dirham, NC. El material secado mediante congelación se reconstituyó con 1 ml de agua estéril y se diluyó 1:10 en salina búfer fosfato, pH 7.2; a continuación se preparó 0.1 ml, se mezcló con la vacuna y se inyectó. Todas las vacunas se inyectaron en el mismo lugar (parte superior del brazo o pierna).

Evaluación inmunológica - La comprobación de la piel se llevó a cabo mediante inyección intradérmica de 0.1 ml de material de test en el antebrazo, y la hipersensibilidad de tipo tardío fue controlada a las 48 horas midiendo el diámetro medio de endurecimiento. Las reacciones positivas fueron fotografiadas. Los siguientes materiales fueron comprobados: 1) 1 x 10^{6} células autólogas irradiadas de melanoma; 2) 3 x 10^{6} linfocitos autólogos de sangre periférica, tanto conjugados como no conjugados con DNP; 3) Solución de Hank; 4) fuerza intermedia PPD; y 5) antígenos microbiales de retirada - Cándida, tricofitón y paperas. También, se comprobó la sensibilidad de contacto con DNFB aplicando 200 pg a la piel del antebrazo y examinando el área en busca de un círculo de endurecimiento a las 48 horas.

A todos los pacientes se les recogió sangre para separación y criopreservación de linfocitos y suero cada vez que se realizaba un test de piel (ver Tabla 1 para programa de dibujo sanguíneo). Periódicamente, se comprobó lo siguiente: 1) respuesta proliferativa y citotóxica para células autólogas de melanoma; y 2) respuesta proliferativa a linfocitos autólogos conjugados con DNP.

Duración del Estudio

1) Los pacientes fueron tratados con ocho cursos de vacuna que requirieron aproximadamente ocho meses. A continuación el tratamiento se paró. Estos pacientes serán controlados hasta al menos cinco años desde su operación quirúrgica inicial.

2) Los pacientes que desarrollaron recurrencia regional o metástasis distante antes de la finalización de los ocho tratamientos fueron sacados del estudio y se trataron clínicamente tal y como se ha establecido (quimioterapia o cirugía).

El grupo de control consistente en 22 pacientes con metastático para nódulos linfáticos regionales. Fueron sometidos a resección quirúrgica de su enfermedad en un momento en el que no tenían evidencia clínica de melanoma metastático. A continuación, recibieron tratamiento con una vacuna no sometida a hapteno de melanoma autólogo. En primer lugar, se les suministró ciclosfosfamida, 300 Mg/M^{2}. Tres días después, se les inyectó la vacuna intradérmicamente, que consistía en 10 x 10^{6} a 25 x 10^{6} células autólogas irradiadas de melanoma mezcladas con BCG. El tratamiento con vacuna de ciclofosfamida se repitió cada 28 días. Se dio un total de ocho tratamientos. Los pacientes fueron clínicamente evaluados cada dos meses.

Solamente el 20% de los pacientes de control fueron liberados del cáncer a los dos años. Sin embargo, los pacientes tratados con vacuna DNP de la invención tuvieron una significante supervivencia al cáncer tal y como se ha establecido anteriormente.

Todos los pacientes que recibieron vacuna con hapteno tenían melanoma metastático para nódulos linfáticos regionales, pero no presentaron ninguna evidencia de metástasis distantes. Los pacientes en estas condiciones son tratados rutinariamente mediante resección quirúrgica de los nódulos dañados. La resección quirúrgica permite que estén clínicamente libres de la enfermedad, pero tienen un 80-85% de posibilidades de desarrollar melanoma metastático al cabo de dos años.

Los pacientes en el grupo de control se encontraban en la misma condición clínica con el fin de ser comparable con el grupo de vacuna sometida a hapteno. Por lo tanto, el grupo de control también consistía en pacientes con melanoma metastático para nódulos linfáticos regionales, pero sin ninguna evidencia de metástasis distantes, que habían sido sometidos a resección quirúrgica de los nódulos dañados. Cuando se inició el tratamiento con la vacuna sin hapteno, los pacientes del control estaban libres de cáncer, pero como previamente se había señalado, el 80% desarrolló metástasis distante.

Los pacientes con melanoma quirúrgicamente incurable no fueron seleccionados como controles porque dichos pacientes tienen una tasa de cura que se acerca al cero, e incluso una supervivencia más corta que pacientes con metástasis extirpable de nódulos linfáticos. Además, en dichos pacientes no es posible medir la supervivencia libre de enfermedad, un parámetro que se prolongó de manera dramática por medio de la vacuna de la presente invención.

Un análisis estadístico de los datos fue presentado de la siguiente manera: se construyeron gráficos de Kaplan-Meier de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia total. La diferencia entre pacientes con vacuna DNP y pacientes control fue analizada por el test log-rank de Mantel. Estas son métodos estadísticos estándar para analizar dichos datos. La diferencia fue elevadamente significativa con p < .01.

Diecisiete pacientes adicionales fueron tratados de acuerdo con el protocolo anteriormente explicado (el tamaño del grupo de control no aumentó por razones expuestas anteriormente). Los resultados mantuvieron diferencias estadísticamente significativas en la supervivencia libre de cáncer y supervivencia total.

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Ejemplo 5

La administración de una vacuna antóloga de melanoma conjugada con DNPL dinitrofenil provoca la infiltración de célula T de tumores metastáticos, y prolonga la supervivencia de paciente que han sufrido linfadenectomía para metástasis regionales voluminosas. Estos efectos parecen ser debido a las células T específicas para melanoma. Su generación es contingente sobre células T con especificidad para células de melanoma modificadas con DNP (DNP-MEL).

Protocolo Clínico

Todos los pacientes tenían melanoma metastático y estaban sometidos a inmunoterapia con vacuna antóloga de tumor conjugada con DNP, como previamente se ha descrito en Berd, D. et al., Cancer Res., 1991, 51, 273 I, aquí incorporado como referencia en su totalidad. Se obtuvieron consentimientos correctos de los pacientes. Los pacientes fueron pre-tratados con ciclosfosfamida, 300 Mg/M^{2}, ver Berd et al. (1986) supra, y tres días más tarde fueron sensibilizados para DNFB mediante aplicación tópica de 0.1 ml de una solución 1 DNFB en aceite acetona-maíz durante dos días consecutivos. Dos semanas más tarde, los pacientes fueron administrados de nuevo ciclofosfamida, y 3 días más tarde se les inyectó la vacuna de melanoma conjugada con DNP. La vacuna DNP se repitió cada 28 días. La ciclofosfamida fue administrada antes de los dos primero ciclos. La vacuna consistió en 10 x 10^{6} - 25 x 10^{6} células autólogas criopreservadas irradiadas (2500 R) de melanoma conjugadas con DNP mezcladas con BCG. Todas las preparaciones de tumor contenían linfocitos que fueron los residuos de tejido de nódulo linfático infiltrado en el tumor. El surero y PBL se recogieron en los siguientes puntos en el tiempo: día 0 (antes de la sensibilización), día 14 (2 semanas después de la sensibilización DNFB), día 63 (tras 2 vacunas), día 119 (tras 4 vacunas), día 175 (tras 6 vacunas), y día 231 (tras 8 vacunas).

