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1. Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein neues Antikrebsmittel mit starker antineoplastischer
Wirkung ohne systemische Toxizität
oder Mutagenität.
Darüber
hinaus zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine höhere Spezifität gegenüber Krebszellzielen
als bisher bekannte Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine Verbindung
der vorliegenden Erfindung als aktives Mittel umfassen. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung neue Derivate von 1-Aryl-3-(2-chloralkanyl)harnstoffen
mit Substituenten am ersten Kohlenstoffatom des 2-Chloralkanylrests.
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2. Stand der Technik
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Einige
1-Aryl-3-(2-chloralkanyl)harnstoffderivate (hiernach als „CAUs" bezeichnet) sind
aus den US-Patenten 5,530,026 und 5,750,547, die den selben Anmelder
wie die vorliegende Anmeldung haben, bekannt. Insbesondere sind
Verbindungen der folgenden Formel bekannt:
worin R verschiedene Substituenten
an dem Phenylring betrifft.
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Es
ist bekannt, dass CAUs eine Affinität gegenüber Krebszellen zeigen, die
Zellwand durchdringen und eine milde alkylierende Wirkung auf die
Zellbestandteile bereitstellen, wodurch die krankmachende Zelle abgetötet wird.
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Ein
Ziel der Erfindung ist es, neue CAU-Derivate mit deutlich besserer
antineoplastischer Aktivität
gegenüber
bekannten CAUs bereitzustellen, während sie geringe systemische
Toxizität,
Mutagenität
und Nebenwirkungen beibehalten.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wurde nunmehr entgegen den Erwartungen und dokumentierten Beispielen
festgestellt, dass spezielle Substitutionen am ersten Kohlenstoffatom
der 2-Chlorethylgruppe des CAU-Moleküls eine deutliche Verbesserung
der Antikrebswirkung des resultierenden CAUs bereitstellen.
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Darüber hinaus
wurde festgestellt, dass bisher unbekannte Substitutionen am Phenylring
das resultierende CAU-Molekül
sogar noch wirksamer beim Bekämpfen
spezifischer Bereiche krebsartiger Zellen machen, wodurch ihre Spezifität gegenüber verschiedenen
zellartigen Proteinen als Schlüssel
für das
Zellüberleben
verbessert wird.
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Insbesondere
stellt diese Erfindung eine neue Klasse von CAU-Derivaten bereit.
Diese neue Klasse kann durch die folgende Formel ausgedrückt werden:
worin
R
1 Alkyl
(1 bis 6 Kohlenstoffatome) oder H ist;
R
2 Alkyl
(1 bis 6 Kohlenstoffatome) ist;
R
3 und
R
4 wie in Anspruch 1 definiert sind;
R
5 H ist.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Modifizierung des 2-Chloralkanylrests
(R1- und R2-Gruppen)
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Experimente,
um die biopharmazeutischen Eigenschaften bekannter 1-Aryl-3-(2-chlorethyl)harnstoffe (CAUs)
zu bestimmen, haben unerwarteterweise gezeigt, dass bestimmte Zellenzyme,
wie z.B. die Cytochrome P450 1A2 und 2E1
CAUs oxidieren und sie daher zu iner ten Molekülen metabolisieren und ihnen
die Antikrebswirkung entziehen. Es wurde wiederum unerwarteterweise
festgestellt, dass der Metabolisierungsmechanismus am ersten Kohlenstoffatom
des 2-Chloralkylrests benachbart zum Harnstoffrest wirkt.
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Z.B.
trat im Falle eines 4-tert.-Butyl-CAU (tBCAU) die Metabolisierung
entlang des folgenden Weges auf:
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Überraschenderweise
hat dies einen metabolischen Schwachpunkt am ersten Kohlenstoffatom
des 2-Chloralkanylrests des CAUs dargelegt. Die vorliegende Erfindung
zielt daher im Allge meinen darauf, Schutzgruppen an diesem ersten
Kohlenstoffatom bereitzustellen und neue CAU-Derivate mit starker antineoplastischer
Wirkung bereitzustellen.
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Insbesondere
wurde der Schutz des schwachen Kohlenstoffatoms vor der Metabolisierung
durch Substituieren des Kohlenstoffatoms durch Gruppen, wie z.B.
niedere Alkylgruppen, wie z.B. Methyl, Ethyl und Propyl, erreicht.
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Modifizierung der R3- und R4-Reste
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Des
Weiteren wurde überraschenderweise
festgestellt, dass bestimmte Modifikationen der Substituenten am
Arylrest die Spezifität
der resultierenden CAU-Derivate gegenüber unterschiedlichen Zellproteinen, die
den Schlüssel
für das
Zellüberleben
darstellen, dramatisch verbessern.
