DE69326536T2

DE69326536T2 - Antitumor Impfstoff

Info

Publication number: DE69326536T2
Application number: DE1993626536
Authority: DE
Inventors: Meir Shinitzky
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1993-03-18
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2013-03-19
Also published as: DE69326536D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Krebstherapie und betrifft neue Immunogene, ein Verfahren zur Herstellung der Immunogene, ein in vitro Verfahren zur Sensibilisierung von Immunzellen, eine Impfstoffzubereitung, die geeignet ist, eine Antitumor-Immunantwort zu induzieren, und die Verwendung der Impfstoffzubereitung zur Herstellung eines Arzneimittels.
Die erfindungsgemäßen Immunogene umfassen Tumorzellen, welche behandelt wurden, um deren spezifische Immunogenität zu erhöhen, und/oder Plasmamembranen derartiger Zellen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK

Wie gut bekannt und dokumentiert, enthalten Krebszellen im allgemeinen auf ihren externen Oberflächen spezifische Neoantigene, die für den Wirtskörper fremd sind. Nichtsdestoweniger entwickelt das Immunsystem aus nicht völlig verstandenen Gründen keine wirksame Immunreaktion gegen die Tumorzellen. Es wurden Versuche unternommen, Krebspatienten mit Zubereitungen zu immunisieren, die deren Immunsysteme stimulieren, um eine Reaktion gegen die Neoantigene zu entwickeln, in der Hoffnung, daß eine solche Immunreaktion den vorhandenen Krebs zerstört.
US-Patent Nr. 4,931,275 offenbart Antitumor-Impfstoffe, die Tumorzellen, die behandelt worden sind, um deren imunogenen Eigenschaften zu steigern, deren Plasmamembranen oder spezifische Membranproteine, die aus diesen Zellen oder Membranen erhalten wurden, als Wirkstoff enthalten. Die Behandlung, die gemäß diesem Patent deren Immunogenität steigert, besteht entweder aus einem Aussetzen der Zellen Cholesterinhemisuccinat, was die Lipidschicht der Plasmamembran steif macht, oder der Anwendung eines hydrostatischen Drucks bis zu etwa 1500 atm, oder aus einer Kombination dieser zwei Behandlungen.
Ramakrishna & Shinitzky (Cancer Immunol. Immunother., 1991, 33 : 1-8) zeigten, daß eine Antwort vom verzögerten Hypersensitivitätstyp (DTH, delayed type hypersensitivity) gegen syngene Tumoren potentiert werden konnte durch Zellen, die entweder mit einem hydrostatischen Druck bis zu 1200 atm, oder durch Vernetzen mit Adenosion-2',3'- dialdehyd, oder mit hydrostatischem Druck, gefolgt von Vernetzen, behandelt worden waren.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein neues Immunogen bereitzustellen, das geeignet ist, eine Antitumor-Immunantwort zu induzieren. Insbesondere ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Immunogen bereitzustellen, das modifizierte Tumorzellen und/oder Plasmamembranen davon umfaßt.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung des Immunogens bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen das Immunogen umfassenden Impfstoff bereitzustellen.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß wurde herausgefunden, daß ein Immunogen mit hervorragender Antitumor-Immunogenität erhalten werden kann aus Tumorzellen, die behandelt worden sind durch gleichzeitiges Aussetzen einem Vernetzungsmittel, das ein 2',3'-Nucleosid- oder Nucleotiddialdehyd ist (nachfolgend als "das Vernetzungsmittel" bezeichnet), und einem hydrostatischen Druck im Bereich von etwa 1200-1400 atm.
Gemäß einem ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung ein Immunogen bereit, das modifizierte Tumorzellen umfaßt, und geeignet ist, eine Antitumor-Immunantwort zu induzieren, wobei die modifizierten Tumorzellen dadurch hergestellt wurden, daß Tumorzellen gleichzeitig dem Vernetzungsmittel in einer Konzentration und während eines Zeitraums, welche ausreichen, um eine Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck im Bereich von etwa 1200-1400 atm ausgesetzt wurden.
Die Konzentration des Vernetzungsmittels beträgt bevorzugt mehr als 20 mM.
Das Anlegen und das Ablassen von Druck erfolgen bevorzugt nach und nach, beispielsweise während eines Zeitraums von 5-10 Minuten.