Reagentes Celulares

PBL fueron separados mediante centrifugación en gradiente de densidad en metrizoato Ficoll. Fueron suspendidas en medio de congelación (RPMI-1640 (Mediatech, Washington DC) + albúmina de 11 humano + 10 dimetil sulfóxido) congelados en un congelador con velocidad regulada, y almacenados en nitrógeno líquido. Se llevó a cabo el tipaje HLA de PBL por parte del Laboratorio Clínico del Hospital Universitario Thomas Jefferson.

Las células de melanoma se extrajeron enzimáticamente de masas metastáticos de acuerdo con el método de Berd, D., et al., (1986) supra, aquí incorporado como referencia en su totalidad, y se criopreservaron. Las líneas celulares fueron derivadas de estas suspensiones y se mantuvieron en RPMI-1640 con 10% suero de carnero fetal. Las líneas celulares de melanoma de los pacientes usados en este estudio fueron distinguidas por diferencias MHC clase 1 determinadas por análisis citométricos de flujo con un panel de anticuerpos monoclonales obtenido de la Colección de Cultivo de Tipo Americano: (HB82 = HLA-A2, HB122 = HLA-A3, HB164 = HLA-A11,24).

Conjugación con Hapteno

PBL fueron modificados con DNP por medio de una incubación de 30 minutos con DNFB acuoso o DNBS, de acuerdo con los métodos de Miller, S. D. y H. N. Claman, J. Immunol., 1976, 117, 1519 y Geczy, A. F., y A. Baumgarten, Immunology, 1970, 19, 189, (aquí incorporados como referencia en su totalidad) respectivamente; los dos métodos produjeron resultados equivalentes. Para controles de especificidad, las células se modificaron con TNP mediante incubación con TNBS, o con oxazolona, de acuerdo con los métodos de Fujiwara, H., et al., J. Immunol., 1980, 124, 863 y Boerrigter, G. H. y R. J. Scheper, J. Invest. Dermatol., 1987, 88, 3, (aquí incorporados como referencia en su totalidad) respectivamente. La conjugación con hapteno se repitió con células de melanoma.

Hipersensibilidad de Tipo Tardío (DTH)

Los PBL criopreservados fueron descongelados, lavados, y resuspendidos en solución salina balanceada de Hank. Las células se dividieron en tres grupos: no modificadas, conjugadas con DNP, y conjugadas con TNP. Tras el lavado, 1 x 10^{6} células de melanoma o 3 x 10^{6} fueron suspendidas en 0.1 ml solución de Hank y se inyectaron por vía intradérmica en el antebrazo. DHT fue determinado a las 48 horas midiendo el diámetro medio de endurecimiento. El ensayo de DHT se repitió con células de melanoma.

Todos los pacientes desarrollaron DTH para PBL autólogo modificado con DNP (Figura 1). Las respuestas a DHT fueron evidentes dos semanas después de la aplicación tópica de DNFB (día 14), y a continuación permanecieron estables a lo largo de un periodo de administración mensual de vacunas. Las suspensiones con células autólogas de melanoma conjugadas con DNP provocaron DHT más fuerte que DNP-PBL (promedio SE:PBL = 13.3 \pm 1.3 mm, células de melanoma = 21.9 mm + 3.6 mm; p < 0.01). DTH fue específico para DNP auto-modificado, ya que PBL autólogo conjugado con TNP no provocó ninguna respuesta en los 50 pacientes del test.

Anticuerpo Anti-DNP

Se desarrolló un ELISA mediante pozos microtítulo cubiertos con PBL conjugado con DNP. Se consideró que este método para placas cubiertas con albúmina conjugada con DNP era preferible porque daba como resultado lecturas de bajo fondo con suero de pacientes pre-inmunizados. Se añadió PBL conjugado con DNP (5 x 10^{5} en 0.1 ml) a cada pozo de una placa plan inferior con 96 pozos. Las células fueron fijadas a la placa mediante secado seguido de una exposición de 5 minutos a 100% metanol. A continuación, las placas se lavaron con fosfato búfer salina + 0.05% Tween-20. Las diluciones en serie del suero para test fueron añadidas a los pozos y la placa se incubó en una cámara humidificada a 37°C durante una hora. Después de la incubación, la placa se lavó cinco veces, y a continuación se añadió inmunoglobulina anti-humana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano (Laboratorios Cappel, Malvern, PA) a la dilución óptima predeterminada. Para detectar anticuerpos IgC o IgM, se emplearon IgC o IgM de cabra conjugados con peroxidasa de rábano, respectivamente. Después de una hora de incubación a 37ºC, la placa se lavó cinco veces y se añadió 0.1 ml de sustrato (-fenilenediamina, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a cada pozo seguido de 0.12 OI peroxido de hidrógeno. La placa fue leída en un lector de placa ELISA.

El ensayo fue validado empleando un anticuerpo monoclonal anti-DNP murino (clon SPE-7; Sigma ImmunoChemicals) y un anticuerpo de inmunoglobulina de ratón conjugado con peroxidasa como segundo reagente de segundo paso. Posteriormente, el control positivo consistió en una muestra de suero de un paciente que había recibido múltiples inyecciones de vacuna DNP. El título de anticuerpo anti-DNP de cada muestra de suero se definió del siguiente modo: (pico OD de muestra) X (recíproco de la dilución que tiene OD igual a la mitad del pico OD del control positivo) Butler, J. E., Methods Enzymol., 1981, 73, 482.

