DE60020873T2

DE60020873T2 - Nervonsäurederivate,ihre herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE60020873T2
Application number: DE60020873T
Authority: DE
Inventors: Keith Coupland; Yann Raoul
Original assignee: Croda International PLC
Current assignee: Croda International PLC
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-23
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2020-11-24
Also published as: EP1232139B1; GB0028525D0; CA2391953A1; AU1533301A; GB2357083A; ES2242651T3; US6664406B1; JP3993434B2; NZ518961A; AU775643B2; DE60020873D1; GB9927629D0; WO2001038288A1; EP1232139A1; ATE297887T1; CA2391953C; JP2003514886A; GB2357083B

Description

Gegenstand der Erfindung sind bestimmte Fettsäureester und ihre Herstellung und die Verwendung solcher Verbindungen oder pharmazeutischen Formulierungen davon in Arzneimitteln, wie zum Beispiel entzündungshemmenden oder immunmodulatorischen Mitteln, in einem Säuger, einschließlich Menschen.
Von Fettsäuren ist im Allgemeinen bekannt, dass sie Carbonsäuren einschließen, die Glyceride, wie zum Beispiel Triacylglycerole, das heißt die in den Fettspeicherzellen von Pflanzen und Tieren enthaltenen Carbonsäureester bilden. Viele solcher Fettsäuren stellen geradkettige Verbindungen mit von drei bis achtzehn Kohlenstoffatomen (C₃-C₁₈) dar; außer den C₃- und C₅-Verbindungen liegen, aufgrund ihrer Biosynthese, nur Säuren mit einer geraden Kohlenstoffatomzahl in erheblichen Mengen vor. Es sind sowohl gesättigte als auch ungesättigte Fettsäuren, wie zum Beispiel die ungesättigten C₁₈-Öl-, -α-Linol- und -γ-Linolen-(GLA)-Fettsäuren vorhanden, wobei jede eine, zwei bzw. drei Kohlenstoff Kohlenstoff-Doppelbindung(en) aufweist. Die übliche Bezeichnung verweist deshalb auf diese Säuren als 18:1-, 18:2bzw. 18:3-Fettsäuren. Die Konfiguration im Bereich dieser Doppelbindungen stellt gewöhnlich cis dar, die (im Vergleich zu den entsprechenden gesättigten und trans-Verbindungen) den Schmelzpunkt des entsprechenden Fettes senkt.
Außer diesen kurz- und mittelkettigen Fettsäuren sind die mit längeren Ketten, wie zum Beispiel C₁₆-C₂₄, auch bekannt und wurden untersucht, insbesondere die, die aus Fischölen, wie zum Beispiel Eicosapentaen- (EPA, 20:5 (n-3)) und Docosahexaensäuren (DHA, 22:6 (n:3)), worin x in (n-x) die Stellung der ersten Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindung in Bezug auf die terminale Methylgruppe an der Fettsäure anzeigt.
Ebenso wie ihr dietätischer Metabolismus und ihre potenzielle dietätische Verwendung wurden einige Fettsäuren im Zusammenhang mit Erkrankungen, wie zum Beispiel Schizophrenie (GLA und DHA) und bipolarer Störung (EPA und DNA) untersucht. Einige wurden auch zur Verbesserung des Transports von biologisch aktiven Arzneimitteln („Bioaktiva") durch die Lipidmembranen, durch Verknüpfung des Bioaktivums entweder direkt oder indirekt an bestimmte Fettsäuren, vorgeschlagen. So wird zum Beispiel in der PCT-Patentschrift Nr. WO 96/34846 offenbart, dass jedwede der essenziellen Fettsäuren (welche GLA, DHA und EPA einschließen) oder jedwede andere C_12-30-Fettsäure mit mindestens zwei Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen verwendet werden können. Unter einer weiten Reihe möglicher Bioaktiva und (12-30: ≥ 2) Fettsäuren, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, wird spezifisch GLA-GLA offenbart, wobei ein GLA-Molekülpaar über eine Propan-1,3-diol-Komponente, nämlich 1,3-(Di-z,z,z-octadeca-6,9,12-trienoyloxy)propan verknüpft ist. Es werden jedoch in keinem der pharmakologischen Tests irgendwelche biologischen Ergebnisse für GLA-GLA gezeigt, mit Ausnahme eines Berichts, dass es in Höhe bis zu 10 g/kg an Ratten und Mäuse ohne Hinweis auf Diarrhöe (d. h. Abwesenheit von Toxizität, anstelle der Anwesenheit einer therapeutischen Wirkung) verabreicht wurde.
Dennoch wird GLA-GLA als eine mögliche Propan-1,3-diol-Verbindung mit einem breiten Bereich aufgelisteter Anwendungen, einschließlich der Behandlung entzündlicher Erkrankungen, erwähnt. Wie jedoch hierin nachstehend mit besonderer Bezugnahme auf Beispiel 4 berichtet wird, fanden wir, dass GLA:GLA in unseren Tests auf entzündungshemmende Aktivität keine Wirkung besaß. Demgemäß könnte erwartet werden, dass andere Kombinationen von (12-30: ≥ 2)-Fettsäuren, die über eine Propan- 1,3-diol-Komponente verknüpft sind, auch keine entzündungshemmende Wirkung zeigen dürften, insbesondere, wenn eine derartige Wirkung nicht bereits für mindestens eine der beteiligten Fettsäurekomponenten nachgewiesen wurde.
Überdies wird in WO 96/34846 keine Möglichkeit der Verwendung anderer Fettsäuretypen, wie zum Beispiel derjenigen, die nur eine Kohlenstoff-Kohlenstoff Doppelbindung aufweisen, in Betracht gezogen. Ein solcher unterschiedlicher Fettsäuretyp stellt Nervonsäure dar. Nervonsäure (24:1 (n-9)) stellt cis- (oder z)-Tetracos-15-ensäure dar; sie wird nicht als eine essenzielle Fettsäure eingestuft und weist nur eine ungesättigte C=C-Bindung auf. Sie spielt eine Rolle bei der Biosynthese von Myelin und stellt eine der bedeutenden Fettsäuren in den Sphingolipiden im Gehirn dar. Nervonsäure wurde deshalb bei Erkrankungen, die von Demyelinisierung, wie zum Beispiel Adrenoleukodystrophie (ALD) und multipler Sklerose (MS), begleitet sind, impliziert. Es wurde deshalb die Verabreichung von Nervonsäure oder einer Quelle davon als eine pharmazeutische Formulierung davon an Patienten, die an von Demyelinisierung begleiteten Erkrankungen leiden (wie in der in PCT veröffentlichten Patentschrift Nr. WO 91/07955 beschrieben) oder zur Bereitstellung von Nervonsäure oder eines funktionellen Derivats davon als eine dietätische Ergänzung, zum Beispiel als Säuglings- oder Kleinkinderernährung oder an schwangere oder stillende Frauen (wie in der in PCT veröffentlichten Patentschrift Nr. PCT/GB95/01985 beschrieben), vorgeschlagen. Obwohl die genauen Ursachen der MS bisher noch nicht bekannt sind, deuten Hinweise nunmehr stark darauf hin, dass MS aus einem Autoimmunvorgang resultiert, der durch einen Umweltfaktor, möglicherweise eine nicht spezifische Virusinfektion, in einer genetisch suszeptiblen Person, bei der die Immunzellen das Myelin irrtümlich als einen Fremdeindringling ansehen und es angreifen, getriggert wird. Dieser Vorgang verursacht eine perivaskuläre Entzündung im ZNS und schädigt allmählich nicht nur das Myelin, sondern auch das darunter liegende Nervengewebe. Es ist jedoch nicht bekannt, dass Nervonsäure über irgendeine allgemeine Wirkung auf die Entzündung oder Entzündungskrankheiten verfügt.
Aufgrund der Schädigung des Myelins und Nervengewebes wird die Blut-Hirn-Schranke unterbrochen, wodurch aktivierten T-Zellen ermöglicht wird, in das Gehirn einzudringen und andere Lymphozyten zu rekrutieren. Aktivierte T-Zellen setzen Lymphotoxin, Interferon-gamma (IFN-γ) und andere entzündlichen Cytokine frei. Lymphotoxin kann Oligodendrozyten schädigen, und IFN-γ, von dem gezeigt wurde, dass es die MS-Exazerbationen provoziert, stimuliert das Immunsystem auf mehrere verschiedene Arten und Weisen, von denen angenommen wird, dass sie die MS aggravieren. Oligodendrozyten synthetisieren Myelin-spezifische Proteine und Lipide und ihre Rolle ist sowohl für die normale Myelinscheidenbildung als auch die normale Hirnfunktion kritisch.
IFN-γ augmentiert zum Beispiel die Expression der Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse II auf Makrophagen und induziert ihre Expression auf Astrozyten, der Mikroglia und Endothelzellen. Mit diesen MHC-Molekülen assoziierte antigene Myelinpeptide werden von den T-Zellen erkannt, die als Antwort auf die Antigenpräsentation proliferieren, wobei die Immunantwort amplifiziert wird.
Durch IFN-γ aktivierte Makrophagen setzen auch den Tumornekrosefaktor (TNF) frei, von dem gezeigt wurde, dass er die Oligodendrozyten in vitro schädigt. Außerdem werden Cytokine, Proteinasen und Lipasen sezerniert, und B-Zellen werden zum Synthetisieren von Antikörpern induziert. Diese Antwort führt zur Demyelinisierung und Gliose, die veranlasst, dass Nervenimpulse verlangsamt oder angehalten werden und die Symptome der MS hervorruft.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass bestimmte Nervonsäure-Derivate eine entzündungshemmende und/oder immunmodulatorische Aktivität besitzen. Einige dieser Derivate unterstützen überdies die Passage der Nervonsäure über die Blut-Hirn-Schranke.
Es wird erfindungsgemäß eine Verbindung der Formel (I)
bereitgestellt, worin R Wasserstoff (H) oder einen Rest einer Carbonsäure oder einem Salz der Verbindungen darstellt, worin R für H steht.
Die Definition der Formel (I) schließt gegebenenfalls auch individuelle Isomere und Gemische davon ein. Im Rahmen des Hintergrunds versteht man unter dem Begriff „Biopräkursor" oder „Prodrug" ein pharmakologisch verträgliches Derivat – z. B. einen Ester (wie zum Beispiel ein biolabiles Esterderivat von einer -COOH-Gruppe) – die in vivo in eine erfindungsgemäße Verbindung umgewandelt wird. Geeignete Prodrugs können unter Bezugnahme auf Goodman und Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Auflage, McGraw-Hill, Int. Aufl. 1992, insbesondere „Biotransformation of Drugs", S. 13–15, bestimmt werden.
Die Carbonsäure, auf die bei der Definition von R Bezug genommen wird, weist von 1 bis 26 Kohlenstoffatom(en) auf, und kann gerad- oder verzweigtkettig, gesättigt oder ungesättigt sein. Die Carbonsäure ist bevorzugter geradkettig und ist aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus einfach- und mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin R einen Rest von einer einfach- oder mehrfach ungesättigten C₁₈- bis C₂₄-Fettsäure mit von 1 bis 6 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en) darstellt. Besonders bevorzugt ist, wenn A einen Rest der Nervonsäure (24:1(n-9)), Docosahexaensäure (22:6(n-3)) oder γ-Linolensäure (18:3(n-6)) darstellt, worin x in (n-x) die Stellung der ersten Doppelbindung in Bezug auf die terminale Methylgruppe der Fettsäure anzeigt.
Es wird von einem Fachmann erkannt werden, dass die Verbindungen der Formel (I), worin R für H steht, als Intermediärprodukte bei der Synthese anderer Verbindungen der Formel (I) nützlich sind. Demgemäß wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) bereitgestellt, worin R einen Rest einer Carbonsäure darstellt, welches Verfahren das Reagieren der Verbindung der Formel (IA), nämlich 1-(z-15-Tetracosenoylpoxy)-3-hydroxypropan,
mit der entsprechenden Carbonsäure der Formel R-H umfasst, worin R wie für die Formel (I) definiert ist.
Geeignete Bedingungen für diese Veresterungsreaktion sind dem Fachmann bekannt und schließen die Anwesenheit von hypophosphoriger Säure, bevorzugt unter Erhitzen auf Rückfluss unter einer inerten Atmosphäre, wie zum Beispiel Stickstoff, ein.
Die Verbindung der Formel (IA) kann selbst auf übliche Weise, wie zum Beispiel aus der Reaktion des Säurechlorids der Nervonsäure (d. h. CH₃-(CH₂)_y-CH=CH-(CH₂)₁₃-COCl) mit Propan-1,3-diol in Anwesenheit einer Base, wie zum Beispiel einer organischen Base, zum Beispiel Trialkylaminen, wie z. B. Triethylamin und Tributylamin und Pyridin, 2,6-Diemethylpyridin und Chinolin, bevorzugt in einem organischen aprotischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem halogenierten Alkan, zum Beispiel Dichlormethan, Ether, Tetrahydrofuran und Toluen, hergestellt werden. Die Reaktion wird bevorzugt mit Kühlung, wie zum Beispiel ca. 0°C, unter einer inerten Atmosphäre, wie zum Beispiel Stickstoff, durchgeführt.
Das Säurechlorid von Nervonsäure (z-15-Tetracosenoylchlorid) kann auf übliche Weise aus Nervonsäure und Thionylchlorid, Phosphortrichlorid oder insbesondere Phosphorpentachlorid, bevorzugt in einem polaren Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem Ether in wasserfreien Bedingungen und bevorzugt unter einer inerten Atmosphäre, hergestellt werden.
Im Falle der Herstellung der Verbindung der Formel (I), worin R den Rest der Nervonsäure darstellt, kann das vorstehend beschriebene Zweistufenverfahren in einer einzelnen Blase aus Nervonsäure, Propan-1,3-diol und zum Beispiel hypophosphoriger Säure durchgeführt werden.
Nervonsäure ist gewerblich von Aldrich Chemicals, UK, erhältlich, oder ist andernfalls, wie zum Beispiel in der US-Patentschrift Nr. US 5194448 oder in der veröffentlichten PCT-Patentschrift Nr. PCT/GB95/01985) beschrieben, verfügbar.
Es wurde, wie vorstehend erwähnt, überraschend gefunden, dass die Verbindungen der Formel (I), worin R anders als H ist, nämlich Verbindungen der Formel (IB)
worin R¹ einen Rest einer Carbonsäure darstellt, entzündungshemmende und/oder immunmodulatorische Aktivität besitzen.
Bevorzugte Carbonsäurereste sind wie hierin vorstehend in Bezug auf die Definition von R beschrieben.
Demgemäß sind erfindungsgemäß die folgenden spezifischen Verbindungen der Formel (IB) bereitgestellt:
1-(z-15-Tetracosenoyloxy)-3-(z,z,z-6,9,12-octadecatrienoyloxy)propan (hierin nachstehend als NA:GLA bezeichnet);
1-(z-15-Tetracosenoyloxy)-3-(z-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyloxy)propan (hierin nachstehend als NA:DHA bezeichnet); und
1,3-Di-(z-15-tetracosenoyloxy)propan (hierin nachstehend als NA:NA bezeichnet).