Das Vernetzungsmittel ist bevorzugt ein 2',3'-Dialdehyd eines natürlichen Nucleotids oder Nucleosids, da nicht-natürlich vorkommende, d. h. synthetische Nucleoside oder Nucleotide, sehr häufig stark toxisch sind.
Die bevorzugten Vernetzungsmittel werden dargestellt durch die folgende Formel I:
wobei R H oder eine Mono-, Di- oder Triphosphatgruppe ist; und B eine Nucleotidbase ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil und Inosin.
Beispiele für ein solches Vernetzungsmittel sind 2',3'-Adenosindialdehyd (AdA) und 2',3'-Adenosinmonophosphatdialdehyd (AMPdA).
Die Verbindung nach Formel I kann hergestellt werden durch Umsetzen eines Nucleosids oder eines Nucleotids der folgenden Formel II:
worin R und B die vorstehend für Formel I angegebenen Bedeutungen haben, mit einem Oxidationsmittel, z. B. einem Alkaliperjodat.
Das Immunogen kann bestehen aus den vollständigen modifizierten Tumorzellen, oder aus von solchen Zeilen stammenden Plasmamembranen, die im wesentlichen die Fähigkeit der modifizierten Tumorzellen, die Antitumor-Immunantwort zu induzieren, beibehalten.
Bevorzugt werden die modifizierten Tumorzellen nach der erfindungsgemäßen Behandlung Strahlung mit hoher Intensität ausgesetzt, um deren genetisches Material zu zerstören. Dies ist insbesondere von Bedeutung, wenn die vollständigen modifizierten Tumorzellen zur Immunisierung verwendet werden, und mag nicht unbedingt erforderlich sein, wenn das Immunogen aus Membranpräparationen besteht.
Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Immunogens, umfassend modifizierte Tumorzellen und/oder Membranen davon, und welches geeignet ist, eine Antitumor-Immunantwort zu induzieren, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellen von Tumorzellen,
(b) gleichzeitiges Aussetzen der Tumorzellen dem Vernetzungsmittel in einer Konzentration und während eines Zeitraums, welche ausreichen, um eine Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck im Bereich von etwa 1200-1400 atm, und
(c) Trennen der Tumorzellen und des Vernetzungsmittels.
Wenn das gewünschte Immunogen aus den vollständigen modifizierten Tumorzellen besteht, kann das Produkt des obigen Verfahrens per se verwendet werden, oder nach mehreren Reinigungsbehandlungen, die beispielsweise aus Zentrifugation und Entfernen der Überstände bestehen.
Wenn das gewünschte Immunogen aus Membranen der modifizierten Tumorzellen besteht, werden die modifizierten Tumorzellen einer weiteren Behandlung unterzogen, in der die Zellen aufgebrochen werden, z. B. durch Aussetzen einem hypotonischen Medium oder durch Beschallung, und danach werden die Membranfragmente gesammelt, z. B. durch Zentrifugation in einem Sucrosegradienten, wie allgemein an sich bekannt.
Das Immunogen kann nützlich sein zur Immunisierung von Krebspatienten gegen Tumoren, zur Herstellung einer Impfstoffzubereitung, oder es kann zur Sensibilisierung von Immunzellen in vitro verwendet werden. Für eine Immunisierung kann das Immunogen zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Adjuvans in einer ausreichenden Menge, um eine Antikrebs-Immunantwort zu erreichen, einem Patienten injiziert werden.
Für eine in vitro Sensibilisierung werden dem Patienten Immunzellen, d. h. Leucozyten oder Lymphozyten mittels an sich bekannter Mittel entnommen und danach zusammen mit dem Immunogen kultiviert, bis eine Population von solchen Immunzellen, die gegen das Immunogen reaktiv sind, erhalten wird. Die Population kann danach einem Krebspatienten reinjiziert werden, um seinen Tumor zu behandeln.