El anticuerpo anti-DNP se desarrolló en 24 de los 27 pacientes que participaron en el test (Figura 2). A diferencia de DTH, el anticuerpo no fue provocado por la aplicación tópica de DNFB (día 14). En 19 pacientes, los títulos aumentaron por encima de los niveles de la pre-inmunización tras dos inyecciones intradérmicas de células de melanoma conjugadas con DNP (día 63); en 5 pacientes adicionales, se encontraron títulos significativos después de 4 a 6 vacunas. En todos los pacientes, se detectó el anticuerpo IgG; se encontró IgM anti-DNP únicamente en tres pacientes. El anticuerpo anti-DNP reaccionó de manera cruzada con TNP, y se muestra en el enlace con las células modificadas por TNP, pero no con el hapteno, oxazolona no relacionados.

Desarrollo de Líneas Celulares T

PBL (1 x 10^{6}) se mezclaron con células autólogas linfoblastoides B conjugadas con DNP (1 x 10^{5}) en placas con fondo plano de 24 pozos en un medio de cultivo de linfocito. Después de 7 días de cultivo, se añadió IL2 100 U/ml (un obsequio de Cetus Oncology, CA). Los cultivos expansivos de células T se mantuvieron en el medio + IL2 y fueron separados cuando fue preciso para mantener una concentración de aproximadamente 2 x 10^{6} células en un pozo de 22 mm. Cada 14 días, los cultivos fueron reestimulados añadiendo células autólogas linfoblastoides B conjugadas con DNP. Los fenotipos fueron determinados mediante citometría de flujo con un panel de anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson, San Jose, CA). La separación de células T CD8+ y CD4+ se llevó a cabo mediante criba indirecta en la cual las células T cubiertas con anticuerpos monoclonales anti-CD8 o anti-CD4 fueron adheridas a los platos cubiertos con inmunoglobulina empleando técnicas estándar de acuerdo con los métodos de Wysocki, L. J. y V. L. Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2844, aquí incorporado como referencia en su totalidad; las células adherentes fueron aisladas y expandidas con estimuladores modificados con DNP e IL2.

Las subpoblaciones fenotípicamente homogéneas de células T se obtuvieron mediante cultivo en dilución limitativa en pozos microtítulo de fondo redondo en medio de cultivo de linfocitos que contenía 2 x 10^{5} células comedoras alogénicas irradiadas, 200 U/ml IL2, y fitohemaglutinina. Los pozos con colonias crecientes de linfocitos fueron analizados en busca de habilidad para proliferar en respuesta a células linfoblastoides B modificadas con DNP. Los pozos positivos se expandieron en IL2 y fueron reestimulados con células linfoblastoides B modificadas con DNP cada 14 días.

Respuestas linfoproliferativas - PBL fueron testadas como células respondedoras. Se suspendieron en medio de cultivo de linfocito (RPMI-1640, 10% suero AB^{+} humano, suplemento de medio insulina-transferina-selenita (Sigma Chemical Co.) 2 mM L-glutamina, 1% aminoácidos no esenciales, 25 mM búfer HEPES, penicilina + estreptomicina) y se añadieron a placas microtítulo de fondo plano y con 96 pozos a 1 x 10^{5} células/pozo. Las células estimuladoras incluyeron: 1) PBL autólogos o alogénicos, 2) líneas linfoblastoides B autólogas o alogénicas hechas mediante transfección con el virus Epstein-Barr, 3) células cultivadas autólogas de melanoma; fueron inactivadas mediante irradiación (5000 R). En la mayoría de los experimentos, el radio respondedor:estimulador fue 1:1. Las placas se incubaron en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 5 días; a continuación las células se pulsaron con IUDR etiquetado ^{121}I (ICN Radiochemical, Costa Mesa, CA) durante 6 horas, se cosecharon con un dispositivo automático de cosecha, y se contaron en un contador gamma. SE calculó el promedio de pozos triplicados. Las células T cultivadas también fueron testadas en busca de una respuesta proliferativa de acuerdo con los métodos mencionados.

PBL, obtenido y criopreservado de cuatro pacientes en el momento de máxima reactividad DTH con células autólogas modificadas con DNP, se descongelaron y testaron para reexpuestas proliferativas in vitro. PBL de los cuatro pacientes proliferaron tras la estimulación con células modificadas con DNP (Figura 3). La cinética del desarrollo de la respuesta proliferativa en uno de estos pacientes (DM2) se muestra en la Figura 4. La aplicación de DNFB solo (día 14) no dio como resultado números detectables de células respondedoras circulatorias. Se detectaron PBL reactivos tras dos inyecciones de vacuna DNP (día 63) y continuaron detectándose a lo largo de un periodo de 8 meses de tratamiento con vacuna.

La respuesta proliferativa de células modificadas con DNP fue específica, ya que ni PBL no conjugados ni PBL modificado con TNP provocaron respuestas (Figura 5). La post-vacuna PBL también se proliferó de manera clara cuando se estimuló con línea celular de melanoma modificada con DNP derivada de tejido tumoral autólogo. Cuando se estimuló con linfocitos alogénicos, PBL mostró la reacción esperada de linfocito mezclado que fue de tres a cinco veces mayor que las respuestas DNP.

Los linfocitos T circuladotes de uno de estos pacientes (DM2) se expandieron in vitro mediante cultivo en IL2 y la reestipulación se repitió con células autólogas linfoblastoides B modificadas con DNP. Tras cuatro semanas de expansión, las células T fueron 70% CD3+, CD8+ y 30% CD3+, CD4+. Se proliferaron cuando se estimularon por medio de células autólogas linfoblastoides B modificadas con DNP o por medio de células de melanoma cultivadas modificadas con DNP, pero no por medio de células autólogas no conjugadas (Figura 6). Estas células se separaron mediante criba positiva en poblaciones enriquecidas con CD8 y con CD4 que fueron 98% puras tal y como se determinó en el análisis de citometría de flujo. Tal y como se muestra en la Figura 7, tanto las células T enriquecidas con CD4 como las enriquecidas con CD8 mostraron una respuesta proliferativa a células autólogas linfoblastoides B modificadas con DNP. Sin embargo, sólo las células T CD8+ respondieron a células de melanoma autólogas modificadas con DNP. Este resultado puede deberse a la baja expresión constitutiva (< 5%) de MHC clase II por medio de la línea celular de melanoma.

Las células T expandidas fueron testadas para comprobar su habilidad para producir citoquinas cuando se estimularon con células autólogas linfoblastoides B modificadas con DNP. Tal y como se muestra en la Figura 8, produjeron interferón gamma pero no IL4. Para determinar si tanto las células T CD4 + como CD8+ estuvieron implicadas en la respuesta citoquina, se analizaron sublíneas que se obtuvieron colocando en placas células T en dilución limitativa. Cada uno de estos cultivos fue homogéneo con respecto a la expresión de CD4 y CD8. Tres de estas sublíneas (dos CD4+, una CD8) fueron testadas en busca de respuesta citoquina para células linfoblastoides B modificadas con DNP. Las tres produjeron interferón gamma mientras que ninguna produjo IL4 (Figura 8).