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Die
folgenden Verbindungen wurden daher entwickelt und werden durch
die allgemeine Formel ausgedrückt:
worin
R
1 H,
C
1-C
6-Alkyl ist;
R
2 C
1-C
6-Alkyl
ist;
R
3 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus H, Halogenid, C
1-C
7-Alkyl,
C
1-C
7-Alkoxy, C
1-C
7-Hydroxyalkyl, C
1-C
7-Aminoalkyl, C
1-C
6-Thioalkyl, C
1-C
7-Cyanoalkyl, C
1-C
7-Halogenalkyl und C
3-C
7-Cycloalkyl;
R
4 ausgewählt ist
aus der Gruppe, bestehend aus Halogenid, C
1-C
7-Alkyl, C
1-C
7-Alkoxy, C
1-C
7-Hydroxyalkyl, C
1-C
7-Aminoalkyl,
C
1-C
6-Thioalkyl,
C
1-C
7-Cyanoalkyl,
C
1-C
7-Halogenalkyl,
C
3-C
7-Cycloalkyl;
oder R
3 und
R
4 eine alicyclische Gruppe der folgenden
Struktur bilden
worin n = 1 ist (R
5 ist gezeigt, um deutlich anzugeben, dass
die kondensierte alicyclische Gruppe an den 3- und 4-Positionen
des Phenylrings angebracht ist); und
R
5 H
ist.
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Herstellung von CAU-Derivaten
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden leicht in guten Ausbeuten
ohne begleitende Polymerisation oder Zersetzung hergestellt. Die
Verbindungen können
auch leicht durch übliche
Verfahren, wie z.B. Kristallisation oder Flüssigchromatographie, gereinigt
werden. Des Weiteren zeigen die Verbindungen eine verbesserte Haltbarkeit
ohne Zersetzung an der Luft.
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Die
Art und das Niveau der Aktivität
für eine
gegebene Dosierung einer jeden Verbindung kann herkömmlicherweise
durch Routineexperimente unter Verwendung wohlbekannter pharmakologischer
Protokolle bestimmt werden.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung scheinen Krebstumorzellen
durch Alkylierung ihres β-Tubulins
an einem spezifischen Cysteinrest (Cyst-239) und auch durch andere
Mechanismen, die untersucht werden, zu töten. Die molekulare Struktur
des β-Tubulins
wurde über
die Evolution stark bewahrt und liegt daher in vielen Säugetierzellen
vor. Folglich sind die Verbindungen der Erfindung angezeigt für: weit
reichende Antikrebsmittel, transdermal für die präoperative Behandlung von Melanomen
und systemisch für
andere Krebsarten.
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Prodrogen
der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch leicht hergestellt
werden. Als ein Beispiel für
Prodrogen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden die
Sulfone und Sulfoxidderivate der Alkylthiosubstituenten unmittelbar
durch den geübten
Fachmann in Erwägung
gezogen. Während die
Sulfon- und Sulfoxidderivate allgemein nicht aktiv sind, werden
sie aktiviert, sobald sie einem Patienten verabreicht werden. Die
Aktivierung tritt auf, wenn die Prodroge reduziert wird, um das
entsprechende Alkylthio, eine aktive Verbindung, zu ergeben.
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Das
folgende Syntheseflussdiagramm zeigt eine Route zur Herstellung
von CAU-Derivaten der vorliegenden Erfindung.
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Es
ist wichtig anzumerken, dass die Herstellung von CAU-Derivaten der
vorliegenden Erfindung zu der Bildung von R- und S-Isomeren geführt hat,
die (in einigen Fällen)
deutliche Unterschiede in der cytotoxischen Aktivität (siehe
Tabellen I und II unten) zeigen.
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BEISPIELE
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Herstellung von N-(4-Alkylphenyl)-N'-(1-alkyl-2-hydroxy)ethylharnstoffen
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Diese
Verbindungen wurden gemäß der oben
dargestellten allgemeinen Syntheseroute hergestellt.
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Zu
einer gerührten
Lösung
aus Di-tert.-butyldicarbonat (3,9 mmol) and 4-Dimethylaminopyridin
(0,4 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 ml) wurde tropfenweise
das relevante Anilin (auch 2-Aminofluorenyl, 2-Aminonaphthyl, etc.
Derivative) (3,7 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über 30 min
bei Raumtemperatur gerührt
und der erforderliche (R)- oder (S)-Aminoalkohol wurde tropfenweise
zugegeben. Die Mischung wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, und das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie
auf Silicagel (Dichlormethan/Ethylacetat, 20/80) gereinigt, um den
Hydroxyharnstoff als einen farblosen Feststoff zu ergeben.