Gemäß einem weiteren ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung somit eine Impfstoff-Zusammensetzung bereit, welche das Immunogen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Obwohl die Immunisierung von Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines allogenen Immunogens durchgeführt werden kann, wird sie bevorzugt durchgeführt unter Verwendung eines autologen Immunogens, d. h. eines Immunogens, welches Tumorzellen des selben Patienten und/oder Membranen der Tumorzellen umfaßt: Die Verwendung eines autologen Immunogens bringt signifikante Vorteile mit sich, indem die auftretende Immunantwort vorwiegend gegen das Neoantigen des Tumors gerichtet ist, während bei Verwendung eines allogenen Immunogens die resultierende Immunantwort gegen alle nicht-selbst-Antigene eines derartigen Immunogens gerichtet sein wird. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung eines autologen Immunogens liegt darin, daß die mit einem spezifischen Tumor assoziierten Neoantigene von einem Patienten zu einem anderen verschieden sein können. Wenn eine autologe Zubereitung verwendet wird, umfaßt die Immunisierung eines Patienten die folgenden Schritte:
(a) Entnehmen eines Tumorgeschwulstes aus einem Patienten durch Biopsie oder Chirurgie,
(b) Dissoziieren intakter Tumorzellen durch mechanische oder enzymatische Mittel,
(c) Dispergieren der Tumorzellen in einem Medium,
(d) gleichzeitiges Aussetzen der Tumorzellen dem Vernetzungsmittel in einer Konzentration und während eines Zeitraums, welche ausreichen, um eine Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck im Bereich von etwa 1200-1400 atm,
(e) Entfernen des Vernetzungsmittels und Herstellen eines tumorspezifischen Immunogens, das die modifizierten Zellen und/oder Membranen davon umfaßt, und
(f) Injizieren dem Patienten das Immunogen, wodurch in dem Patienten eine Antitumor-Immunantwort induziert wird.
Wenn ein allogenes Immunogen verwendet wird, kann ein Immunogen verwendet werden, welches modifizierte Tumorzellen umfaßt, die aus einer definierten Tumorzellinie erhalten wurden.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf mehrere nicht-einschränkende Beispiele erläutert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Nachfolgend wird mitunter Bezug genommen auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 eine graphische Darstellung eines Experiments ist, in dem die Überlebensrate von Tumorzell-exponierten Mäusen nach Immunisierung mit einer der nachfolgenden Zubereitungen getestet wurde: EL4 Leukämiezellen, behandelt mit verschiedenen Werten von hydrostatischem Druck in der Gegenwart von 40 mM AdA (ausgefüllte Vierecke); EL4 Leukämiezellen, behandelt mit ansteigenden Werten von hydrostatischem Druck und danach mit 40 mM AdA (umrandete Vierecke); B16 Melanomzellen, behandelt mit verschiedenen Werten von hydrostatischem Druck in der Gegenwart von 40 mM AdA (ausgefüllte Kreise); und B16 Melanomzellen, behandelt mit hydrostatischem Druck und danach mit 40 mM AdA,
Fig. 2 die Überlebensrate von Tumorzell-exponierten Mäusen nach Immunisierung mit einer der nachfolgenden Zubereitungen zeigt: EL4 Leukämiezellen, behandelt während 10 min mit einem hydrostatischen Druck von 1350 atm in der Gegenwart von verschiedenen AdA-Konzentrationen (ausgefüllte Vierecke); in der gleichen Weise behandelte B16 Melanomzellen (ausgefüllte Kreise),
Fig. 3 eine dreidimensionale Darstellung der Antigenexpression auf der Plasmamembranoberfläche von B16-BL6 Melanomzellen zeigt, wie auf einem FACScan durch indirekte Immunofluoreszenz analysiert: A & B - negative Kontrollen (A - Autofluoreszenz, B - Zellen, reagiert nur mit sekundärem Antikörper); C - nichtmodifizierte Zellen; D & X - Zellen, die 20 mM AdA ausgesetzt worden waren, E & Z - Zellen, die während 15 min einem hydrostatischen Druck von 1200 atm ausgesetzt worden waren; F & Y - Zellen, die gleichzeitig sowohl 20 mM AdA als auch 1200 atm Druck ausgesetzt worden waren,
Fig. 4 die Wirkung (in Prozent positiver Zellen, die von der FACScan-Vorrichtung gezählt wurden, aus 10.000 Ereignissen) von abgestuften Werten des hydrostatischen Drucks (angelegt während 15 min) in Kombination mit einer konstanten Dosis von 20 mM AdA auf die Antigenexpression von B16-BL6 Melanomzellen zeigt: ausgefüllte Balken - Klasse I Antigen, graue Balken - B16 Antigen, und
Fig. 5 die Wirkung (in Prozent positiver Zellen, wie mit FACScan aus 10.000 Ereignissen bestimmt) von variierenden AdA-Konzentrationen in Kombination mit einem konstanten Wert des hydrostatischen Drucks (1200 atm, 15 min) auf die Antigenexpression von B16-BL6 Melanomzellen zeigt: schwarze Balken - MHC Klasse I Antigen, graue Balken - B16 Antigen.