Producción de Citoquina - Se añadieron células T a placas microtítulo con fondo redondo en 1 x 10^{5} células/pozo. Se añadió un número igual de estimuladores (células autólogas linfoblastoides B modificadas con DNP), y se recogieron los sobrenadantes tras 18 horas de incubación. Se emplearon kits ELISA disponibles en el mercado para medir interferón gamma (Endogen, Boston, MA; sensibilidad = 5 pg/ml) e IL4 (R&D Systems, Minneapolis, MN; sensibilidad = 3 pg/ml).

Para determinar la dependencia a MHC de la respuesta, las células estimuladoras de pre-incubaron con anticuerpos monoclonales a MHC clase I (W6/32) o MHC clase II (L243) en una concentración de 10 pg/ml durante una hora antes de añadir células respondedoras. Se testó la inmunoglobulina de ratón no específica en la misma concentración como control negativo.

Las células T CD8 reactivas con DNP obtenidas por medio de criba de la población a granel fueron capaces de mantenerse en cultivo a largo plazo (< 3 meses) en medio que contenía IL2 mediante estimulación repetida con células autólogas linfoblastoides B modificadas con DNP; contenían el fenotipo estable, CD3+, CD8+. Dos líneas de evidencia confirmaron que su respuesta fue MHC clase I restringida: 1) La producción de interferón gamma se bloqueó por la pre-incubación de células estimuladoras con anticuerpo armazón anti-clase I, pero con por el anticuerpo anti-clase II (Figura 9) y 2) Las células T fueron capaces de responder a estimuladores alogénicos modificados con DNP que coincidieron en uno o en ambos de los puntos HLA-A, pero no a estimuladores que no coincidieron con HLA-A. Tal y como se muestra en la Figura 10, las células T se proliferaron tras la estimulación con PBL autólogo modificado con DNP (HLA-A1, A2, B8+, Bw6) y con PBL alogénico modificado con DNP que expresaron Al o A2 o ambos; no se produjo ninguna respuesta por parte de estimuladores alogénicos modificados con DNP que fueron A1 y A2 negativos.

Citotoxicidad - Los objetivos melanoma fueron etiquetados durante dos horas con ^{51}Cr (Amersham Corp, Arlington Heights, IL), y se añadieron 2500 células a pozos microtítulo con fondo redondo. A continuación se añadieron células efectoras para conseguir una serio de radios E:T. Tras 6 horas de incubación a 37ºC, se retiraron los sobrenadantes y se contaron en un contador gamma. La tisis se definió del siguiente modo: [CPMT_{test} - CPM_{espontáneo}] / [CPM_{total} - CPM_{espontáneo}]) * 100. La toxicidad de la línea celular CD8+ se testó en un ensayo de liberación ^{51}Cr con células autólogas de melanoma como objetivos. Para minimizar la liberación espontánea 51Cr, la modificación con DNP se llevó a cabo con DNBS en lugar de DNFB. Las células T lisiaron células autólogas de melanoma modificadas con DNP pero no células de melanoma alogénicas (clase I-desigual) (Figuras 11a, 11b). Hubo una dirección directa entre susceptibilidad para tisis y el grado de modificación de DNP, tal y como se determinó por la concentración de DNBS empleada. Ni los objetivos autólogos ni los alogénicos fueron modificados con TNP fueron lisados.

Ejemplo 6

Se recogieron los datos clínicos para sugerir que una vacuna de melanoma antóloga conjugada con DNP prolonga la supervivencia libre de enfermedad (DFS) y la total supervivencia (TS) en pacientes de melanoma con metástasis voluminosas en nódulos linfáticos regionales pero extirpables. Cuarenta y siete pacientes fueron sometidos a linfadenectomía estándar con resección de masas metastáticas. Las células tumorales se disociaron enzimáticamente de estos tejidos y se criopreservaron. Las vacunas consistieron en 10 x 10^{6} a 20 x 10^{6} células de melanoma irradiadas (2500 R), conjugadas con DNP y mezcladas con BCG. Se inyectaron por vía intravenosa cada 28 días durante un total de 8 tratamientos. Se dio ciclofosfamida 300 Mg/M^{2} 3 días antes de las primeras 2 vacunas solamente. DFS y TS de estos pacientes se comparó con los de los 22 pacientes de melanoma con metástasis nodal extirpable tratados previamente con una vacuna no conjugada, ver Ejemplo 4. De los 36 pacientes con melanoma en fase 3 (masa palpable en una región del nódulo linfático), 22 están libres de enfermedad con un seguimiento medio de 33 meses. El análisis Kaplan-Meir proyecta una DFS de 3 años y TS de 59% a 71%, respectivamente. Sin embargo, el DF8 y TS de fase 3 en pacientes tratados con vacuna no conjugada fue 22% y 27% respectivamente (p = 0.01, test log-rank). De 11 pacientes en la fase 4 (masa palpable en dos regiones del nódulo linfático), 5 son NED (sin evidencia de enfermedad) con un seguimiento medio de 41 meses. Tanto para pacientes en fase 3 como en fase 4, el mayor índice de recaídas tuvo lugar en los 6 primeros meses, un momento en el que la inmunidad anti-melanoma podía no haberse establecido aún. El experimento será seguido por un programa acelerado de inmunizaciones para reducir el índice de recaídas y mejorar el resultado clínico general. Los pacientes fueron comparados con su condición antes del tratamiento con la vacuna. Los pacientes tratados antes del estudio de la vacuna fueron retirados del tratamiento uno o dos meses antes del inicio del estudio de la vacuna. Por consiguiente, los pacientes no fueron tratados al comenzar el estudio de la vacuna.

Ejemplo 7 Materiales y Métodos

Líneas Celulares y Tejido de melanoma humano - Se obtuvo tejido de pacientes con melanoma metastático antes de entrar en el programa de vacunación y después de la vacuna. El protocolo clínico para la administración de la vacuna DNP se llevó a cabo de acuerdo con Berd, D., et al., Cancer Res. 1991 51: 2731-2734. Tras la operación, el espécimen tumoral fue transportado a un laboratorio, el tejido tumoral se aisló de la fascia que lo rodea y del tejido conector, se congelaron piezas de tumor que medían 2-4 mm^{3} en nitrógeno líquido. Las líneas celulares de melanoma de los mismos especímenes se derivaron de los compendios de enzima (ADNasa y colagenasa) del tumor y se propagaron tal y como lo describe Berd, D., et al., Cancer Res. 1986 46:2572-2577.