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Halogenierung von N-(4-Alkylphenyl)-N'-(1-alkyl-2-hydroxy)ethylharnstoffen
zu N-(4-Alkylphenyl)-N'-(1-alkyl-2-chlor)ethylharnstoffen
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Eine
Lösung
des relevanten Hydroxyharnstoffs (2,4 mmol) und Triphenylphosphin
(3,7 mmol) in einer Mischung aus Dichlormethan und Kohlenstofftetrachlorid
(20:6) wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck entfernt, und das Rohprodukt wurde
durch Flash-Chromatographie auf Silicagel (Ethylether/Petrolether,
50/50) gereinigt, um den Chlorethylharnstoff als einen weißen Feststoff
zu ergeben.
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Von
Bedeutung ist, dass die R1- oder/und R2-substituierten CAUs auch auf mehreren synthetischen Routen
hergestellt werden können.
Ein Fachmann wird dies schnell erkennen.
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BEISPIEL 1: Evaluierung
der cytotoxischen Aktivität
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Verbindungen,
die gemäß dem oben
dargestellten Verfahren hergestellt wurden, wurden synthetisiert und
auf ihre cytotoxische Aktivität überprüft. Die
molekulare Struktur eines jeden von ihnen wurde durch IR-, NMR-
und Massenspektroskopie überprüft.
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Tabelle
1, unten, stellt die Evaluierung der in vitro cytotoxischen Aktivitäten unterschiedlicher
Verbindungen, die gemäß der oben
dargestellten Synthese hergestellt wurden, und in denen R3 und R5 H sind,
bereit.
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Das
herkömmliche
Evaluierungsverfahren, das durch das American National Cancer Institute
vorgeschlagen wurde, wurde verwendet. Das Verfahren misst die Effektivität eines
Antikrebsmittels, basierend auf dem IC50-Wert,
der die Arzneimittelkonzentration in μM darstellt, bei der das Arzneimittel
die Inhibierung der Proliferation einer gegebenen Krebszelllinie
um den Faktor einhalb erreicht, verglichen mit der normalen Proliferation
der selben Krebszelllinie in dem selben Wachstumsmedium.
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Cytotoxische Untersuchung:
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CAUs
wurden mit verschiedenen Zelllinien, einschließlich menschlichen, nicht hormonabhängigen Brustkrebszellen
(MDA-MB-231) und Mausleukämie
(L1210), untersucht. MDA-MB-231. Diese Zelllinien wurden von der
American Type Culture Collection (Bethesda, MD, USA) erhalten. Die
Cytotoxizität
der CAU-Derivate wurde untersucht und mit der Wirkung von Chlorambucil
und Carmustin verglichen.
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Die
Tumorzellen wurden in RPMI-1640-Medium gezüchtet, unterstützt mit
10%-igem Rinderfötenserum,
2 mM Glutamin und 64 U/ml Gentamycin. Die Zellen wurden bei 90%
Konfluenz routinemäßig passagiert.
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5000
Zellen (100 μl)
wurden in 96 Well-Platten eingesetzt und für 1 Tag bei 37°C unter befeuchteter Atmosphäre in Gegenwart
von 5% CO2 bebrütet. Anschließend wurden
100 μl frisches
Medium, das CAU enthält,
zu den Kulturen dazugegeben, um die endgültigen Konzentrationen im Bereich
von 1 bis 200 μM
zu erhalten. Die CAUs wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; Aldrich
Chemicals Company Inc., Milwaukee, WI) aufgelöst, das bei 0,5 Vol.-% gehalten
wurde. Die Zellen wurden für
4 bis 5 Tage in Gegenwart der Arzneimittel bebrütet.
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Das Überleben
der Zellen wurde durch colorimetrische Untersuchung unter Verwendung
von MTT evaluiert, gemäß einer
Modifizierung des Verfahrens, das durch Carmichael und Kollegen
[J. Carmichael, W.G. De Graff, A.F. Gazdar, I.D. Minna, J.B. Mitchell
(1987, Cancer Res. 47, Seiten 936 bis 942] berichtet wurde. Kurz
gesagt wurde das Kulturmedium durch 50 μl einer Lösung, die MTT (1,0 mg/ml in
PBS: RPMI-1640 (1:4)) enthält,
ersetzt. Das MTT wird durch mitochondrische Dehydrogenase reduziert,
um MTT-Formazan zu bilden. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurden
die Wells mit 200 μl
Salzlösung
gewaschen und 100 μl
DMSO, das 0,5 Vol.-% einer Glycerinlösung 0,1 M bei pH 11 (NaOH)
enthält,
zugegeben, um den Niederschlag aufzulösen. Die Platten wurden dann über 15 min
geschüttelt
und die Absorption bei 570 nm mit einem Behring Elisa Processor
II (Behring, Marburg, Deutschland) gemessen.
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Die
Evaluierung wurde mit 2 typischen Krebszelllinien, nämlich L1210
(Mausleukämiezellen)
und MDA-MB-231 (menschliche Brustkrebszellen) durchgeführt. Ein
Vergleich mit herkömmlichen
Antikrebsarzneimitteln Chlorambucil und Carmustin wird bereitgestellt,
um die Effektivität
der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu zeigen.