BEISPIEL 1:

Materialien und Verfahren zur Modifizierung von Tumorzellen

Zellen:

Zellen aus einem EL4 Tumor, der eine chemisch induzierte T-Leukämie ist (Gorrer, 1961. In: Harris RJG, Herausgeber, Biological Approach to Cancer Chemotherapy. Academic Press, New York) wurden in Aszitenform in der Bauchhöhle von 6-8 Wochen alten weiblichen C57B1/6JMäusen gehalten. Es wurden etwa 105 Zellen i.p. geimpft und 10 Tage später wurden die Zellen (annähernd 5 · 10&sup8; Zellen pro Tier) geerntet.
Zellen von ARadLV136, was eine strahlungsinduzierte, Leukämie erzeugende Variante von ARadLV ist, wurden in vitro gehalten, wie früher beschrieben (Haran-Ghera et al., 1977, J. Immunol. 118 : 600).
BL6 Melanomzellen sind eine extrem invasive Variante der B16-Zellinie (Hart 1979, Am. J. Patholog. 97 : 587). Der B16-BL6 Tumor wurde in syngenen C57BI Mäusen seriell passagiert durch s.c. Impfung von 2-5 · 106 Zellen.

Adenosin-2',3'-dialdehyd (AdA):

AdA, der ein biologisch kompatibles chemisches Vernetzungsmittel ist, wurde synthestisiert mittels einer Modifikation des früher beschriebenen Verfahrens (Hansske et al., 1974, Bioorg. Chem. 3 : 367): Adenosin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und Natriummetaperjodat (Fluka Chemie AG, Buchs. BRD) wurden in 100 ml wässriger Lösung auf eine Endkonzentration von 10 mM jeder dieser Substanzen gemischt, 1 h im Dunkeln gerührt und mit Eiswasser gekühlt, und danach bei 30ºC unter Vakuum auf 5 ml eingeengt. Das resultierende Konzentrat wurde danach 12 h bei 4ºC inkubiert und das kristalline Produkt, das erhalten worden war, wurde abgetrennt und in Dünnschichtchromatographie (Silikagel G Platte, 0,2 mm Dicke, Merck Darmstadt, Lauflösungsmittel Acetonitril/Wasser 4 : 1 v/v, RF 0,80) für homogen befunden. Die Kristalle wurden abfiltriert, drei Mal mit kaltem Wasser gewaschen und in Vakuum (12 mm Hg, 1,6 kPa) über Silikagel getrocknet.
Es wurde festgestellt, daß das obige Herstellungsverfahren eine Ausbeute von annähernd 90% ergab. Das erhaltene Produkt hatte einen Schmelzpunkt von 110ºC und das Schmelzen war von Zersetzung begleitet, was mit früheren Berichten (Hansske et al., 1974, supra) übereinstimmt.

Modifizierung von Tumorzellen:

Nach dem Ernten wurden die Zellen zwei Mal mit PBS (pH 7,4) gewaschen und danach einer der folgenden Modifizierungsbehandlungen unterzogen. Die Lebensfähigkeit der modifizierten Tumorzellen wurde durch Ausschluß des Farbstoffs Trypanblau getestet.

Modifizierung I: Vernetzen von Proteinen auf der Tumorzell-Oberfläche

Etwa 10&sup8; Zellen/ml wurden in einem 50 ml Röhrchen (Falcon, Becton Dickinson Labware, N. J.), das eine 0,5% AdA enthaltende PBS-Lösung enthielt, angeimpft, und wurden in dieser Lösung unter gelegentlichem Mischen 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundener AdA wurde durch drei Runden Zentrifugation bei 1500 UpM für 5 min, gefolgt von sanfter Resuspendierung des Pellets in PBS, entfernt (bei der letzten Resuspendierung wurde PBS zugegeben um eine gewünschte Zellkonzentration zu erhalten).

Modifizierung II: Anwendung von hydrostatischem Druck

Diese Modifizierung wurde in einer ähnlichen Weise, wie früher beschrieben (Richert et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 22 : 119), ausgeführt. Zellen wurden in einer Konzentration von 10&sup8; Zellen/ml in einem mit Deckel versehenen und bis zum Rand gefüllten Eppendorf Kunststoffröhrchen (1,5 ml, Netheler und Hinz GmbH, Hamburg, BRD) in PBS dispergiert. Eine 0,5 Zoll (1,27 cm) 18G Nadel wurde durch den Deckel eingeführt und diente als ein Ventil zum Druckausgleich. Sowohl die Nadel als auch das Röhrchen waren mit PBS gefüllt und der Deckel wurde herunter gedrückt ohne Luftblasen einzuschließen (Entfernung aller Luftblasen ist wichtig, da diese beim Druckablassen ein Aufbrechen von Zellen verursachen können). Die Röhrchen wurden dann in eine Druckkammer (Aminco, American Instruments Co., MD) mit einer Kapazität von 40 ml gegeben, sie wurde mit PBS gefüllt und verschlossen.
Druck wurde allmählich angelegt, so daß innerhalb von 7-8 min ein Wert von etwa 1200 atm erreicht wurde, und dieser Druck wurde etwa 15 min gehalten. Danach wurde die Druckkammer entriegelt und innerhalb von 8-10 min nach und nach auf Umgebungsdruck dekomprimieren gelassen. Die Zellen wurden dann in ein 50 ml Röhrchen in 10 ml PBS transferiert und 5 min bei 1500 UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde danach in PBS sanft auf die gewünschte Konzentration resuspendiert.

Modifizierung III: hydrostatischer Druck und Vernetzen nacheinander

Mittels der zwei vorstehend ausgeführten Modifizierungsverfahren wurden Zellen unter Druck gesetzt und unmittelbar danach vernetzt.

Modifizierung IV: hydrostatischer Druck und Vernetzen gleichzeitig

Bei dieser Modifizierung, welche die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführte ist, wurden die Zellen gleichzeitig mittels der zwei vorstehend beschriebenen Modifizierungsverfahren unter Druck gesetzt und vernetzt.