Aislamiento de ARN y Amplificación por medio de RT-PCR - El total de ARN se extrajo de tejidos congelados puliéndolo en guanidina isotiocianato, seguido de aislamiento usando gradiente CsCL tal y como se describe en Lattime, E. C., et al., J. Immunol. 1988 144:3422-3428. Para minimizar la pérdida de tejido ARN, se añadieron 15 \mug de E. coli ribosomal ARN (Sigma Chemical Corp. St. Louis, MO) a cada muestra. El ARN aislado fue resuspendido en agua destilada deionizada tratada con dietilpirocarbonato (DEPC-tx) (Sigma). Las síntesis de cADN se llevó a cabo usando un total de 10 \mug de ARN, Random Primer (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), y búfer RT en agua DEPC-tx. Esto se incubó a 65ºC durante 10 minutos y a continuación se colocó a 4ºC. A esto se añadieron 10 mM DTT (Gibco BRL), 0.5 mM de cada dATP, dCTP, dTTP, dTTP, (Gibco BRL), y 500 U MMLV-RT (Gibco BRL) para conseguir un volumen final de reacción de 50 \mul. Las muestras se incubaron a 37ºC durante una hora y a continuación se calentaron a 95ºC durante 5 minutos.

Para amplificación mediante PCR, se añadieron a continuación 5 \mul de cada ADN a los tubos de reacción MicroAmp (Perkin Elmer, Norwalk, CT) que contenían búfer de reacción PCR, 0.2 mM de cada dATP, dCTP, dTTP, dTTP, 1.25 U AmpliTaq Polimerasa ADN (Perkin Elmer), las concentraciones MgCl2 determinaron ser óptimas para cada par iniciador (concentraciones finales de 1.5-6.0 mM), y 0.5 mM respectivamente de cada par de iniciadores apropiados en un volumen final de 50 \mul. La parejas de iniciadores empleadas en este estudio incluyeron beta-actina, TNF-alpha, IL4, IFN\gamma, South San Francisco, CA) e IL10 (Clontech, Palo Alto, CA). P-actina sirvió como un estándar para comparación de expresión relativa de mARN entre muestras, así como control para reacciones RT y PCR. Las muestras PCR fueron amplificadas usando un termociclo GeneAmp Systems 9600 (Perkin Elmer). Cada muestra se desnaturalizó a 94ºC durante 37 segundos, se templó a 55ºC durante 45 segundos, y se extendió a 72ºC durante 60 segundos durante 39 ciclos, seguido de una extensión de 10 minutos a 72ºC.

Los productos PCR y los marcadores de tamaño (Novagen, Madison, WI) se separaron en un gel agarosa 20% (FCM BioProducts, Rockland, ME). El gel se tiñó con bromuro de etidio, se visualizó y se fotografió bajo iluminación UV. La electroforesis de productos PCR reveló una banda correspondiente al tamaño de fragmento predichos para cada conjunto de iniciadores. ARN transcrita no inversas fue sometida a amplificación mediante PCR como un control para contaminación genómica de ADN.

Las suspensiones de células disociadas de enzima y criopreservadas de tejidos de melanoma resultaron no ser útiles para análisis de ARN. Estas muestras normalmente expresaron mARN para todas las citoquinas testadas, probablemente un resultado de activación a través del proceso de disociación.

Histología y RT-PCR In-Situ - El tinte H&E rutinario de especímenes representativos fue realizado por el Departamento de Patología. RT-PCR in situ fue llevado a cabo en secciones de parafina que se permeabilizaron usando proteinasa K, se trató con transcriptasa inversa y el IL10 ADN resultante fue amplificado usando los mismos iniciadores que se han establecido empleando la metodología de acuerdo con Bagasra, O., et al., J. Immunol. Meth. 1993 158:131-145.

MARN de Citoquina en Biopsias Inflamadas Post-vacuna - Mientras que el melanoma metastático se caracteriza por una escasez de infiltración linfocítica (Elder et al., "The surgical pathology of cutaneous malignant melanoma" En: W. H. Clark, Jr. et al. (Eds.), Human Malignant Melanoma, pp. 100, New York: Grune y Stratton 1979), la administración de vacuna DNP provoca infiltración de células Ten masas metastáticas (Berd et al., 1991 supra.) Ocho (8) metástasis subcutáneas (de 4 pacientes) que habían desarrollado inflamación tras el tratamiento con vacuna fueron estudiadas y comparadas con 3 metástasis subcutáneas extirpadas antes de la vacuna y 4 metástasis post-vacuna que no desarrollaron una respuesta antiinflamatoria. Las biopsias post-vacuna inflamadas contenían mARN para IFN\gamma (5/8), IL4 (4/8) o ambos (3/8). Sin embargo, ni IFN\gamma mARN ni IL4 mARN fue detectado en los 7 especímenes de control. Todos menos uno de estos 15 tejidos expresaron mARN para IL10. La Figura 14 muestra la expresión de mARN citoquina para una biopsia representativa post-vacuna infiltrada de células T junto con la histología correspondiente.

Metástasis de Nódulo Linfático - También se estudió un grupo de biopsias de metástasis de nódulo linfática de melanoma. Histológicamente estas lesiones se caracterizan por la abundancia de linfocitos (Figura 15B) que se cree que son los residuos de los linfocitos de nódulo linfático infiltrado en el tumor (Cardi, et al., Cancer Res. 1989 49:6562-6565). De las 10 biopsias de nódulo linfático estudiadas, solamente una expresó mARN para IFN\gamma; este espécimen, y un espécimen adicional, contenían mARN para IL4. Sin embargo, los 10 especímenes contenían mARN para IL10. La Figura 15 muestra expresión de mARN citoquina para una metástasis representativa de nódulo linfático junto con la histología correspondiente.