Unter ‚entzündungshemmend’ versteht man hierin die Fähigkeit, eine Entzündung oder eine entzündliche Antwort zu reduzieren, zu verbessern oder zu verhindern. Unter ‚immunmodulatorisch’ versteht man hierin die Fähigkeit, eine Immunantwort, wie zum Beispiel durch Suppression oder Stimulation einer derartigen Antwort, zu modulieren. Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass sowohl eine entzündungshemmende als auch immunmodulatorische Aktivität zur Behandlung oder Prävention einiger medizinischer Erkrankungen wünschenswert sein könnte.
Die entzündungshemmenden und/oder immunmodulatorischen Wirkungen der Verbindungen der Formel (IB) können in Tests zur experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE), die in den Beispielen hierin nachstehend ausführlicher beschrieben sind, beobachtet werden. EAE stellt eine entzündliche Autoimmunkrankheit des ZNS dar, die durch perivaskuläre und subpiale inflammatorische Infiltrate und Demyelinisierungsläsionen gekennzeichnet ist. Sie kann durch Immunisation mit ganzem homogenisiertem Rückenmark oder Gehirnmaterial, gereinigtem Myelin oder Oligodendrozyten, gereinigten Myelinkomponenten kombiniert mit Adjuvanzien induziert werden. Die Verwendung von Adjuvanzien, wie zum Beispiel Freund'schem Adjuvanz, ist zur Verstärkung der immunologischen Antwort, die letztlich in der Erkrankung resultiert, notwendig. Aufgrund der relativen Leichtigkeit der Reinigung wurden basisches Myelinprotein (MBP) und Proteolipidprotein (PLP) und ihre Fragmente als Encephalitogene bei EAE eingehend untersucht.
EAE-Modelle können breitgefächert als akute monophasische EAE oder chronisch-rezidivierende EAE klassifiziert werden.
Bei der akuten EAE unterliegen suszeptible Tiere, die mit kleinen Dosen der Myelinantigene in komplettem Freund'schem Adjuvanz (CFA) injiziert wurden, innerhalb von 10 bis 14 Tagen einer paralytischen Erkrankung. Das Einsetzen der Erkrankung wird als Tonusverlust des Schwanzes und/oder leichte Paralyse der Hinterbeine beobachtet, die zu Muskelschwund in den Keulen und im unteren Rückenbereich fortschreitet. In schweren Fällen kann sich die Paralyse auf die Vordergliedmaßen ausbreiten. Wenn die Tiere nicht moribund werden, geht der Schweregrad der Paralyse zurück und die Tiere erholen sich wieder. Eine klassische akute EAE kann bei Lewis-Ratten beobachtet werden; solche Modelle sind zur Untersuchung der Wirkungen einer Arzneimittel- und/oder Immuntherapie, die auf die Reduktion der akuten Entzündung des ZNS abgezielt ist, ideal geeignet.
Das klinische Grading und die Klassifikation des neurologischen Defizits hängen vom Stamm des verwendeten Tieres und vom Krankheitsverlauf ab. Es wird im Allgemeinen eine Gradeinteilung nach Punkten von 0 bis 6 verwendet, die im Bereich von asymptomatisch (0) bis zum Tod (6) liegt.
Vor dem Einsetzen der klinischen Zeichen, leiden die Tiere an Gewichtsverlust und die Untersuchung des ZNS lässt eine mononukleare Zellinfiltration, insbesondere im Rückenmark erkennen. Nach dem Einsetzen klinischer Zeichen infiltrieren zunehmende Anzahlen mononuklearer Zellen das ZNS und akkumulieren sich vor der Infiltration des Parenchyms in den subpialen Arealen des Rückenmarks. Anhand der Immunhistochemie und von Zellisolationsverfahren wurden die prädominanten Zellen als Makrophagen und CD4+-T-Zellen identifiziert. Es ist bemerkenswert, dass die Demyelinisierung nicht zu den klassischen Anzeichen der akuten EAE zählt, und deshalb ist dieser Test eher Indikativ für eine entzündungshemmende/immunmodulatorische Aktivität im Allgemeinen als nur auf die, welche die demyelinisierende Erkrankungen begleiten könnte.
Die chronische EAE ist gekennzeichnet durch das Fortdauern des neurologischen Defizits nach einer Episode einer akuten EAE ohne Genesung.
Als Alternative tritt nach der akuten Phase eine volle Genesung (Remission) auf, der Phasen der klinischen und histologischen Erkrankung und weitere Remissionen folgen. Hierbei handelt es sich um eine chronisch-rezidivierende (und remittierende) EAE, die mehr Ähnlichkeit mit den Symptomen der multiplen Sklerose als das akute Modell aufweist. Obwohl die chronisch-rezidivierende EAE bei vielen Spezies charakterisiert wurde, weisen Mausmodelle den Vorteil eines gut charakterisierten Immunsystems und die Verfügbarkeit einer weiten Reihe verschiedener immunologischer Reagenzien auf, mit denen die Erkrankung untersucht werden kann.
Außer den bei der EAE vorliegenden entzündlichen Effekten präsentiert sich die chronischrezidivierende EAE (CREAE) primär mit Demyelinisierung in diesen inflammatorischen Arealen, die in einer Rezidivphase besonders ausgeprägt sind.
Die stark positiven Ergebnisse, die mit den Tests bei der akuten EAE mit NA:NA erhalten werden, weisen darauf hin, dass die Verwendung der Propan-1,3-diol-Komponente als ein Linker zwischen den beiden Fettsäureacyl-Komponenten von größter Bedeutung ist, da Glyceryltrinervonat (GTN), das aus drei an eine Glycerol-Hauptkette gebundenen Fettsäureacyl-Komponenten besteht, keine Wirkung auf den Verlauf der akuten EAE zeigte. Die Annahme, dass lediglich das Vorliegen der Propan-1,3-diol-Komponente in sich selbst ausreichend ist, um Anlass zu den positiven Ergebnissen zu geben, ist jedoch nicht ausreichend. Wir haben gefunden, dass NA:GLA auch Anlass zu positiven Ergebnissen gab, wohingegen Tests unter Verwendung von GLA:GLA diese Wirkung nicht aufweisen. Dies ist überraschend, da die Offenbarung der PCT-Patentschrift Nr. WO 96/348846, wie vorstehend besprochen, zur Erwartung führen könnte, dass GLA:GLA zu besonders vorteilhaften biologischen Ergebnissen führen würde. Das einfache Zusammenfügen zweier Fettsäurekomponenten (R¹) über eine Propan-1,3-diol-Komponente führt deshalb nicht unbedingt zu einer Verbindung mit immunimodulatorischer und/oder entzündungshemmender Aktivität.
Deshalb würde es den Anschein haben, dass Propan-1,3-diol-Derivate von Nervonsäure im Vergleich zu denen von Fettsäuren mit zwei oder mehr ungesättigten C=C-Bindungen nicht vorherzusagende und unterschiedliche Aktivitäten aufweisen. Eine Struktur-Aktivitätsbeziehung für NA:NA wurde etabliert und es wurde auch gezeigt, dass Nervonsäure in der Form der Derivate NA:NA und NA:GLA eine allgemeine entzündungshemmende Aktivität, die zuvor noch nicht gezeigt wurde, aufweist.
Demzufolge können die Verbindungen der Formel (IB) bei der Linderung der rheumatoiden Arthritis, rheumatoiden Spondylitis, Osteoarthritis, Gichtarthritis und anderen arthritischen Erkrankungen; entzündeten Gelenken; Ekzem und anderen entzündlichen Hauterkrankungen; entzündlichen Augenerkrankungen einschließlich Konjunktivitis; Pyrexie und anderen mit einer Entzündung assoziieren Erkrankungen, einschließlich der Reduktion von Gewebsnekrose bei chronischer Entzündung; der Suppression der Gewebeabstoßung nach Transplantationschirurgie, Crohn-Krankheit und ulzerativer Kolitis angewendet werden.
Die Verbindungen der Formel (IB) können auch bei der Behandlung oder Prophylaxe von entzündlichen Atemwegserkrankungen, wie zum Beispiel Asthma und Bronchitis verwendet werden. Andere Erkrankungen, die zur Behandlung mit einem Immunmodulator geeignet sind, schließen systemischen Lupus erythematodes; multiple Sklerose; Myasthenia gravis; progressive systemische Sklerose; atopische Dermatitis; Hyperimmunglobin E; Hepatitis-B-Antigen-negative chronische aktive Hepatitis; Hashimoto-Thyreoiditis; familiäres Mittelmeerfieber; Basedow-Krankheit; autoimmunhämolytische Anämie; primäre biliäre Zirrhose; und entzündliche Darmerkrankung ein. Weitere zur Behandlung mit einem Immunstimulans geeignete Erkrankungen schließen jedwede ein, worin das Immunsystem kompromittiert, beeinträchtigt oder dysfunktionell ist, wie zum Beispiel bei AIDS-Patienten und den mit Virusinfektionen begleiteten, wie zum Beispiel HIV.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (IB) zur Anwendung als einen Entzündungshemmer und/oder ein Immunsuppressivum schließen NA:NA und NA:GLA, insbesondere NA:GLA ein; bevorzugt für die Immunstimulans-Anwendung ist NA:DHA.
Die Menge einer Verbindung der Formel (IB) (der Wirkstoff), die zur therapeutischen Wirkung erforderlich ist, wird natürlich mit der jeweiligen Verbindung, der Verabreichungsroute und dem Säuger unter der Behandlung variieren. Eine geeignete Dosis einer Verbindung der Formel (IB) für einen Säuger, der an einer Erkrankung wie hierin vorstehend definiert, leidet, liegt im Bereich von 0,1 bis 1000 mg bezogen auf die Basis pro kg Körpergewicht, wobei die bevorzugteste Dosierung 0,5 bis 500 mg/kg bezogen auf das Körpergewicht des Säugers, wie zum Beispiel von 1 bis 50 mg/kg, wie zum Beispiel 5 bis 25 mg/kg darstellt, die zwei- oder dreimal täglich verabreicht wird.
Im Fall der Behandlung oder Prophylaxe von entzündlichen Atemwegserkrankungen beträgt eine geeignete antiasthmatische Dosis einer Verbindung der Formel (IB) 1 mg bis 10 mg bezogen auf die Basis pro Kilogramm Körpergewicht, wobei die bevorzugteste Dosierung 1 mg bis 5 mg/kg bezogen auf das Körpergewicht des Säugers, wie zum Beispiel von 1 bis 2 mg/kg, darstellt.
Während es möglich ist, einen Wirkstoff allein als die Rohchemikalie zu verabreichen, wird bevorzugt, sie als eine pharmazeutische Formulierung darzureichen. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, sowohl für die veterinär- als auch die humanmedizinische Anwendung, umfassen einen Wirkstoff in Assoziation mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger dafür und optional einen anderen oder andere therapeutische(n) Bestandteil(e). Der/Die Träger muss/müssen in dem Sinn ‚verträglich’ sein, dass er/sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger davon nicht nachteilig ist/sind.
Der Wirkstoff umfasst zweckmäßigerweise von 0,1 Gew.-% bis 99,9% Gew.-% bezogen auf die Formulierung. Die Dosiseinheiten einer Formulierung enthalten geeigneterweise zwischen 0,1 mg und 1 g des Wirkstoffes. Die Formulierung ist bevorzugt zur Verabreichung von ein- bis sechsmal täglich, wie zum Beispiel zwei- bis viermal täglich, geeignet. Zur topischen Verabreichung umfasst der Wirkstoff bevorzugt von 1 Gew.-% bis 2 Gew.-% der Formulierung, der Wirkstoff kann aber so viel wie 10 Gew.-% umfassen. Zur nasalen oder bukkalen Verabreichung geeignete Formulierungen, wie zum Beispiel die hierin nachstehend beschriebenen selbstgetriebenen Pulverdispensierformulierungen, können 0,1 bis 20 Gew.-%, wie zum Beispiel ca. 2 Gew.-% Wirkstoff, umfassen.
Die Formulierungen schließen die in einer für die orale, ophthalmische, rektale, parenterale (einschließlich der subkutanen, vaginalen, intraperitonealen, intramuskulären und intravenösen), intraartikuläre, topische, nasale oder bukkale Verabreichung geeigneten Form ein.
Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in einer Dosierungseinheitsform dargereicht werden und können mittels jedweden im Stand der Pharmazie weithin bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schließen den Schritt des Inkontaktbringens des Wirkstoffes mit dem Träger ein, der einen oder mehr Hilfsstoff(e) ausmacht. Die Formulierungen werden im Allgemeinen durch gleichmäßiges und inniges Inkontaktbringen des Wirkstoffs in Assoziation mit einem flüssigen Träger oder einem fein verteilten festen Träger oder beidem hergestellt, und dann wird das Produkt gegebenenfalls in die gewünschte Formulierung geformt.
Geeignete erfindungsgemäße Formulierungen zur oralen Verabreichung können in der Form diskreter Einheiten, wie zum Beispiel als Kapseln, Cachets, Tabletten oder Lutschtabletten, die jeweils eine prädeterminierte Menge des Wirkstoffs enthalten, in der Form eines Pulvers oder Granulats; in der Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder nicht wässrigen Flüssigkeit; oder in der Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasser-in-Öl-Emulsion vorliegen. Der Wirkstoff kann auch in der Form eines Bolus, Linctus oder einer Paste vorliegen. Für derartige Formulierungen sind eine Reihe verschiedener Verdünnungen des Wirkstoffs im Vehikel, wie zum Beispiel in von 1%iger bis 99%iger, bevorzugt 5%iger bis 50%iger und bevorzugter 10%iger bis 25%iger Verdünnung geeignet. In Abhängigkeit vom Verdünnungsgrad stellt die Formulierung entweder bei Raumtemperatur (im Bereich von ca. 20°C) eine Flüssigkeit oder einen niedrigschmelzenden Feststoff dar. Zusammensetzungen, in denen NA:GLA zum Beispiel den Wirkstoff darstellt, sind alle in allen Anteilen bei Raumtemperatur mischbar, wohingegen diejenigen, die NA:NA umfassen, bei Raumtemperatur Flüssigkeiten darstellen, wenn die Konzentration bei oder unter ca. 25% liegt.
Eine Tablette kann durch Komprimieren oder Formen des Wirkstoffs optional mit einem oder mehr Hilfsstoff(en) hergestellt werden. Komprimierte Tabletten können durch Komprimieren, in einer geeigneten Maschine, des Wirkstoffs in einer freifließenden Form, wie zum Beispiel als ein Pulver oder Granulat, optional mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel, Tensid oder Dispergiermittel gemischt hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen in einer geeigneten Maschine, eines Gemischs aus dem pulverförmigen Wirkstoff und eines mit einem inerten Verdünnungsmittel angefeuchteten Trägers hergestellt werden.
Formulierungen zur rektalen Verabreichung können in der Form eines Suppositoriums, das den Wirkstoff und einen Träger, wie zum Beispiel Kakaobutter, inkorporiert, oder in der Form eines Klistiers vorliegen.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen, wie vorstehend beschrieben, eine Lösung, Suspension oder Emulsion, zweckmäßigerweise eine sterile wässrige Zubereitung des Wirkstoffs, die bevorzugt mit dem Blut des Empfängers isoton ist.