BEISPIEL 2

Die Lebensfähigkeit von C57BI Mäusen, die nach Vorbehandlung mit verschiedenen immunogenen Zubereitungen einer Exposition von 10&sup5; unbehandelten lebensfähigen Tumorzellen ausgesetzt wurden, wurde getestet. Die Überlebensrate nach der Exposition wurde am Tag 30 bewertet.
Die Vorbehandlung bestand aus zwei Impfungen, eine drei Wochen und die andere eine Woche vor der Exposition, mit einer immunogenen Zubereitung, welche aus Zellen bestand, die einer der folgenden Modifizierungsbehandlungen ausgesetzt worden waren: Aussetzen an AdA, Anlegen von hydrostatischem Druck oder einer Kombination der zwei, mittels der vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Modifizierungsverfahren.
Die zur Impfung verwendeten Zellen waren vom gleichen Typ wie die bei der Exposition der Mäuse verwendeten Zellen.
Die in diesem Experiment verwendeten Zellen waren entweder EL-4 oder BL6.

Test Nr. 1

Es wurden vier Gruppen von Mäusen verwendet, die jeweils mit einer der folgenden Zubereitungen vorbehandelt worden waren:
Gruppe 1: EL-4 Leukämiezellen, behandelt während 10 min mit verschiedenen Werten von hydrostatischem Druck, in der Gegenwart von 40 mM AdA,
Gruppe 2: EL-4 Leukämiezellen, behandelt während 10 min mit verschiedenen Werten von hydrostatischem Druck, und danach mit 40 mM AdA,
Gruppe 3: B16 Melanomzellen, behandelt wie Gruppe 1,
Gruppe 4: B16 Melanomzellen, behandelt wie Gruppe 2.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt (jeder Punkt stellt einen Mittelwert aus 10 Tieren dar): Gruppe 1 - ausgefüllte Vierecke, Gruppe 2 - umrandete Vierecke, Gruppe 3 - ausgefüllte Kreise, Gruppe 4 - umrandete Kreise.
Die Ergebnisse zeigen, daß die maximale Überlebensfähigkeit erhalten wurde bei Impfung mit einer immunogenen Zubereitung, die einem hydrostatischen Druck von 1200 bis 1400 ausgesetzt worden war, und überraschenderweise wurden deutlich schlechtere Ergebnisse erhalten bei Aussetzen einem hydrostatischen Druck von 1500 atm. Weiterhin zeigen diese Ergebnisse, das ein gleichzeitiges Aussetzen sowohl einem hydrostatischen Druck als auch an AdA zu einer höheren Überlebensfähigkeit der Mäuse führt, als diese zwei Behandlungen nacheinander.

Test Nr. 2

Mehrere Gruppen von C57BI Mäusen (10 Mäuse in jeder Gruppe) wurden mit einer der folgenden Zubereitungen vorbehandelt:
Behandlung 1: EL-4 Leukämiezellen, behandelt während 10 Minuten mit hydrostatischem Druck von 1350 atm, in der Gegenwart von verschiedenen ansteigenden AdA-Konzentrationen,
Behandlung 2: B16 Melanomzellen, behandelt wie in Behandlung 1,
Behandlung 3: B16 Melanomzellen behandelt während 10 min mit hydrostatischem Druck von 1350 atm, in der Gegenwart von verschiedenen AMPdA- Konzentrationen.
Die Ergebnisse der Experimente in bezug auf Behandlung 1 und Behandlung 2 sind in Fig. 2 gezeigt (jeder Punkt stellt einen Mittelwert aus 10 Tieren dar): Behandlung 1 - ausgefüllte Vierecke, Behandlung 2 - ausgefüllte Kreise. Die Ergebnisse von Behandlung 3 sind nicht gezeigt. In den Experimenten von Fig. 2 wurde die maximale Überlebensrate mit einer AdA- oder AMPdA-Konzentration oberhalb von 30 mM erhalten.

