DE60028563T2

DE60028563T2 - Aryl-chloralkylharnstoffe

Info

Publication number: DE60028563T2
Application number: DE60028563T
Authority: DE
Inventors: C. Rene St-Nicolas GAUDREAULT
Original assignee: SOVAR; SOVAR Sainte-foy
Current assignee: SOVAR; SOVAR Sainte-foy
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: EP1169303A2; DE60028563D1; BR0010615A; WO2000061546A3; MXPA01010311A; AU3952000A; EP1169303B1; AU778391B2; CA2268588A1; ATE312075T1; WO2000061546A2; JP2002541240A; US6686394B1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein neues Antikrebsmittel mit starker antineoplastischer Wirkung ohne systemische Toxizität oder Mutagenität. Darüber hinaus zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine höhere Spezifität gegenüber Krebszellzielen als bisher bekannte Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine Verbindung der vorliegenden Erfindung als aktives Mittel umfassen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Derivate von 1-Aryl-3-(2-chloralkanyl)harnstoffen mit Substituenten am ersten Kohlenstoffatom des 2-Chloralkanylrests.
2. Stand der Technik
Einige 1-Aryl-3-(2-chloralkanyl)harnstoffderivate (hiernach als „CAUs" bezeichnet) sind aus den US-Patenten 5,530,026 und 5,750,547, die den selben Anmelder wie die vorliegende Anmeldung haben, bekannt. Insbesondere sind Verbindungen der folgenden Formel bekannt:
worin R verschiedene Substituenten an dem Phenylring betrifft.
Es ist bekannt, dass CAUs eine Affinität gegenüber Krebszellen zeigen, die Zellwand durchdringen und eine milde alkylierende Wirkung auf die Zellbestandteile bereitstellen, wodurch die krankmachende Zelle abgetötet wird.
Ein Ziel der Erfindung ist es, neue CAU-Derivate mit deutlich besserer antineoplastischer Aktivität gegenüber bekannten CAUs bereitzustellen, während sie geringe systemische Toxizität, Mutagenität und Nebenwirkungen beibehalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde nunmehr entgegen den Erwartungen und dokumentierten Beispielen festgestellt, dass spezielle Substitutionen am ersten Kohlenstoffatom der 2-Chlorethylgruppe des CAU-Moleküls eine deutliche Verbesserung der Antikrebswirkung des resultierenden CAUs bereitstellen.
Darüber hinaus wurde festgestellt, dass bisher unbekannte Substitutionen am Phenylring das resultierende CAU-Molekül sogar noch wirksamer beim Bekämpfen spezifischer Bereiche krebsartiger Zellen machen, wodurch ihre Spezifität gegenüber verschiedenen zellartigen Proteinen als Schlüssel für das Zellüberleben verbessert wird.
Insbesondere stellt diese Erfindung eine neue Klasse von CAU-Derivaten bereit. Diese neue Klasse kann durch die folgende Formel ausgedrückt werden:
worin
R₁ Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoffatome) oder H ist;
R₂ Alkyl (1 bis 6 Kohlenstoffatome) ist;
R₃ und R₄ wie in Anspruch 1 definiert sind;
R₅ H ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Modifizierung des 2-Chloralkanylrests (R₁- und R₂-Gruppen)
Experimente, um die biopharmazeutischen Eigenschaften bekannter 1-Aryl-3-(2-chlorethyl)harnstoffe (CAUs) zu bestimmen, haben unerwarteterweise gezeigt, dass bestimmte Zellenzyme, wie z.B. die Cytochrome P₄₅₀ 1A2 und 2E1 CAUs oxidieren und sie daher zu iner ten Molekülen metabolisieren und ihnen die Antikrebswirkung entziehen. Es wurde wiederum unerwarteterweise festgestellt, dass der Metabolisierungsmechanismus am ersten Kohlenstoffatom des 2-Chloralkylrests benachbart zum Harnstoffrest wirkt.
Z.B. trat im Falle eines 4-tert.-Butyl-CAU (tBCAU) die Metabolisierung entlang des folgenden Weges auf:
Überraschenderweise hat dies einen metabolischen Schwachpunkt am ersten Kohlenstoffatom des 2-Chloralkanylrests des CAUs dargelegt. Die vorliegende Erfindung zielt daher im Allge meinen darauf, Schutzgruppen an diesem ersten Kohlenstoffatom bereitzustellen und neue CAU-Derivate mit starker antineoplastischer Wirkung bereitzustellen.
Insbesondere wurde der Schutz des schwachen Kohlenstoffatoms vor der Metabolisierung durch Substituieren des Kohlenstoffatoms durch Gruppen, wie z.B. niedere Alkylgruppen, wie z.B. Methyl, Ethyl und Propyl, erreicht.