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Tabelle
I In
vitro cytotoxische Aktivität
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Anmerkung:
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- *S und *R beziehen sich auf die Isomerenformen des Kohlenstoffs,
an dem sowohl R1 und R2 angebracht
sind.
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Verbindungen,
in denen R2 ein H darstellt, sind nicht
gemäß der Erfindung.
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Die
obigen Experimente zeigen, dass das R-Isomer an der R1-Gruppe
eine höhere
Aktivität
als das S-Isomer bereitstellt.
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BEISPIEL 2
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In
einem ähnlichen
Satz von Experimenten wurde die tert.-Butylgruppe an R4 durch
Iod ersetzt, um 4-Iod-CAUs zu ergeben (bioisostere Form der tert.-Butylgruppe).
R5 blieb H. Tabelle II, unten, evaluiert
die Cytotoxizität
solcher Moleküle
und die Wirkung der Substitution an dem 2-Chlorethylaminorest. Während der
Experimente wurde der IC50-Wert gegenüber den
Krebszelllinien L1210 und K562 (Mausleukämiezellen) aufgenommen.
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Tabelle
II In
vitro cytotoxische Aktivität
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Anmerkung:
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- *S und *R betreffen die Isomerenform des Kohlenstoffs, an
dem sowohl R1 als auch R2 angebracht
sind.
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Die
Verbindungen, in denen R2 ein H darstellt,
sind nicht gemäß der Erfindung.
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Diese
Tabelle zeigt, dass das R-Isomer der 4-Iod-CAUs (bioisostere Form
der tert.-Butylgruppe) nach einer Substitution des 2-Chlorethylaminorests
zu einem sehr aktiven Arzneistoff führt.
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Beispiel 3
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In
einem anderen ähnlichen
Satz von Experimenten, in denen R1 H oder
CH3 und R2 CH3 ist, wurde die Wirkung auf Substitutionen
des Phenylrings beobachtet. Es wird theoretisiert, dass diese Substitutionen bei
der Positionierung und Selektivität der Verbindungen gegenüber intrazellularen
Schlüsselproteinen
helfen.
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Die
Ergebnisse von in vitro Untersuchungen sind in Tabelle III, unten,
dargestellt.
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Tabelle
III In
vitro cyctotoxische Aktivität
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Die
Verbindung, in der R5 Methyl darstellt,
ist nicht gemäß der Erfindung.
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Aus
diesen Beobachtungen wird ersichtlich, dass R- und S-Alkyl-CAU,
die aus 3,4-Dimethyl-CAUs
abgeleitet sind, besonders wirksame Antikrebsmittel sind.
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In
einem anderen Experiment wurden die folgenden polycyclischen Moleküle hergestellt:
worin
R1 H oder CH3 und
R2 CH3 ist.
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In
vitro cytotoxische Aktivitäten
sind in Tabelle IV, unten, dargestellt.
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Tabelle
IV In
vitro cytotoxische Aktivität
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Anmerkung:
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- *S und *R beziehen sich auf die Isomerenform des Kohlenstoffs,
an dem sowohl R1 als auch R2 angebracht sind.
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Die
Verbindungen CAU-2 und CAU-3 und die Verbindungen CAU-1, in denen
R2 H darstellt, sind nicht gemäß der Erfindung.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Modifizierung des Kohlenstoffs 1' des CAUs zu R- und
S-Isomeren von CAU
führt.
Die R-Isomere sind in den meisten Fällen cytotoxischer als die
unsubstituierten CAUs. Des Weiteren sind die R-Isomere in den meisten
Fällen
mehrfach wirksamer als die S-Isomere. Dies kann an der besseren
Spezifität
gegenüber
den Protein(en), die sie alkylieren, liegen.
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BEISPIEL
5 Die
folgenden Verbindungen wurden erfolgreich auf ihre cytotoxische
Aktivität
hin untersucht.
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Diese
Verbindungen sind nicht gemäß der Erfindung.
- CHO
- = Chinesisches Hamsterovarium
- MDA-MB-231
- = Hormon-unabhängiger Brustkrebs
- HT-29
- = Human-Dickdarmkarzinom
- K562
- = Human-Leukämie
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Anmerkung:
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- *R betrifft die R-Isomerenform des Kohlenstoffs, an dem
sowohl R1 als auch R2 angebracht
sind.
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Basierend
auf der Formel der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie
oben gezeigt, wurden spezifische Moleküle synthetisiert und später auf
ihre cytotoxische Aktivität
hin untersucht.