Test Nr. 3

Fünf Gruppen von C57BI Mäusen (6 Mäuse in jeder Gruppe) wurden subkutan immunisiert und danach einer Exposition von B16-BL6 Zellen ausgesetzt. Die zur Immunisierung verwendete Zubereitung bestand aus Plasmamembranen, welche aus unbehandelten oder behandelten Zellen durch diskontinuierliche Sucrosegradientenzentrifugation (Maeda et al., 1983, Biochim. Biophys. Acta 731 : 115) isoliert worden waren. Einzelheiten der Immunisierungszubereitungen sind in Tabelle 1 angegeben.
Die folgenden Parameter wurden für jede Gruppe von Tieren untersucht: Überlebensrate, mittlerer Tumordurchmesser, gemessen unter Verwendung von Standardtastvorrichtungen in drei senkrechten Richtungen und dargestellt als Mittelwert, metastatische Knoten in Lungen, aufgenommen nach Entfernung der Lungen und Fixierung mit Bouin's Fixierer und danach Waschen mit 70 Ethanol. Die Ergebnisse dieses Experiments sind ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Wirkung von Modifizierung auf die Immunogenität von B16-BL6 Melanom-Membranen
* Alle Modifizierungen von B16-BL6 Melanom bestanden aus gleichzeitiger Behandlung von Tumorzellen mit 40 mM AdA und 1350 atm hydrostatischem Druck.
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Immunisierung mit einer Immunisierungszubereitung, die aus Plasmamembranen bestand, welche erfindungsgemäß aus durch Druck und AdA behandelten B16-BL6 Zellen isoliert worden waren (Behandlungen 4 und 5), eine sehr hohe Überlebensrate erbrachte, wobei der mittlere Tumordurchmesser minimal war und keine metastatischen Knoten in den Lungen beobachtet wurden.
Diese Ergebnisse beweisen die unerwartet hohe Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Impfbehandlung.

BEISPIEL 3

Die Gegenwart von MHC Klasse I-Antigenen (H-2kb) und des tumorspezifischen retroviralen Antigens auf B16-BL6 Melanomzellen, die aus s.c. Tumoren direkt, oder nach dem Erhalt von Einzelzellsuspensionen oder Passagieren der Zellen in Kultur 6-8 Mal über einen Zeitraum von 3-4 Wochen stammten, wurde mittels Durchflußzytometrie analysiert.
In einem ersten Schritt wurden etwa 10&sup6; modifizierte oder nicht-modifizierte B16-BL6 Tumorzellen mit unmarkierten Primärantikörpern inkubiert: 30 ul (25 ug) monoklonaler anti-Klasse I-Antikörper (Klon 28-8-6, erhalten von Dr. D. Sachs, National Cancer Institute, U. S. A.) oder 10 ul (8 ug) monoklonaler Antikörper gegen ein retrovirales Antigen auf der Oberfläche von B16 Zellen (MM2.9B6, Leong et al., 1988, Cancer Res. 48 : 4954) in einem Endvolumen von 50 ul, enthaltend 1% FCS (fötales Kälberserum, fetal calf serum) und 0,01% Natriumazid, und die Inkubation erfolgte während 45 Minuten bei 4ºC. Zellen wurden zwei Mal in HBS (Hepes-gepufferte Salzlösung, hepes buffered sahne) gewaschen und das Pellet wurde in einer Lösung von markiertem Sekundärantikörper resuspendiert: 50 ul einer Lösung, enthaltend 40 ug des F(ab')2- Fragments von FITC-GAMIG (Fluoresceinisothiocyanat-markierter anti-Maus IgG aus Ziege) in HBS mit 1% FCS und 0,1% Natriumazid, und die Inkubation erfolgte während weiterer 45 Minuten bei 4ºC im Dunkeln. Danach wurden die Zellen wie zuvor gewaschen und 20 Minuten in 1% frisch zubereitetem Paraformaldehyd fixiert. Fixierte Zellen wurden drei Mal in HBS gewaschen, in 0,5 ml HBS resuspendiert und vor Durchflußzytometrie-Analyse durch ein 100u Nylonnetz geführt. Proben wurden nicht länger als 24 Stunden bei 4ºC im Dunkeln gelagert, da Proben, die länger gelagert worden waren, eine höhere Autofluoreszenz ergaben.
B16-BL6 Zellen, die nicht umgesetzt worden waren, und B16-BL6 Zellen, die direkt mit FITC-GAMIG umgesetzt worden waren, und 2% BSA (Rinderserumalbumin, bovine serum albumin) dienten als negative Kontrollen. Modifizierte sowie nicht-modifizierte Zellen wurden markiert und entweder auf einem FACS 440 (Becton-Dickinson, Mountainview, CA) oder der FACScan-Vorrichtung (Becton-Dickinson) analysiert. Populationen, die bei Zwei-Parameter-Analyse (Vorwärts- und orthogonale Lichtstreuung) als positiv ermittelt wurden, wurden gegattert und Daten wurden an live- Gattern gesammelt. Histogramme wurden erzeugt unter Verwendung von entweder Consort 40 Software auf FACS 440 oder Consort 30 mit LYSYS Software, erhältlich mit FACScan. Geeignete Kontrollen wurden eingeführt, um logische Schwellenwerte anzuwenden. Amelanotische Zellen, die in der Population auftraten, wurden in der vorliegenden Analyse durch Lichtstreuungs-Gattern ausgegattert. Annähernd 10.000 Ereignisse wurden in jeder Probe getestet.
Aussetzen an AdA oder hydrostatischen Druck wurde in einer ähnlichen Weise, wie der in Beispiel 1 beschriebenen, durchgeführt.
Wie aus Fig. 3 ersichtlich, wurde eine maximale Expression von sowohl Klasse I- als auch Melanom-spezifischem Antigen festgestellt bei B16-BL6 Zellen, welche durch 1.200 Atmosphären hydrostatischen Druck und gleichzeitiges Vernetzen mit 20 mM AdA modifiziert worden waren.
In einer anderen Versuchsreihe wurden B16-BL6 Zellen einem hydrostatischen Druck im Bereich von 600-1.200 atm und einer konstanten AdA-Konzentration von 20 mM ausgesetzt, und die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. In einem weiteren Experiment wurden B16-BL6 Zellen einem konstanten Wert des hydrostatischen Drucks von 1.200 atm ausgesetzt, während Inkubation mit AdA in Konzentrationen von 0,002 mM bis 20 mM erfolgte, und die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Wie in diesen Figuren erkannt werden kann, wurde eine maximale Fluoreszenzintensität für sowohl Klasse I-Antigen als auch B16-BL6 Tumorantigen für eine Kombination eines hohen Druckwerts (1.200 atm) und der höchsten AdA-Konzentration in der Konzentrationsreihe, 20 mM, beobachtet.