Modifizierung der R₃- und R₄-Reste
Des Weiteren wurde überraschenderweise festgestellt, dass bestimmte Modifikationen der Substituenten am Arylrest die Spezifität der resultierenden CAU-Derivate gegenüber unterschiedlichen Zellproteinen, die den Schlüssel für das Zellüberleben darstellen, dramatisch verbessern.
Die folgenden Verbindungen wurden daher entwickelt und werden durch die allgemeine Formel ausgedrückt:
worin
R₁ H, C₁-C₆-Alkyl ist;
R₂ C₁-C₆-Alkyl ist;
R₃ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus H, Halogenid, C₁-C₇-Alkyl, C₁-C₇-Alkoxy, C₁-C₇-Hydroxyalkyl, C₁-C₇-Aminoalkyl, C₁-C₆-Thioalkyl, C₁-C₇-Cyanoalkyl, C₁-C₇-Halogenalkyl und C₃-C₇-Cycloalkyl;
R₄ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Halogenid, C₁-C₇-Alkyl, C₁-C₇-Alkoxy, C₁-C₇-Hydroxyalkyl, C₁-C₇-Aminoalkyl, C₁-C₆-Thioalkyl, C₁-C₇-Cyanoalkyl, C₁-C₇-Halogenalkyl, C₃-C₇-Cycloalkyl;
oder R₃ und R₄ eine alicyclische Gruppe der folgenden Struktur bilden
worin n = 1 ist (R₅ ist gezeigt, um deutlich anzugeben, dass die kondensierte alicyclische Gruppe an den 3- und 4-Positionen des Phenylrings angebracht ist); und
R₅ H ist.
Herstellung von CAU-Derivaten
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden leicht in guten Ausbeuten ohne begleitende Polymerisation oder Zersetzung hergestellt. Die Verbindungen können auch leicht durch übliche Verfahren, wie z.B. Kristallisation oder Flüssigchromatographie, gereinigt werden. Des Weiteren zeigen die Verbindungen eine verbesserte Haltbarkeit ohne Zersetzung an der Luft.
Die Art und das Niveau der Aktivität für eine gegebene Dosierung einer jeden Verbindung kann herkömmlicherweise durch Routineexperimente unter Verwendung wohlbekannter pharmakologischer Protokolle bestimmt werden.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung scheinen Krebstumorzellen durch Alkylierung ihres β-Tubulins an einem spezifischen Cysteinrest (Cyst-239) und auch durch andere Mechanismen, die untersucht werden, zu töten. Die molekulare Struktur des β-Tubulins wurde über die Evolution stark bewahrt und liegt daher in vielen Säugetierzellen vor. Folglich sind die Verbindungen der Erfindung angezeigt für: weit reichende Antikrebsmittel, transdermal für die präoperative Behandlung von Melanomen und systemisch für andere Krebsarten.
Prodrogen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch leicht hergestellt werden. Als ein Beispiel für Prodrogen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden die Sulfone und Sulfoxidderivate der Alkylthiosubstituenten unmittelbar durch den geübten Fachmann in Erwägung gezogen. Während die Sulfon- und Sulfoxidderivate allgemein nicht aktiv sind, werden sie aktiviert, sobald sie einem Patienten verabreicht werden. Die Aktivierung tritt auf, wenn die Prodroge reduziert wird, um das entsprechende Alkylthio, eine aktive Verbindung, zu ergeben.
Das folgende Syntheseflussdiagramm zeigt eine Route zur Herstellung von CAU-Derivaten der vorliegenden Erfindung.
Es ist wichtig anzumerken, dass die Herstellung von CAU-Derivaten der vorliegenden Erfindung zu der Bildung von R- und S-Isomeren geführt hat, die (in einigen Fällen) deutliche Unterschiede in der cytotoxischen Aktivität (siehe Tabellen I und II unten) zeigen.
BEISPIELE
Herstellung von N-(4-Alkylphenyl)-N'-(1-alkyl-2-hydroxy)ethylharnstoffen
Diese Verbindungen wurden gemäß der oben dargestellten allgemeinen Syntheseroute hergestellt.
Zu einer gerührten Lösung aus Di-tert.-butyldicarbonat (3,9 mmol) and 4-Dimethylaminopyridin (0,4 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (20 ml) wurde tropfenweise das relevante Anilin (auch 2-Aminofluorenyl, 2-Aminonaphthyl, etc. Derivative) (3,7 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über 30 min bei Raumtemperatur gerührt und der erforderliche (R)- oder (S)-Aminoalkohol wurde tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie auf Silicagel (Dichlormethan/Ethylacetat, 20/80) gereinigt, um den Hydroxyharnstoff als einen farblosen Feststoff zu ergeben.