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 1:1
- R1 = 0,31 (Ether:Petrolether = 1:1)
- 1H-NMR (CDCl3):
7,17 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,11 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,4 Hz), 4,27 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,72 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,3 und J=11,0 Hz), 3,57 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,4 und J=11,0 Hz), 2,55 (t, 2H, CH3(CH2)4CH2),
1,53 (m, 2H, CH3(CH2)3CH2CH2),
1,23 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl,
J=6,9 Hz), 1,18–1,43
(m, 6H, CH3(CH2)3CH2CH2),
0,87 (t, 3H, CH3(CH2)5).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 2:3
- Rf = 0,29 (Ether:Petrolether = 2:3);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,5 Hz), 7,07 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,5 Hz), 5,33 (br s, 1H, NH), 4,23 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,65 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,53 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,5 und J=11,0 Hz), 2,52 (t, 2H, CH3(CH2)4CH2,
J=7,5 Hz), 1,50–1,60
(m, 2H, CH3(CH2)3CH2CH2),
1,28 (m, 6H, CH3(CH2)3CH2CH2),
1,19 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl,
J=6,7 Hz), 0,87 (t, 3H, CH3(CH2)5, J=6,5 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 1:1;
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,11 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,4 Hz), 4,24 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,66 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,2 und J=11,0 Hz), 3,54 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,4 und J=11,0 Hz), 2,43 (m, 1H, CH-Ph), 1,7–1,90 (m, 6H, H-Cyclohexyl),
1,35–1,45
(m, 4H, H-Cyclohexyl), 1,20 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl, J=6,7 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether 1:1;
- Rf = 0,24 (Ether:Petrolether = 1:1);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,18 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,7 Hz), 7,14 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,7 Hz), 4,27 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,71 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,4 und J=11,0 Hz), 3,56 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,2 und J=11,0 Hz), 2,45 (m, 1H, CH-Ph), 1,70–1,85 (m, 6H, H-Cyclohexyl),
1,36 (m, 4H, H-Cyclohexyl), 1,23 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl, J=6,8 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 10:11;
- Rf = 0,38 (Ether:Petrolether = 1:1);
- 1H-NMR (CDCl3);
7,17 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,08 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,4 Hz), 5,24 (br s, 1H, NH), 4,02 (m, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 3,69 (dd,
1H, CH2Cl, J=4,0 und 11,0 Hz), 3,60 (dd,
1H, CH2Cl, J=3,3 und 11,0 Hz), 2,53 (t,
2H, CH2Ph, J=7,8 Hz), 1,56 (m, 4H, CH3(CH2)3CH2CH2 und CH(CH2CH3)CH2Cl),
1,28 (m, 6H, CH3(CH2)3CH2CH2),
0,89 (2t, 6H, CH3(CH2)5 und CH(CH2CH3)CH2Cl, J=6,5 und
7,4 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 35:65;
- Rf = 0,28 (Ether:Petrolether = 2:3);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,2 Hz), 7,06 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,2 Hz), 5,41 (br s, 1H, NH), 4,02 (m, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 3,67 (dd,
1H, CH2Cl, J=4,2 und 11,0 Hz), 3,58 (dd,
1H, CH2Cl, J=3,5 und 11,0 Hz), 2,52 (t,
2H, CH2Ph, J=7,7 Hz), 1,55 (m, 4H, CH3(CH2)3CH2CH2 und CH(CH2CH3)CH2Cl),
1,28 (m, 6H, CH3(CH2)3CH2CH2),
0,89 (2t, 6H, CH3(CH2)5 und CH(CH2CH3)CH2Cl, J=6,6 und
7,5 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 10:11;
- Rf = 0,38 (Ether:Petrolether = 1:1);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,18 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,7 Hz), 7,14 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,7 Hz), 4,04 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,73 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,0 und J=11,2 Hz), 3,63 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,2 und J=11,2 Hz), 2,46 (m, 1H, CH-Ph), 1,70–1,85 (m, 4H, H-Cyclohexyl),
1,58 (m, 2H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 1,18–1,45 (m, 6H, H-Cyclohexyl),
0,93 (t, 3H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,4 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 1:1;
- Rf = 0,35 (Ether:Petrolether = 1:1);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,18 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,5 Hz), 7,13 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,5 Hz), 4,03 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,72 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,9 und J=11,1 Hz), 3,64 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,4 und J=11,1 Hz), 2,45 (m, 1H, CH-Ph), 1,65–1,95 (m, 4H, H-Cyclohexyl),
1,56 (m, 2H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 1,20–1,40 (m, 6H, H-Cyclohexyl),
0,93 (t, 3H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,4 Hz).
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- Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 2:3;
- Rf = 0,31 (Ether:Petrolether = 2:3);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,17 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,2 Hz), 7,04 (d, 2H, H-C3 und C5, J=8,2
Hz), 4,05 (m, 1H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl), 3,64 (dd,
1H, CH2Cl, J=4,3 und J=11 Hz), 3,54 (dd,
1H, CH2Cl, J=3,7 und J=11 Hz), 2,51 (t,
2H, CH3(CH2)4CH2, J=7,7 Hz),
1,25–1,60
(m, 12H, CH3(CH2)4CH2 und CH(CH2CH2CH3)CH2Cl), 0,88 (t, 3H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl,
J=7,2 Hz).