BEISPIEL 4

Die Immunogenität von autologen Tumorzellen, welche durch ein gleichzeitiges Druck- Vernetzungs-Verfahren modifiziert worden waren, wurde in fünf Krebspatienten unter Verwendung des Tests vom verzögerten Hypersensitivitätstyp (DTH, delayed type hypersensitivity) getestet.
Von jedem der fünf Krebspatienten wurden Tumorzellen isoliert und wurden während 15 min einem hydrostatischen Druck von 1.200 atm in der Gegenwart von 20 mM AdA, gemäß "Modifizierung IV" in Beispiel 1, ausgesetzt. Die Zellen wurden danach mit einer Dosis von 10.000 rad bestrahlt, wonach sie ihr Proliferierungspotential verloren, aber immunogen blieben.
10&sup6; modifizierte und bestrahlte autologe Tumorzellen (d. h. Zellen, die von dem patienteneigenen Tumor stammen) wurden danach intradermal (i.d.) injiziert. Eine durch die injizierten Zellen ausgelöste Immunreaktion war aufgrund eines angeschwollenen roten Bereichs, der in der Haut an der Impfstelle auftrat, in den Patienten offensichtlich.
Das Ausmaß der Hautreaktion der Patienten wurde anhand von Durchmesser des Erythems (Rötung) und Verhärtung (Schwellung) bestimmt (nach der Methode von Skornick et al., Cancer Immunot Immunother, 11, 93, 1981; eine Kopie dieser Literaturstelle ist hieran beigefügt und mit "C" gekennzeichnet). Die Hautreaktion wurde mit einer Bewertung von "-", "+", "++" oder "+++" ausgedrückt, wobei "-" auf keine Reaktion hinweist und "+++" auf die maximale Reaktion hinweist. Eine Standard- Maximalreaktion wurde erhalten, indem Personen mit einer Anamnese einer Tuberkuloseinfektion oder einer früheren Tuberkuloseimpfung Tuberculin (ein Lipoprotein von Mycobacterium tuberculosis) injiziert wurde.
Die DTH-Reaktion wurde 24, 36, 48 und 72 Stunden nach der Impfung mit den Zellen überprüft. Das Reaktionsmaximum wurde üblicherweise 24 bis 48 Stunden nach dem Impfen beobachtet.
Die Ergebnisse wurden mit Kontrollergebnissen verglichen, welche erhalten wurden mittels Injektion von autologen, bestrahlten aber unmodifizierten Zellen nach der gleichen Vorgehensweise. Diese Kontrollzellen wurden dem Patienten am selben Tag an einer benachbarten Stelle injiziert.
Die Hautreaktion wurde bewertet wie vorstehend beschrieben durch Messen des Durchmessers des Erythems und des Verhärtungsgrades zu verschiedenen Zeitintervallen nach den Injektionen, und die mit den fünf Krebspatienten erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt: Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen, daß die Injektion der modifizierten Zellen in allen Patienten zu einer sehr starken Immunreaktion (++ bis +++) führte, während nicht-behandelte Zellen eine minimale DTH-Reaktion (- oder ±) hervorrufen. Die maximale Reaktion trat 36-48 Stunden nach der Injektion der Zellen auf, in Übereinstimmung mit dem erwarteten Verlauf der DTH-Reaktion.

Claims

1. Immunogen, das modifizierte Tumorzellen oder daraus erhaltene Plasmamembranen umfaßt, und geeignet ist, eine Anti-Tumor-Immunantwort zu induzieren, wobei die modifizierten Tumorzellen dadurch hergestellt werden, daß Tumorzellen gleichzeitig der Wirkung eines Vernetzungsmittels, wobei das Vernetzungsmittel ein 2',3'-Nucleosid- oder Nucleotiddialdehyd ist, in einer Konzentration und während eines Zeitraums, welche ausreichen, um die Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck von ungefähr 1200 bis 1400 Atmosphären ausgesetzt werden.