Halogenierung von N-(4-Alkylphenyl)-N'-(1-alkyl-2-hydroxy)ethylharnstoffen zu N-(4-Alkylphenyl)-N'-(1-alkyl-2-chlor)ethylharnstoffen
Eine Lösung des relevanten Hydroxyharnstoffs (2,4 mmol) und Triphenylphosphin (3,7 mmol) in einer Mischung aus Dichlormethan und Kohlenstofftetrachlorid (20:6) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie auf Silicagel (Ethylether/Petrolether, 50/50) gereinigt, um den Chlorethylharnstoff als einen weißen Feststoff zu ergeben.
Von Bedeutung ist, dass die R₁- oder/und R₂-substituierten CAUs auch auf mehreren synthetischen Routen hergestellt werden können. Ein Fachmann wird dies schnell erkennen.
BEISPIEL 1: Evaluierung der cytotoxischen Aktivität
Verbindungen, die gemäß dem oben dargestellten Verfahren hergestellt wurden, wurden synthetisiert und auf ihre cytotoxische Aktivität überprüft. Die molekulare Struktur eines jeden von ihnen wurde durch IR-, NMR- und Massenspektroskopie überprüft.
Tabelle 1, unten, stellt die Evaluierung der in vitro cytotoxischen Aktivitäten unterschiedlicher Verbindungen, die gemäß der oben dargestellten Synthese hergestellt wurden, und in denen R₃ und R₅ H sind, bereit.
Das herkömmliche Evaluierungsverfahren, das durch das American National Cancer Institute vorgeschlagen wurde, wurde verwendet. Das Verfahren misst die Effektivität eines Antikrebsmittels, basierend auf dem IC₅₀-Wert, der die Arzneimittelkonzentration in μM darstellt, bei der das Arzneimittel die Inhibierung der Proliferation einer gegebenen Krebszelllinie um den Faktor einhalb erreicht, verglichen mit der normalen Proliferation der selben Krebszelllinie in dem selben Wachstumsmedium.
Cytotoxische Untersuchung:
CAUs wurden mit verschiedenen Zelllinien, einschließlich menschlichen, nicht hormonabhängigen Brustkrebszellen (MDA-MB-231) und Mausleukämie (L1210), untersucht. MDA-MB-231. Diese Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (Bethesda, MD, USA) erhalten. Die Cytotoxizität der CAU-Derivate wurde untersucht und mit der Wirkung von Chlorambucil und Carmustin verglichen.
Die Tumorzellen wurden in RPMI-1640-Medium gezüchtet, unterstützt mit 10%-igem Rinderfötenserum, 2 mM Glutamin und 64 U/ml Gentamycin. Die Zellen wurden bei 90% Konfluenz routinemäßig passagiert.
5000 Zellen (100 μl) wurden in 96 Well-Platten eingesetzt und für 1 Tag bei 37°C unter befeuchteter Atmosphäre in Gegenwart von 5% CO₂ bebrütet. Anschließend wurden 100 μl frisches Medium, das CAU enthält, zu den Kulturen dazugegeben, um die endgültigen Konzentrationen im Bereich von 1 bis 200 μM zu erhalten. Die CAUs wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; Aldrich Chemicals Company Inc., Milwaukee, WI) aufgelöst, das bei 0,5 Vol.-% gehalten wurde. Die Zellen wurden für 4 bis 5 Tage in Gegenwart der Arzneimittel bebrütet.
Das Überleben der Zellen wurde durch colorimetrische Untersuchung unter Verwendung von MTT evaluiert, gemäß einer Modifizierung des Verfahrens, das durch Carmichael und Kollegen [J. Carmichael, W.G. De Graff, A.F. Gazdar, I.D. Minna, J.B. Mitchell (1987, Cancer Res. 47, Seiten 936 bis 942] berichtet wurde. Kurz gesagt wurde das Kulturmedium durch 50 μl einer Lösung, die MTT (1,0 mg/ml in PBS: RPMI-1640 (1:4)) enthält, ersetzt. Das MTT wird durch mitochondrische Dehydrogenase reduziert, um MTT-Formazan zu bilden. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurden die Wells mit 200 μl Salzlösung gewaschen und 100 μl DMSO, das 0,5 Vol.-% einer Glycerinlösung 0,1 M bei pH 11 (NaOH) enthält, zugegeben, um den Niederschlag aufzulösen. Die Platten wurden dann über 15 min geschüttelt und die Absorption bei 570 nm mit einem Behring Elisa Processor II (Behring, Marburg, Deutschland) gemessen.
Die Evaluierung wurde mit 2 typischen Krebszelllinien, nämlich L1210 (Mausleukämiezellen) und MDA-MB-231 (menschliche Brustkrebszellen) durchgeführt. Ein Vergleich mit herkömmlichen Antikrebsarzneimitteln Chlorambucil und Carmustin wird bereitgestellt, um die Effektivität der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu zeigen.
Tabelle I In vitro cytotoxische Aktivität
Anmerkung:

*S und *R beziehen sich auf die Isomerenformen des Kohlenstoffs, an dem sowohl R₁ und R₂ angebracht sind.

Verbindungen, in denen R₂ ein H darstellt, sind nicht gemäß der Erfindung.
Die obigen Experimente zeigen, dass das R-Isomer an der R₁-Gruppe eine höhere Aktivität als das S-Isomer bereitstellt.
BEISPIEL 2
In einem ähnlichen Satz von Experimenten wurde die tert.-Butylgruppe an R₄ durch Iod ersetzt, um 4-Iod-CAUs zu ergeben (bioisostere Form der tert.-Butylgruppe). R₅ blieb H. Tabelle II, unten, evaluiert die Cytotoxizität solcher Moleküle und die Wirkung der Substitution an dem 2-Chlorethylaminorest. Während der Experimente wurde der IC₅₀-Wert gegenüber den Krebszelllinien L1210 und K562 (Mausleukämiezellen) aufgenommen.
Tabelle II In vitro cytotoxische Aktivität
Anmerkung:

*S und *R betreffen die Isomerenform des Kohlenstoffs, an dem sowohl R₁ als auch R₂ angebracht sind.

Die Verbindungen, in denen R₂ ein H darstellt, sind nicht gemäß der Erfindung.
Diese Tabelle zeigt, dass das R-Isomer der 4-Iod-CAUs (bioisostere Form der tert.-Butylgruppe) nach einer Substitution des 2-Chlorethylaminorests zu einem sehr aktiven Arzneistoff führt.
Beispiel 3
In einem anderen ähnlichen Satz von Experimenten, in denen R₁ H oder CH₃ und R₂ CH₃ ist, wurde die Wirkung auf Substitutionen des Phenylrings beobachtet. Es wird theoretisiert, dass diese Substitutionen bei der Positionierung und Selektivität der Verbindungen gegenüber intrazellularen Schlüsselproteinen helfen.
Die Ergebnisse von in vitro Untersuchungen sind in Tabelle III, unten, dargestellt.
Tabelle III In vitro cyctotoxische Aktivität
Die Verbindung, in der R₅ Methyl darstellt, ist nicht gemäß der Erfindung.
Aus diesen Beobachtungen wird ersichtlich, dass R- und S-Alkyl-CAU, die aus 3,4-Dimethyl-CAUs abgeleitet sind, besonders wirksame Antikrebsmittel sind.
BEISPIEL 4
In einem anderen Experiment wurden die folgenden polycyclischen Moleküle hergestellt:
worin R₁ H oder CH₃ und R₂ CH₃ ist.
In vitro cytotoxische Aktivitäten sind in Tabelle IV, unten, dargestellt.
Tabelle IV In vitro cytotoxische Aktivität
Anmerkung:

*S und *R beziehen sich auf die Isomerenform des Kohlenstoffs, an dem sowohl R₁ als auch R₂ angebracht sind.

Die Verbindungen CAU-2 und CAU-3 und die Verbindungen CAU-1, in denen R₂ H darstellt, sind nicht gemäß der Erfindung.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Modifizierung des Kohlenstoffs 1' des CAUs zu R- und S-Isomeren von CAU führt. Die R-Isomere sind in den meisten Fällen cytotoxischer als die unsubstituierten CAUs. Des Weiteren sind die R-Isomere in den meisten Fällen mehrfach wirksamer als die S-Isomere. Dies kann an der besseren Spezifität gegenüber den Protein(en), die sie alkylieren, liegen.
BEISPIEL 5 Die folgenden Verbindungen wurden erfolgreich auf ihre cytotoxische Aktivität hin untersucht.
Diese Verbindungen sind nicht gemäß der Erfindung.

CHO: = Chinesisches Hamsterovarium
MDA-MB-231: = Hormon-unabhängiger Brustkrebs
HT-29: = Human-Dickdarmkarzinom
K562: = Human-Leukämie

Anmerkung:

*R betrifft die R-Isomerenform des Kohlenstoffs, an dem sowohl R₁ als auch R₂ angebracht sind.

BEISPIELE 6 bis 15
Basierend auf der Formel der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie oben gezeigt, wurden spezifische Moleküle synthetisiert und später auf ihre cytotoxische Aktivität hin untersucht.
BEISPIEL 6

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 1:1
R₁ = 0,31 (Ether:Petrolether = 1:1)
¹H-NMR (CDCl₃): 7,17 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,11 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,4 Hz), 4,27 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,72 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,3 und J=11,0 Hz), 3,57 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,4 und J=11,0 Hz), 2,55 (t, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂), 1,53 (m, 2H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂), 1,23 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,9 Hz), 1,18–1,43 (m, 6H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂), 0,87 (t, 3H, CH₃(CH₂)₅).