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- 1H-NMR (CDCl3):
7,18 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,7 Hz), 7,13 (d, 2H, H-C3 und C5, J=8,7
Hz), 4,13 (m, 1H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl), 3,73 (dd,
1H, CH2Cl, J=4,1 und J=11,1 Hz), 3,59 (dd,
1H, CH2Cl, J=3,5 und J=11,1 Hz), 2,45 (m,
1H, CH-Ph), 1,20–2,00
(m, 14H, CH2-Cyclohexyl und CH(CH2CH2CH3)CH2Cl), 0,91 (t, 3H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl,
J=7,1 Hz).
-
BEISPIEL 16: Bestimmung
der cytotoxischen Aktivität
-
Zellkultur.
Tumorzelllinien (B 16-F0, Caco-2, DU-145, HT-29, MDA-MB-231 und
andere Zelllinien, die bisher in der Patentanmeldung beschrieben
wurden) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC HTB-26;
Bethesda, MD) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, das
mit 10%-igem Rinderfötenserum
(Hyclone, Road Logan, Utah) versetzt wurde, gezüchtet und wurden in einer befeuchteten
Atmosphäre bei
37°C in
5% CO2 kultiviert.
-
Arzneimittel:
Alle Arzneimittel wurden in DMSO aufgelöst und die endgültige Konzentration
des DMSO in dem Kulturmedium wurde bei 0,5 Vol.-% beibehalten.
-
Cytotoxische
Untersuchungen. Am Tag 1 wurden die Tumorzellen in der Suspension
in 100 μl
auf Mikrotiterplatten (96 Wells) aufgebracht. Am Tag 0 wurden die
Tumorzellen durch Zugabe von sich erhöhenden Konzentrationen des
Arzneimittels (100 μl
Lösung)
behandelt. An diesem Tag wurde die Zahl der lebenden Zellen in den
Wells, die unbehandelt waren, bestimmt. Dies wurde durchgeführt, um
in der Lage zu sein, die toxische Konzentration des Arzneimittels
zu bestimmen, die notwendig ist, um 50% der Zellpopulation, die
zu Beginn des Experiments vorlag, zu töten. Dieser Wert wird als C50-Wert in der Tabelle angegeben. Am Tag
3 wurde die Zahl der lebenden Zellen entweder unter Verwendung des
MTT- oder des Resazurintest bestimmt. Die wachstumshemmende Wirkung
dieser Verbindungen wurde als die Konzentration an CAU ausgedrückt, die das
Zellwachstum um 50%, G50 in der folgenden
Tabelle, hemmt.
-
Der
MTT-Test wurde, wie oben beschrieben in Beispiel 1, durchgeführt. Der
Resazurin-Test wurde wie folgt durchgeführt:
Ziehe den Überstand
ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 100 μl NaCl 0,9%
(Salzlösung)
zu,
Ziehe den Überstand
ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 50 μl RZ (Resazurin
125 μg/ml/PBS:RPMI
ohne FBS; 1:4) zu, Inkubiere bei 37°C,
Nimm Fluoreszenzdaten
zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf.
FILTER EM EM
ZENTRUM
590 590
-
Tabelle
V In
vitro cytotoxische Aktivität
-
-
-
Basierend
auf der Formel der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie
oben gezeigt, wurden spezifische Moleküle synthetisiert und später auf
ihre cytotoxische Aktivität
hin untersucht.