Zur intraartikulären Verabreichung geeignete Formulierungen können in der Form einer sterilen wässrigen Zubereitung des Wirkstoffs vorliegen, die in einer mikrokristallinen Form, zum Beispiel in der Form einer wässrigen mikrokristallinen Suspension oder als eine mizelläre Dispersion oder Suspension vorliegen kann. Liposomale Formulierungen oder biologisch abbaubare Polymersysteme können auch zur Darreichung des Wirkstoffs, insbesondere sowohl zur intraartikulären als auch ophthalmischen Verabreichung verwendet werden.
Zur topischen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen flüssige oder halbflüssige Zubereitungen, wie zum Beispiel Linimente, Lotionen oder Applikationen; Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie zum Beispiel Cremes, Salben oder Pasten; oder Lösungen oder Suspensionen, wie zum Beispiel Tropfen ein. Zur ophthalmischen Verabreichung kann der Wirkstoff zum Beispiel in der Form wässriger Augentropfen, wie zum Beispiel einer 0,1–1,0%igen Lösung, dargereicht werden.
Erfindungsgemäße Tropfen können sterile wässrige oder ölige Lösungen umfassen und können durch Auflösen des Wirkstoffs in einer geeigneten wässrigen Lösung, enthaltend ein Bakterizid und/oder Fungizid und/oder jedwedes andere geeignete Konservierungsmittel, hergestellt werden. Die sich ergebende Lösung kann dann durch Filtration geklärt, in ein geeignetes Behältnis transferiert und dann fest verschlossen und durch Autoklavieren oder Aufrechterhaltung bei 90–100°C für eine Zeitdauer von 30 Minuten sterilisiert werden. Die Lösung kann mittels Filtration sterilisiert and mittels eines aseptischen Verfahrens in ein Behältnis transferiert werden. Zu den zum Einschluss in die Tropfen geeigneten Konservierungsmitteln, Bakteriziden und Fungiziden zählen Phenylquecksilbersalze (0,002%), Benzalkoniumchlorid (0,01%) und Chlorhexidinacetat (0,01%). Zu geeigneten Lösungsmitteln zur Herstellung einer öligen Lösung gehören Glycerol, verdünnter Alkohol und Propylenglykol.
Erfindungsgemäße Lotionen schließen diejenigen ein, die zur Applikation in das Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wässrige Lösung umfassen, die optional ein Bakterizid oder Konservierungsmittel enthält, die anhand von Verfahren hergestellt wird, die denen zur Herstellung von Tropfen ähnlich sind. Lotionen oder Linimente zur Applikation auf die Haut können auch ein Mittel zum beschleunigten Trocknen und Kühlen der Haut, wie zum Beispiel einen Alkohol oder einen Weichmacher oder ein Feuchthaltemittel, wie zum Beispiel Glycerol oder ein Öl, wie zum Beispiel Kastoröl oder Arachisöl, einschließen.
Cremes, Salben oder Pasten stellen erfindungsgemäß halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs zur äußerlichen Anwendung dar. Sie können durch Mischen des Wirkstoffs in Granulat- oder Pulverform, allein oder in Lösung oder Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Lösung in geeigneten Maschinen, mit einer Fett- oder Nichtfettgrundlage hergestellt werden. Die Grundlage kann ein oder mehr eines harten, weichen oder flüssigen Paraffins, Glycerols, Bienenwachses, einer metallischen Seife; eines Gummischleims; eines Öls, wie zum Beispiel eines pflanzlichen Öls, z. B. Mandel-, Mais-, Arachis-, Kastor- oder Olivenöl; Wollfett oder seine Derivate; oder einen Fettsäureester von einer Fettsäure zusammen mit einem Alkohol, wie zum Beispiel Propylenglykol oder Makrogole, umfassen. Die Formulierung kann auch ein geeignetes oberflächenaktives Mittel, wie zum Beispiel ein anionisches, kationisches oder nicht ionisches Tensid, wie zum Beispiel ein Glykol oder Polyoxyethylen-Derivate davon, umfassen. Suspensionsmittel, wie zum Beispiel natürliche Gummis können optional mit anderen anorganischen Materialien, wie zum Beispiel kieseligen Siliziumdioxiden und anderen Bestandteilen, wie zum Beispiel Lanolin, inkorporiert werden.
Zur Verabreichung in die Nase oder Mundhöhle geeignete Formulierungen schließen diejenigen ein, die zur Inhalation oder Insufflation geeignet sind und schließen Pulver, selbsttreibende und Sprühformulierungen, wie zum Beispiel Aerosole und Zerstäuber ein. Wenn sie dispergiert sind, weisen die Formulierungen bevorzugt eine Partikelgröße im Bereich von 10 bis 200 μm auf.
Solche Formulierungen können in der Form eines fein zermahlenen Pulvers zur pulmonalen Verabreichung aus einer Pulverinhalationsvorrichtung oder selbsttreibenden Pulverdispensierformulierungen vorliegen, bei denen der Wirkstoff als ein fein zermahlenes Pulver bis zu 99 Gew.-% der Formulierung umfassen kann. Im Fall der selbsttreibenden Lösung und Sprühformulierungen kann die Wirkung entweder durch Wahl eines Ventils mit den gewünschten Sprühmerkmalen (d. h. die zur Herbeiführung eines Sprays mit der gewünschten Partikelgröße fähig ist) oder Inkorporation des Wirkstoffs als ein suspendiertes Pulver von kontrollierter Partikelgröße erreicht werden. Folglich wird die Formulierung, anstelle in die Lungen zu passieren, weitgehend in der Nasenhöhle zurückgehalten. Diese selbsttreibenden Formulierungen können entweder Pulverdispensierformulierungen oder Formulierungen, die den Wirkstoff einer Lösung oder Suspension als Tröpfchen dispensieren, vorliegen.
Selbsttreibende Pulverdispensierformulierungen umfassen bevorzugt dispergierte Partikel des festen Wirkstoffs und ein flüssiges Treibmittel mit einem Siedepunkt unter 18°C bei Atmosphärendruck. Das flüssige Treibmittel kann jedwedes bekannte Treibmittel darstellen, das zur arzneilichen Verabreichung geeignet ist und kann einen oder mehr niedere(n) Alkylkohlenwasserstoff(e) oder halogenierte(n) niedere(n) Alkylkohlenwasserstoff(e) oder Gemische davon enthalten; chlorierte und fluorierte niedere Alkylkohlenwasserstoffe sind besonders bevorzugt. Im Allgemeinen macht das Treibmittel 50 bis 99,9 Gew.-% der Formulierung aus, während der Wirkstoff 0,1 bis 20 Gew.-%, zum Beispiel ca. 2 Gew.-%, der Formulierung ausmacht.
Der pharmazeutisch verträgliche Träger in derartigen selbsttreibenden Formulierungen kann außer dem Treibmittel andere Bestandteile einschließen, insbesondere ein Tensid oder ein festes Verdünnungsmittel oder beides. Tenside sind erwünscht, da sie die Agglomerisation der Partikel des Wirkstoffs verhindern und den Wirkstoff in Suspension aufrechterhalten. Insbesondere wertvoll sind flüssige nicht ionische Tenside und feste anionische Tenside oder Gemische davon. Geeignete flüssige nicht ionische Tenside stellen diejenigen dar, die ein hydrophiles-lipophiles Gleichgewicht (HLB, siehe Journal of the Society of Cosmetic Chemists Vol. 1, S. 311–326 (1949)) von unter 10, insbesondere Ester und Teilester von Fettsäuren mit aliphatischen mehrwertigen Alkoholen, zum Beispiel Sorbitanmonooleat und Sorbitantrioleat, die gewerbsmäßig als ‚Span 80^TM’ bzw. ‚Span 85^TM’ erhältlich sind, aufweisen. Das flüssige nicht ionische Tensid kann von 0,01 bis zu 20 Gew.-% der Formulierung ausmachen, obwohl es bevorzugt unter 1 Gew.-% der Formulierung ausmacht. Geeignete feste anionische Tenside schließen Alkalimetall, Ammonium- und Aminsalze von Dialkylsulfosuccinat (worin die Alkylgruppen 4 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen) und Alkylbenzolsulfonsäure (worin die Alkylgruppe 8 bis 14 Kohlenstoffatome aufweist) ein. Die festen anionischen Tenside können von 0,01 bis zu 20 Gew.-% der Formulierung, obwohl bevorzugt unter 1 Gew.-% der Zusammensetzung ausmachen. Feste Verdünnungsmittel können in solche selbsttreibenden Formulierungen, in denen sich die Dichte des Wirkstoffs weitgehend von der Dichte des Treibmittels unterscheidet, vorteilhaft inkorporiert werden; sie helfen auch bei der Aufrechterhaltung des Wirkstoffs in Suspension. Das feste Verdünnungsmittel liegt in der Form eines feinen Pulvers, bevorzugt mit einer Partikelgröße der gleichen Größenordnung wie die der Partikel des Wirkstoffs vor. Geeignete feste Verdünnungsmittel schließen Natriumchlorid, Natriumsulfat und Zucker ein.
Erfindungsgemäße Formulierungen können auch in der Form einer selbsttreibenden Formulierung vorliegen, worin der Wirkstoff in Lösung vorliegt. Solche selbsttreibenden Formulierungen können den Wirkstoff Treibstoff und das Cosolvens und vorteilhafterweise einen Antioxidans-Stabilisator umfassen. Das Treibmittel stellt eines oder mehr dieser bereits vorstehend aufgelisteten dar. Cosolvenzien werden aufgrund ihrer Löslichkeit im Treibmittel, ihrer Fähigkeit, den Wirkstoff aufzulösen und weil sie den niedrigsten Siedepunkt aufweisen, was mit diesen vorstehend erwähnten Eigenschaften konsistent ist, ausgewählt. Geeignete Cosolvenzien stellen niedere Alkylalkohole und Gemische davon dar. Das Cosolvens kann 5 bis 40 Gew.-% der Formulierung, obwohl bevorzugt weniger als 20 Gew.-% der Formulierung ausmachen. Antioxidans-Stabilisatoren können in solche Lösungsformulierungen zum Inhibieren des Verfalls des Wirkstoffs inkorporiert werden und stellen zweckmäßigerweise Alkalimetallascorbate oder -bisulfite dar. Sie liegen bevorzugt in einer Menge von bis zu 0,25 Gew.-% der Formulierung vor.
Solche selbsttreibenden Formulierungen können anhand eines jedweden im Stand der Technik bekannten Verfahrens hergestellt werden. Der Wirkstoff wird zum Beispiel (entweder als Partikel wie hierin vorstehend in Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit oder gegebenenfalls in einer bis zu 20 gew.-%igen Lösung in einem verträglichen Cosolvens) mit jedweden anderen Bestandteilen des pharmazeutisch verträglichen Trägers gemischt. Das sich ergebende Gemisch wird gekühlt, in ein geeignetes gekühltes Behältnis eingeführt, und es wird Treibmittel in flüssiger Form zugefügt; und das Behältnis wird dicht verschlossen. Als Alternative können derartige selbsttreibenden Formulierungen durch Mischen des Wirkstoffs entweder in Partikeln, wie hierin vorstehend beschrieben, oder in 2 bis 20 Gew.-% Alkohol oder wässriger Lösung, gegebenenfalls zusammen mit den übrigen Bestandteilen des pharmazeutisch verträglichen Trägers mit Ausnahme des Treibmittels hergestellt werden; Einführen des sich ergebenden Gemischs, optional mit etwas Treibmittel, in ein geeignetes Behältnis; und Injektion des Treibmittels, unter Druck, in das Behältnis bei Umgebungstemperatur durch ein Ventil, das einen Teil des Behältnisses umfasst und zur Kontrolle der Freisetzung der Formulierung aus ihm verwendet wird. Das Behältnis wird gegebenenfalls mittels Entfernung der Luft aus ihm in einer zweckmäßigen Phase der Herstellung der selbsttreibenden Formulierung durchspült.
Ein geeignetes Behältnis für die selbsttreibende Formulierung ist eines, das mit einem manuell zu betätigenden Ventil versehen und aus Aluminium, Edelstahl oder verstärktem Glas angefertigt ist. Das Ventil sollte selbstverständlich eines sein, das die gewünschten Sprühmerkmale von Partikeln aufweist, die eine genau festgelegte Menge der Formulierung nach jeder Betätigung des Ventils, zum Beispiel ca. 50 bis 100 Mikroliter der Formulierung in jeder Abgabe abgibt; Dosiervorrichtungen sind dem Fachmann weithin bekannt.
Erfindungsgemäße Formulierungen können auch in der Form einer wässrigen oder alkoholischen Lösung, optional einer sterilen Lösung, des Wirkstoffs zur Anwendung in einem Vernebler oder Zerstäuber vorliegen, worin ein beschleunigter Luftstrom zur Herstellung eines feinen Nebels, bestehend aus kleinen Tröpfchen der Lösung, verwendet wird. Solche Formulierungen enthalten gewöhnlich einen Geschmacksstoff, wie zum Beispiel Saccharin-Natrium und ein flüchtiges Öl. Ein Puffermittel, wie zum Beispiel Natriummetabisulfit und ein oberflächenaktives Mittel, können auch in einer derartigen Formulierung eingeschlossen sein, die außerdem ein Konservierungsmittel, wie zum Beispiel Methylhydroxybenzoat, enthalten sollte.
Andere Formulierungen, die zur nasalen Verabreichung geeignet sind, schließen ein Pulver mit einer Partikelgröße von 20 bis 500 Mikron ein, das auf die Weise verabreicht wird, in der es durch die Nase aufgeschnupft wird, d. h. durch rasche Inhalation durch die Nasenpassage aus einem Behältnis mit dem Pulver, das dicht an die Nase gehalten wird.
Außer den vorstehend erwähnten Bestandteilen können die erfindungsgemäßen Formulierungen einen oder mehr zusätzliche(n) Bestandteil(e), wie z. B. Verdünnungsmittel, Puffer, Geschmacksstoffe, Bindemittel, Tenside, Verdickungsmittel, Gleitmittel, Konservierungsmittel, z. B. Methylhydroxybenzoat (einschließlich Antioxidanzien), Emulgatoren und dergleichen einschließen. Ein besonders bevorzugter Träger oder ein Verdünnungsmittel zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Formulierungen stellt einen niederen Alkylester von einer einfach ungesättigten C₁₈- bis C₂₄-Fettsäure, wie zum Beispiel Ölsäure, wie zum Beispiel Ethyloleat dar. Andere geeignete Träger oder Verdünnungsmittel schließen Caprin oder Caprylsäureester oder Triglyceride oder Gemische davon, wie zum Beispiel die Capryl/Caprinsäure-Triglyceride ein, die unter dem Handelsnamen Miglyol, z. B. Miglyol 810, angeboten werden.
Jedweder andere therapeutische Bestandteil kann ein oder mehr des Folgenden umfassen: (ein) antibiotische(s), antifungale(s) und antivirale(s) Mittel.
Deshalb wird erfindungsgemäß Folgendes bereitgestellt:

(a) Eine neue Verbindung der Formel (I), einschließlich der Verbindungen der Formel (IA) oder ein Salz davon und (IB);
(b) ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), wie zum Beispiel durch Veresterung einer Verbindung (IA) zur Herstellung einer Verbindung der Formel (IB);
(c) eine pharmazeutische Formulierung, umfassend eine nicht toxische, wirksame Menge einer Verbindung der Formel (IB) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür;
(d) ein Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen;
(e) eine Verbindung der Formel (IB) zur Verwendung in der Medizin, wie zum Beispiel bei der Inhibition der Entzündung und/oder der Modulation des immunregulatorischen Systems;
(f) die Verwendung einer Verbindung der Formel (IB) bei der Herstellung eines Arzneimittels, wie zum Beispiel zur Behandlung oder der Prophylaxe der Entzündung und/oder von mit einer Hyper- oder Hypostimulation des Immunsystems begleiteten Erkrankungen; und
(g) die Verwendung einer Verbindung der Formel (IA) bei der Herstellung einer Verbindung der Formel (IB).

Die folgenden Beispiele sind durch Erläuterung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. In den folgenden Beschreibungen und Beispielen wurden die Strukturen der Endprodukte mittels ¹H- und ¹³C-NMR-Spektroskopie unter Verwendung eines JEOL JNM-GX 270 Spektrometers bereitgestellt.
Chemische ¹H- und ¹³C-Verschiebungen wurden für Lösungen in CDCl₃ im Vergleich zum Lösungsmittel gemessen. Ner verweist auf die Tetracosenoyloxy-Kette, Lin auf die γ-Linolenoyloxy-Kette, Doc auf die Docosahexaenoyloxy-Kette und Pol auf die Propan-1,3-diol-Kette. Alle angegebenen Temperaturen liegen in Grad Celsius vor.
BESCHREIBUNG 1 – Herstellung der Ausgangsverbindung – z-5-Tetracosenoyl-chlorid
Phosphorpentachlorid (0,123 mol, 25,6 g) wurde nach und nach einer Lösung aus Nervonsäure (erhältlich von Aldrich Chemicals) (0,123 mol, 45,0 g) in trockenem Ethylether (225 ml, C=200 g·l^–1) zugefügt. Das Gemisch wurde 3 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt und auf Trockene konzentriert, um z-15-Tetracosenoylchlorid als blassgelbes, ziemlich viskoses Öl zu ergeben.
BESCHREIBUNG 2 – Herstellung der Vergleichsverbindung – 1,3-Di-(z,z,z-6,9,12-Octadecatrienoyloxy)propan (GLA:GLA)
z,z,z-6,9,12-Octadecatriensäure (erhältlich von Sigma Chemicals) (0,180 mol, 50,0 g), Propan-1,3-diol (0,086 mol, 6,5 g) und hypophosphorige Säure (0,2 g) wurden unter Rühren unter Stickstoff auf 160°C erhitzt. Nach 6 h deutete die DC (80:18:2 Petrolether – Ethylether – Essigsäure) darauf hin, dass die Reaktion bis zum Abschluss abgelaufen war (R_f: 0,56). Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der Petrolether (700 ml) wurde zugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (3 × 70 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (3 × 70 ml) gewaschen. Es wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf Trockene konzentriert. Der restliche Monoester und die Fettsäure wurden durch Destillation im Vakuum (180°C, 10–² mbar) entfernt. Das sich ergebende Öl wurde in Petrolether aufgelöst, um eine 33%ige Lösung herzustellen und wurde einer Kieselsäule hinuntergeleitet. Das Hexan wurde schließlich entfernt, um 1,3-Di-(z,z,z-6,9,12-octadecatrienoyloxy)propan als ein farbloses Öl zu ergeben.
¹H-NMR: δ: 0,89 (t, 6H, J = 6,8 Hz, Lin-H₁₈), 1,31 (m, 12H, Lin-H_15-17), 1,41 (m, 4H, J = 7,6 Hz, Lin-H₄), 1,65 (m, 4H, J = 7,6 Hz, Lin-H₃), 1,96 (m, 2H, J = 6,4 Hz, Pol-H₂), 2,07 (dxt, 8H, J_4-5 = J_14-15 = 5,4 Hz, J_5-6 = J_13-14 6,8 Hz, Lin-H_5,14), 2,31 (t, 4H, J = 7,3 Hz, Lin-H₂), 2,81 (t, 8H, J = 5,6 Hz, Lin-H_8,11), 4,15 (t, 4H, J = 6,8 Hz, Pol-H_1,3), 5,30–5,43 (m, 12H, Lin-H_{6,7,9,10,12,13}).
¹³C-NMR: δ: 14,0 (Lin-C₁₈), 22,5 (Lin-C₁₇), 24,5 (Lin-C₃), 25,6 (Lin-C_8,11), 26,8 (Lin-C₅), 27,2 (Lin-C₁₄), 28,0 (Pol-C₂), 29,0 (Lin-C₄), 29,3 (Lin-C₁₅), 31,5 (Lin-C₁₆), 34,1 (Lin-C₂), 60,8 (Pol-C_1,3) 127,5 (Lin-C₁₂), 128,0 (Lin-C₉), 128,2 (Lin-C₇), 128,3 (Lin-C₁₀), 129,5 (Lin-C₆), 130,4 (Lin-C₁₃), 173,5 (Lin-C₁).
BESCHREIBUNG 3 – Herstellung von 1-Hydroxy-3-(z-15-tetracosenoyloxy)propan
Eine Lösung aus z-15-Tetracosenoylchlorid, das gemäß der Beschreibung 1 hergestellt wurde; (0,129 mol, 49,7 g) in Methylenchlorid (500 ml) wurde tropfenweise (über eine Zeitdauer von 2,5–3 h) einem Gemisch aus Propan-1,3-diol (0,780 mol, 58,9 g) und Triethylamin (0,323 mol, 32,6 g) in Methylenchlorid (1200 ml) bei 0°C unter Stickstoff zugefügt. Das Gemisch wurde weitere 2 h in einem Eisbad rühren lassen, bis die DC (80:18:2 Petrolether – Ethylether – Essigsäure) zeigte, dass sich das Nebenprodukt der Reaktion zu bilden begann (R_f-Produkt: 0,16; Nebenprodukt: 0,63). Die Lösung wurde mit 2 M Schwefelsäure (2 × 150 ml), gesättigtem Natriumbicarbonat (3 × 300 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (2 × 300 ml) gewaschen. Sie wurde schließlich über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, konzentriert und mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel (7:3 Petrolether – Ethylether) gereinigt, um 1-Hydroxy-3-(z-15-Tetracosenoyloxy)propan als einen weißen Feststoff zu ergeben.
¹H-NMR: δ: 0,85 (t, 3H, J = 6,7 Hz, Ner-H₂₄), 1,23 (m, 32H, Ner-H_4-13, Ner-H_18-23, 1,59 (m, 2H, J = 7,3 Hz, Ner-H₃), 1,84 (m, 2H, J = 6,1 Hz, Pol-H₂), 1,98 (dxt, 4H, J_14-15= J_16-17 = 5,3 Hz, J_13-14= J_17-18 = 6,4 Hz, Ner-H_14,17), 2,28 (t, 2 H, J_2-3= 7,3 Hz, Ner-H₂), 3,66 (t, 2H, J = 6,1 Hz, Pol-H₁), 4,21 (t, 2H, J = 6,1 Hz, Pol-H₁), 5,33 (m, 2H, J_14-15 = J_16-17 = 5,3 Hz, Ner-H_15,16).
¹³C-NMR: δ: 14,1 (Ner-C₂₄), 22,7 (Ner-C₂₃), 25,0 (Ner-C₃), 27,2–29,8 (Ner-C_4-14, Ner-C_17-21), 31,8 (Pol-C₂), 31,9 (Ner-C₂₂), 34,3 (Ner-C₂), 59,2 (Pol-C₁), 61,1 (Pol-C₃), 129,9 (Ner-C_15,16), 174,3 (Ner-C₁).
BESCHREIBUNG 4 – Herstellung der Vergleichsverbindung – Glyceryltrinervonat
Nervonsäure wurde unter Verwendung von Natriumethanoat in Ethanol in den entsprechenden Ethylester umgewandelt und der letztere wurde mit Glycerol bei 160°C zur Reaktion gebracht. Dies fand unter lösungsmittelfreien Bedingungen unter Verwendung von Natriumethoxid als Katalysator statt. Wasser wurde bei seiner Bildung entfernt, das Äquilibrium wurde leicht in Richtung der Bildung des Triglycerids verschoben.
In der folgenden Tabelle ist die Evolution der Reaktion gefolgt von GPC ersichtlich; nach 10 h waren 90% des Ausgangsmaterials in Glyceryltrinervonat umgewandelt.
TABELLE D4:
Das sich ergebende Gemisch wurde schließlich unter Vakuum unter Verwendung eines CD6-Dünnfilmverdampfers im Laboratoriumsmaßstab bei 220°C, 10^–3 mbar, destilliert. Das restliche Ethylnervonat wurde erfolgreich entfernt, um reines Glyceryltrinervonat als einen weißen Feststoff zurückzulassen.
BEISPIEL 1 – Herstellung von 1-(z,z,z-6,9,12-Octadecatrienoyloxy)-3-(z-15-tetracosenoyloxy)propan (NA:GLA)
Ein Gemisch aus 1-Hydroxy-3-(z-15-tetracosenoyloxy)propan, das gemäß der Beschreibung 3, (0,045 mol, 19,0 g) hergestellt wurde, z,z,z-6,9,12-Octadecatriensäure (0,054 mol, 15,0 g) und hypophosphorige Säure (0,4 g) wurden unter Stickstoff unter Rühren auf 160°C erhitzt. Nach 5 h zeigte die DC (80:18:2 Petrolether – Ethylether – Essigsäure) an, dass der größte Teil des Monoesters zur Reaktion gebracht wurde (R_f: 0,60). Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und Petrolether (800 ml) wurde zugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (3 × 80 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (3 × 80 ml) gewaschen. Es wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, konzentriert und mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel (19:1 Petrolether-Ethylether) gereinigt, um 1-(z,z,z-6,9,12-Octadecatrienoyloxy)-3-(z-15-tetracosenoyloxy)propan als blassgelbes Öl zu ergeben.
¹H-NMR: δ: 0,88 (t, 3H, J = 6,8 Hz, Ner-H₂₄), 0,89 (t, 3H, J = 6,8 Hz, Lin-H₁₈), 1,26–1,36 (m, 38H, Lin-H_15-17, Ner-H_4-13, Ner-H_18-23), 1,40 (m, 2 H, J = 7,8 Hz, Lin-H₄), 1,63 (m, 4H, Lin-H₃, Ner-H₃), 1,96 (m, 2H, J = 6,3 Hz, Pol-H₂), 2,02 (m, 4H, Ner-H_14,17), 2,06 (m, 4H, Lin-H_5,14), 2,30 (m, 4H, J = 7,6 Hz, Lin-H₂, Ner-H₂), 2,81 (t, 4H, J = 5,8 Hz, Lin-H_8,11), 4,15 (t, 2H, J = 6,3 Hz, Pol-H₁), 4,15 (t, 2H, J = 6,3 Hz, Pol-H₃), 5,30–5,43 (m, 8H, Lin-H_{6,7,9,10,12,13}, Ner-H_15,16).
¹³C-NMR: δ: 14,0 (Lin-C₁₈), 14,1 (Ner-C₂₄), 22,6 (Lin-C₁₇), 22,7 (Ner-C₂₃), 24,5 (Lin-C₃), 24,9 (Ner-C₃), 25,6 (Lin-C_8,11), 26,8 (Lin-C₅), 28,0 (Pol-C₂), 29,1–29,8 (Lin-C_4,14,15, Ner-C_4-14, Ner-C_17-21), 31,5 (Lin-C₁₆), 31,9 (Ner-C₂₂), 34,1 (Lin-C₂), 34,2 (Ner-C₂), 60,8 (Pol-C_1,3), 127,6 (Lin-C₁₂), 128,0 (Lin-C₉), 128,3 (Lin-C₇), 128,4 (Lin-C₁₀), 129,5 (Lin-C₆), 129,9 (Ner-C_15,16), 130,4 (Lin-C₁₃), 173,5 (Lin-C₁), 173,7 (Ner-C₁).
BEISPIEL 2 – Herstellung von 1-(z-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoyloxy)-3-(z-15-tetracosenoyloxy)propan (NA:DHA)
(a) Ein Gemisch aus 1-Hydroxy-3-(z-15-tetracosenoyloxy)propan, das gemäß der Beschreibung 3 hergestellt wurde (0,033 mol, 14,0 g), z-4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure (0,040, 13,0 g) und hypophosphorige Säure (0,3 g) wurde unter Stickstoff unter Rühren auf 160°C erhitzt. Nach 5 h deutete die DC (80:18:2 Petrolether – Ethylether – Essigsäure) an, dass der größte Teil des Monoesters zur Reaktion gebracht wurde (R_f: 0,56). Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und Petrolether (600 ml) wurde zugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (3 × 60 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (3 × 60 ml) gewaschen. Sie wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, konzentriert und mittels Flash-Chromatographie auf Kieselgel (32:1 Petrolether-Ethylether) gereinigt, um 1-(z-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoyloxy)-3-(z-15-Tetracosenoyloxy)propan als ein blassgelbes Öl zu ergeben.
¹H-NMR: δ: 0,88 (t, 3H, J = 6,6 Hz, Ner-H₂₄), 0,97 (t, 3H, J = 7,6 Hz, Doc-H₂₂), 1,26 (m, 32H, Ner-H_4-13, Ner-H_18-23), 1,61 (m, 2H, J = 7,3 Hz, Ner-H₃), 1,96 (m, 2H, J = 6,4 Hz, Pol-H₂), 2,03 (m, 4 H, J = 6,8 Hz, Ner-H_14,17), 2,08 (m, 2H, J = 7,6 Hz, Doc-H₂₁), 2,29 (t, 2 H, J = 7,6 Hz, Ner-H₂), 2,37 (m, 4H, Doc-H_2,3), 2,85 (m, 10H, Doc-H_6,9,12,15,18), 4,15 (dxt, 4H, J_1,2 = J_2,3 = 6,1 Hz, Pol-H_1,3), 5,33–5,40 (m, 14H, Doc-H_{4,5,7,8,10,11}, Doc-H_{13,14,16,17,19,20}, Ner-H_15,16).
¹³C-NMR: δ: 14,1 (Ner-C₂₄), 14,2 (Doc-C₂₂), 20,5 (Doc-C₂₁), 22,7 (Doc-C₃, Ner-C₂₃), 24,9 (Ner-C₃), 25,6 (Doc-C_6,9,12,15,18), 27,2–29,7 (Pol-C₂, Ner-C_4-14, Ner-C_17-21), 31,9 (Ner-C₂₂), 34,1 (Doc-C₂), 34,2 (Ner-C₂), 60,7 (Pol-C₃), 61,0 (Pol-C₁), 127,0 (Doc-C₁₉), 127,8 (Doc-C_5,16), 128,0–128,2 (Doc-C_{7,8,10,11,13,14}), 128,5 (Doc-C₁₇), 129,3 (Doc-C₄), 129,9 (Ner-C_15,16), 132,0 (Doc-G₂₀), 172,9 (Doc-C₁), 173,7 (Ner-C₁).
BEISPIEL 3 -Herstellung von 1,3-Di-(z-15-tetracosenoyloxy)propan (NA:NA)
z-15-Tetracosensäure (erhältlich von Sigma Chemicals), (0,286 mol, 104,7 g), Propan-1,3-diol (0,136, 10,3 g) und hypophosphorige Säure (0,4 g) wurde unter Stickstoff unter Rühren auf 160°C erhitzt. Nach 6 h deutete die DC (80:18:2 Petrolether – Ethylether – Essigsäure) an, dass die Reaktion bis zum Abschluss abgelaufen war (R_f: 0,63). Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und Petrolether (1500 ml) wurde zugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (3 × 150 ml) und gesättigtem Natriumchlorid (3 × 150 ml) gewaschen. Sie wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf Trockene konzentriert. Der restliche Monoester und die Fettsäure wurden mittels Destillation unter Vakuum (230°C, 10^–2 mbar) entfernt. Das sich ergebende Öl wurde zur Herstellung einer 33%igen Lösung in Petrolether aufgelöst und einer Kieselsäuresäule hinuntergeleitet. Das Hexan wurde schließlich entfernt, um 1,3-Di-(z-15-tetracosenoyloxy)propan als ein farbloses Öl zu ergeben.
¹H-NMR: δ: 0,88 (t, 6H, J = 6,8 Hz, Ner-H₂₄), 1,26 (m, 64H, Ner-H_4-13, Ner-H_18-23), 1,59 (m, 4H, J = 7,6Hz, Ner-H₃), 1,96 (m, 2H, J = 6,3 Hz, Pol-H₂), 2,01 (dxt, 8H, J_14-15 = J_16-17 = 5,6 Hz, J_13-14= J_17-18 6,5 Hz, Ner-H_14,17), 2,29 (m, 4H, J_2,3 = 7,6 Hz, Ner-H₂), 4,15 (t, 4 H, J = 6,3 Hz, Pol-H_1,3), 5,34 (m, 4H, J_14-15 = J_16-17 = 5,6 Hz, Ner-H_15,16).
¹³C-NMR: δ: 14,1 (Ner-C₂₄), 22,7 (Ner-C₂₃), 24,9 (Ner-C₃), 27,2–29,8 (Ner-C_4-14, Ner-C_17-21, Pol-C₂), 31,9 (Ner-C₂₂), 34,2 (Ner-C₂), 60,8 (Pol-C_1,3), 129,9 (Ner-C_15,16), 173,7 (Ner-C₁).
BEISPIEL 4 – Vergleich zwischen NA:NA und GLA:GLA bei EAE
Die prophylaktische Wirkung von GLA:GLA (Beschreibung 2) und NA:NA (Beispiel 3) auf das Auftreten und die Entwicklung der neurologischen experimentellen allergischen Encephalomyelitis (EAE) wurde bei der Lewis-Ratte wie folgt verglichen:
MATERIALIEN UND VERFAHREN
(a) INDUKTION VON EAE
Am Tag der Inokulation wurden 230–290 g wiegende männliche Lewis-Ratten mit 0,1 ml einer Emulsion, enthaltend gleiche Teile Rückenmark vom Meerschweinchen; phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkomplettes Freund'sches Adjuvanz, supplementiert mit 10 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H₃₇Ra, in jeden hinteren Fußballen injiziert.
(b) BEURTEILUNG VON EAE
Die Tiere wurden täglich gewogen und ab Tag 7 nach der Inokulation (PI) auf eine neurologische Erkrankung beurteilt. Ratten, die die Symptome einer EAE aufwiesen, wurden die folgenden Scores zugeteilt: 1: Schlaffer Schwanz (FT), 2: Hypotonus im Hinterbein (HLH), 3: partielle Paralyse des Hinterbeins (PHLP), 4: vollständige Paralyse des Hinterbeins (CHLP), 5: moribund oder tot.
(c) DOSIERUNGSREGIME
GLA:GLA und NA:NA (pure Öle) wurden 5 Tage vor der Inokulation und für die Dauer von 25 Tagen nach der Inokulation in einer Dosis von 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag (bei 45°C) oral verabreicht. Alle zur Kontrolle sensibilisierten Tiere erhielten das PBS-Vehikel oder wurden nicht dosiert, und jede Behandlungsgruppe enthielt 7 Tiere. Individuelle Gehirne und Blutproben wurden dann gesammelt und vor der Fettsäureanalyse bei –20°C gelagert. Die NA:NA-Behandlung wurde bei 2 Tieren am Tag 21 terminiert, da sich die Ratten wiederholten Versuchen der oralen Verabreichung des Arzneimittels widersetzten.
ERGEBNISSE
(a) ÄNDERUNGEN DES MITTLEREN KÖRPERGEWICHTS
Nicht dosierte sensibilisierte Ratten und Tiere, die das Vehikel erhielten, verloren zwischen 10 und 12 Tagen PI Körpergewicht. Mit GLA:GLA und NA:NA behandelte Ratten wiesen, beginnend 10 Tage PI, Gewichtsverlust auf. Bei Tieren unter allen Behandlungen trat 18–20 Tage PI eine Erhöhung des Körpergewichts auf.
(b) EINSETZEN UND MINDERUNG DER SYMPTOME
Nicht dosierte Ratten und mit dem Vehikel behandelte Tiere zeigten zwischen den Tagen 11 und 12 PI initiale Krankheitszeichen (Tabelle 1). Das Einsetzen von Symptomen, die Minderung von Krankheitszeichen und der Krankheitsdauer war bei GLA:GLA- und NA:NA-Ratten im Vergleich zu den Kontrollgruppen nicht signifikant unterschiedlich. Interessanterweise überlebten im Vergleich zu den Kontrollen und den mit GLA:GLA behandelten Gruppen alle mit NA:NA behandelten Tiere.
TABELLE 1:
(c) INZIDENZ UND SCHWEREGRAD VON EAE
Die mittleren kumulativen neurologischen Scores, ein graphischer Ausdruck der täglichen Krankheitsentwicklung, waren für nicht dosierte und mit dem Vehikel behandelte Ratten während der frühen Stadien der EAE vergleichbar. Die für Tiere unter dem Vehikel aufgezeichneten kumulativen Daten stiegen über die Werte an, die für nicht dosierte Ratten, aber mit ähnlichem Krankheitsprofil wie es von der mit GLA:GLA behandelten Gruppe aufgewiesen wurde, bemerkt wurden. Mit EAE inokulierte Ratten, die mit NA:NA behandelt wurden, wiesen Scores auf, die – beginnend 14 Tage PI – konsistent niedriger als die der nicht dosierten und Vehikel-Behandlungen lagen.
Alle Kontroll-, mit Vehikel behandelten und mit GLA:GLA dosierten Ratten zeigten FT und HLH (Tabelle 2). Interessanterweise wiesen nur 4/7 mit NA:NA behandelte Tiere die initialen Krankheitssymptome auf. Überdies erfuhren in deutlichem Gegensatz zu mit dem Kontrollvehikel und mit GLA:GLA behandelten Gruppen keine Tiere unter NA:NA PHLP oder CHLP. Außerdem schienen die mit NA:NA dosierten Tiere im Vergleich zu den nicht dosierten und mit dem Vehikel behandelten Ratten mehr alert und weniger inkontinent zu sein. TABELLE 2:

* Anzahl der Tiere mit Symptomen/Gesamtzahl
# P < 0,01 NA:NA vs. Vehikel. Fischers Wahrscheinlichkeitstest

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die Behandlung von mit EAE mokulierten Ratten mit GLA:GLA im Vergleich zu nicht dosierten Ratten und denen unter den Vehikel-Behandlungen veränderte nicht den Verlauf der neurologischen EAE. Bei mit EAE sensibilisierten Tieren, denen NA:NA verabreicht wurde, wurde jedoch die Gesamtintensität der Erkrankung deutlich reduziert und insbesondere die Inzidenz der teilweisen Paralyse im Vergleich zur Behandlung mit dem Vehikel signifikant vermindert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass NA:NA eine immunmodulatorische oder entzündungshemmende Wirkung auf die Entwicklung von EAE besitzt.
VERGLEICHSBEISPIEL: Glyceryltrinervonat bei EAE
Die prophylaktischen Wirkungen von Glyceryltrinervonat (GTN, Beschreibung 4) wurden auf die akute EAE bei der Lewis-Ratte beurteilt. Die Induktion und Beurteilung von EAE erfolgte wie für Beispiel 4. Das Dosierungsregime beinhaltete die orale Verabreichung in Miglyol 810 fünf Tage vor und 20 Tage nach der Inokulation. (Vergleiche Beispiel 8 bezüglich der Insignifikanz der Anwendung von PBS- oder Miglyol-Vehikeln).
ERGEBNISSE
(a) ÄNDERUNGEN DES KÖRPERGEWICHTS:
Die Tiere wiesen bis zum Tag 10 eine Gewichtszunahme auf, wobei sie zeigten, dass das in der Nahrung verabreichte GTN keine bedeutende unerwünschte Wirkung induzierte. Die Ergebnisse zeigen den charakteristischen Körpergewichtsverlust sowohl bei den als Kontrolle dienenden als auch behandelten Tieren, die dem Einsetzen von Symptomen vorausgingen. Die Werte für die als Kontrolle dienenden und behandelten Tiere unterschieden sich nicht.
(b) NEUROLOGISCHE SCORES – INZIDENZ UND SCHWEREGRAD DER EAE
Alle inokulierten Tiere zeigten mit der EAE einhergehende neurologische Defizite. Das Einsetzen und die Minderung der Symptome zusammen mit der Dauer der Krankheit bei mit GTN behandelten Tieren unterschieden sich nicht signifikant von den Vehikel- oder nicht dosierten Gruppen (Tabelle 3).
TABELLE 3:
Tabelle 4 zeigt, dass 70–80% der nicht dosierten und mit dem Vehikel behandelten Ratten an der paralytischen Erkrankung litten und von Tieren unter GTN erhobene Daten bestätigen, dass sich die Behandlung nicht signifikant auf jedweden mit neurologischen Defiziten bei an EAE erkrankten Ratten einhergehenden Parameter auswirkte. TABELLE 4:

* Prozentualer Anteil der Ratten in der Gruppe; n = 10 Tiere für alle Gruppen

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Diese Ergebnisse etablierten, dass NA in dieser Form nicht die Blut-Hirn-Schranke überquert. Dies ist überraschend, da GTN über eine O-Esterverknüpfung verfügt, die Nervonsäure-Moleküle an Glycerol bindet. Man begegnet Glycerol in der Struktur der Hirnlipide, die als ein Träger wirken, der zum Überqueren der Hirn-Blut-Schranke fähig ist, sehr häufig, und es könnte erwartet werden, dass es die Passage von Lipiden, wie zum Beispiel NA durch diese Membran erleichtert. Dieser Test zeigt, dass frühere Vorstellungen in Bezug auf geeignete Lipidträger nicht auf NA zutreffen.
BEISPIEL 5 – NA:NA (Ethyloleat-Formulierung) bei EAE
Die prophylaktische Wirkung der Verbindung von Beispiel 3 (NA:NA), unter Verwendung einer alternativen Formulierung, auf das Auftreten und die Entwicklung der neurologischen EAE bei der Lewis-Ratte wurde wie folgt beurteilt:
MATERIALIEN UND VERFAHREN
(a) INDUKTION VON EAE
Am Tag der Inokulation wurden 240–360 g wiegende männliche Lewis-Ratten mit 0,1 ml einer Emulsion, enthaltend gleiche Teile Rückenmark vom Meerschweinchen; phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkomplettes Freund'sches Adjuvanz, supplementiert mit 10 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H₃₇Ra, in jeden hinteren Fußballen injiziert.
(b) BEURTEILUNG VON EAE
Die Tiere wurden täglich gewogen und ab Tag 7 nach der Inokulation (PI) auf eine neurologische Erkrankung beurteilt. Ratten, die die Symptome einer EAE aufweisen, wurden den folgenden Scores zugeteilt: 1: Schlaffer Schwanz (FT), 2: Hypotonus im Hinterbein (HLH), 3: partielle Paralyse des Hinterbeins (PHLP), 4: vollständige Paralyse des Hinterbeins (CHLP), 5: moribund oder tot.
(c) DOSIERUNGSREGIME
NA:NA (10 gew.%ige Lösung in Ethyloleat B.P.) wurde 5 Tage vor der Inokulation und für die Dauer von 22 Tagen PI bei einer Dosis von 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag (bei 35–37°C) oral verabreicht. Die als Kontrolle sensibilisierten Tiere erhielten das Ethyloleat-Vehikel oder wurden nicht dosiert, und jede Behandlungsgruppe enthielt 10 Tiere. Am Tag 23 PI wurden individuelle Rattenhirne und Plasmaproben gesammelt und vor der Fettsäure-Analyse bei –20°C gelagert.
STATISTISCHE ANALYSE
Zur Beurteilung der signifikanten Unterschiede der neurologischen Scores wurde Students t-Test und auf die An- oder Abwesenheit von Symptomen Fischers Wahrscheinlichkeitstest verwendet.
ERGEBNISSE
(a) ÄNDERUNGEN DES MITTLEREN KÖRPERGEWICHTS
Nicht dosierte sensibilisierte Ratten und Tiere, die entweder das Vehikel oder NA:NA erhielten, erfuhren zwischen 10 und 12 Tagen PI den charakteristischen Körpergewichtsverlust. Bei Tieren unter allen Behandlungen steigerte sich das Körpergewicht 16–18 Tage PI.
(b) EINSETZEN UND MINDERUNG VON SYMPTOMEN
Alle nicht dosierten und mit Vehikel behandelten sensibilisierten Ratten zeigten neurologische Zeichen der EAE (Tabelle 3). Im Gegensatz dazu erfuhren nur 60% der Tiere unter NA:NA die Krankheitssymptome. Der mittlere Tag des Einsetzens und der Minderung der Symptome wurde durch die NA:NA-Behandlung nicht signifikant verändert. Die mittlere Dauer der Symptome bei Ratten unter NA:NA war reduziert, aber im Vergleich zu nicht dosierten und mit Ethyloleat behandelten Gruppen nicht signifikant. TABELLE 5:

* NA:NA im Vergleich zu nicht dosierten Gruppen und Vehikel-Gruppen P<0,05

(c) INZIDENZ UND SCHWEREGRAD VON EAE
Die neurologischen Scores für mit NA:NA dosierten Ratten waren im Vergleich zu den aufgezeichneten Werten für nicht dosierte und mit dem Vehikel behandelte Tiere konsistent niedriger. Die mittleren kumulativen neurologischen Scores für nicht dosierte Ratten und Tiere unter Ethyloleat waren über die Dauer der Studie ähnlich. Im Gegensatz dazu waren die kumulativen Scores für mit NA:NA behandelten Ratten 12–13 Tage PI reduziert und waren deutlich niedriger als die Kontrollwerte für den Rest der Studie.
Die Anzahl der mit NA:NA dosierten Ratten, die FT und HLH aufwiesen, war im Vergleich zu nicht dosierten und mit Vehikel behandelten Tieren signifikant reduziert (Tabelle 6 FT: P<0,05, HLH: P<0,01). Außerdem erfuhren weniger Tiere unter NA:NA die paralytischen Symptome von EAE. Mit NA:NA behandelte Ratten waren im Vergleich zu Kontrollgruppen zudem mehr alert und sich ihrer Umgebung mehr bewusst und waren weniger inkontinent. TABELLE 6:

* Anzahl der Tiere mit Symptomen/Gesamtzahl
** NA:NA im Vergleich zu nicht dosierten und Vehikelgruppen P<0,05
*** NA:NA im Vergleich zu nicht dosierten und Vehikelgruppen P<0,01

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Diese Studie lässt deutlich erkennen, dass NA:NA die Krankheitsinzidenzen signifikant reduziert und das Auftreten der initialen nicht paralytischen Symptome trotz des vorherigen charakteristischen Körpergewichtsverlusts bei allen behandelten Tieren inhibiert. Auch die täglichen neurologischen Scores waren unter der NA:NA-Behandlung deutlich reduziert.
Die vorherige Studie (Beispiel 4) zur Bestimmung der Wirksamkeit von NA:NA bei EAE zeigte, dass die Verbindung die Gesamtintensität der Erkrankung reduzierte und die paralytischen Symptome im Vergleich zur Vehikel-Behandlung signifikant unterdrückte. Die aktuelle Untersuchung (Beispiel 5) hat gezeigt, dass die Reformulierung von NA:NA in Ethyloleat die Verabreichung (wobei die Senkung seiner Temperatur auf 35–37°C ermöglicht wurde) ohne den Verlust der Wirksamkeit der Verbindung bei EAE erleichterte.
Die Ergebnisse deuten eindeutig darauf hin, dass NA:NA bei der akuten EAE der Ratte ein immunmodulatorisches oder antünflammatorisches Aktivitätsprofil aufweist.
BEISPIEL 6 – NA:DHA und NA:GLA bei EAE-Tests
Die prophylaktische Wirkung der Verbindungen von Beispiel 1 (NA:GLA) und Beispiel 2 (NA:DHA) auf das Auftreten und die Entwicklung von neurologischer EAE bei der Lewis-Ratte wurde wie folgt beurteilt:
MATERIALIEN UND VERFAHREN
(a) INDUKTION VON EAE
Am Tag der Inokulation wurden 230–280 g wiegende männliche Lewis-Ratten mit 0,1 ml einer Emulsion, enthaltend gleiche Teile Rückenmark vom Meerschweinchen; phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkomplettes Freund'sches Adjuvanz, supplementiert mit 10 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H₃₇Ra, in jeden hinteren Fußballen injiziert.
(b) BEURTEILUNG VON EAE
Die Tiere wurden täglich gewogen und ab Tag 7 nach der Inokulation (PI) auf eine neurologische Erkrankung beurteilt. Ratten, die die Symptome einer EAE aufwiesen, wurden die folgenden Scores zugeteilt: 1: Schlaffer Schwanz (FT), 2: Hypotonus im Hinterbein (HLH), 3: partielle Paralyse des Hinterbeins (PHLP), 4: vollständige Paralyse des Hinterbeins (CHLP), 5: moribund oder tot.
(c) DOSIERUNGSREGIME
NA:GLA (pures Öl) wurde 5 Tage vor der Inokulation oral verabreicht und für die Dauer von 25 Tagen PI bei einer Dosis von 750 mg/kg Körpergewicht/Tag und 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag fortgesetzt. NA:DHA (pures Öl) wurde bei einem identischen Dosierungsregime in einer Dosis von 500 mg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht. Die zur Kontrolle sensibilisierten Tiere erhielten das PBS-Vehikel oder wurden nicht dosiert. In den nicht dosierten, Vehikel- und niedrigdosierten NA:GLA-Behandlungsgruppen befanden sich sieben Tiere. Vier Ratten erhielten hochdosiertes NA:GLA und 3 Ratten wurden mit NA:DHA dosiert. Individuelle Gehirne und Blutproben wurden dann zur Analyse gesammelt.
ERGEBNISSE
(a) ÄNDERUNGEN DES MITTLEREN KÖRPERGEWICHTS
Nicht dosierte, sensibilisierte Ratten und Tiere, die das Vehikel erhielten, verloren zwischen 8 und 10 Tagen Gewicht. Mit NA:DHA behandelte Ratten wiesen ebenso, beginnend 8 Tage nach der Inokulation, Körpergewichtsverlust auf. Mit NA:DHA behandelte Ratten wiesen jedoch während der Woche im Anschluss an die Sensibilisierung im Vergleich zur Kontrolle und den dosierten Gruppen eine größere Körpergewichtszunahme auf. Der von den mit der niedrig- und hochdosierten NA:GLA behandelten Tieren erfahrene Körpergewichtsverlust begann 2 Tage später als der bei anderen Behandlungen aufgezeichnete.
(b) EINSETZEN UND MINDERUNG DER SYMPTOME
Nicht dosierte Ratten und Tiere, die das Vehikel erhielten, zeigten zwischen 10 und 11 Tagen PI initiale Zeichen der Erkrankung (Tabelle 7).
TABELLE 7:
Das Einsetzen der Erkrankung bei mit NA:GLA behandelten Ratten wurde verzögert und bei Tieren, denen im Vergleich zu den Kontrollgruppen NA:DHA verabreicht wurde, beschleunigt. Die Werte für die dosierten Tiere waren jedoch nicht signifikant unterschiedlich von den für die nicht dosierten und Vehikel-Behandlungen aufgezeichneten Daten.
(c) INZIDENZ UND SCHWEREGRAD VON EAE
Die mittleren kumulativen klinischen Scores, ein graphischer Ausdruck der täglichen Krankheitsentwicklung, für nicht dosierte und mit Vehikel behandelte Ratten war im gesamten Experiment durchweg vergleichbar. Die für Tiere unter niedrig- und hochdosiertem NA:GLA aufgezeichneten Daten waren für die Dauer der Studie konsistent niedriger als die Kontrollwerte. Der tägliche Score für Ratten, die mit NA:DHA behandelt wurden, war im Vergleich zu den für die Kontroll- oder die mit NA:GLA behandelten Tiere verstärkt. Alle Kontroll- und mit Arzneimittel behandelten Ratten zeigten FT und HLH (Tabelle 8). Weniger Tiere unter NA:GLA erfuhren jedoch PHLP (niedrige Dosis: 57%/hohe Dosis: 50%) und CHLP (niedrige Dosis: 43%/ hohe Dosis: 25%) im Vergleich zu den Kontrollen und mit NA:DHA behandelten Ratten. Die Entwicklung von CHLP bei Ratten unter NA:DHA trat auch früher auf (11,3 ± 1,3 bzw. 12,7 ± 1,3). TABELLE 8:

* Anzahl der Tiere mit Symptomen/Gesamtzahl

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die prophylaktische Verabreichung von NA:GLA bei 750 und 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag an mit akuter EAE sensibilisierten Ratten verzögerte das Einsetzen und reduzierte eindeutig die Inzidenz und den Schweregrad der Erkrankung im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verbindung immunsuppressive oder entzündungshemmende Aktivität aufweist, welche die immunologische Antwort auf das Neuroantigen und die sich anschließende Manifestation der Erkrankung beeinflusste. Im Gegensatz dazu intensivierte die Behandlung mit NA:DHA die neurologischen Symptome, möglicherweise durch eine Verstärkung der Induktionsphase von EAE, was darauf hindeutet, dass die Verbindung als ein Immunpotenziator wirken kann.
BEISPIEL 7 – Bewertung von NA:NA und NA:GLA bei Mäusen
Die prophylaktische Wirkung der Verbindungen von Beispiel 3 (NA:NA) und Beispiel 1 (NA:GLA) wurden auf chronische EAE im Biozzi-Mausmodell beurteilt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
(a) INDUKTION VON EAE
30–35 g wiegende männliche Biozzi-Mäuse wurden mit 0,15 ml einer Emulsion, enthaltend lyophilisiertes Rückenmark von der Maus, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und inkomplettes Freund'sches Adjuvanz, supplementiert mit Mycobacterium butyricum und Mycobacterium tuberculosis H₃₇Ra in jede Flanke injiziert.
(b) BEURTEILUNG VON EAE
Die Tiere wurden täglich gewogen und ab Tag 7 nach der Inokulation (PI) auf eine neurologische Erkrankung beurteilt. Mäuse, die die Symptome einer EAE aufwiesen, wurden den folgenden Scores zugeteilt: 1: Partieller schlaffer Schwanz (PFT), 2: vollständig schlaffer Schwanz (CFT), 3: beeinträchtigter Stellreflex (IRR), 4: ataxischer Gang (AG), 5. Hypotonus im Hinterbein (HLH), 6: partielle Paralyse des Hinterbeins (PHLP), 7: vollständige Paralyse des Hinterbeins (CHLP), 8: moribund (M) 9. tot (D).
(c) DOSIERUNGSREGIME
NA:NA und NA:GLA (beide als 10 gew.-%ige Lösung in Ethyloleat B.P.) wurden (bei 35–37°C) 5 Tage vor der Inokulation und für die Dauer von 43 Tagen PI in einer Dosis von 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag oral verabreicht. Die als Kontrolle dienenden sensibilisierten Tiere erhielten das Ethyloleat-Vehikel oder wurden nicht dosiert, und jede Behandlungsgruppe enthielt 10 Tiere. Individuelle Gehirn- und Blutproben wurden dann zur Analyse an den Tagen 43–44 PI gesammelt.
ERGEBNISSE
(a) ÄNDERUNGEN DES MITTLEREN KÖRPERGEWICHTS:
Die mittleren Körpergewichte von mit chronischer EAE sensibilisierten Mäusen, die das Vehikel, NA:GLA oder NA:NA erhielten, nahmen zwischen –4 und 2 Tagen nach der Inokulation ab.
Eine dramatische Reduktion des Körpergewichts trat bei nicht dosierten Mäusen 16 Tage nach der Inokulation auf, während keine ähnlichen Gewichtsverluste bei Tieren aufgezeichnet wurden, die das Vehikel, NA:GLA oder NA:NA erhielten. Die mittleren Körpergewichte von nicht dosierten Mäusen und Tieren, die das Vehikel und NA:NA erhielten, nahmen ständig zu und wurden 13–40 Tage nach der Inokulation vergleichbar. Die mit NA:GLA behandelten Mäuse erfuhren jedoch keine ähnliche Körpergewichtszunahme. Alle Gruppen zeigten 40–44 Tage nach der Inokulation Körpergewichtsverlust.
(b) NEUROLOGISCHE SCORES – INZIDENZ UND SCHWEREGRAD DER CHRONISCH-REZIDIVIERENDEN EAE:
Das Einsetzen akuter Symptome trat bei 80% der nicht dosierten Mäuse ca. 20 Tage PI (Tabelle 9) auf. Im Gegensatz dazu zeigten nur 20–30% der Tiere die akute Erkrankung in den Vehikel- und mit der Verbindung behandelten Gruppen. Bei Mäusen unter NA-NA verminderten sich die Zeichen der akuten Erkrankung früher, und folglich war die Dauer der Defizite im Vergleich zu erkrankten Mäusen in anderen Gruppen kürzer.
TABELLE 9:
Im Vergleich zu nicht dosierten Tieren erlitten weniger mit der Verbindung behandelte Mäuse ein Rezidiv (Tabelle 10). Eine ähnliche Anzahl an Mäusen unter dem Vehikel erfuhren jedoch ein Wiederauftreten der Symptome. Interessanterweise war das Einsetzen des Rezidivs bei mit NA:GLA und NA:NA dosierten Tieren verzögert, jedoch nicht signifikant. TABELLE 10:

* Die Bewertung wurde vor dem Ende der Rezidivphase terminiert

Tabellen 11 und 12 beschreiben den prozentualen Anteil der nicht mit dem Vehikel dosierten und mit der Verbindung behandelten Mäuse, die progressive Symptome der akuten und rezidivierenden Erkrankung zeigen. Die Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass die akuten und rezidivierenden Symptome bei mit dem Vehikel behandelten Tieren im Vergleich zum Auftreten der Erkrankung bei nicht dosierten Mäusen unterdrückt sind. Die von mit dem Vehikel behandelten Mäusen gezeigten neurologischen Zeichen sind überdies den Symptomen ähnlich, die von Tieren unter NA:GLA und NA:NA erfahren werden. Die mittleren neurologischen Scores für nicht dosierte, mit der chronisch-rezidivierenden EAE sensibilisierten Mäuse erhöhte sich charakteristisch 2 bis 3 Wochen nach der initialen Inokulation.
Eine Remission der Symptome trat 25–33 Tage nach der Sensibilisierung, gefolgt von einem Rezidiv der neurologischen Defizite auf. Die akuten und rezidivierenden Symptome waren bei Tieren, die das Vehikel, NA:GLA und NA:NA erhielten, deutlich reduziert. Die neurologischen Symptome wurden, insbesondere während der akuten und rezidivierenden Phasen der chronisch-rezidivierenden EAE, bei mit NA:NA behandelten Mäusen vollkommen ausgeschaltet. TABELLE 11:

* Prozentualer Anteil der Mäuse in der Gruppe; n = 10 Tiere für alle Gruppen

* Prozentualer Anteil der Mäuse in der Gruppe; n = 10 Tiere für alle Gruppen

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung der mit der chronisch-rezidivierenden EAE inokulierten Mäuse mit dem Vehikel, Ethyloleat, die Inzidenz und den Schweregrad der akuten und rezidivierenden Phasen der chronisch-rezidivierenden EAE in diesem Test signifikant reduzierte.
Die Modifikation der chronisch-rezidivierenden EAE mit der Vehikel-Behandlung – das Vehikel wirkt als ein Lösungsmittel für das Arzneimittel und erleichtert seine Verabreichung – verhindert eine eindeutige Beurteilung der Wirksamkeit der Verbindung bei der chronischen EAE und befindet sich im Gegensatz zu den initialen Studien mit der Ratte, bei der auch Ethyloleat eingesetzt wurde (siehe Beispiel 5).
Dennoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die NA:GLA- und NA:NA-Behandlung, insbesondere in Kombination mit Ethyloleat, das Potenzial zur Begrenzung der Dauer der akuten Erkrankung und zur Verzögerung des Einsetzens der rezidivierenden Symptome besitzt. Dies verleiht den Schlussfolgerungen der vorstehenden Beispiele zur Wirksamkeit der Verbindung bei der akuten EAE der Ratte Unterstützung.
BEISPIEL 8 – Die Anwendung von Miglyol als ein Vehikel bei der Behandlung der chronisch-rezidivierenden EAE im Mausmodell
Deshalb wurde die Verwendung eines Vehikels ohne die Möglichkeit der Modifikation des Verlaufs der chronisch-rezidivierenden EAE in der Biozzi-Maus untersucht. Dieses Experiment beinhaltete nur PBS, Miglyol und Ethyloleat, bei denen es sich um Arzneimittel-Vehikel handelt und die bewertet wurden, um ihre Neutralität auf den Verlauf der EAE zu beurteilen.
Miglyol 810, bei dem es sich um ein Gemisch aus Triglyceriden handelt, das die Acylketten mit 8–10 Kohlenstoffen trägt, wurde zuerst einer Vergleichsstudie mit PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wässrige Lösung) zur Sicherstellung seiner Neutralität gegenüber den EAE-Erkrankungen unterzogen.
PBS stellt ein Referenzvehikel dar, und es ist bekannt, dass es den Verlauf der EAE nicht verändert. Die prophylaktischen Wirkungen von Miglyol 810 wurden an der chronisch-rezidivierenden EAE (CREAE) im Biozzi-Mausmodell gemäß einem Verfahren, das dem von Beispiel 7 ähnlich ist, aber unter Verwendung des Miglyol 810- Vehikels und der Behandlung nach der Inokulation bis zum Tag 30 in einer Dosis von 10 g/kg Körpergewicht/Tag beurteilt. [Erklärung des Dosisregimes: Wenn eine Studie eine Testverbindung, wie zum Beispiel NA:NA beinhaltet, verweist die angezeigte Dosis nur auf die Menge der verabreichten Testverbindung, nicht auf die Menge des Vehikels+Verwindung. Da in dieser Vehikel-Studie keine Testverbindung, wie zum Beispiel NA:NA anwesend war, verweist die Dosis auf die Menge des Vehikels, d. h. 10-mal höher als die Menge der Testverbindung, die gemäß allen anderen Studien im Mausmodell anwesend gewesen wäre.]
Die Ergebnisse wiesen eindeutig darauf hin, dass alle Mäuse, die mit CREAE inokuliert wurden, etablierte akute paralytische Symptome aufwiesen. Insbesondere der Verlauf der Krankheit wurde nicht durch eine wiederholte orale Dosierung mit entweder PBS oder Miglyol beeinflusst.
Deshalb schien Miglyol zur Verwendung als ein Vehikel in sich anschließenden Studien zur Bestmmung der Wirksamkeit der Verbindungen bei CREAE gut geeignet zu sein. Deshalb wurden unter Verwendung von Miglyol 810 als das neue Vehikel, die prophylaktischen Wirkungen von NA:NA und NA:GLA auf CREAE im Biozzi-Mausmodell (90%ige Verdünnung, 1000 mg/kg/Tag, bis zu 43 Tage PI) erneut beurteilt.
ERGEBNISSE
(a) ÄNDERUNGEN DES KÖRPERGEWICHTS
Die mittleren Körpergewichte von mit CREAE sensibilisierten Mäusen, die das Vehikel und NA:GLA erhielten, nahmen im Gegensatz zu nicht dosierten und mit NA:NA behandelten Mäusen zwischen 1 und 4 Tagen PI ab.
Das Einsetzen und die Progression der Symptome führte zu einer dramatischen Reduktion des Körpergewichts, die in allen Tiergruppen zwischen 12 uns 22 Tagen PI auftrat, die Körpergewichtsverluste für die mit dem Arzneimittel behandelten Tiere waren jedoch weniger wichtig als für die nicht dosierten und Vehikelgruppen.
Körpergewichtszunahmen wurden von Tieren in allen Gruppen zwischen 23 und 31 Tagen PI erfahren, die der Minderung der neurologischen Defizite entsprachen. Im Gegensatz zu nicht dosierten und mit dem Vehikel behandelten Tieren fuhr das Körpergewicht für mit NA:GLA und NA:NA behandelte Mäuse während des Einsetzens und der Progression von Symptomen der rezidivierenden Phase ab 32 Tagen PI interessanterweise noch weiter fort, anzusteigen.
(b) NEUROLOGISCHE SCORES – INZIDENZ UND SCHWEREGRAD VON CREAE
Die Tiere in jeder Behandlungsgruppe waren vom akuten Stadium der CREAE stark betroffen. Mäuse unter NA:GLA wiesen im Vergleich zu mit NA:NA, nicht dosierten und mit dem Vehikel behandelten Tieren eine kürzere Dauer der Symptome auf (Tabelle 13).
Fast alle Tiere in jeder Gruppe erlitten ein Rezidiv (Tabelle 14). Es bestand kein Unterschied beim Einsetzen der Symptome zwischen den Gruppen; die Dauer der Symptome war jedoch bei mit NA:GLA behandelten Mäusen im Vergleich zu NA:NA-, nicht dosierten und Vehikel-Gruppen signifikant reduziert.
Die mit NA:NA behandelten Tiere wiesen überraschend eine längere Dauer der Symptome auf. TABELLE 13:
TABELLE 14:

* Bei einem Tier gingen die paralytischen Symptome 45 Tage PI zurück. Die übrigen Mäuse starben entweder oder wiesen eine Paralyse auf.

Tabellen 15 und 16 beschreiben den prozentualen Anteil an nicht dosierten, mit Vehikel und mit der Verbindung behandelten Mäusen, welche die progressiven Symptome der akuten und rezidivierenden Erkrankung aufweisen. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass akute und rezidivierende Symptome bei mit NA:GLA behandelten Tieren im Vergleich zum Auftreten der Erkrankung in anderen Mäusegruppen vermindert sind. Die von mit NA:NA behandelten Mäusen gezeigten Symptome scheinen überdies den Symptomen ähnlich zu sein, die von Tieren erfahren wurden, die das Vehikel oder keine Behandlung erhielten.
Die mittleren neurologischen Scores für nicht dosierte und mit Vehikel behandelte Mäuse nahmen charakteristisch 2 Wochen nach der initialen Inokulation zu. Die mit der NA:NA-Behandlung erhaltenen Scores unterschieden sich in der akuten Phase der Erkrankung nicht von beiden Kontrollgruppen und waren in der rezidivierenden Phase nur geringgradig niedriger. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wiesen mit NA:GLA behandelte Tiere sowohl in den akuten als auch rezidivierenden Phasen niedrigere Scores auf. TABELLE 15:

* Prozentualer Anteil der Mäuse in der Gruppe; n = 12 Tiere für alle Gruppen, außer für NA:GLA, worin n = 11 darstellt.