BEISPIEL 7

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 2:3
R_f = 0,29 (Ether:Petrolether = 2:3);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,5 Hz), 7,07 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,5 Hz), 5,33 (br s, 1H, NH), 4,23 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,65 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,53 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,5 und J=11,0 Hz), 2,52 (t, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂, J=7,5 Hz), 1,50–1,60 (m, 2H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂), 1,28 (m, 6H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂), 1,19 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,7 Hz), 0,87 (t, 3H, CH₃(CH₂)₅, J=6,5 Hz).

BEISPIEL 8

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 1:1;
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,11 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,4 Hz), 4,24 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,66 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,2 und J=11,0 Hz), 3,54 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,4 und J=11,0 Hz), 2,43 (m, 1H, CH-Ph), 1,7–1,90 (m, 6H, H-Cyclohexyl), 1,35–1,45 (m, 4H, H-Cyclohexyl), 1,20 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,7 Hz).

BEISPIEL 9

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether 1:1;
R_f= 0,24 (Ether:Petrolether = 1:1);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,18 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,7 Hz), 7,14 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,7 Hz), 4,27 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,71 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,4 und J=11,0 Hz), 3,56 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,2 und J=11,0 Hz), 2,45 (m, 1H, CH-Ph), 1,70–1,85 (m, 6H, H-Cyclohexyl), 1,36 (m, 4H, H-Cyclohexyl), 1,23 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,8 Hz).

BEISPIEL 10

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 10:11;
R_f = 0,38 (Ether:Petrolether = 1:1);
¹H-NMR (CDCl₃); 7,17 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,08 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,4 Hz), 5,24 (br s, 1H, NH), 4,02 (m, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,69 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,0 und 11,0 Hz), 3,60 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,3 und 11,0 Hz), 2,53 (t, 2H, CH₂Ph, J=7,8 Hz), 1,56 (m, 4H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 1,28 (m, 6H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂), 0,89 (2t, 6H, CH₃(CH₂)₅ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=6,5 und 7,4 Hz).

BEISPIEL 11

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 35:65;
R_f = 0,28 (Ether:Petrolether = 2:3);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,2 Hz), 7,06 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,2 Hz), 5,41 (br s, 1H, NH), 4,02 (m, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,67 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,2 und 11,0 Hz), 3,58 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,5 und 11,0 Hz), 2,52 (t, 2H, CH₂Ph, J=7,7 Hz), 1,55 (m, 4H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 1,28 (m, 6H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂), 0,89 (2t, 6H, CH₃(CH₂)₅ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=6,6 und 7,5 Hz).

BEISPIEL 12

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 10:11;
R_f = 0,38 (Ether:Petrolether = 1:1);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,18 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,7 Hz), 7,14 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,7 Hz), 4,04 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,73 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,0 und J=11,2 Hz), 3,63 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,2 und J=11,2 Hz), 2,46 (m, 1H, CH-Ph), 1,70–1,85 (m, 4H, H-Cyclohexyl), 1,58 (m, 2H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 1,18–1,45 (m, 6H, H-Cyclohexyl), 0,93 (t, 3H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,4 Hz).

BEISPIEL 13

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 1:1;
R_f = 0,35 (Ether:Petrolether = 1:1);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,18 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,5 Hz), 7,13 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,5 Hz), 4,03 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,72 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,9 und J=11,1 Hz), 3,64 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,4 und J=11,1 Hz), 2,45 (m, 1H, CH-Ph), 1,65–1,95 (m, 4H, H-Cyclohexyl), 1,56 (m, 2H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 1,20–1,40 (m, 6H, H-Cyclohexyl), 0,93 (t, 3H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,4 Hz).

BEISPIEL 14

Flash-Chromatographie: Ether:Petrolether = 2:3;
R_f = 0,31 (Ether:Petrolether = 2:3);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,17 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,2 Hz), 7,04 (d, 2H, H-C3 und C5, J=8,2 Hz), 4,05 (m, 1H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,64 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,3 und J=11 Hz), 3,54 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,7 und J=11 Hz), 2,51 (t, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂, J=7,7 Hz), 1,25–1,60 (m, 12H, CH₃(CH₂)₄CH₂ und CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl), 0,88 (t, 3H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,2 Hz).

BEISPIEL 15

¹H-NMR (CDCl₃): 7,18 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,7 Hz), 7,13 (d, 2H, H-C3 und C5, J=8,7 Hz), 4,13 (m, 1H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,73 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,1 und J=11,1 Hz), 3,59 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,5 und J=11,1 Hz), 2,45 (m, 1H, CH-Ph), 1,20–2,00 (m, 14H, CH₂-Cyclohexyl und CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl), 0,91 (t, 3H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,1 Hz).