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 9/1 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,31 (100% Ether);
- 1H-NMR (CDCl3):
6,95 (d, 1H, H-C2, J=2,2 Hz), 6,72 (d, 1H, H-C5, J=8,4 Hz), 6,64
(dd, 1H, H-C6, J=2,0
und J=8,4 Hz), 4,21 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,78 (s, 6H, 2 OCH3),
3,67 (dd, 1H, CH2Cl, J=4,1 und J=10,9 Hz),
3,50 (dd, 1H, CH2Cl, J=3,3 und J=10,9 Hz),
1,17 (t, 3H, CH(CH3)CH2Cl,
J=6,7 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 9/1 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,33 (100% Ether)
- 1H-NMR (CDCl3):
6,96 (d, 1H, H-C2, J=2 Hz), 6,70 (d, 1H, H-C5, J=8,5 Hz), 6,63 (d,
1H, H-C6, J=8,5
Hz), 4,20 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl),
3,76 und 3,78 (2s, 6H, 2 OCH3), 3,65 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,2 und J=11,0 Hz), 3,49 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,4 und J=11,0 Hz), 1,16 (t, 3H, CH(CH3)CH2Cl, J=6,8 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 7/3 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,17 (7/3 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDC13): 6,99 (d, 1H, H-C2, J=2,3
Hz), 6,80 (d, 1H, H-C5, J=8,4 Hz), 6,72 (d, 1H, H-C6, J=8,4 Hz), 4,04
(m, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 3,85 (s, 6H, 2 OCH3),
3,75 (dd, 1H, CH2Cl, J=3,9 und J=11,2 Hz),
3,63 (dd, 1H, CH2Cl, J=3,3 und J=11,2 Hz),
1,57 (m, 2H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 0,93 (t, 3H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,5 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 7/3 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,17 (7/3 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,02 (d, 1H, H-C2, J=2,2 Hz), 6,77 (d, 1H, H-C5, J=8,7 Hz), 6,70
(dd, 1H, H-C6, J=2,2
und J=8,7 Hz), 4,03 (m, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 3,83 (s,
6H, 2 OCH3), 3,73 (dd, 1H, CH2Cl,
J=4,0 und J=11,2 Hz), 3,61 (dd, 1H, CH2Cl,
J=3,2 und J=11,2 Hz), 1,56 (m, 2H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 0,92 (t,
3H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,4 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 35/65 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,16 (2/3 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,15 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,07 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,4 Hz), 4,25 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,65 (dd, 1H, CH(CH3)CH2Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,53 (dd, 1H,
CH(CH3)CH2Cl, J=3,6
und J=11,0 Hz), 2,53 (t, 2H, CH3(CH2)5CH2,
J=7,8 Hz), 1,55 (m, 2H, CH3(CH2)4CH2CH2),
1,28 (m, 8H, CH3(CH2)4CH2CH2),
1,20 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl,
J=6,7 Hz), 0,87 (t, 3H, CH3(CH2)6, J=6,8 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 4/5/1 : CH2Cl2/Petrolether/Ether;
- Rf = 0,23 (2/3 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,3 Hz), 7,07 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,3 Hz), 4,23 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,65 (dd, 1H, CH(CH3)CH2Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,53 (dd, 1H,
CH(CH3)CH2Cl, J=3,5
und J=11,0 Hz), 2,52 (t, 2H, CH3(CH2)5CH2,
J=7,7 Hz), 1,55 (m, 2H, CH3(CH2)4CH2CH2),
1,28 (m, 8H, CH3(CH2)4CH2CH2),
1,19 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl,
J=6,6 Hz), 0,87 (t, 3H, CH3(CH2)6, J=6,6 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 4/5/1: CH2Cl2/Petrolether/Ether;
- Rf = 0,31 (2/3 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,17 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,2 Hz), 7,09 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,2 Hz), 4,03 (m, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 3,70 (dd,
1H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=3,7 und J=11,0 Hz), 3,61 (dd, 1H,
CH(CH2CH3)CH2Cl, J=3,2 und J=11,0 Hz), 2,53 (t, 2H, CH3(CH2)5CH2, J=7,7 Hz), 1,57 (m, 4H, CH3(CH2)4CH2CH2 und CH(CH2CH3)CH2Cl), 1,27 (m,
8H, CH3(CH2)4CH2CH2),
0,92 und 0,87 (2t, 6H, CH3(CH2)6 und CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,6 und
J=7,0 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 4/5/1: CH2Cl2/Petrolether/Ether;
- Rf = 0,31 (2/3 : Ether/PetrolEther)
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6 J=8,5 Hz), 7,06 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,5 Hz), 4,00 (m, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl), 3,67 (dd,
1H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=4,2 und J=11,1 Hz), 3,58 (dd, 1H,
CH(CH2CH3)CH2Cl, J=3,5 und J=11,1 Hz), 2,53 (t, 2H, CH3(CH2)5CH2, J=7,7 Hz), 1,54 (m, 4H, CH3(CH2)4CH2CH2 und CH(CH2CH3)CH2Cl), 1,28 (m,
8H, CH3(CH2)4CH2CH2),
0,91 und 0,87 (2t, 6H, CH3(CH2)6 und CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,4 und
J=7,1 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 2/3 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,31 (2/3 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,6 Hz), 7,08 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,6 Hz), 4,08 (m, 1H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl),
3,66 (dd, 1H, CH2Cl, J=4,2 und J=11,0 Hz),
3,55 (dd, 1H, CH2Cl, J=3,6 und J=11,0 Hz),
2,42 (m, 1H, CH-Ph), 1,70–1,82
(m, 6H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl und H-Cyclohexyl),
1,20–1,60
(m, 8H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl und H-Cyclohexyl), 0,88
(t, 3H, CH(CH2CH2CH3)CH2Cl, J=7,2 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 1/1 : Ether/Petrolether;
- Rf = 0,16 (1/1 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,7 Hz), 6,85 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=8,7 Hz), 4,26 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,92 (t, 2H, CH3(CH2)4CH2O,
J=6,6 Hz), 3,72 (dd, 1H, CH(CH3)CH2Cl, J=4,3 und J=11,0 Hz), 3,55 (dd, 1H,
CH(CH3)CH2Cl, J=3,5
und J=11,0 Hz), 1,76 (m, 2H, CH3(CH2)3CH2CH2O), 1,24–1,50 (m, 6H, CH3(CH2)3CH2CH2O), 1,21 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl, J=6,7 Hz), 0,90 (t, 3H, CH3(CH2)5O, J=6,9 Hz).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 55/35/10 : CH2Cl2/Petrolether/Ether;
- Rf = 0,16 (1/1 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,13 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=7,7 Hz), 6,79 (d, 2H, H-C3 und H-C5,
J=7,7 Hz), 4,21 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl), 3,87 (t, 2H, CH3(CH2)4CH2O,
J=6,5 Hz), 3,64 (dd, 1H, CH(CH3)CH2Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,52 (dd, 1H,
CH(CH3)CH2Cl, J=3,5
und J=11,0 Hz), 1,74 (m, 2H, CH3(CH2)3CH2CH2O), 1,24–1,45 (m, 6H, CH3(CH2)3CH2CH2O), 1,18 (d, 3H, CH(CH3)CH2Cl, J=6,6 Hz), 0,89 (m, 3H, CH3(CH2)5O).