2. Immunogen nach Anspruch 1, wobei die modifizierten Tumorzellen dadurch hergestellt werden, daß Tumorzellen gleichzeitig dem hydrostatischen Druck und einem Vernetzungsmittel ausgesetzt werden, das durch die folgende Formel (I) dargestellt ist:

wobei R H oder eine Mono-, Di- oder Triphosphatgruppe ist; und B eine Nucleotidbase ist, die aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil und Inosin, ausgewählt wird.

3. Immunogen nach Anspruch 2, wobei das Vernetzungsmittel 2',3'- Adenosindialdehyd oder 2',3'-Adenosinmonophosphatdialdehyd ist.

4. Immunogen nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel in einer Konzentration von 20 mM oder höher vorliegt.

5. Verfahren zum Herstellen von modifizierten Tumorzellen nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen von Tumorzellen;

(b) gleichzeitiges Aussetzen der Tumorzellen der Wirkung eines Vernetzungsmittels, wobei das Vernetzungsmittel ein 2',3'-Nucleosid- oder Nucleotiddialdehyd ist, in einer Konzentration und für einen Zeitraum, welche ausreichen, um die Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck von ungefähr 1200 bis 1400 Atmosphären;

(c) Trennen der Tumorzellen und des Vernetzungsmittels und wahlweise Reinigen der so erhaltenen modifizierten Tumorzellen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Vernetzungsmittel in einer Konzentration von 20 mM oder höher vorliegt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, in welchem die modifizierten Zellen aufgebrochen werden, gefolgt vom Sammeln der Plasmamembranfragmente.

8. In vitro-Verfahren zum Sensibilisieren von Immunzellen, um Tumorzellen anzugreifen, umfassend das Entnehmen von Immunzellen von einem Patienten und das Kultivieren dieser Immunzellen mit einem Tumorimmunogen, das modifizierte Tumorzellen oder daraus erhaltene Plasmamembranen umfaßt und geeignet ist, eine Anti-Tumor- Immunantwort zu induzieren, wobei die modifizierten Tumorzellen dadurch hergestellt werden, daß Tumorzellen einem Vernetzungsmittel, welches ein 2',3'-Nucleosid- oder Nucleotiddialdehyd ist, in einer Konzentration und während eines Zeitraums ausgesetzt werden, welche ausreichen, um die Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, wobei das Kultivieren während eines Zeitraums durchgeführt wird, der ausreicht, um eine Kultur der Immunzellen zu erhalten, die gegen das Immunogen reaktionsfähig sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, in welchem das 2',3'-Nucleosid oder Nucleotiddialdehyd Vernetzungsmittel durch die folgende Formel (I) dargestellt ist:

wobei R H oder eine Mono-, Di- oder Triphosphatgruppe ist; und B eine Base ist, die aus der Gruppe, bestehend aus Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil und Inosin, ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Vernetzungsmittel 2',3'-Adenosindialdehyd oder 2',3'-Adenosinmonophosphatdialdehyd ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das Vernetzungsmittel in einer Konzentration von 20 mM oder höher vorliegt.

12. Impfstoffzubereitung, die geeignet ist, eine Anti-Tumor-Immunantwort zu induzieren, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine wirksame Menge einer immunogenen Zubereitung, welche modifizierte Tumorzellen oder daraus erhaltene Plasmamembranen umfaßt, wobei die modifizierten Tumorzellen dadurch hergestellt werden, daß Tumorzellen gleichzeitig der Wirkung eines Vernetzungsmittels, wobei das Vernetzungsmittel ein 2',3'-Nucleosid- oder Nucleotiddialdehyd ist, in einer Konzentration und während eines Zeitraums, welche ausreichen, um die Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck von ungefähr 1200 bis 1400 Atmosphären ausgesetzt werden.

13. Verwendung einer immunogenen Zubereitung, die modifizierte Tumorzellen oder daraus erhaltene Plasmamembranen umfaßt, wobei die modifizierten Tumorzellen dadurch hergestellt werden, daß Tumorzellen gleichzeitig der Wirkung eines Vernetzungsmittels, wobei das Vernetzungsmittel ein 2',3'-Nucleosid- oder Nucleotiddialdehyd ist, in einer Konzentration und während eines Zeitraums, welche ausreichen, um die Vernetzung von Proteinen in den Plasmamembranen der Zellen zu bewirken, und einem hydrostatischen Druck von ungefähr 1200 bis 1400 Atmosphären ausgesetzt werden, für die Herstellung einer Impfstoffzubereitung für die Behandlung von Tumoren.