BEISPIEL 16: Bestimmung der cytotoxischen Aktivität
Zellkultur. Tumorzelllinien (B 16-F0, Caco-2, DU-145, HT-29, MDA-MB-231 und andere Zelllinien, die bisher in der Patentanmeldung beschrieben wurden) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC HTB-26; Bethesda, MD) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, das mit 10%-igem Rinderfötenserum (Hyclone, Road Logan, Utah) versetzt wurde, gezüchtet und wurden in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert.
Arzneimittel: Alle Arzneimittel wurden in DMSO aufgelöst und die endgültige Konzentration des DMSO in dem Kulturmedium wurde bei 0,5 Vol.-% beibehalten.
Cytotoxische Untersuchungen. Am Tag 1 wurden die Tumorzellen in der Suspension in 100 μl auf Mikrotiterplatten (96 Wells) aufgebracht. Am Tag 0 wurden die Tumorzellen durch Zugabe von sich erhöhenden Konzentrationen des Arzneimittels (100 μl Lösung) behandelt. An diesem Tag wurde die Zahl der lebenden Zellen in den Wells, die unbehandelt waren, bestimmt. Dies wurde durchgeführt, um in der Lage zu sein, die toxische Konzentration des Arzneimittels zu bestimmen, die notwendig ist, um 50% der Zellpopulation, die zu Beginn des Experiments vorlag, zu töten. Dieser Wert wird als C₅₀-Wert in der Tabelle angegeben. Am Tag 3 wurde die Zahl der lebenden Zellen entweder unter Verwendung des MTT- oder des Resazurintest bestimmt. Die wachstumshemmende Wirkung dieser Verbindungen wurde als die Konzentration an CAU ausgedrückt, die das Zellwachstum um 50%, G₅₀ in der folgenden Tabelle, hemmt.
Der MTT-Test wurde, wie oben beschrieben in Beispiel 1, durchgeführt. Der Resazurin-Test wurde wie folgt durchgeführt:
Ziehe den Überstand ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 100 μl NaCl 0,9% (Salzlösung) zu,
Ziehe den Überstand ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 50 μl RZ (Resazurin 125 μg/ml/PBS:RPMI ohne FBS; 1:4) zu, Inkubiere bei 37°C,
Nimm Fluoreszenzdaten zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf.
FILTER EM EM
ZENTRUM 590 590
Tabelle V In vitro cytotoxische Aktivität
BEISPIELE 17 bis 29
Basierend auf der Formel der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie oben gezeigt, wurden spezifische Moleküle synthetisiert und später auf ihre cytotoxische Aktivität hin untersucht.
BEISPIEL 17

Flash-Chromatographie: 9/1 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,31 (100% Ether);
¹H-NMR (CDCl₃): 6,95 (d, 1H, H-C2, J=2,2 Hz), 6,72 (d, 1H, H-C5, J=8,4 Hz), 6,64 (dd, 1H, H-C6, J=2,0 und J=8,4 Hz), 4,21 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,78 (s, 6H, 2 OCH₃), 3,67 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,1 und J=10,9 Hz), 3,50 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,3 und J=10,9 Hz), 1,17 (t, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,7 Hz).

BEISPIEL 18

Flash-Chromatographie: 9/1 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,33 (100% Ether)
¹H-NMR (CDCl₃): 6,96 (d, 1H, H-C2, J=2 Hz), 6,70 (d, 1H, H-C5, J=8,5 Hz), 6,63 (d, 1H, H-C6, J=8,5 Hz), 4,20 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,76 und 3,78 (2s, 6H, 2 OCH3), 3,65 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,2 und J=11,0 Hz), 3,49 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,4 und J=11,0 Hz), 1,16 (t, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,8 Hz).

BEISPIEL 19

Flash-Chromatographie: 7/3 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,17 (7/3 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDC13): 6,99 (d, 1H, H-C2, J=2,3 Hz), 6,80 (d, 1H, H-C5, J=8,4 Hz), 6,72 (d, 1H, H-C6, J=8,4 Hz), 4,04 (m, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,85 (s, 6H, 2 OCH₃), 3,75 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,9 und J=11,2 Hz), 3,63 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,3 und J=11,2 Hz), 1,57 (m, 2H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 0,93 (t, 3H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,5 Hz).