-
-
-
- Flash-Chromatographie: 55/35/10 : CH2Cl2/Petrolether/Ether;
- Rf = 0,26 (1/1 : Ether/Petrolether);
- 1H-NMR (CDCl3):
7,16 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,8 Hz), 6,82 (d, 2H, H-C3 und C5, J=8,8
Hz), 4,01 (m, 1H, CH(CH3)CH2Cl),
3,90 (t, 2H, CH3(CH2)4CH2O, J=6,6 Hz),
3,70 (dd, 1H, CH(CH2CH3)CH2Cl, J=4,0 und J=11,2 Hz), 3,60 (dd, 1H,
CH(CH2CH3)CH2Cl, J=3,3 und J=11,2 Hz), 1,75 (m, 2H, CH3(CH2)3CH2CH2O), 1,20–1,70 (m, 8H,
CH3(CH2)3CH2O) und CH(CH2CH3)CH2Cl),
0,90 (2t, 6H, CH3(CH2)5O und CH(CH2CH3)CH2Cl, J=7,4 und J=6,5
Hz).
-
BEISPIEL 29: Bestimmung
der cytotoxischen Aktivität
-
Zellkultur:
Tumorzelllinien (B16-F0, Caco-2, DU-145, HT-29, MDA-MB-231 und andere
Zelllinien, die bisher in der Patentanmeldung beschrieben wurden)
wurden von der American Type Culture Collection (ATCC HTB-26; Bethesda,
MD) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, das mit 10%-igem
Rinderfötenserum
(Hyclone, Road Logan, Utah) versetzt wurde, gezüchtet und wurden in einer befeuchteten
Atmosphäre bei
37°C in
5% CO2 kultiviert.
-
Arzneimittel:
Alle Arzneimittel wurden in DMSO aufgelöst und die endgültige Konzentration
des DMSO in dem Kulturmedium wurde bei 0,5 Vol.-% beibehalten.
-
Cytotoxische
Untersuchungen. Am Tag 1 wurden die Tumorzellen in der Suspension
in 100 μl
auf Mikrotiterplatten (96 Wells) aufgebracht. Am Tag 0 wurden die
Tumorzellen durch Zugabe von sich erhöhenden Konzentrationen des
Arzneimittels (100 μl
Lösung)
behandelt. An diesem Tag wurde die Zahl der lebenden Zellen in den
Wells, die unbehandelt waren, bestimmt. Die Zahl der lebenden Zellen
wurde entweder unter Verwendung des MTT- oder des Resazurintests
bestimmt. Die wachstumshemmende Wirkung dieser Verbindung wurde
als die Konzentration an CAU ausgedrückt, die das Zellwachstum um
50%, G50 in der folgenden Tabelle, hemmt.
-
Der
MTT-Test wurde, wie oben beschrieben in Beispiel 1, durchgeführt. Die
Resazurin-Test wurde wie folgt durchgeführt:
Ziehe den Überstand
ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 100 μl NaCl 0,9%
(Salzlösung)
zu,
Ziehe den Überstand
ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 50 μl RZ (Resazurin
125 μg/ml/PBS:RPMI
ohne FBS; 1:4) zu,
Inkubiere bei 37°C,
Nimm Fluoreszenzdaten
zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf.
FILTER EM EM
ZENTRUM
590 590
-
Tabelle
VI In
vitro cytotoxische Aktivität
-
-
-
-
-
-
Die
Verbindungen, in denen R2 H darstellt, sind
nicht gemäß der Erfindung.