Producción de IL10 por Metástasis de Melanoma y Líneas Celulares - Tal y como se ha indicado anteriormente, la expresión IL10 mARN fue vista en 24/25 metástasis de melanoma (Figura 16). Debido a que era independiente de IFN\gamma o expresión IL4 mARN y no era correlativa con la infiltración de célula T, las células de melanoma, más que linfocitos, pueden ser la fuente de IL10. Se emplearon dos técnicas para comprobar esta hipótesis. En primer lugar, se examinaron las líneas celulares derivadas de dos de los tumores metastáticos descritos anteriormente. Tal y como se muestra en la Figura 17A, tanto las líneas celulares como el tejido del que se deriva expresaron IL10 mARN.

Ambas líneas celulares produjeron IL10, tal y como fue determinado por el ensayos de cultivos de sobrenadantes tras una incubación de 72 horas (concentraciones IL10: 760 pg/ml y 10 pg/ml, respectivamente). En segundo lugar, la expresión IL10 mARN en una sección de tejido de una metástasis de melanoma fue estudiada usando RT-PCR in situ. Tal y como se observa en la Figura 17B, IL10 mARN está asociado con células de melanoma pero no con elementos no tumorales.

TFN mARN se expresa en metástasis de melanoma - mARN para TFN en biopsias de carcinoma de colon humano usando hibridización in situ (Taylor, M. S., et al., Cancer Res. 1990 50:4436-4440), y esa resistencia a TFN está asociada con el crecimiento tumoral in vivo (Lattime, E. C. y Stutman, O. J. Immunol. 1989 143:4317-4323). Se detectó TFN mARN en 6/23 especímenes de melanoma. Hubo una asociación con la inflamación producida por la vacuna DNP: 4/7 biopsias post-vacuna infiltradas con célula T fueron positivas contra 2/16 pre-vacunas o especímenes de post-vacunas sin infiltración.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe péptidos tumorales modificados con dinitrofenil para inmunoterapia de cáncer.

Se añadió el virus Epstein barr (EBV) a células linfoblastoides B en cultivo. Las células linfoblastoides B se transformaron en un tumor celular B a partir de los propios linfocitos del paciente. El melanoma de una metástasis se cultivó en RPMI 1640 + 10% suero fetal de ternero o 10% de suero humano mezclado. Las células no adheridas fueron lavadas con medio RPMI. Cuando las células confluyeron, se separaron con 0.1% EDTA y se pasaron a dos frascos. Este proceso continuó durante aproximadamente de 10 a 30 pasos. Para comprobar la producción de interferón gamma por parte de células T, se obtuvieron linfocitos de la sangre de un paciente. Se mezclaron aproximadamente 1.000.000 linfocitos con células de melanoma autólogas modificadas con DNP para estimular células T. Cada siete días, se añadieron 100 U/ml de interleukina-2. Las células se expandieron mediante paso a frascos tal y como se ha descrito anteriormente. A continuación, las células T se reestimularon mediante células de melanoma autólogas modificadas con DNP. La estimulación fue determinada por la cantidad de producción de interferón gamma por parte de células T. Por norma general, se consideró la producción de interferón gamma mayor que 15 picogramos/ml. Posteriormente, estas células T se emplearon para realizar pruebas con el péptido.

Los péptidos pequeños se extrajeron de cuatro tipos de células, todas generadas por un único paciente: 1) células linfoblastoides B, 2) células linfoblastoides modificadas con dinitrofenil (DNP), 3) células cultivadas de melanoma, 4) células cultivadas de melanoma modificadas con DNP. Las células se suspendieron en 0.1% ácido trifluoroacético, se sometieron al homogenizador Dounce, se sometieron a ultrasonido, y centrifugaron a 100,000 xg durante 90 minutos. El material en el sobrenadante de peso molecular inferior a 10,000 fue retirado por medio de un filtro Centricon 10. El material restante fue separado en una columna HPLC de fase inversa. Las fracciones individuales fueron recogidas, secadas y se resuspendieron en el medio de cultivo, y se añadieron a células linfoblastoides B autólogas, que se enlazaron y presentaron con los péptidos. Estas células B pulsadas por péptidos fueron sometidas a pruebas para comprobar su habilidad para estimular una línea celular de linfocito T que estaba específicamente sensibilizada para células de melanoma autólogas modificadas con DNP.

Inicialmente, las fracciones 50 HPLC (10 \mul de cada muestra) se dividieron en cinco grupos de diez fracciones cada uno. Tal y como se muestra en la Figura 13, solamente los péptidos derivados de células de melanoma modificadas con DNP (DNP-MEL) o células B modificadas con DNP (DNP-LY) fueron estimuladoras, y sólo el conjunto #2 fue positivo.

Cada una de las fracciones individuales del conjunto #2 fue analizado llevando a cabo la prueba de estimulación de célula T con cada una de las fracciones en el conjunto 2; se encontró actividad solamente en las fracciones #17 y #18, y el péptido DNP-MEL estimuló dos veces más la producción de interferón gamma que DNP-LY.

Estos resultados indican que una única fracción HPLC de una preparación con péptido de peso molecular bajo contiene el péptido o los péptidos responsables de la estimulación de células T sensibilizadas para células de melanoma modificadas con DNP.

Ejemplo 9

Este ejemplo determinará la inhibición de estimulación péptida por medio de anticuerpo anti-DNP.

El experimento será idéntico al descrito en el Ejemplo 8 con una excepción. Tras añadir péptido a las células linfoblastoides B, y justo antes de añadir las células T respondedoras, las variadas concentraciones (1-100 \mul/ml) de anticuerpo anti-DNP se añadirán a las diferentes muestras. El anticuerpo anti-DNP puede obtenerse del ATCC, hibridoma #CRL-1968, o de un anticuerpo similar. Si la estimulación es provocada por los péptidos modificados con DNP, el anticuerpo lo inhibirá. Se espera que las fracciones 17 y 18 sean inhibidas por el anticuerpo.

Ejemplo 10

Se espera que el Ejemplo 10 determine si las células T respondedoras son CD4 + o CD8 +.

El experimento será idéntico al descrito en el Ejemplo 8 con una excepción. Las células T respondedoras se fraccionarán en subconjuntos antes de añadirse a las células linfoblastoides B pulsadas por péptido. Esto se lleva a cabo mezclando las células T con gotas magnéticas cubiertas bien con anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 (comercialmente obtenidos a partir de Immunotech, Inc., Westbrook, Maine). A continuación, se retiran con un imán las gotas y las células que se han unido a ellas. Las células que no se han unido se lavan en el medio de cultivo del tejido (RPMI + 10% suero humano mezclado) se contaron y se añadieron a los pozos microtítulo para medición de estimulación.

Ejemplo 11

El Ejemplo 11 describe membranas tumorales modificadas con dinitrofenil para inmunoterapia de cáncer.