BEISPIEL 20

Flash-Chromatographie: 7/3 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,17 (7/3 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,02 (d, 1H, H-C2, J=2,2 Hz), 6,77 (d, 1H, H-C5, J=8,7 Hz), 6,70 (dd, 1H, H-C6, J=2,2 und J=8,7 Hz), 4,03 (m, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,83 (s, 6H, 2 OCH₃), 3,73 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,0 und J=11,2 Hz), 3,61 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,2 und J=11,2 Hz), 1,56 (m, 2H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 0,92 (t, 3H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,4 Hz).

BEISPIEL 21

Flash-Chromatographie: 35/65 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,16 (2/3 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,15 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,4 Hz), 7,07 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,4 Hz), 4,25 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,65 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,53 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=3,6 und J=11,0 Hz), 2,53 (t, 2H, CH₃(CH₂)₅CH₂, J=7,8 Hz), 1,55 (m, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂), 1,28 (m, 8H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂), 1,20 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,7 Hz), 0,87 (t, 3H, CH₃(CH₂)₆, J=6,8 Hz).

Beispiel 22

Flash-Chromatographie: 4/5/1 : CH₂Cl₂/Petrolether/Ether;
R_f = 0,23 (2/3 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,3 Hz), 7,07 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,3 Hz), 4,23 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,65 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,53 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=3,5 und J=11,0 Hz), 2,52 (t, 2H, CH₃(CH₂)₅CH₂, J=7,7 Hz), 1,55 (m, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂), 1,28 (m, 8H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂), 1,19 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,6 Hz), 0,87 (t, 3H, CH₃(CH₂)₆, J=6,6 Hz).

BEISPIEL 23

Flash-Chromatographie: 4/5/1: CH₂Cl₂/Petrolether/Ether;
R_f = 0,31 (2/3 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,17 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,2 Hz), 7,09 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,2 Hz), 4,03 (m, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,70 (dd, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=3,7 und J=11,0 Hz), 3,61 (dd, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=3,2 und J=11,0 Hz), 2,53 (t, 2H, CH₃(CH₂)₅CH₂, J=7,7 Hz), 1,57 (m, 4H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 1,27 (m, 8H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂), 0,92 und 0,87 (2t, 6H, CH₃(CH₂)₆ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,6 und J=7,0 Hz).

BEISPIEL 24

Flash-Chromatographie: 4/5/1: CH₂Cl₂/Petrolether/Ether;
R_f = 0,31 (2/3 : Ether/PetrolEther)
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6 J=8,5 Hz), 7,06 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,5 Hz), 4,00 (m, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,67 (dd, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=4,2 und J=11,1 Hz), 3,58 (dd, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=3,5 und J=11,1 Hz), 2,53 (t, 2H, CH₃(CH₂)₅CH₂, J=7,7 Hz), 1,54 (m, 4H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 1,28 (m, 8H, CH₃(CH₂)₄CH₂CH₂), 0,91 und 0,87 (2t, 6H, CH₃(CH₂)₆ und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,4 und J=7,1 Hz).

BEISPIEL 25

Flash-Chromatographie: 2/3 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,31 (2/3 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,6 Hz), 7,08 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,6 Hz), 4,08 (m, 1H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl), 3,66 (dd, 1H, CH₂Cl, J=4,2 und J=11,0 Hz), 3,55 (dd, 1H, CH₂Cl, J=3,6 und J=11,0 Hz), 2,42 (m, 1H, CH-Ph), 1,70–1,82 (m, 6H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl und H-Cyclohexyl), 1,20–1,60 (m, 8H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl und H-Cyclohexyl), 0,88 (t, 3H, CH(CH₂CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,2 Hz).

BEISPIEL 26

Flash-Chromatographie: 1/1 : Ether/Petrolether;
R_f = 0,16 (1/1 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=8,7 Hz), 6,85 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=8,7 Hz), 4,26 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,92 (t, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂O, J=6,6 Hz), 3,72 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=4,3 und J=11,0 Hz), 3,55 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=3,5 und J=11,0 Hz), 1,76 (m, 2H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂O), 1,24–1,50 (m, 6H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂O), 1,21 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,7 Hz), 0,90 (t, 3H, CH₃(CH₂)₅O, J=6,9 Hz).

BEISPIEL 27

Flash-Chromatographie: 55/35/10 : CH₂Cl₂/Petrolether/Ether;
R_f = 0,16 (1/1 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,13 (d, 2H, H-C2 und H-C6, J=7,7 Hz), 6,79 (d, 2H, H-C3 und H-C5, J=7,7 Hz), 4,21 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,87 (t, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂O, J=6,5 Hz), 3,64 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=4,5 und J=11,0 Hz), 3,52 (dd, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=3,5 und J=11,0 Hz), 1,74 (m, 2H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂O), 1,24–1,45 (m, 6H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂O), 1,18 (d, 3H, CH(CH₃)CH₂Cl, J=6,6 Hz), 0,89 (m, 3H, CH₃(CH₂)₅O).