* Prozentualer Anteil der Mäuse in der Gruppe; n = 9 Tiere für die Vehikel- und NA:GLA-Gruppen, n = 10 für die nicht dosierte Gruppe und n = 11 für die NA:NA-Gruppe

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die für die nicht dosierten und mit dem Vehikel behandelten Gruppen erhaltenen Ergebnisse unterschieden sich nicht und bestätigten, dass Miglyol 810 den Verlauf der Krankheit nicht veränderte.
Die Wirkungen von NA:NA und NA:GLA auf den neurologischen Verlauf der chronisch-rezidivierenden EAE (CREAE) unterschieden sich jedoch von der initialen Bewertung.
NA:NA schien überraschenderweise nicht signifikant den Verlauf von CREAE zu verändern, was im Gegensatz zu den im Rattenmodell mit der akuten EAE erhaltenen Ergebnisse steht.
Dennoch reduzierte NA:GLA eindeutig die Intensität der neurologischen Defizite, sowohl während der akuten als auch rezidivierenden Phasen.
Diese Studie ermöglichte uns die Bestimmung, dass NA:GLA in beiden Modellen, der akuten EAE bei der Ratte und der chronisch-rezidivierenden EAE bei der Maus, effizient war.
BEISPIEL 9 – Fettsäure-Zusammensetzungen der Lipide des Tierhirns anhand biologischer Bewertungen
Nach der Terminierung bestimmter biologischer Bewertungen wurden die Ratten- oder Maushirne extrahiert, und die Fettsäure-Zusammensetzung der polaren Gesamtlipide aus dem Ratten-/Maushirn wurde bestimmt.
Das Ziel dieser Untersuchungen bestand darin, zu bestimmen, ob die Nervonsäurespiegel im Gehirn nach der Behandlung mit den erfindungsgemäßen Nervonsäurederivaten verstärkt wurden. Biologisches Material wurde an Dr J. Hendersen, University of Stirling, Institute of Aquaculture, Schottland, zur Analyse gesandt. Die Analysen wurden an zwei für Experimente bestimmten Chargen durchgeführt (detailliert in Beispiel 6 bzw. Beispiel 7). Die Ergebnisse sind nachstehend detailliert.
ERGEBNISSE
(a) ANALYSEN DES RATTENHIRNS NACH DEN BEHANDLUNGEN MIT NA:DHA/NA:GLA
Tabelle 17 zeigt den Nervonsäuregehalt (NA-Gehalt) im polaren Gesamtlipid aus dem Rattenhirn; diese Tiere wurden mit akuter EAE inokuliert.
TABELLE 17:
Die Analysen zeigen, dass die NA:DHA-Behandlung im Vergleich zu normalen, nicht dosierten und mit dem Vehikel behandelten Tieren, die NA-Spiegel in den Rattenhirnlipiden nicht verstärkte.
Es besteht jedoch eine deutliche Zunahme der NA-Spiegel in den Hirnlipiden nach der Behandlung mit NA:GLA, sowohl bei niedrigen als auch hohen Dosen.
(b) ANALYSE DES MAUSHIRNS NACH NA:NA/NA:GLA-BEHANDLUNGEN
Tabelle 18 zeigt den Nervonsäuregehalt (NA-Gehalt) im polaren Gesamtlipid aus dem Maushirn; diese Tiere wurden mit chronisch-rezidivierender EAE (CREAE) inokuliert.
TABELLE 18:
Die Analysen zeigen nicht dosierte und mit dem Vehikel behandelte Maushirne mit einem ähnlichen NA-Spiegel in ihren Lipiden. Im Gegensatz dazu zeigen NA:GLA und NA:NA eine Verstärkung der NA-Spiegel in Hirnlipiden, die für mit NA:NA behandelte Tiere sogar noch größer ist.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Obwohl sowohl DHA als auch GLA durch die Blut-Hirn-Schranke gehen, bestätigen die von den Hirnanalysen erhaltenen Ergebnisse deutlich, dass diese beiden Fettsäuren in der Form von Propan-1,3-diol-Derivaten unterschiedlich wirken: im Gegensatz zur Behandlung mit NA:DHA führt die Behandlung mit NA:GLA zu einer Augmentierung des NA-Spiegels in Hirnlipiden, was bedeuten könnte, dass NA die Blut-Hirn-Schranke in der Form von NA:GLA überquert.
Es ist auch bemerkenswert, dass die größte Steigerung des NA-Spiegels in den Hirnlipiden, die durch die Verabreichung dieser Derivate getriggert wird, von mit NA:NA behandelten Mäusen kam, wodurch die Bedeutung der Propan-1,3-diol-Einheit in der Struktur der Verbindung, welche die Blut-Hirn-Schranke überquert, nachgewiesen wurde.
Die bisher erhaltenen Ergebnisse führen uns schließlich zur Schlussfolgerung, dass NA:GLA, dass sowohl in Ratten- als auch Mausmodellen mit akuter bzw. chronisch-rezidivierender EAE Aktivität aufwies, entzündungshemmende Eigenschaften besitzt und zur Steigerung des Nervonsäuregehalts in den Hirnlipiden fähig ist.
BEISPIEL A – Tablette
Der Wirkstoff, Lactose und Stärke werden zusammengemischt. Die Pulver werden unter Verwendung einer Lösung aus Povidon in gereinigtem Wasser granuliert. Das Granulat wird getrocknet, das Magnesiumstearat zugefügt und das Gemisch zur Herstellung von Tabletten, 100 mg pro Tablette, komprimiert.
BEISPIEL B – Salben-Zusammensetzung
Der Wirkstoff wird in einem kleinen Volumen des Vehikels dispergiert und dann in die Masse des Vehikels zur Herstellung eines glatten, homogenen Produkts inkorporiert. Kollabierbare Metalltuben werden dann mit der Dispersion gefüllt.
BEISPIEL C – Topische Creme-Zusammensetzung
Das Polawachs, Bienenwachs und Lanolin werden zusammen bei 60°C erhitzt. Eine Lösung aus Methylhydroxybenzoat wird zugefügt und Homogenisierung wird unter Verwendung von Rühren bei hoher Geschwindigkeit erreicht. Die Temperatur wird auf 50°C reduziert. Der Wirkstoff wird dann zugefügt und dispergiert. Die Zusammensetzung wird unter Rühren bei langsamer Geschwindigkeit abkühlen lassen.
BEISPIEL D – Topische Lotion-Zusammensetzung
Das Methylhydroxybenzoat und Glycerin werden in 70 ml des Wassers bei 75°C aufgelöst. Das Sorbitanmonolaurat, Polysorbat 20^TM und der Cetostearylalkohol werden bei 75°C zusammen geschmolzen und der wässrigen Lösung zugefügt. Die sich ergebende Emulsion wird homogenisiert, unter kontinuierlichem Rühren abkühlen lassen, und der Wirkstoff wird als eine Suspension in dem restlichen Wasser zugefügt. Die Suspension wird bis zur Homogenisierung gerührt.
BEISPIEL E – Kapsel-Zusammensetzung
Durch Befüllen einer zweiteiligen Hartgelatinekapsel mit 50 mg Wirkstoff, 110 mg Lactose, 32 mg Talc und 8 mg Magnesiumstearat wurde eine Kapsel hergestellt.
BEISPIEL F – Augentropfen-Zusammensetzung
Die Methyl- und Propylhydroxybenzoate werden in 70 ml gereinigtem Wasser aufgelöst und die sich ergebende Lösung wird abkühlen lassen. Der Wirkstoff wird zugefügt und die Lösung wird durch Filtration durch ein Membranfilter (0,22 μm Porengröße) sterilisiert und in geeignete sterile Behältnisse gepackt.
BEISPIEL G – Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation
Für einen Aerosolbehälter mit einem Fassungsvermögen von 15–20 ml: Der Wirkstoff (10 mg) wird mit 0,2–0,2% eines Gleitmittels, wie zum Beispiel Polysorbat 85^TM oder Ölsäure oder einem Gemisch davon, in einem Treibmittel, wie zum Beispiel Freon^TM, bevorzugt in einer Kombination aus 1,2-Dichlorethen und Difluorchlormethan gemischt, und das Gemisch wird in einen angemessenen Aaerosolbehälter gegeben, der zur Verabreichung durch Inhalation adaptiert ist.
BEISPIEL H – Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation (alkoholische Lösung)
Für einen Aerosolbehälter mit einem Fassungsvermögen von 15–20 ml: Der Wirkstoff (10 mg) wird in Ethanol (6–8 ml) aufgelöst, 0,1–0,2% eines Gleitmittels werden zugefügt, wie zum Beispiel Polysorbat 85^TM und in einem Treibmittel, wie zum Beispiel Freon^TM, bevorzugt in einer Kombination von 1,2-Dichlorethen und Difluorchlormethan dispergiert, und das Gemisch wird in einen angemessenen Aerosolbehälter gegeben, der zur nasalen oder oralen Verabreichung zur Inhalation adaptiert ist.
BEISPIEL I – Injizierbare parenterale Zusammensetzung
Eine Injektion wird unter Rühren eines 1,5 gew.-%igen Wirkstoffs in Propylenglykol und Wasser hergestellt. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert.
BEISPIEL J – Orale Zusammensetzung
Die Herstellung einer oralen Zusammensetzung erfolgt durch Mischen von 10 Teilen Wirkstoff (NA:NA und/oder NA:GLA) mit 90 Teilen Ethyloleat, die eine 10%ige Verdünnung des Lipids in Ethyloleat ergibt.

Claims

Verbindung der Formel (I): CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₁₃-C(O)-O-(CH₂)₃-OR (I)worin R Wasserstoff (H) oder einen Rest einer Carbonsäure darstellt; oder ein Salz der Verbindung, worin R für H steht, oder ein Hydrat davon.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die Carbonsäure, auf die in der Definition von R verwiesen wird, von 1 bis 26 Kohlenstoffatome aufweist und gerad- oder verzweigtkettig, gesättigt oder ungesättigt sein kann.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Carbonsäure geradkettig ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einfach und mehrfach ungesättigten Fettsäuren besteht.
Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin R für H oder einen Rest von einer einfach oder mehrfach ungesättigten C₁₈- bis C₂₄-Fettsäure, die von 1 bis 6 Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung(en) aufweist, steht.
Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin R für H oder einen Rest von Nervonsäure (24:1(n-9)), Docosahexaensäure (22:6(n-3)) oder γ-Linolensäure (18:3(n-6)) steht, worin x in (n-x) die Position der ersten Doppelbindung in Bezug auf die terminale Methylgruppe der Fettsäure anzeigt.
Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die ausgewählt ist aus: 1-(z-15-Tetracosenoyloxy)-3-hydroxypropan; 1-(z-15-Tetracosenoyloxy)-3-(z,z,z-6,9,12-octadecatrienoyloxy)propan (hierin nachstehend als NA:GLA bezeichnet); 1-(z-15-Tetracosenoyloxy)-3-(z-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoyloxy)propan (hierin nachstehend als NA:DHA bezeichnet); und 1,3-Di-(z-15-tetracosenoyloxy)propan (hierin nachstehend als NA:NA bezeichnet).
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, welches Verfahren Folgendes umfasst: (a) Reaktion eines reaktionsfähigen Derivats der Nervonsäure mit Propan-1,3-diol in Anwesenheit einer Base zur Bildung einer Verbindung der Formel (IA): CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₁₃-C(O)-O-(CH₂)₃-OH (IA)und danach, gegebenenfalls, (b) Reagieren der Verbindung der Formel (IA) mit der entsprechenden Carbonsäure der Formel R¹-H zur Bildung einer Verbindung der Formel (IB): CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₁₃-C(O)-O-(CH₂)₃-OR¹ (IB)worin R¹ einen Rest einer Carbonsäure darstellt; und optional, Bilden eines Hydrats davon.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die Verbindung der Formel (IA) durch Reaktion des Säurechlorids von Nervonsäure (d. h. CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂H)₁₃-COCl) mit Propan-1,3-diol in Anwesenheit einer Base hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin die Bedingungen für die Veresterungsreaktion (b) die Anwesenheit von hypophosphoriger Säure, optional mit Erhitzen auf Rückfluss unter einer inerten Atmosphäre, einschließen.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R mit Ausnahme von H (d. h. eine Verbindung der Formel (IB) wie in Anspruch 7 definiert) darstellt, zur Verwendung in der Therapie.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R mit Ausnahme von H (d. h. eine Verbindung der Formel (IB) wie in Anspruch 7 definiert) darstellt, zur Anwendung als ein entzündungshemmendes und/oder immunmodulatorisches Mittel.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R ein H (d. h. eine Verbindung der Formel (IA) wie in Anspruch 7 definiert) darstellt, zur Verwendung bei der Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R mit Ausnahme von H (d. h. eine Verbindung der Formel (IB) wie in Anspruch 7 definiert) darstellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine nicht toxische, wirksame Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R verschieden von H ist (d. h. eine Verbindung der Formel (IB) wie in Anspruch 7 definiert), und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin der Träger Ethyloleat umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, worin die Verbindung NA:NA und/oder NA:GLA darstellt.
Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14, worin die Verbindung NA:DHA darstellt.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, welches Verfahren das Inverbindungbringen einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R verschieden von H ist (d. h. eine Verbindung der Formel (IB) wie in Anspruch 7 definiert), mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger dafür umfasst.
Verwendung einer Verbindung der Formel (IB), wie nach Anspruch 7 definiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung nach Anspruch 18, worin das Arzneimittel zur Behandlung oder Prophylaxe einer Entzündung und/oder mit Hyper- oder Hypostimulation des Immunsystems einhergehenden Erkrankungen bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die Erkrankung ausgewählt ist aus: rheumatoider Arthritis, rheumatoider Spondylitis, Osteoarthritis, Gichtarthritis und anderen arthritischen Erkrankungen; entzündeten Gelenken; Ekzem und anderen entzündlichen Hauterkrankungen; entzündlichen Augenerkrankungen einschließlich Konjunktivitis; Pyrexie; der Reduktion von Gewebsnekrose bei chronischer Entzündung; der Suppression der Gewebeabstoßung nach Transplantationschirurgie; Crohn-Krankheit; und ulzerativer Kolitis.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die Erkrankung ausgewählt ist aus: systemischem Lupus erythematodes; multipler Sklerose; Myasthenia gravis; progressiver systemischer Sklerose; atopischer Dermatitis; Hyperimmunglobulin E; Hepatitis-B-Antigen-negativer chronisch aktiver Hepatitis; Hashimoto-Thyreoiditis; familiärem Mittelmeerfieber; Basedow-Krankheit; autoimmunhämolytischer Anämie; primärer biliärer Zirrhose; entzündlicher Darmerkankung; und anderen Erkrankungen, worin das Immunsystem kompromittiert, behindert oder funktionsbeeinträchtigt ist, einschließlich AIDS; und den mit Virusinfektionen einhergehenden, einschließlich HIV.
Verwendung einer Verbindung der Formel (IA), wie nach Anspruch 7 definiert, bei der Herstellung einer Verbindung der Formel (IB), wie in Anspruch 7 definiert.