Se han preparado las membranas de células cultivadas de melanoma de un paciente de acuerdo con el método Heike et al., J. Immunotherapy 1994 15:165-174, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Las células de melanoma se conjugaron con dinitrofenil (DNP) de acuerdo con los métodos de Millar y Claman, J. Immunology 1976 117:1519-1526, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Las células se suspendieron en 5 volúmenes de 30 mM búfer de bicarbonato de sodio con 1 mM fluoruro fenil metil sulfonil y se interrumpió con un homogenizador de cristal. Las células intactas residuales fueron retiradas mediante centrifugado a 1000 g. A continuación, las membranas se transformaron en bolas por medio de centrifugado a 100,000 g durante 90 minutos. Las membranas fueron resuspendidas en 8% sacarosa y se congelaron a -80ºC hasta que fueron necesarias. Las células de melanoma se prepararon de manera similar para conjugación con dinitrofenil.

Estas membranas celulares de melanoma modificadas con DNP fueron sometidas a pruebas para comprobar su habilidad para estimular los linfocitos T autólogos que habían sido sensibilizados para células de melanoma intactas modificadas con DNP. Esto se realizó incubando aproximadamente 100,000 linfocitos T/pozo con aproximadamente 10,000 a 100,000 equivalentes celulares de membrana/pozo modificados con DNP, y midiendo la producción de interferón gamma (superior a 15 picogramos). Este proceso se repitió incubando los linfocitos T con células de melanoma modificadas con DNP. Los resultados rebelaron que las células intactas de melanoma y las membranas derivadas de ellas fueron igualmente efectivas en la estimulación de células T.

Este experimento, que ha sido repetido en varias ocasiones (usando la muestra del mismo paciente) con resultados similares, indica que las membranas de melanoma modificadas con DNP pueden sustituir a las células intactas de melanoma modificadas con DNP en la provocación de una repuesta de célula T.

Ejemplo 12

El Ejemplo 12 determinará si la adición de monocitos autólogos o células dendríticas aumenta la respuesta de célula T a las membranas tumorales.

Los monocitos autólogos se aislarán del siguiente modo. Los linfocitos de sangre periférica se separarán de la sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de acuerdo con los métodos de Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, 1968 Suppl 97:77-89, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Se suspenderán en medio de tejido de cultivo (RPMI-1640 + 10% suero humano mezclado) y se añadirán a pozos microtítulo de plástico durante aproximadamente dos horas con el fin de que los monocitos se adhieran. A continuación, las células no adherentes se lavaron con el medio de cultivo. Se añadirán varias concentraciones de GM-CSF (factor estimulador de colina macrófago granulocito, obtenido en el mercado en Immunex, Seattle, WA) para estimular el crecimiento de monocitos. Tras aproximadamente 2-3 semanas, los monocitos, ahora considerados macrófagos, se retirarán del plástico con 0.1% EDTA, y se añadirán en números graduados (aproximadamente de 100 a 10,000/pozo) a pozos frescos microtítulo. Los números graduados de membranas, preparadas a partir de células tumorales autólogas modificadas con DNP (cuantificadas como equivalentes celulares), se añadirán a la monocapa adherente de macrófago. Tras aproximadamente 6 a aproximadamente 24 horas, se añadirán las células T autólogas específicas de DNP y se incubarán durante 24 horas adicionales. A continuación, se recogerán los sobrenadantes y se comprobarán la producción de citoquina con, sin limitación, interferón gamma, IL2, factor de necrosis tumoral; o para proliferación o estimulación de células T como por ejemplo, mediante timidina, con tintes tales como MTT. Por ejemplo, se añadirá ^{125}IUDR y las células se recogerán en un dispositivo automático de cosecha para comprobar la proliferación de células T. Los controles consistirán en células T no estimuladas y células T estimuladas con membranas en ausencia de macrófagos. La habilidad de células dendríticas autólogas para aumentar o mejorar la respuesta a las membranas se comprobará de la misma manera. Las células dendríticas se aislarán de células mononucleares de sangre periférica y crecerán en cultivo de tejido de acuerdo con el método de O'Doherty, U. et al., J. Exp. Med. 1993 178:10678-1078, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Se espera que el Ejemplo 13 determine si los pacientes que recibieron la vacuna modificada con DNP manifiestan hipersensibilidad de tipo tardío (DTH) a membranas de melanoma autólogas modificadas con DNP.

Los sujetos del estudio serán pacientes que han recibido repetidas dosis de vacuna de célula de melanoma modificada con DNP. Las membranas se prepararán a partir de células autólogas de melanoma modificadas con DNP tal y como se ha descrito anteriormente. Los números graduados de membranas (aproximadamente entre 100 y 10,000 equivalentes celulares) ser lavarán en PBS, se resuspenderán en PBS, y se inyectarán por vía intradérmica en el antebrazo. Se medirá DHT aproximadamente 48 horas después, al igual que el diámetro del endurecimiento cutáneo. Los controles consistirán en membranas antólogas celulares de melanoma no conjugadas o membranas preparadas a partir de linfocitos sanguíneos autólogos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Se espera que el ejemplo 14 determine si los macrófagos o células dendríticas procesan membranas alogénicas de melanoma y las presenta de manera inmunogénica para células T singénicas y macrófagos.

El procedimiento será similar al descrito en el Ejemplo 12 con la excepción de que las membranas estimuladoras se prepararán a partir de células alogénicas de melanoma conjugadas con DNP. La hipótesis es que los macrófagos o células dendríticas del paciente A pueden procesar in vitro membranas obtenidas de células de melanoma del paciente B. Esto da como resultado la estimulación de células T del paciente A. Este experimento puede dar lugar a una estrategia para inmunización alogénica. Las membranas modificadas con DNP preparadas a partir de una única línea celular alogénica de melanoma, o conjunto de líneas celulares alogénicas, se procesarían por medio de macrófagos de un paciente o células dendríticas in vitro. Esas células podrían usarse para inmunización.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15