BEISPIEL 28

Flash-Chromatographie: 55/35/10 : CH₂Cl₂/Petrolether/Ether;
R_f = 0,26 (1/1 : Ether/Petrolether);
¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (d, 2H, H-C2 und C6, J=8,8 Hz), 6,82 (d, 2H, H-C3 und C5, J=8,8 Hz), 4,01 (m, 1H, CH(CH₃)CH₂Cl), 3,90 (t, 2H, CH₃(CH₂)₄CH₂O, J=6,6 Hz), 3,70 (dd, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=4,0 und J=11,2 Hz), 3,60 (dd, 1H, CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=3,3 und J=11,2 Hz), 1,75 (m, 2H, CH₃(CH₂)₃CH₂CH₂O), 1,20–1,70 (m, 8H, CH₃(CH₂)₃CH₂O) und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl), 0,90 (2t, 6H, CH₃(CH₂)₅O und CH(CH₂CH₃)CH₂Cl, J=7,4 und J=6,5 Hz).

BEISPIEL 29: Bestimmung der cytotoxischen Aktivität
Zellkultur: Tumorzelllinien (B16-F0, Caco-2, DU-145, HT-29, MDA-MB-231 und andere Zelllinien, die bisher in der Patentanmeldung beschrieben wurden) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC HTB-26; Bethesda, MD) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium, das mit 10%-igem Rinderfötenserum (Hyclone, Road Logan, Utah) versetzt wurde, gezüchtet und wurden in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert.
Arzneimittel: Alle Arzneimittel wurden in DMSO aufgelöst und die endgültige Konzentration des DMSO in dem Kulturmedium wurde bei 0,5 Vol.-% beibehalten.
Cytotoxische Untersuchungen. Am Tag 1 wurden die Tumorzellen in der Suspension in 100 μl auf Mikrotiterplatten (96 Wells) aufgebracht. Am Tag 0 wurden die Tumorzellen durch Zugabe von sich erhöhenden Konzentrationen des Arzneimittels (100 μl Lösung) behandelt. An diesem Tag wurde die Zahl der lebenden Zellen in den Wells, die unbehandelt waren, bestimmt. Die Zahl der lebenden Zellen wurde entweder unter Verwendung des MTT- oder des Resazurintests bestimmt. Die wachstumshemmende Wirkung dieser Verbindung wurde als die Konzentration an CAU ausgedrückt, die das Zellwachstum um 50%, G₅₀ in der folgenden Tabelle, hemmt.
Der MTT-Test wurde, wie oben beschrieben in Beispiel 1, durchgeführt. Die Resazurin-Test wurde wie folgt durchgeführt:
Ziehe den Überstand ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 100 μl NaCl 0,9% (Salzlösung) zu,
Ziehe den Überstand ein (Zellsuspension: Zentrifugiere erst),
Gebe 50 μl RZ (Resazurin 125 μg/ml/PBS:RPMI ohne FBS; 1:4) zu,
Inkubiere bei 37°C,
Nimm Fluoreszenzdaten zu unterschiedlichen Zeitpunkten auf.
FILTER EM EM
ZENTRUM 590 590
Tabelle VI In vitro cytotoxische Aktivität
Die Verbindungen, in denen R₂ H darstellt, sind nicht gemäß der Erfindung.

Claims

Verbindung der Formel:
wobei R₁ wie folgt ist: H, C₁-C₆ Alkyl; R₂ wie folgt ist: C₁-C₆ Alkyl; R₃ ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus H, Halogenid, C₁-C₇ Alkyl, C₁-C₇ Alkoxy, C₁-C₇ Hydroxyalkyl, C₁-C₇ Aminoalkyl, C₁-C₆ Thioalkyl, C₁-C₇ Cyanoalkyl, C₁-C₇ Haloalkyl, and C₃-C₇ Cycnoalkyl; R₄ ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Halogenid, C₁-C₇ Alkyl, C₁-C₇ Alkoxy, C₁-C₇ Hydroxyalkyl, C₁-C₇ Aminoalkyl, C₁-C₆ Thioalkyl, C₁-C₇ Cyanoalkyl, C₁-C₇ Haloalkyl, and C₃-C₇ Cycloalkyl; oder R₃ und R₄ Teil einer alicyclischen Gruppe sind, die an den Phenylring fusioniert sind, wie dies durch die nachfolgende Struktur gezeigt ist:
wobei n = 1; und R₅ H ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ Ethyl oder Propyl ist, und wobei das kohlenstofftragende R₂ die (R)-Isomerform aufweist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R₄ Jod ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R₄ ausgewählt wird aus sek. Butyl, tert. Butyl und iso-Propyl.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₃ und R₄ Methyl sind.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung im Wesentlichen reines R-Isomer ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.