La administración de una vacuna consistente en células autólogas de melanoma modificadas con hapteno, dinitrofenil (DNP-vacuna), prolongó el periodo sin recaídas y la supervivencia en pacientes con fase clínica tres de melanoma seguido de linfadenectomía. Los siguientes programas con cuatro dosis de vacuna DNP en pacientes adyuvantes tras la cirugía fueron comparados para determinar su eficacia en la producción de DHT para células autólogas de melanoma no modificadas (autol-MEL): (1) Programa A, de acuerdo con el cual se administró un total de ocho vacunas cada 28 días (todas las vacunas fueron modificadas con DNP); (2) Programa B, de acuerdo con el cual se administró un total de 12 vacunas semanalmente y se alternó la vacuna modificada con DNP y la no modificada; (3) Programa C, de acuerdo con el cual se administró un total de 12 vacunas semanalmente, (todas las vacunas fueron modificadas con DNP); y (4) Programa D, de acuerdo con el cual se administró un total de seis vacunas semanalmente (todas las vacunas fueron modificadas con DNP). Todos los pacientes salvo los de D fueron sensibilizados con hapteno antes de la vacuna. En los cuatro regímenes se mezcló BCG con las células de melanoma para proporcionar un adyuvante inmunológico. Los pacientes del programa C recibieron tres dosis de ciclofosfamida en intervalos separados en el tiempo durante el tratamiento. Los pacientes del programa D recibieron sólo una dosis de ciclofosfamida antes de la primera
vacuna.

De manera sorprendente, los programas de dosis A y D produjeron de manera significativa DTH mayor para autol-MEL que los programas más intensivos, B y C (p = 001, Mann-Whiten U Tests). El porcentaje de pacientes que desarrolló una respuesta DTH para autol-MEL \geq 5 mm fue del siguiente modo: Programa A: 45% (20 pacientes de un total de 44, es decir 22/44), Programa B: 11% (3/27), Programa C: 18% (4/22), Programa D: 59% (16/27) (p<01, Chi square). Sin embargo, los cuatro programas de dosis provocaron respuestas similares de DTH para PPD. El seguimiento hasta la fecha sugiere que los dos programas de dosis (A y D) que fueron más efectivos para producir DTH para autol-MEL produjeron supervivencias libres de recaída más largas que los dos programas (B y C) que resultaron inmunológicamente menos efectivos, incluso después de ajustarlos para variables pronosticas estándar. Por lo tanto, la dosis y el programa de vacunación de administración de vacunas para tumores humanos pueden ser importantes al provocar respuestas inmunológicas que tienen significado clínico.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Berd, David;

\hskip3.9cm

Eisenlohr, Lavrrence; and

\hskip3.9cm

Lattime, Edmund

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN QUE CONTIENE EXTRACTO DE CÉLULA TUMORAL Y MÉTODO DE USO DE LA COMPOSICIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Woodcock Washbum Kurtz Mackiewicz & Norris

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: One Liberty Place - 46th Floor

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Philadelphia

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

C.P: 19103

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: DISKETTE, 33 INCH, 1.44 Mb ALMACENAJE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NUMERO DE SOLICITUD: Desconocido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: Julio 7, 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN: Desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NUMERO DE SOLICITUD: 08/203,004

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: Febrero 28, 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Lori Y. Beardell

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34,293

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE ARCHIVO: TJU-1582

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (215) 568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (215) 568-3439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTID: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGATGATG ATATCGCCGC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAAGCAT TTGCGGTGGA CGATGGAGGG GCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAATATA CAAGTTATAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(8)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: Yes

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACTGGGAT GCTCTTCGAC CTCGAAACAG CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: nidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGGTCTCA CCTCCCAACT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGCTCGAA CACTTTGAAT ATTTCTCTCT CAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: mido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTGAGAA CCAAGACCCA GACATCAAGG CG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: Si

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTATCCCA GAGCCCCAGA TCCGATTTTG G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(10) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAGCACTG AAAGCATGAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(11) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS SECUENCIALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 parejas base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN SECUENCIAL: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCACAGGGCA ATGATCCCAA AGT

\hfill

23

Claims (13)

1. Uso, en la fabricación de una composición para inducir una respuesta anti-tumor en un paciente mamífero que sufre un tumor, de una célula tumoral o extracto de célula tumoral que:

(i)

está conjugada con un hapteno;

(ii)

es del mismo tipo tumoral que el tumor del paciente;

(iii)

no es alogénica a dicho paciente, y

(iv)

es incapaz de crecer en el cuerpo del paciente tras la inyección como resultado de irradiación antes de su uso.

Donde:

a)

dicha composición debe administrarse con un adyuvante de manera repetitiva en intervalos semanales;

b)

a un paciente mamífero que no ha sido sensibilizado para dicho hapteno antes de la administración de dicha composición; y

c)

únicamente antes de la primera administración de dicha composición, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida a dicho paciente.

2. El uso de la reivindicación 1, donde dicha composición debe administrarse al menos tres veces.

3. El uso de la reivindicación 1, donde dicha composición debe administrarse al menos seis veces.

4. El uso de la reivindicación 1, donde dicha cantidad terapéuticamente eficaz de ciclofosfamida comprende una dosis de aproximadamente 300 mg/M^{2} de ciclofosfamida.

5. El uso de la reivindicación 1 donde dicha célula tumoral o extracto se selecciona del grupo consistente en célula tumoral o extracto de melanoma, pulmón, colon, pecho, riñón, próstata, ovario y leucemia.

6. El uso de la reivindicación 5, donde dicha célula tumoral o extracto es una célula tumoral o extracto de melanoma.

7. El uso de la reivindicación 1 donde dicho hapteno se selecciona del grupo consistente en dinitrofenil, trinitrofenil, N-iodoacetil-N'-(5-sulfónico 1-naftil)etileno diamina, ácido benceno isotiocianato, ácido trinirobencenosulfónico, ácido sulfanílico, ácido arsanílico, dinitrobenceno-S-mostaza y combinaciones de los mismos.

8. El uso de la reivindicación 7 donde dicho hapteno es dinitrofenil.

9. El uso de la reivindicación 1 donde dicho adyuvante se selecciona del grupo consistente en Bacillus Calmette-Guerin, QS-21, endotoxina detoxificada y una citoquina.

10. El uso de la reivindicación 1 donde dicho paciente mamífero es un humano.

11. El uso de la reivindicación 1 donde dicha composición comprende un máximo de aproximadamente 7.5 x 10^{6} células tumorales o extracto c. e por dosis.

12. El uso de la reivindicación 1 donde dicha respuesta anti-tumor es al menos una de las siguientes: necrosis tumoral, regresión tumoral, inflamación tumoral, infiltración tumoral por linfocitos T activados, enfermedad estable y prolongación de supervivencia del paciente.

13. El uso de acuerdo con las reivindicaciones precedentes donde la célula tumoral o el extra o de célula tumoral se irradia a 2500 gG antes de su uso.